WO2010000593A1 - Biopuces pour la detection de l'activite enzymatique d'une enzyme protease - Google Patents

Biopuces pour la detection de l'activite enzymatique d'une enzyme protease Download PDF

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WO2010000593A1
WO2010000593A1 PCT/EP2009/057207 EP2009057207W WO2010000593A1 WO 2010000593 A1 WO2010000593 A1 WO 2010000593A1 EP 2009057207 W EP2009057207 W EP 2009057207W WO 2010000593 A1 WO2010000593 A1 WO 2010000593A1
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WO
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pro
leu
gly
seq
ala
Prior art date
Application number
PCT/EP2009/057207
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English (en)
Inventor
Thomas Berthelot
Gérard DELERIS
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique
Universite Victor Segalen - Bordeaux 2
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a biochip for detecting the enzymatic activity of a protease enzyme, in particular metalloprotease enzymes, such as MMPs (abbreviation corresponding to extracellular matrix metalloproteases).
  • a protease enzyme in particular metalloprotease enzymes, such as MMPs (abbreviation corresponding to extracellular matrix metalloproteases).
  • biochips find their application in the field of diagnosis, especially in the determination of the progress of certain pathologies involving protease enzymes, such as MMPs (such as cancer, and particularly tumor angiogenesis and aggressiveness). tumor) and in the field of development and validation of novel therapeutics against protease enzymes, such as MMPs.
  • MMPs protease enzymes
  • MMPs novel therapeutics against protease enzymes, such as MMPs.
  • MMP protease enzymes are a family of endopeptidases, 28 in number, containing a zinc atom at their active site. They can be classified into two subfamilies, depending on whether they are secreted or associated with a membrane.
  • Secreted MMPs include collagenases (such as MMP-I, 8, 13 and 18), gelatinases (such as MMP-2 and 9), matrilysines (such as MMP-7 and 26), stromelysins (such as MMPs). -3, 10 and 11), epilysine (MMP-28), eneamelysine (MMP-20).
  • MMPs Membrane-associated agents include transmembrane MMPs such as MMP-14, MMP-15, MMP-I6, MMP-17, MMP-23, MMP-24 and MMP-25.
  • MMPs are capable of cleaving all elements of the extracellular matrix as well as certain growth factors, or adhesion molecules. MMPs are regulated by natural inhibitors, such as TIMP (abbreviation for tissue inhibitors of metalloproteases), and play an important role in physiological processes (such as embryonic growth, angiogenesis, remodeling of bone tissue). When the MMP / TIMP balance is out of order, pathological processes appear such as tumor growth, metastases, rheumatoid arthritis, heart disease.
  • TIMP tissue inhibitors of metalloproteases
  • MMPs have been shown to also have proteolytic activity against non-matrix proteins, giving them a complex role in several other stages of tumor progression, loss of adhesion, invasion, proliferation, angiogenesis , Intravasion, extravasion and metastatic growth.
  • MMP-2 and 9 are the most expressed in tumor angiogenesis.
  • MMP-2 and 9 are the most expressed in tumor angiogenesis.
  • MMP-I, 2, 3, 7 and 8, 9, 10 and 133, and MT1-MMP have become important therapeutic targets for the treatment of cancerous tumors.
  • MMPs are involved in the degradation of many extracellular and non-matrix proteins.
  • Peptide assays can be effective tools for biology, medicinal chemistry in the identification of inhibitors, enzyme-recognized sequences, enzymatic activities.
  • protease enzymes such as MMPs
  • these solution tests use synthetic substrates or fragments of protein substrates.
  • synthetic or natural substrates are poorly soluble, which poses many problems. There is therefore a real need for supported tests, namely biochips, to monitor the activity of protease enzymes which allow: a lesser use of the synthetic or natural substrates of the protease enzyme;
  • the subject of the invention is a biochip intended for detecting the activity of a protease enzyme comprising a solid support comprising predetermined sites covered with a layer, which layer can be obtained by:
  • first silane compound and second silane compound respectively comprising a group capable of reacting with a functional group of the support to form a covalent bond, a spacer arm and a terminal group, the spacer arm of the first silane compound and the spacer arm of the second silane compound being a hydrocarbon chain comprising a number of carbon atoms greater than 17, said terminal group of the first silane compound being a group capable of react with a substrate function of the above-mentioned protease enzyme to form a covalent bond and said terminal group of wherein the second silane compound is a group not capable of reacting with a substrate function of the above-mentioned protease enzyme, whereby the predetermined sites are grafted with the first silane compound and the second silane compound;
  • covalent grafting can thus be achieved on the predetermined sites of substrates of the protease enzyme. (Of which we want to measure the activity) without adsorption of said substrates on the surface of said sites (this adsorption being avoided thanks to the second silane compound comprising a terminal function as defined above).
  • these layers constitute self-assembled monolayers (often called SAM layers), these monolayers being very compact monomolecular films resulting, in our case, from the covalent attachment of said first and second silane compounds, this binding being enabled by the reaction between a group of said first and second silane compounds and a functional group of the surface substrate (this functional group generally being a hydroxyl group).
  • the spacer arm of the first silane compound and the second silane compound is a hydrocarbon chain comprising a number of carbon atoms greater than 17.
  • a dense layer resulting in good protection of the covalent bonds between the support and the silane compounds while allowing a good reactivity of the terminal function of the first silane compound.
  • the solid support constituting the biochips of the invention is conventionally an inorganic solid support.
  • the inorganic solid supports may be chosen from the group consisting of glasses, quartz, ceramics (such as oxide ceramics, such as silica, alumina), metals (such as aluminum, chromium). , copper, zinc, silver, nickel, tin or gold), metalloids (such as silicon).
  • the solid supports are made of metalloids, they may be subjected to an oxidation treatment, so as to create, at their surface, especially at the aforementioned predetermined sites, -OH groups, these -OH groups constituting the aforementioned functional groups.
  • the solid support may be a silicon wafer.
  • the support can also be organic in nature. It may be in particular a polymer chosen from polyurethanes, polyolefins, polycarbonates, polyethylene terephthalates, these polymers being advantageously fluorinated or even perfluorinated.
  • fluoropolymers that may be suitable, mention may be made of polyvinylidene fluoride, copolymers of tetrafluoroethylene and tetrafluoropropylene (known by the abbreviation FEP), copolymers of ethylene and tetrafluoroethylene
  • These solid supports include groups capable of reacting a group of first and second silane compounds to form a covalent bond.
  • These groups present on the surface of solid supports are conventionally hydroxyl groups, which are capable of reacting with a group of said first and second silane compounds, to form a covalent bond.
  • the first silane compound advantageously corresponds to the following formula (I):
  • X 1 , X 2 and X 3 which are identical or different, are chosen from the group consisting of linear or branched C 1 -C 6 alkyl groups and hydrolysable groups, provided that at least one of the groups Xi, X 2 and X 3 is a hydrolyzable group;
  • A corresponds to a spacer arm consisting of a hydrocarbon chain comprising a number of carbon atoms greater than 17;
  • B is a terminal group capable of reacting with a substrate function of the above-mentioned protease enzyme to form a covalent bond.
  • the second silane compound advantageously corresponds to the following formula (II):
  • X 1 , X 2 and X 3 which are identical or different, are chosen from the group consisting of linear or branched C 1 -C 6 alkyl groups; hydrolyzable, provided that at least one of X 1 , X 2 and X 3 is a hydrolyzable group;
  • A corresponds to a spacer arm consisting of a hydrocarbon chain comprising a number of carbon atoms greater than 17;
  • - D corresponds to a terminal group not being able to react with a function of the substrate of the aforementioned protease enzyme.
  • Said X1, X2 and X3, when they constitute hydrolyzable groups, may be chosen from the group consisting of halogen atoms, the groups -OR ', R' representing a linear or branched C 1 to C alkyl group 6 .
  • the hydrolyzable groups are advantageously halogen atoms, such as Cl.
  • A can represent a group - (CH 2 ) n -, where n is an integer greater than 17, for example equal to 22.
  • the group B will be selected so as to react with a function of a substrate of the protease enzyme whose activity is to be determined. It may be a group susceptible, by chemical reaction, to form an ester bond or an amide bond or a group capable of forming a bond by a metathesis reaction or chemistry of Click (Huisgen). It can thus act of an allyl group, an alkyne group, an amino group, an azide group or a carboxyl group.
  • the function of the substrate may be a carboxyl or amino group, in which case, in the case of a carboxyl group, group B is advantageously a polyethylene glycol group, such as the triethylene glycol group of the following formula:
  • the polyethylene glycol groups because of their hydrophilic character, allow the first silane compound to be clearly separated from the surface of the biochip support in an aqueous medium.
  • a first particularly advantageous silane compound is a compound corresponding to the following formula (III):
  • the -OH group being optionally protected by a protecting group, such as an acetyl group.
  • the group D will be chosen so as not to react with a function of a substrate of the enzyme whose activity is to be determined.
  • the terminal group D may be a hydroxyl group directly attached to the spacer arm.
  • a second particularly advantageous silane compound is a compound corresponding to the following formula (IV):
  • biochips are intended, as announced above, for the determination of the enzymatic activity of protease enzymes.
  • these biochips comprise on the predetermined sites substrates of the protease enzyme whose activity is to be determined, these substrates being grafted onto said sites via the first silane compounds as defined above.
  • protease enzyme substrate is intended to mean a peptide sequence comprising a target peptide sequence of the protease enzyme, the activity of which is to be measured.
  • this substrate will advantageously comprise probes, for example fluorescent probes, in order to be able to measure activity.
  • probes for example fluorescent probes
  • target peptide sequences may be target of an MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-10, MMP-11 enzyme, MMP 12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9,
  • MMP-23 MMP-25 and MMP-26.
  • the synthetic sequences may include, for example, the following amino acids or groups:
  • Nva Nor-valine
  • Cha 3-cyclohexylalanine
  • Dpa N-3 (2,4-dinitrophenyl) -L-2,3-diaminopropionyl
  • Abu ⁇ -aminobutyric acid
  • GIy glycine
  • Pro proline
  • Leu leucine
  • AIa alanine
  • GIn glutamine
  • Ile isoleucine
  • Arg arginine
  • Val valine
  • Tyr tyrosine
  • Glu glutamate
  • Met methionine
  • Phe phenylalanine
  • Asn Asparagine
  • Thr threonine
  • Trp tryptophan
  • Ser serine
  • His histidine
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-I enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-2 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-3 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-5 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Arg- Pr o-Ly s-Pr o-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Ly s-
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-7 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-8 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-9 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-10 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Arg-Ile-Ala-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-II enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-12 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-13 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Gly-Pr o-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-SEQ. 49
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-14 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences: -Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg-
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-15 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-I 6 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-17 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-I 9 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-23 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-25 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • target peptide sequence When the target peptide sequence is intended to target the MMP-26 enzyme, it can thus correspond to one of the following sequences:
  • a natural or synthetic substrate is recognized and cleaved by several MMPs. In order to determine which MMP is responsible for the cleavage, it will then be necessary to use and compare the enzymatic kinetics data of the different MMPs for this substrate.
  • S corresponds to a target peptide sequence of the protease enzyme (whose activity is to be determined), this sequence possibly corresponding to one of those explained above for MMP enzymes;
  • n and m are integers equal to 0 or 1;
  • Xi is a probe carrying a fluorescent donor group and X 2 is a probe carrying a fluorescent or non-fluorescent acceptor group, the donor group and the acceptor group being chosen, preferably , so that the fluorescence emission spectrum of the donor group overlaps, at least in part, the absorption spectrum of the acceptor group.
  • substrates conventionally react by means of a pendant function, such as a carboxyl function or an amine function, present in the peptide sequence, which function is capable of reacting with the terminal groups of the first silane compounds.
  • Suitable substrates capable of being grafted onto the predetermined sites may also correspond to cyclic peptides comprising the following sequence:
  • Si is a first target peptide sequence of a protease enzyme Ei
  • S2 is a second target peptide sequence of a protease enzyme E 2
  • Si and S 2 may be identical or different
  • Ei and E 2 may correspond to the same protease enzyme or two distinct protease enzymes
  • Xi is a probe carrying a fluorescent donor group
  • X 2 is a probe carrying a fluorescent or non-fluorescent acceptor group.
  • the donor group and the acceptor group are selected so that the fluorescence emission spectrum of the donor group overlaps, at least in part, the absorption spectrum of the acceptor group.
  • the cyclic peptides of the invention will cleave both at the level of the first peptide sequence Si and at the level of the second peptide sequence S 2 , which will generate a distance in the space of the probes Xi and X2, because of the arrangement of the probes Xi and X2.
  • fluorescent donor group is conventionally meant a group capable of absorbing light energy (called excitation light, whose wavelength generally belongs to the ultraviolet range) and to restore it in two possible forms according to its environment: a) in the form of a resonance excitation energy transfer with an acceptor group, provided that the latter is at a distance compatible with the FRET phenomenon previously described and preferably at a distance of 10 to 100 A; or b) in the form of a fluorescent light (called donor emission light), the wavelength of which generally belongs to the visible range.
  • excitation light whose wavelength generally belongs to the ultraviolet range
  • acceptor group is conventionally meant, within the meaning of the invention, a group capable of absorbing the excitation energy of the donor group by resonance energy. This excitation energy can be restored according to two major modes: a) by radiative emission (photon emission), in which case we will speak of fluorescent acceptor group; or (b) by non-radiative emission (ie any other mode of deactivation other than photon emission), in which case it will be referred to as a non-fluorescent acceptor group.
  • radiative emission photon emission
  • non-radiative emission ie any other mode of deactivation other than photon emission
  • probe conventionally means an amino acid residue carrying a donor group (in the case of the Xi probe) or carrying an acceptor group (in the case of the X probe). 2 ).
  • target peptide sequence conventionally means a peptide sequence capable of being recognized and cleaved by the protease enzyme E.
  • a cyclic peptide comprising two target peptide sequences of a protease enzyme E 1 and E 2 between which are respectively arranged an X 1 probe and a probe X 2 according to the invention allows, as explained above, to provide good tools for quantifying the activity of a protease enzyme.
  • Cyclic substrates of the invention can satisfy the following formula (VI):
  • - Ri and R2 independently correspond to a single bond, an amino acid residue or a peptide sequence
  • Y is a -CONH- or -NHCO- group.
  • Si and S2 may be identical or different, especially when the peptide is intended to differentiate the presence of isoforms of the same enzyme or when it is a question of differentiating two distinct protease enzymes E x and E 2 .
  • Si and S 2 are identical, they can be arranged in the same direction or in the opposite direction.
  • Si corresponds to the sequence -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-
  • the sequence S 2 can correspond to the same sequence arranged in the opposite direction, namely the following sequence -Ala Gly- Leu-Leu-Gly-Gln-Pro-Gly-.
  • the substrates may comprise at least one probe Xi carrying a fluorescent donor group and at least one probe X 2 carrying a fluorescent or non-fluorescent acceptor group, so that preferably , the fluorescence emission spectrum of the donor group covers, at least in part, the absorption spectrum of the acceptor group, which results in a non-radiative transfer phenomenon of the excitation energy of the donor group towards the acceptor group (or resonance energy transfer).
  • Such groups typically include an aromatic nucleus, such as a benzene, anthracene or coumarin nucleus.
  • the following pairs may be mentioned (the first member of the pair being the donor group, while the second member of the pair being the acceptor group):
  • N-methylanthranoyl / 2,4-dinitrophenyl symbolized by the abbreviation Nma / Dnp
  • the donor group and the acceptor group are groups comprising a coumarin nucleus.
  • the preferred pair may be the pair MC / DAC, having for respective formulas, once bound to the probe, the following formulas:
  • the probes Xi and X2 may be amino acid residues.
  • probe Xi can thus be the probe -Lys (MC) - of following formula:
  • probe X2 can be the probe -Lys (DAC) - of following formula:
  • Si and S2 may correspond to a target sequence of an MMP as defined above, in particular to the following sequence:
  • sequences respectively corresponding to sequences recognized by the enzyme MMP-I and the enzyme MMP-9.
  • a cyclic substrate according to the invention may be a cyclic peptide of the following formula:
  • a precise cyclic peptide according to the invention has the following formula:
  • the bold sequences will be cleaved in the presence of the MMP1 enzyme, thus helping to separate the Lys (Dac) and Lys (TM) probes from one another. This results in a variation of the resonance transfer, thus making it possible to quantify the activity of the MMP1 enzyme.
  • linear substrates that can be grafted onto the predetermined sites by means of the first silane compounds are the following:
  • Lys (DAC) -Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys (TM) -AIa, the groups Lys (DAC) and -Lys (TM) corresponding to the following respective formulas:
  • the bond on the silane compound is, conventionally, the -CO2H function carried by the amino acid AIa.
  • the peptide sequence represented in bold, is targeted at the MMP-9 enzyme, this enzyme being involved in the process of tumor angiogenesis. She is also a potential marker and target in oncology.
  • the substrates having probes X1 and X2 as defined above and grafted at predetermined sites of a solid substrate via the first silane compounds as defined above will make it possible to monitor the protease enzyme activity:
  • biochips of the invention can be prepared by the following method:
  • the method of the invention may comprise a step of activating the support at predetermined sites to create reactive functions.
  • the activation step may consist in subjecting the support at predetermined sites to an oxidation treatment so as to create -OH groups on the surface of the support, this treatment of oxidation may be to subject the support to an ozone stream for an appropriate period.
  • the first and second silane compounds correspond to the same definition as that given above as well as the substrate.
  • the support may be a silicon support, while the first and second compounds may respectively correspond to the following formulas (III) and (IV):
  • the -OH group being optionally protected by a protective group, such as an acetyl group;
  • the -OH group being optionally protected by a protective group, such as an acetyl group; and the substrate can meet the following formula: Lys (DAC) -Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys (TM) -AIa
  • Lys (DAC) and Lys (TM) corresponding to the same formula as that given above for the linear substrate.
  • the silane compounds may be previously by conventional techniques of organic synthesis.
  • the first silane compound of formula (III) can be prepared according to the following reaction scheme:
  • THF Mg, THF; g: MeLi, THF; h: CuI, TA, 15h; there. And 3N, TsCl, DCM, TA, 12; k: THF, reflux 12h 1: DCM, Ac 2 O, reflux 12h; m: toluene, HSiCl 3 , Kârsted catalyst, 40 ° C., 2h abbreviations THF, Me, TA, Et, Ts, DCM, Ac respectively corresponding to tetrahydrofuran, methyl, room temperature, ethyl, tosyl, dichloromethane and acetyl.
  • the first and second silane compounds are intended to be brought into contact with the possibly activated support. Prior to contacting, the first and second silane compounds may be solubilized in one or more organic solvents, the resulting solution thus constituting the bath in which the support will be immersed in order to be functionalized by said silane compounds.
  • the compounds of formulas (III) and (IV) mentioned above may be solubilized in a hexane / chloroform / carbon tetrachloride mixture. Once contacted with the possibly activated support if necessary, the silane compounds react with the appropriate functions of the solid substrate at predetermined sites and bind to these latter covalently including forming siloxane bonds.
  • n cyclohexane / chloroform / carbon tetrachloride (80/13/7), 18 ° C, 15h; o: caustic potash, 20 min
  • the grafting reactions can be monitored by FR-IR imaging (infra-red by Fourier transform). This technique makes it possible to obtain an image, where each pixel represents an IR spectrum. When making the tape reports, it is possible to visualize the presence or absence of introduced molecules. Such imaging can be obtained from a Spotlight 300 Imager from Perkin-Elmer.
  • the support may be subjected to a step intended to remove unreacted silane compounds, this step possibly consisting of subjecting it to sonication for a few minutes.
  • the support thus functionalized is then brought into contact with a substrate of the enzyme whose activity is to be determined, this substrate comprising a function capable of reacting with a terminal group of the first silane compound, so as to form a covalent bond.
  • reaction scheme can be as follows:
  • the signal of the biochip may be followed in the following ways: by increasing the fluorescence intensity of the probe as defined above (provided it is present), being on the peptide portion released after hydrolysis of the substrate peptide through the use of a spectrofluorometer and a fluorescence cell;
  • the substrate comprises probes as defined above using an epifluorescence microscope; by FT-IR imaging by visualizing the ratio of absorption bands of chemical functions as a function of time.
  • FRET resonance energy
  • the biochips of the invention are intended to be used to determine the enzymatic enzyme protease activity. As a result, they may be intended to be placed in contact with biological fluids comprising the protease enzyme, whose activity is to be determined, or with media comprising cell cultures or tumor cells, and the protease enzyme, which is desired. determine the activity.
  • FIGS. 1A and 1B show the FT-IR imaging of the silicon support before and after grafting of the silane compounds of formulas (III) and (IV) according to point e) of the example.
  • Figure IC shows the ellipsometry image of the support after grafting.
  • FIGS. 2A to 2C show the FT-IR imaging of the silicon support according to point f of the example and FIG. 2D represents the ellipsometry image of the biochip obtained according to point f of the example.
  • FIG. 3 represents a diagram corresponding to a fluorescence cell used for the determination of enzymatic cells.
  • the fluorescence spectra were carried out on a PTI spectrofluorometer and a Jobin-Yvon JY3 with a tank thermostated at 37 ° C. Solid phase peptide synthesis was performed on an Applied Biosystem 433A synthesizer.
  • the purifications were performed on a reversed-phase Shimadzu HPLC (SLC-IO AVP controller, LC8A pumps, UV / Vis SPD-IO AVP detector (wavelengths 214, 267 and 254 nm) and C18 column Satisfaction RP18AB 5 ⁇ m 250 * 4.6 mm
  • the solvent system used for elution is: (A) 0.1% aqueous TFA solution and (B) 70% aqueous ACN solution Fluorescence images were obtained with an Olympus BX 51 epifluorescence microscope from Olympus, Japan All images were acquired with an exposure time of 1/3 sec
  • the excitation filter used is a 330-385 nm filter.
  • FT-IR spectra were obtained using a SpotLight 300 imaging system from Perkin-Elmer (France), equipped with Spectrum One spectrophotometer. The FT-IR acquisition spectra were made using the transmission mode (8 scans at a resolution of 8 cm -1 ) . The pixel size of the FT-IR images is 6.25 * 6.25 microns.
  • the measurements were carried out with a nitrogen purged system, the atmospheric correction was carried out on each FT-IR spectrum, in order to reduce the absorption of water and CO2, the ellipsometry measurements were carried out on a Nanofilm lelli 2000 ellipsometer, equipped with an objective * 10, at 563 nm to determine the thickness of the monolayer of alkylsilanes on the surface of silicon wafers
  • the measuring surface is 450 * 450 ⁇ m 2 .
  • ACN acetonitrile
  • DAC 7-diethylamino coumarin-3-carboxylic acid
  • DCM dichloromethane
  • DIEA diisopropylethylamine
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide chloride
  • Fmoc 9-fluorophenylmethyloxycarbonyl
  • HBTU N- [1H-benzotriazol-1-yl) dimethylamino) methylene] -N-methylmethaminium hexafluorophosphate N-oxide
  • HOBt N-hydroxybenzotriazole
  • MC 7-methoxycoumarinic acid 3-carboxylic acid
  • MeOH methanol
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • OtBu Ot-butyl
  • Pmc 2, 2, 5, 7, 8-pentamethylmethyl
  • a 20% piperidine / DMF, TA, 2h; b: FmocLys (TM), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h; c: Peptide synthesis in solid phase; d: FmocLys (DAC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h; e: 20% pipetine / DMF, TA, 2h, TFA / H 2 O / TIS (95: 2.5: 2.5), TA, 3h
  • the peptide Lys (DAC) -GPGGVVGP-Lys (MC) A the letters G, P, V, A corresponding respectively to the amino acids glycine, proline, valine, alanine, was synthesized, using the 0.1 Fmoc strategy. mmol.
  • a Fmoc-Ala-Wang preloaded commercial resin (0.5 g, 0.8 mmol / g) is deprotected according to the standard deprotection procedure of the Fmoc group to give the resin H 2 N-Ala-Wang.
  • the degree of substitution of this new resin is estimated at 0.425 mmol / g by UV measurement of the concentration of dibenzofulvene released after cleavage of the Fmoc group with piperidine.
  • the unreacted amine functions are acetylated to prevent any side reactions in the following steps.
  • This "capping" step is carried out with acetic anhydride (16 mg, 0.16 mmol) and piperidine (12 mg, 0.16 mmol) in DMF (2 mL) for 40 minutes at room temperature. After washing, 0.14 g of this resin is isolated and the effectiveness of the "capping" is verified by a ninhydrin test.
  • Fmoc-Lys (TM) -Ala-Wang resin After several syntheses, 0.238 g of Fmoc-Lys (TM) -Ala-Wang resin are placed in the reactor of the automatic peptide synthesizer. The amino acids N ⁇ -Fmoc (GIy, Pro and Val) are used with a 10-fold excess with HBTU in the presence of HOBt and DIEA for 16 hours. 0.368 g of peptide bound to the resin, which is deprotected at the N-terminus.
  • Fmoc-Lys reacted with the peptide bound to the resin in the presence of PyBOP (216.7 mg, 0.49 mmol), HOBt (67.5 mg, 0.5 mmol) and DIEA (129, 2 mg, 1 mmol) in DMF for 5 hours at room temperature.
  • PyBOP 216.7 mg, 0.49 mmol
  • HOBt 67.5 mg, 0.5 mmol
  • DIEA 129, 2 mg, 1 mmol
  • the solution is filtered and the The resin is washed to give 0.392 g of peptide bound to the resin.
  • the peptide is cleaved from the resin with a solution of TFA / H 2 O / TIS (92: 2.5: 2.5) for 3 hours. at room temperature.
  • This synthesis comprises three steps: the formation of 11-bromomagnesium-1-undecene; the formation of lithium alkoxide;
  • Docos-21-enyl acetate has the following formula:
  • organic compound 4 having the following formula:
  • organic compound 4 (200 mg, 0.5 mmol) is placed in a Schlenk tube previously purged by alternating switching between a vacuum ramp and an argon ramp. After adding 2 mL of freshly distilled toluene, the solution is stirred under argon until complete dissolution. solid. 300 ⁇ l of freshly distilled trichlorosilane are then added, as well as 2 drops of Krstedt catalyst. The solution turned pale yellow is stirred for 2 hours at 40 ° C. After evaporation under reduced pressure, a crude solid is obtained and is used in the state for the grafting step. This solid corresponds to 22- (trichlorosilanyl) -docosyl acetate, hereinafter referred to as organic compound 7 of the following formula:
  • the two types of compounds are mixed in an equimolar proportion, in order to obtain a surface having an average density of active sites with respect to the peptide.
  • the silicon substrate is introduced into a reactor.
  • the reactor chamber allows the substrate to be dried at a controlled temperature, avoiding any organic contamination after cleaning.
  • compounds 5 and 7 are solubilized in hexane / chloroform 90/10 to a final concentration of 6.10 -3 M for each compound.
  • This so-called “silanization” solution is then introduced into the reactor, where the silicon substrates are located.
  • the substrates are removed from the chamber and immersed in an osmosis water bath subjected to ultrasound over a period of 5 minutes.
  • This type of treatment makes it possible to eliminate the organosilicon compounds only adsorbed on the support without weakening the grafted layer.
  • the next step is the deprotection of the -OH function by saponification of the residues of the supported compounds 5 and 7 using 0.5M alcoholic potassium hydroxide.
  • the substrates are immersed in this KOH solution for 20 minutes.
  • the supports are then removed and the impurities are removed by 3 successive treatments of 3 minutes by ultrasound in an osmosis water bath.
  • the substrates are then dried on adsorbent paper.
  • Each functionalized support is placed in a pill pillar, each pill pillar being placed in a reactor, which is purged by alternating switching between a vacuum ramp and an argon ramp, in which the grafting took place.
  • a magnetic microbridge is added to ensure agitation.
  • the supports are therefore in an inert atmosphere.
  • activation solution comprising, per unit of support, 2 mmol of HOBt and 2 mmol of [3- (N-ethylcarbodiimide) iodide).
  • FT-IR imaging of functionalized chips shows the presence of peptides on the surface of peptides
  • FIG. 2A confirms that the monolayer of alkylsilanes is always present on the silicon surface after functionalization with the peptides.
  • Figure 2C shows the distribution of peptides on the surface of the chip (epifluorescence image).
  • the chip is introduced into a fluorescence cell shown in FIG. 3, this cell comprising: a quartz vat 1;
  • the flurorescence intensity at 470 nm of the fluorescent probe released after cleavage in the solution is measured (in this case, here, measurement of the fluorescence of the group
  • the C-terminal end is covalently bound to the support, only half of the peptide containing the N-terminal portion is released into the solution.
  • a fluorescence image was made to present the surface of the chip after hydrolysis of the peptide by MMP-9. Obtaining fluorescence in the blue confirms that the peptide has been hydrolyzed (single presence of the C-terminus containing the donor group).
  • the hydrolysed chip was subjected to FT-IR imaging analysis. No amide absorption band could be observed, which means that the peptide was thus hydrolyzed.
  • the ellipsometry analysis made it possible to determine a thickness of the layer of alkylsilanes and of the hydrolysis peptide of 2.7 nm, which, by comparing with the values obtained previously, makes it possible to confirm the hydrolysis of the peptide.

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Abstract

La présente invention a trait à une biopuce destinée à la détection de l'activité d'une enzyme protéase comprenant un support comprenant des sites prédéterminés recouverts d'une couche, laquelle est susceptible d'être obtenue par : - mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec un groupe fonctionnel du support support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, le bras espaceur du premier composé silane et le bras espaceur du second composé silane étant une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane; - mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi le substrat réagit, par le biais d'un groupe pendant, avec le groupe terminal du premier composé silane pour former

Description

BIOPUCES POUR LA DETECTION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE
D'UNE ENZYME PROTEASE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention a trait à une biopuce pour détecter l'activité enzymatique d'une enzyme protéase, en particulier d'enzymes métalloprotéases, telle que des MMP (abréviation correspondant aux métalloprotéases de matrice extracellulaire) .
Ces biopuces trouvent leur application dans le domaine du diagnostic, notamment dans la détermination de l'état d'avancement de certaines pathologies impliquant des enzymes protéases, telles que les MMP (telles que le cancer, et particulièrement l' angiogénèse tumorale et l'agressivité tumorale) et dans le domaine du développement et de la validation de nouvelles thérapeutiques contre les enzymes protéases, telles que les MMP.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
Les enzymes protéases du type MMP sont une famille d' endopeptidases, au nombre de 28, contenant un atome de zinc au niveau de leur site actif. Elles peuvent être classées en deux sous-familles, selon qu'elles sont sécrétées ou associées à une membrane. Les MMP sécrétées comprennent les collagénases (telles que MMP-I, 8, 13 et 18), les gélatinases (telles que MMP-2 et 9), les matrilysines (telles que MMP-7 et 26), les stromélysines (telles que MMP-3, 10 et 11), l'épilysine (MMP-28), l' énamélysine (MMP-20). Les MMP associées à une membrane comprennent les MMP transmembranaires telles que MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-23, MMP-24 et MMP-25.
Les MMP sont capables de cliver tous les éléments de la matrice extracellulaire ainsi que certains facteurs de croissance, ou encore des molécules d'adhésion. Les MMP sont régulées par des inhibiteurs naturels, tels que les TIMP (abréviation correspondant aux inhibiteurs tissulaires de métalloprotéases) , et jouent un rôle important dans les processus physiologiques (tels que la croissance embryonnaire, l' angiogénèse, le remodelage du tissu osseux) . Lorsque la balance MMP/TIMP est déréglée, des processus pathologiques apparaissent tels que la croissance tumorale, les métastases, les arthrites rhumatoïdes, les maladies cardiaques.
Le rôle des MMP dans la progression tumorale est multiple, notamment du fait de la capacité des MMP à dégrader la matrice extracellulaire, favorisant ainsi l'invasion tumorale. Il a été démontré que les MMP ont également une activité protéolytique contre des protéines non matricielles, ce qui leur confère un rôle complexe dans plusieurs autres étapes de la progression tumorale, la perte d'adhérence, l'invasion, la prolifération, l' angiogénèse, 1' intravasion, l' extravasion et la croissance métastatique .
La cellule endothéliale présente une remarquable stabilité génétique et sera donc peu sujette à des mutations provoquant une résistance aux traitements. L' angiogénèse tumorale est donc clairement l'un des domaines les plus prometteurs et les plus actifs de la recherche contre le cancer. Plusieurs produits actuellement utilisés pour le traitement de certaines tumeurs ont des effets anti-angiogéniques . Le remodelage de la matrice extracellulaire, en particulier sa dégradation, est nécessaire dans plusieurs étapes de la progression tumorale. Cette dégradation est assurée en grande partie par les MMP. L'expression des MMP varie selon les étapes de la progression tumorale. Par exemple, ce sont les gélatinases (MMP-2 et 9) , qui sont les plus exprimées dans l' angiogénèse tumorale. La plupart de ces MMP, en l'occurrence MMP-I, 2, 3, 7 et 8, 9, 10 et 133 et la MTl-MMP sont devenues des cibles thérapeutiques importantes pour le traitement de tumeurs cancéreuses.
Les MMP sont impliquées dans la dégradation de nombreuses protéines de la matrice extracellulaire mais aussi non matricielles. Des tests utilisant des peptides peuvent être des outils efficaces pour la biologie, la chimie médicinale dans l'identification d'inhibiteurs, des séquences reconnues par des enzymes, d'activités enzymatiques . Actuellement, pour les enzymes protéases telles que les MMP, ces tests en solution utilisent des substrats synthétiques ou des fragments de substrats protéiques. Cependant, les substrats synthétiques ou naturels sont peu solubles, ce qui pose de nombreux problèmes. II existe donc un véritable besoin pour des tests supportés, à savoir des biopuces, pour suivre l'activité d'enzymes protéases qui permettent : une utilisation moindre des substrats synthétiques ou naturels de l'enzyme protéase ;
- la disparition des problèmes liés à la solubilité des substrats ;
- d'éviter l'adsorption des substrats sur le support de test sans qu' il y ait liaison par covalence, ce qui générait une non reproductibilité des résultats .
EXPOSÉ DE L' INVENTION
Ainsi, l'invention a pour objet une biopuce destinée à la détection de l'activité d'une enzyme protéase comprenant un support solide comprenant des sites prédéterminés recouverts d'une couche, laquelle couche est susceptible d'être obtenue par :
- mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec un groupe fonctionnel du support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, le bras espaceur du premier composé silane et le bras espaceur du second composé silane étant une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d' atomes de carbone supérieur à 17, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ;
- mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi le substrat réagit par le biais d'un groupe pendant, avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente .
En formant sur des sites prédéterminés d'un support solide une couche à base de deux types de composés silanes tels que mentionnés ci-dessus, l'on peut accéder ainsi à un greffage par covalence sur les sites prédéterminés de substrats de l'enzyme protéase (dont on veut mesurer l'activité) sans qu'il y ait adsorption desdits substrats à la surface desdits sites (cette adsorption étant évitée grâce au second composé silane comprenant une fonction terminale telle que définie ci-dessus) .
Sans que l'on soit nullement lié par la théorie, ces couches constituent des monocouches autoassemblées (souvent dénommées couches SAM) , ces monocouches étant des films monomoléculaires très compacts résultant, dans notre cas de figure, de la fixation par covalence desdits premier et second composés silanes, cette fixation étant permise grâce à la réaction entre un groupe desdits premier et second composés silanes et un groupe fonctionnel de la surface du substrat (ce groupe fonctionnel étant généralement un groupe hydroxyle) .
Comme annoncé ci-dessus, le bras espaceur du premier composé silane et du second composé silane est une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17. Ainsi, avec de tels composés, l'on obtient une couche dense entraînant une bonne protection des liaisons de covalence entre le support et les composés silanes tout en permettant une bonne réactivité de la fonction terminale du premier composé silane. Avec de tels composés, l'on obtient un éloignement suffisant entre le support et le substrat de l'enzyme protéase dont on veut déterminer l'activité, ce qui permet au substrat de pouvoir accéder efficacement au site actif de l'enzyme protéase. On obtient, de la sorte, une biopuce permettant une excellente détection de l'activité de l'enzyme protéase que l'on veut analyser.
Le support solide constitutif des biopuces de l'invention est classiquement un support solide inorganique. Par exemple, les supports solides inorganiques peuvent être choisis dans le groupe constitué par les verres, les quartz, les céramiques (telles que les céramiques oxydes, comme la silice, l'alumine), les métaux (tels que l'aluminium, le chrome, le cuivre, le zinc, l'argent, le nickel, l'étain ou l'or), les métalloïdes (tels que le silicium) .
Dans le cas où les supports solides sont en métalloïdes, ils pourront être amenés à subir un traitement d'oxydation, de sorte à créer, à leur surface, notamment sur les sites prédéterminés susmentionnés, des groupes -OH, ces groupes -OH constituant les groupes fonctionnels susmentionnés.
En particulier, le support solide peut être un wafer en silicium.
Le support peut également être de nature organique. Il peut s'agir notamment d'un polymère choisi parmi les polyuréthanes, les polyoléfines, les polycarbonates, les polyéthylènetéréphtalates, ces polymères étant avantageusement fluorés voire perfluorés. Parmi les polymères fluorés susceptibles de convenir, on peut citer le polyfluorure de vinylidène, les copolymères de tétrafluoroéthylène et de tétrafluoropropylène (connus sous l'abréviation FEP), les copolymères d' éthylène et de tétrafluoroéthylène
(connus sous l'abréviation ETFE), les copolymères d' hexafluoropropène et fluorure de vinylidène (connus sous l'abréviation HFP-co-VDF) .
Ces supports solides comprennent des groupes aptes à réagir un groupe des premier et second composés silanes afin de former une liaison covalente.
Ces groupes présents à la surface des supports solides sont classiquement des groupes hydroxyles, lesquels sont aptes à réagir avec un groupe desdits premier et second composé silane, pour former une liaison covalente.
Le premier composé silane répond avantageusement à la formule (I) suivante : X
\
X3 .Si"
/
X,
(D
dans laquelle :
- X1, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en Ci-C6, les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes Xi, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ;
A correspond à un bras espaceur consistant en une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et
- B correspond à un groupe terminal apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente.
Le second composé silane répond avantageusement à la formule (II) suivante :
X2-Si" -D
X3
(H)
dans laquelle :
- Xi, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en Ci-C6, les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes Xi, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ;
A correspond à un bras espaceur consistant en une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et
- D correspond à un groupe terminal n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée.
Lesdits Xi, X2 et X3, lorsqu'ils constituent des groupes hydrolysables, peuvent être choisis dans le groupe constitué par les atomes d'halogène, les groupes -OR' , R' représentant un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, en Ci à C6. En particulier, lorsque le support solide comporte, à sa surface, des groupes fonctionnels hydroxyles, les groupes hydrolysables sont avantageusement des atomes d'halogène, tels que Cl.
A peut représenter un groupe - (CH2) n-, où n est un entier supérieur à 17, par exemple égal à 22.
Pour le premier composé silane, le groupe B sera choisi de façon à pouvoir réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase dont on veut déterminer l'activité. Il peut s'agir d'un groupe susceptible, par réaction chimique, de former une liaison ester ou une liaison amide ou un groupe susceptible de former une liaison par une réaction de métathèse ou chimie de Click (Huisgen) . Il peut ainsi d'agir d'un groupe allyle, d'un groupe alcyne, d'un groupe aminé, d'un groupe azoture ou d'un groupe carboxyle. Par exemple, la fonction du substrat peut être un groupe carboxyle ou aminé, auquel cas, lorsqu'il s'agit d'un groupe carboxyle, le groupe B sera avantageusement un groupe polyéthylèneglycol, tel que le groupe triéthylèneglycol de formule suivante :
Figure imgf000011_0001
Les groupes polyéthylèneglycols, du fait de leur caractère hydrophile, permettent au premier composé silane de se dégager nettement de la surface du support de la biopuce en milieu aqueux.
Un premier composé silane particulièrement avantageux est un composé répondant à la formule (III) suivante :
Figure imgf000011_0002
(in) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl .
Pour le second composé silane, le groupe D sera choisi de sorte à ne pas réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme dont on veut déterminer l'activité. Par exemple, lorsque la fonction est un groupe carboxyle, le groupe terminal D peut être un groupe hydroxyle lié directement au bras espaceur.
Un second composé silane particulièrement avantageux est un composé répondant à la formule (IV) suivante :
Figure imgf000012_0001
(IV) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl .
Les biopuces sont destinées, comme annoncé ci-dessus, à la détermination de l'activité enzymatique d'enzymes protéases.
Ainsi, ces biopuces comprennent sur les sites prédéterminés des substrats de l'enzyme protéase dont on veut déterminer l'activité, ces substrats étant greffés sur lesdits sites via les premiers composés silanes tels que définis ci-dessus.
On précise que par « substrat de l'enzyme protéase », on entend une séquence peptidique comprenant une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase, dont on veut mesurer l'activité. Outre la séquence peptidique cible apte à être clivée par l'enzyme protéase, ce substrat comprendra avantageusement des sondes, par exemple, fluorescentes, afin de pouvoir effectuer des mesures d'activité. Ces biopuces sont particulièrement adaptées à la détermination de l'activité enzymatique d'enzymes métalloprotéases du type MMP, auquel cas le substrat comprendra une séquence peptidique cible d'une enzyme protéase . En particulier, les séquences peptidiques cibles peuvent être cibles d'une enzyme MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP- 9, MMP-IO, MMP-Il, MMP- 12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9,
MMP-23, MMP-25 et MMP-26.
Les séquences synthétiques peuvent comprendre, par exemple les acides aminés ou groupes suivants :
Nva (Nor-valine) ; Cha (3- cyclohexylalanine) ; Dpa (N-3 (2, 4-dinitrophényl) -L-2, 3- diaminopropionyle) ; Abu : acide α-aminobutyrique ;
Cys (Me) correspondant à la S-méthylcystéine, ce qui signifie que le groupe -SH est remplacé par le groupe -
S-CH3, D-Arg correspondant à la D-Arginine.
Dans la suite de cet exposé, on précise que les abréviations listées ci-dessous ont les significations suivantes : GIy : glycine ; Pro : proline ; Leu : leucine ; AIa : alanine ; GIn : glutamine ; Ile : isoleucine ; Arg : arginine ; Val : valine ; Tyr : tyrosine ; Glu : glutamate ; Met : méthionine ; Phe : phénylalanine ; Asn : Asparagine ; Thr : thréonine ; Trp : tryptophane ; Ser : serine ; His : histidine, ces abréviations correspondant à la nomenclature officielle à 3 lettres des acides aminés.
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-I, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-
SEQ. 1 -Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-
SEQ. 2 -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-
SEQ.3 -Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Ile-
SEQ.4 -GIy- Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val -GIy-
SEQ.5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-
SEQ.6
-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg- SEQ.7
-Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr-
SEQ.8 -Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-
SEQ.9 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.10
-Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-
SEQ.11 -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12 -Leu-Arg- AIa-Ty r-Leu-Leu-Pr o- AIa-
SEQ .13 -GIy-Pr o-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ .14
Deng, S. J., et al. 2000. J. Biol . Chem. 275, 31422
-Pr o-Gln-Gly-Leu-Glu- AIa-Ly s-
SEQ .15
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
- Pr o-Leu-Gly-Leu-Trp- AIa-D- Arg- SEQ . 16
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M. S., and Gray , R. D. 1989. J. Biol . Chem. 264, 4277
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ . 17
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86
-Pro-Cha-Abu-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ.18
McGeehan, G. M., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 32814 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 19
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20 Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462
Hanessian, S. et al . 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ.21
Knauper, V. et al. 1996. J. Biol. Chem. 271, 1544
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22
Nemgarten, H.; Feder , J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-
SEQ . 17
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Nagase, H. et al. 1994 J. Biol. Chem. 269, 20952-20957 -Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23
J. Berman et al. 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ. 24
Kraft, P. J. et al. 2001. Connect . Tissue Res . 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J. Pharm. Biomed .Anal . 15, 1417-1426
Welch, A. R. et al. 1995. Arch . Biochem. Biophys . 324, 59-64 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25
Lauer-Fields, J. L. and Fields , G. B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J. L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-2, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ .10 - Pr o -Pr o -Gl y- AIa- Tyr-Hi s -Gl y- AIa-
SEQ.27 -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12 -GIy- Pr o-His-Leu-Leu-Val-Glu- AIa-
SEQ.28
-Leu- Ar g- AIa-Ty r-Leu-Leu- Pr o- AIa- SEQ .13
-Pro -GIn-Gl y-Leu-Glu- Al a-Lys- SEQ.29 Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M. S., and Gray , R. D. 1989. J. Biol . Chem. 264, 4277
-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-
SEQ.30
Murphy, G., et al. 1994. J. Biol. Chem. 269, 6632
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ.21 Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg- SEQ. 31
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86
-Pro-Leu-Gly-SCH [CH2CH (CH3) 2] -CO-Leu-Gly- SEQ . 32
Wemgarten, H., et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Wemgarten, H., et al. 1985. Biochemistry 24, 6730 -Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-
SEQ. 33
G. D. Johnson and K. Ahn 2000. Anal. Biochem. 286, 112
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ.21 Kmght, CG. et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ .22 Wemgarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 Xia, T. et al. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1293, 259
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ.23
J. Berman et al., 1992. J.Biol .Chem. 267, 1434-1437
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ.24 Kraft, P. J. et al. 2001. Connect . Tissue Res . 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J. Pharm. Biomed .Anal . 15, 1417-1426
Welch, A. R. et al. 1995. Arch .Biochem. Biophys . 324, 59-64
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25
Lauer-Fields, J. L. and Fields , G. B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J. L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol . 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J. Biol.Chem. 269, 20952-20957
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-3, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly- SEQ.5
-Arg-Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-
SEQ.34
-Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-
SEQ.35
-Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro- SEQ.36
-Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-
SEQ.37 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
10
SEQ.10 -Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-
15 SEQ.38 -Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr-
SEQ.39
20
-Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys- SEQ.40
25
-Asp-Val-GIy-His-Phe-Arg-Thr-Phe-
SEQ.41
30 -Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr-
SEQ.42 -Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu-
35
SEQ.43 -Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe-
40 SEQ.44 -Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-
SEQ.45
45 -Leu-Arg-Ala-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ala- SEQ .13
-Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser-
SEQ.46
-Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-
SEQ.47
-Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12
-GIy- Pr o-His-Leu-Leu-Val-Glu- AIa-
SEQ.28 -Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln-
SEQ.48
-GIy-Pr o-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-
SEQ. 49
Deng, S. J., et al. 2000. J. Biol . Chem. 275, 31422 -Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-
SEQ . 15
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys-
SEQ. 50
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-
SEQ. 16
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M. S., and Gray , R. D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
-Pr o-Tyr- AIa-Ty r-Trp-Met-Arg- SEQ. 51 Netzel-Arnett, S., et al . 1991. Anal. Biochem. 195, 86
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-
SEQ . 52
Bickett, D. M., et al. 1994. Ann . N. Y. Acad. Sci . 732, 351
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20 Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Kmght, CG. et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 -Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22
Wemgarten, H.; Feder , J. 1985. Anal. Biochem. 147, 431 Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6130
-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol . 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20951
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-
SEQ. 50
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol . 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J.Biol.Chem. 269, 20952-20951
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-5, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Arg- Pr o-Ly s-Pr o-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu- Ala-Ly s-
SEQ. 50
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-7, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
- Pr o-Leu-Gly-Leu-Trp- AIa-D- Arg-
SEQ . 16
Bickett, O.K., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199 Stack, M. S., and Gray, R. D. 1989. J. Biol . Chem. 264, 4277
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-Ser-
SEQ. 24
Welch, A. R. , et al. 1996. Biochemistry 35, 10103 Nelch, A. R. , et al. 1995. Arch. Biochem. Biophys . 324, 59
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, N. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22
Nemgarten, H.; Feder , J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ . 17
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabam, F. et al.1998. Free Radie. Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
- Pr o-Tyr- AIa-Ty r-Trp-Met-Arg-
SEQ. 51 Fmch-Aπetta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo , C189-C191
Netzel-Arnett, S. et al. 1991 Anal . Biochem.195 , 86-92
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ . 52
Fmch-Aπetta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo , C189-C191 Bickett, D. M. et al., 1994. Ann . N . Y . Acad. Sci . 732, 351-355
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-8, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-Ala-Arg-
SEQ. 53
Netzel-Arnett, S., et al. 1991. Anal. Biochem. 195, 86
-Pr o-Leu-Gly-Leu-Trp- AIa-D- Arg-
SEQ . 16 Grams, F. et al. 2001. Biol . Chem. 382, 1277
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462
Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066
Ambrose, N. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 Knauper, V. et al. 1996. J. Biol . Chem. 271,1544
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22
Wemgarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-
SEQ . 17
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabam, F. et al.1998. Free Radie. Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20957
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23
J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ. 24
Kraft, P. J. et al. 2001. Connect . Tissue Res. 42, 149-163 Itoh, M. et al. 1997. J. Pharm. Biomed.Anal . 15, 1417-1426 Nelch, A. R. et al. 1995. Arch . Biochem. Biophys . 324, 59-64
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25 Lauer-Fields, J. L. and Fields, G. B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105
Lauer-Fields, J. L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-9, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-GIy- Pro-Pro-Gly-Val -Val -GIy- Pro-
SEQ.54 -Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-
SEQ.55
-GIy- Pro-Gly-Gly-Val -Val -GIy- Pro-
SEQ.56 -Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.57
-Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-
SEQ.58
-Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12
-GIy-Pr o-Leu-Gly-Met- Ar g-Gly-Leu-
SEQ . 14 Deng, S. J., et al. 2000. J. Biol . Chem. 275, 31422
-Pr o-Gln-Gly-Leu-Glu- AIa-Ly s-
SEQ . 15
Beekman, B., et al. 1996. FEBS Lett 390, 221
-Arg-Pro-Ly s-Pr o-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu- AIa-Ly s-
SEQ.50
Beekman, B., et al. 1997. FEBS Lett 418, 305
-Pr o-Leu-Gly-Leu-Trp- AIa-D- Arg-
SEQ . 16
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58
Kmght, CG. , et al. 1992. FEBS Lett. 296, 263 Darlak, K., et al. 1990. J. Biol. Chem. 265, 5199
Stack, M. S., and Gray , R. D. 1989. J. Biol. Chem. 264, 4277
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ . 19
Bickett, D. M., et al. 1993. Anal. Biochem. 212, 58 -Pro-Leu-Gly-SCH [CH2CH (CH3) 2] -CO-Leu-Gly-
SEQ . 32
Wemgarten, H., et al. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Wemgarten, H., et al. 1985. Biochemistry 24, 6730
-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-
SEQ. 33
G. D. Johnson and K. Ahn 2000. Anal. Biochem. 286, 112
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Roy, N. et al. 1999. Prot. Expr . Puπf. 16, 324
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ. 22
Wemgarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730 Xia, T. et al. 1996. Biochim. Biophys. Acta 1293, 259
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23 J. Berman et al., 1992. J.Biol .Chem. 267, 1434-1437
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-IO, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12
-GIy- Pr o-His-Leu-Leu-Val-Glu- AIa-
SEQ.28 -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr . Puπf. 16, 16
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-Il, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Puπf. 16, 16
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-12, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, N. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21
Park, H. I. et al. 2000. J. Biol . Chem. 275, 20540
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22 Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437
Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17
A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Shabani, F. et al.1998. Free Radie. Res. 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20951
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23 Berman, J. et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1437
- Pr o-Tyr- AIa-Ty r-Trp-Met-Arg-
SEQ. 51
Finch-Aπetta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo, C189-C191 Netzel-Arnett, S. et al. 1991 Anal . Biochem.195, 86-92
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-
SEQ. 52
Finch-Aπetta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo, C189-C191
Bickett, D. M. et al., 1994. Ann .N. Y.Acad. Sci . 732, 351-355
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ. 24 Kraft, P. J. et al. 2001. Connect . Tissue Res. 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J. Pharm. Biomed .Anal . 15, 1417-1426
Welch, A. R. et al. 1995. Arch .Biochem. Biophy s . 324, 59-64
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25 Lauer-Fields, J. L. and Fields, G. B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J. L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J. Biol.Chem. 269, 20952-20957
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-
SEQ. 50 Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol. 9 Suppl 2, S314-S315
Nagase, H. et al. 1994. J. Biol.Chem. 269, 20952-20957
-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln Phe-Trp-
SEQ. 59
Bickett, D. M. et al. 1994. Ann . N . Y . Acad. Sci . 732, 351-355
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-13, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -GIy-Pr o-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 49
Deng, S. J., et al. 2000. J. Biol. Chem. 275, 31422
-Arg- Pr o-Ly s-Pr o-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu- AIa-Ly s-
SEQ. 50 Beekman, B., et al. 1991. FEBS Lett 418, 305
-Pro-Cha-Gly-Nva -Hi s -Al a -Dpa -
SEQ. 25
Knauper, V., et al. 1996. J. Biol . Chem. 271, 1544 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20 Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Knauper, V. et al. 1996. J. Biol . Chem. 271, 1544 -Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ .22
Wemgarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Wemgarten, H. et al. 1985. Biochemistry . 24, 6130
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp- AIa-D- Arg-
SEQ . 16
Netzel-Arnett, S. et al. 1991. Anal . Biochem.195 , 86-92
Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156 Bickett, O.K. et al., 1993. Anal .Biochem. 212, 58-64
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-
SEQ . 17 A. Santala, A. et al. 1999. FEBS Lett. 461, 153-156
Shabani, F. et al.1998. Free Radie. Res . 28, 115-123 Nagase, H. et al. 1994 J.Biol.Chem. 269, 20952-20951
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23
J. Berman et al., 1992. J.Biol.Chem. 267, 1434-1431 -Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-
SEQ. 31
Netzel-Arnett, S. et al.1991. Anal . Biochem.195 , 86-92 d'Ortho, M. P. et al., 1991. Eur . J. Biochem. 250, 151-151
- Pr o-Tyr- AIa-Ty r-Trp-Met-Arg-
SEQ. 51
Fmch-Aπetta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo , C189-C191 Netzel-Arnett, S. et al. 1991 Anal .Biochem.195 , 86-92 -Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-
SEQ . 52
Finch-Aπetta, M. et al., 1993. Agents Actions 39 SpecNo, C189-C191 Bickett, D. M. et al., 1994. Ann . N . Y .Acad . Sci . 732, 351-355
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ. 24
Kraft, P. J. et al. 2001. Connect . Tissue Res . 42, 149-163
Itoh, M. et al. 1997. J. Pharm. Biomed .Anal . 15, 1417-1426 Nelch, A. R. et al. 1995. Arch . Biochem. Biophys . 324, 59-64
- Pr o-Leu- AIa-Ty r-Trp- AIa- Arg-
SEQ. 53
Aschi, M. et al. 2002. J. Comput .Aided Mol. Des 16, 213-225 Netzel-Arnett, S. et al. 1991. Anal .Biochem.135, 86-92
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25
Lauer-Fields, J. L. and Fields , G. B. 2002 Biol.Chem. 383, 1095-1105 Lauer-Fields, J. L. et al. 2001. Biochemistry 40, 5795-5803
-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
Bremer, C. et al.2002. Acad.Radiol . 9 Suppl 2, S314-S315 Nagase, H. et al. 1994. J. Biol.Chem. 269, 20952-20957
-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln Phe-Trp-
SEQ. 59
Bickett, D. M. et al. 1994. Ann . N . Y . Acad. Sci . 732, 351-355
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-14, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes : -Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg-
SEQ. 60 Mucha, A., et al. 1998. J. Biol . Chem. 273, 2763
Holtz, B., et al. 1999. Biochemistry 38, 12174
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20
Mohan, M. J. et al. 2002. Biochemistry 41, 9462 Hanessian, S. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 3066 Ambrose, W. P. et al. 1998. Anal. Biochem. 263, 150
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 Roderfeld, M. et al. 2000 . Prot. Expr . Puπf. 19, 369
Kannan, R. et al. 1999. Prot. Expr. Puπf. 16, 16
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22
Weingarten, H.; Feder, J. 1985. Anal. Biochem. 147, 437 Weingarten, H. et al. 1985. Biochemistry. 24, 6730
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-15, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Xue, C-B. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 2636
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-I 6, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21
Shimada, T. et al. 1999. Eur . J. Biochem. 262, 901 Xue, C-B. et al. 2001. J. Med. Chem. 44, 2636
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-17, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 English, N. R. et al. 2001. FEBS Lett. 491, 131
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ . 22 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-I 9, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Pendâs, A. M. et al. 1991. J. Biol . Chem. 272, 4281
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-23, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
Velasco, G. et al. 1999. J. Biol . Chem. 274, 4510 Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-25, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
English, N. R. et al. 2001. FEBS Lett. 491, 131
Lorsque la séquence peptidique cible est destinée à être cible de l'enzyme MMP-26, elle peut ainsi correspondre à l'une des séquences suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16
Park, H. I. et al. 2002. J. Biol . Chem. 277, 35168
Dans certains cas, il est possible qu'un substrat naturel ou synthétique soit reconnu et clivé par plusieurs MMP. Afin de déterminer quelle MMP est responsable du clivage, il faudra alors utiliser et comparer les données de cinétique enzymatique des différentes MMP pour ce substrat.
Ces données de cinétique enzymatique qui permettent la discrimination entre plusieurs MMP, sont généralement la constante de Mickaelis (Km) qui est l'indicateur d'affinité d'un enzyme pour son substrat et le rapport de la constante catalytique (Kcat, nombre de moles de produits formées par seconde et par mole d'enzyme) sur la constante de Mickaelis qui est l'indicateur de l'efficacité catalytique de l'enzyme. Généralement, il existe donc un couple de valeurs (Km et kcat/Km) spécifique pour un couple MMP/substrat . Il sera donc possible, à titre d'exemple, pour 2 MMP reconnaissant le même substrat de déterminer laquelle est responsable de l'activité visualisée. Des substrats adéquats susceptibles d'être greffés sur les sites prédéterminés peuvent répondre à la formule (V) suivante :
Figure imgf000035_0001
(V)
dans laquelle S correspond à une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase (dont on veut déterminer l'activité), cette séquence pouvant correspondre à l'une de celle explicitée ci-dessus pour les enzymes MMP ;
- n et m sont des entiers égaux à 0 ou 1 ;
- lorsque m et n sont égaux à 1, Xi est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent, le groupe donneur et le groupe accepteur étant choisis, de préférence, de sorte à ce que le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur. Ces substrats réagissent classiquement par le biais d'une fonction pendante, telle qu'une fonction carboxyle ou une fonction aminé, présente dans la séquence peptidique, laquelle fonction est apte à réagir avec les groupes terminaux des premiers composés silane. Des substrats adéquats susceptibles d'être greffés sur les sites prédéterminés peuvent correspondre également à des peptides cycliques comprenant la séquence suivante :
-Si-Xi-S2~X2~
dans laquelle Si est une première séquence peptidique cible d'une enzyme protéase Ei, S2 est une seconde séquence peptidique cible d'une enzyme protéase E2, Si et S2 pouvant être identiques ou différents, Ei et E2 pouvant correspondre à la même enzyme protéase ou à deux enzymes protéases distinctes, Xi est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent .
De préférence, le groupe donneur et le groupe accepteur sont choisis de sorte à ce que le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur.
Ainsi, en présence d'une enzyme protéase E (si Ei et E2 ne constituent qu'une seule et même enzyme et Si et S2 sont des séquences peptidiques cibles de la même enzyme protéase) ou à la fois d'une enzyme protéase Ei et d'une enzyme protéase E2 (lorsqu'elles sont distinctes et que Si est une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase Ei et S2 est une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase E2), les peptides cycliques de l'invention vont se cliver à la fois au niveau de la première séquence peptidique Si et au niveau de la seconde séquence peptidique S2, ce qui va générer un éloignement dans l'espace des sondes Xi et X2, du fait de la disposition des sondes Xi et X2. S'ensuit un éloignement des groupes donneur et accepteur et, par voie de conséquence, une variation du transfert de l'énergie de résonance entre ces deux groupes. A partir de la variation d'énergie de résonance, il est ainsi possible de remonter à l'activité enzymatique de l'enzyme protéase E ou des enzymes protéases Ei et E2. Dans ce qui précède et ce qui suit, par groupe donneur fluorescent, on entend classiquement un groupe apte à absorber de l'énergie lumineuse (dite lumière d'excitation, dont la longueur d'onde appartient généralement au domaine de l'ultraviolet) et de la restituer sous deux formes possibles en fonction de son environnement : a) sous forme d'un transfert d'énergie d'excitation par résonance avec un groupe accepteur, à condition que ce dernier se trouve à une distance compatible avec le phénomène de FRET décrit précédemment et préférentiellement, à une distance allant de 10 à 100 A ; ou b) sous forme d'une lumière fluorescente (dite lumière d'émission du donneur), dont la longueur d'onde appartient, généralement, au domaine du visible.
Par groupe accepteur, on entend classiquement, au sens de l'invention, un groupe apte à absorber l'énergie d'excitation du groupe donneur par énergie de résonance. Cette énergie d'excitation pourra être restituée selon deux grands modes : a) par émission radiative (émission de photons) , auquel cas on parlera de groupe accepteur fluorescent ; ou b) par émission non radiative (à savoir tout autre mode de désactivation autre que l'émission de photons) , auquel cas on parlera de groupe accepteur non fluorescent.
Par sonde, on entend classiquement, au sens de l'invention, un reste d'acide aminé porteur d'un groupe donneur (dans le cas de la sonde Xi) ou porteur d'un groupe accepteur (dans le cas de la sonde X2) .
Par séquence peptidique cible, on entend classiquement, au sens de l'invention, une séquence peptidique apte à être reconnue et clivée par l'enzyme protéase E.
L'utilisation d'un peptide cyclique comprenant deux séquences peptidiques cibles d'une enzyme protéase Ei et E2 entre lesquelles sont disposées respectivement une sonde Xi et une sonde X2 conforme à l'invention permet, comme explicité ci-dessus, de fournir de bons outils pour la quantification de l'activité d'une enzyme protéase.
Des substrats cycliques de l'invention peuvent répondre à la formule (VI) suivante :
Figure imgf000038_0001
(VI)
dans laquelle : - Si, Xi, S2 et X2 répondent à la même définition que celle donnée ci-dessus ;
- Ri et R2 correspondent indépendamment à une liaison simple, un reste d'acide aminé ou une séquence peptidique ;
- Y correspond à un groupe -CONH- ou -NHCO-.
Si et S2 peuvent être identiques ou différents, notamment lorsque le peptide est destiné à différencier la présence d' isoformes de la même enzyme ou lorsque qu'il s'agit de différencier deux enzymes protéases distinctes Ex et E2.
Lorsque Si et S2 sont identiques, elles peuvent être disposées dans le même sens ou en sens inverse. Par exemple, lorsque Si correspond à la séquence -Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-, la séquence S2 peut correspondre à la même séquence disposée en sens inverse, à savoir la séquence suivante -Ala-Gly- Leu-Leu-Gly-Gln-Pro-Gly- .
Qu'ils soient linéaires ou cycliques, les substrats peuvent comprendre au moins un sonde Xi porteuse d'un groupe donneur fluorescent et au moins une sonde X2 porteur d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent, de sorte à ce que, de préférence, le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur, ce qui se traduit par un phénomène de transfert non radiatif de l'énergie d'excitation du groupe donneur vers le groupe accepteur (ou transfert d'énergie de résonance). De tels groupes comprennent classiquement un noyau aromatique, tel qu'un noyau benzénique, anthracénique ou coumarine.
On peut citer, par exemple, les couples suivants (le premier membre du couple étant le groupe donneur, tandis que le second membre du couple étant le groupe accepteur) :
*Tryptophane/2 , 4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation W/Dnp) ; *Acide o-aminobenzoïque/2, 4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation Abz/Dnp) ;
* (7-méthoxycoumarin-4-yl) -acétyle/2, 4-dinitrophényle
(symbolisé par l'abréviation Mca/Dnp) ;
* (7-méthoxycoumarin-4-yl) -acétyle/N-3- (2, 4- dinitrophényl) -L-2 , 3-diaminopropyle (symbolisé par l'abréviation Mca/Dpa) ;
*Tryptophane/Dansyle (symbolisé par l'abréviation
W/Dns) ;
*N-méthylanthranoyle/2 , 4-dinitrophényle (symbolisé par l'abréviation Nma/Dnp) ;
*6, 7-diméthoxycoumarin-4-yl-acétyle/acide 6-N- (7- nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-yl) aminohexanoïque
(symbolisé par l'abréviation DMC/Nbd) ;
*Acide 5- (2' -aminométhyl) naphtalène suifonique/acide 4- (4 ' -diméthylaminophénylaza) benzoïque (symbolisé par l'abréviation EDANS/Dabcyl) ;
* acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique/acide 7- diéthylaminocoumarin-3-carboxylique/ (symbolisé par l'abréviation MC/DAC) , lesdits groupes répondant aux formules suivantes :
Figure imgf000041_0001
DABCYL
Figure imgf000042_0001
Nma
Avantageusement, le groupe donneur et le groupe accepteur sont des groupes comprenant un noyau coumarine .
Du fait que ces groupes présentent un motif aromatique commun du type coumarine, cela permet la formation d'un complexe de nature hydrophobe ou du type π-stacking, qui participe à la stabilité des peptides cycliques de l'invention.
En particulier, le couple préféré peut être le couple MC/DAC, ayant pour formules respectives, une fois liés à la sonde, les formules suivantes :
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
MC
Les sondes Xi et X2 peuvent être des restes d'acide aminé.
Un exemple de sonde Xi peut être ainsi la sonde -Lys (MC) - de formule suivante :
Figure imgf000043_0003
tandis qu'un exemple de sonde X2 peut être la sonde -Lys (DAC) - de formule suivante :
Figure imgf000044_0001
le groupe -NH- du reste de la lysine devenant un groupe -NH2 lorsque la sonde Lys (DAC) constitue un groupe terminal et non un groupe faisant pont .
Si et S2 peuvent correspondre à une séquence cible d'une MMP telle que définie ci-dessus, en particulier à la séquence suivante :
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-
ou
-GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro
ces séquences correspondant respectivement à des séquences reconnues par l'enzyme MMP-I et l'enzyme MMP- 9.
Un substrat cyclique conforme à l'invention peut être un peptide cyclique de formule suivante :
Figure imgf000045_0001
Xi, X2, Ri, Y et R2 répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus.
Un peptide cyclique précis conforme à l'invention répond à la formule suivante :
Figure imgf000045_0002
les groupes -Lys (DAC) - et -Lys (MC) - répondant à la même définition que celle donnée ci-dessus.
Les séquences en gras seront clivées en présence de l'enzyme MMPl, contribuant ainsi à éloigner l'une de l'autre les sondes Lys (Dac) et Lys (MC) . S'ensuit une variation du transfert de résonance, permettant ainsi de quantifier l'activité de l'enzyme MMPl.
Des exemples de substrats linéaires susceptibles d'être greffés sur les sites prédéterminés par le biais des premiers composés silanes sont les suivants :
Lys (DAC) -Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys (MC) -AIa, les groups Lys (DAC) et -Lys (MC) répondant aux formules respectives suivantes:
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
la liaison sur le composé silane se faisant, classiquement, par la fonction -CO2H portée par l'acide aminé AIa.
La séquence peptidique, représentée en gras, est cible de l'enzyme MMP-9, cette enzyme étant impliquée dans le processus d' angiogénèse tumorale. Elle fait également partie des marqueurs et des cibles potentielles en cancérologie. Les substrats présentant des sondes Xi et X2 telles que définies ci-dessus et greffés sur des sites prédéterminés d'un substrat solide via les premiers composés silanes tels que définis ci-dessus vont permettre de suivre l'activité d'enzyme protéase :
- par variation du transfert d'énergie par résonance grâce, par exemple, à un microscope d' épifluorescence ; et
- par augmentation de la fluorescence de l'une des sondes fluorescentes dans le milieu biologique réactionnel après clivage du peptide.
Les biopuces de l'invention peuvent être préparées par le procédé suivant :
- éventuellement, une étape d' activation de la surface d'un support solide en des sites prédéterminés, de façon à créer des fonctions aptes à réagir avec un groupe des premier et deuxième composés silanes pour former une liaison covalente ;
- une étape de mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec le support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ;
- une étape de mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennent quoi le substrat réagit avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente.
Ainsi, le procédé de l'invention peut comprendre une étape d' activation du support en des sites prédéterminés pour créer des fonctions réactives.
Classiquement, lorsque le support est un support en silicium, l'étape d' activation peut consister à soumettre le support sur des sites prédéterminés à un traitement d' oxydation de sorte à créer des groupes -OH à la surface du support, ce traitement d'oxydation pouvant à consister à soumettre le support à un flux d'ozone pendant une durée appropriée .
Pour les étapes de mise en contact, les premier et second composés silanes répondent à la même définition que celle donnée ci-dessus de même que le substrat .
Selon un mode particulier de réalisation, le support peut être un support en silicium, tandis que les premier et second composés peuvent répondre respectivement aux formules (III) et (IV) suivantes :
Figure imgf000048_0001
le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ;
Figure imgf000049_0001
(IV)
le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ; et le substrat peut répondre à la formule suivante : Lys (DAC) -Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys (MC) -AIa
Lys (DAC) et Lys (MC) répondant à la même formule que celle donnée ci-dessus pour le substrat linéaire.
Avant l'étape de mise en contact, les composes silanes peuvent être préalablement par des techniques classiques de synthèse organique.
Ainsi, à titre d'exemple, le premier composé silane de formule (III) peut être préparé selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000050_0001
ONa
Figure imgf000050_0002
f: Mg, THF; g: MeLi, THF; h: CuI, TA, 15h; y. Et3N, TsCl, DCM, TA, 12h; k: THF, reflux 12h 1: DCM, Ac2O, reflux 12h; m: toluène, HSiCl3, catalyseur de Kârsted, 400C, 2h les abréviations THF, Me, TA, Et , Ts , DCM, Ac correspondant respectivement à tétrahydrofurane, méthyl, température ambiante, éthyle, tosyle, dichlorométhane et acétyl .
Quant au second composé silane de formule (IV), il peut être préparé selon le schéma réactionnel suivant :
Figure imgf000051_0001
.OAc
^ 20°
Figure imgf000051_0002
f : Mg, THF; g: MeLi, THF; h: CuI, TA, 15h; i: pyridine, Ac2O, TA, 12h; m: toluène, HSiCl3, catalyseur de Kârsted, 400C, 2h
Les premier et second composés silanes sont destinés à être mis en contact avec le support éventuellement activé. Préalablement à la mise en contact, les premier et second composés silanes peuvent être solubilisés dans un ou plusieurs solvants organiques, la solution résultante constituant ainsi le bain dans lequel sera plongé le support en vue d'être fonctionnalisé par lesdits composés silanes.
A titre d'exemple, les composés de formules (III) et (IV) susmentionnées, peuvent être solubilisés dans un mélange hexane/chloroforme/tétrachlorure de carbone . Une fois mis en contact avec le support éventuellement activé si nécessaire, les composés silanes réagissent avec les fonctions adéquates du substrat solide en des sites prédéterminés et se lient à ces derniers par covalence notamment en formant des liaisons siloxane.
Avec des composés silanes de formules (III) et (IV) susmentionnées, le schéma réactionnel peut être le suivant :
Figure imgf000052_0001
n: cyclohexane/chlorof orme/tétrachlorure de carbone (80/13/7), 18°C, 15h; o: potasse caustique, 20 min
Les réactions de greffages peuvent être suivies par imagerie FR-IR (infra-rouge par transformée de Fourier) . Cette technique permet notamment d'obtenir une image, où chaque pixel représente un spectre IR. En réalisant les rapports de bande, il est possible de visualiser la présence ou non des molécules introduites. Une telle imagerie peut être obtenue à partir d'un imageur SpotLight 300 de chez Perkin-Elmer .
Pour confirmer les résultats par imagerie FT-IR sur les biopuces, il est possible de réaliser, en parallèle, des mesures des surfaces du support par ellipsométrie, qui est une technique optique d'analyse de surface fondée sur la mesure du changement de l'état de polarisation de la lumière après réflexion sur une surface plane. Cette technique permet d'avoir accès à de nombreux paramètres tels que l'épaisseur de la couche mince, son indice de réfraction.
Après l'étape de mise en contact avec les composés silanes, le support peut être soumis à une étape destinée à éliminer les composés silanes n'ayant pas réagi, cette étape pouvant consister à le soumettre à une sonication pendant quelques minutes.
Le support ainsi fonctionnalisé est ensuite mis en contact avec un substrat de l'enzyme dont on veut déterminer l'activité, ce substrat comprenant une fonction apte à réagir avec un groupe terminal du premier composé silane, de sorte à former une liaison covalente .
Avec un substrat greffé avec des composés silanes particuliers tels que mentionnés ci-dessus, le schéma réactionnel peut être le suivant :
+ HOOC Substrat
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002
Le signal de la biopuce pourra être suivi des façons suivantes : par augmentation de l'intensité de fluorescence de la sonde telle que définie ci-dessus (sous réserve d'être présente), se trouvant sur la partie peptidique relarguée après hydrolyse du peptide substrat grâce à l'utilisation d'un spectrofluorimètre et d'une cellule de fluorescence ;
- par variation de l'énergie de résonance (FRET) sous réserve que le substrat comprenne des sondes telles que définies ci-dessus à l'aide d'un microscope d' épifluorescence ; par imagerie FT-IR en visualisant le rapport de bandes d' absorption de fonctions chimiques en fonction du temps.
Les biopuces de l'invention sont destinées à être utilisées pour déterminer l'activité enzymatique d'enzyme protéase. De ce fait, elles peuvent être destinées à être mises en contact avec des fluides biologiques comprenant l'enzyme protéase, dont on veut déterminer l'activité ou avec des milieux comprenant des cultures cellulaires ou cellules tumorales et l'enzyme protéase, dont on veut déterminer l'activité.
L' invention va maintenant être décrite en référence aux exemples suivants, donnés à titre illustratif et non limitatif.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
Les figures IA et IB représentent l'imagerie par FT-IR du support de silicium avant et après greffage des composés silanes de formules (III) et (IV) conformément au point e) de l'exemple. La figure IC représente l'image par ellipsométrie du support après greffage.
Les figures 2A à 2C représentent l'imagerie par FT-IR du support de silicium conformément au point f de l'exemple et la figure 2D représente l'image par ellipsométrie de la biopuce obtenue conformément au point f de l'exemple.
La figure 3 représente un schéma correspondant à une cellule de fluorescence utilisée pour la détermination des cellules enzymatiques . EXPOSE DETAILLE DE MODES DE REALISATION PARTICULIERS
Dans les exemples ci-dessous, tous les produits chimiques et les solvants sont de qualité analytique et ont été achetés chez Sigma. La résine
Fmoc-Ala-Wang, le PyBOP et tous les acides aminés
(protégés en Na par Fmoc) ont été achetés chez Advanced
Chemtech.
Toutes les réactions chimiques ont été réalisées sous N2 avec des solvants anhydres. Le DMF a été desséché sur CaH2 au reflux pendant une nuit et distillé. Le DCM a été distillé avant utilisation.
Les spectres de fluorescence ont été réalisés sur un spectrofluorimètre PTI et un Jobin-Yvon JY3 avec une cuve thermostatée à 370C. La synthèse peptidique en phase solide a été effectuée sur un synthétiseur Applied Biosystem 433A. Les purifications ont été réalisées sur une HPLC Shimadzu en phase inverse (contrôleur SLC-IO AVP, pompes LC8A, détecteur UV/Vis SPD-IO AVP (longueurs d'onde 214, 267 et 254 nm) et colonne C18 Satisfaction RP18AB 5 μm 250*4,6 mm. Le système de solvants utilisés pour l'élution est : (A) solution aqueuse de TFA à 0,1% et (B) solution aqueuse d'ACN à 70%. Les images de fluorescence ont été obtenues avec un microscope d' épifluorescence Olympus BX 51 de chez Olympus (Japon) . Toutes les images ont été acquises avec un temps d'exposition de 1/3 s. Le filtre d'excitation utilisé est un filtre 330-385 nm. Les images et les spectres FT-IR ont été obtenus en utilisant un système imageur SpotLight 300 de chez Perkin-Elmer (France) , équipé avec un spectrophotomètre Spectrum One. Les spectres d'acquisition FT-IR ont été réalisés en utilisant le mode transmission (8 scans à une résolution de 8 cm"1) . La taille des pixels des images FT-IR est de 6,25*6,25 microns. Toutes les mesures ont été conduites avec un système purgé à l'azote. La correction atmosphérique a été réalisée sur chaque spectre FT-IR, afin de réduire l'absorption de l'eau et du CO2. Les mesures d' ellipsométrie ont été effectuées sur un ellipsomètre Nanofilm lelli 2000, équipé d'un objectif *10, à 563 nm pour déterminer l'épaisseur de la monocouche d' alkylsilanes à la surface des wafers de silicium. La surface de mesure est de 450*450 μm2. L'angle d'incidence est de 70°. Les indices de réfraction pour la couche d' alkylsilane et la couche alkylsilane/peptide ont été estimés à 1,46. L'épaisseur de toutes les couches ont été calculées avec Δ=151,6° et ψ=13,57°. Dans ces exemples, il est employé les abréviations suivantes :
ACN : acétonitrile ; DAC : acide 7- diéthylamino coumarin-3-carboxylique ; DCM : dichlorométhane ; DIEA : diisopropyléthylamine ; DMSO : diméthylsulfoxyde ; DMF : diméthylformamide ; EDC : chlorure de l-éthyl-3- (3- diméthylaminopropyl) carbodiimide ; Fmoc : 9- fluorophénylméthyloxycarbonyl ; HBTU : N-[IH- benzotriazol-1-yl) diméthylamino) méthylène] -N- méthylméthaminium hexafluorophosphate N-oxyde ; HOBt : N-hydroxybenzotriazole ; MC : acide 7-méthoxycoumarin- 3-carboxylique ; MeOH : méthanol ; NHS : N- hydroxysuccinimide ; ; OtBu : O-t-butyle ; Pmc : 2, 2, 5, 7, 8-pentaméthylchroman-6-sulfonyl ; AMPA : 4- aminophénylmercurique acétate ; PyBOP : benzotriazol-1- yl-oxy+tris-pyrrolidinophosphonium ; TA : température ambiante ; TFA : acide trifluoroacétique ; THF : tétrahydrofurane ; TIS : triisopropylsilane ; TRIS : tris (hydroxyméthyl) aminométhane .
a) Synthèse du peptide substrat de la MMP-9
Le schéma réactionnel de synthèse de ce peptide est le suivant :
Fmoc-Ala -Wang- H9N- -AIa- -Wanq Fmoc-Ly s(MC)- AIa Wa ng
H2N-GPGGVVGP-LyS(MC)-AIa Wang d
FmOC-LyS(DAC)-GPGGVVGP-LyS(MC)-AlS Wang
a: 20% pipéπdine/DMF, TA, 2h; b: FmocLys(MC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h; c: Synthèse peptidique en phase solide; d: FmocLys(DAC), PyBOP, HOBt, DIEA, DMF, TA, 5h; e: 20% pipéndine/DMF, TA, 2h, TFA/H2O/TIS (95:2,5:2,5), TA, 3h
Le peptide Lys (DAC) -GPGGVVGP-Lys (MC) A, les lettres G, P, V, A correspondant respectivement aux acides aminés glycine, proline, valine, alanine, a été synthétisé, en utilisant la stratégie Fmoc à 0,1 mmol. Une résine commerciale préchargée Fmoc-Ala-Wang (0,5 g, 0,8 mmol/g) est déprotégée selon la procédure standard de déprotection du groupe Fmoc pour donner la résine H2N-Ala-Wang. Cette dernière réagit avec la Fmoc- Lys (MC) (228 mg, 0,4 mmol) en présence de PyBOP (173 mg, 0,392 mmol), de HOBt (54 mg, 0,4 mmol) et de DIEA (103 mg, 0,8 mmol) dans le DMF (5 mL) pendant 5 heures à température ambiante. La solution est filtrée et la résine résultante est lavée avec 5*10 mL de DMF, 5*10 mL de dichlorométhane et 5*10 mL de méthanol pour donner 0,14 g de résine Fmoc-Lys (MC) -Ala-Wang. Le taux de substitution de cette nouvelle résine est estimé à 0,425 mmol/g par mesure UV de la concentration de dibenzofulvène libéré après clivage du groupe Fmoc avec la pipéridine. Les fonctions aminés n'ayant pas réagi sont acétylées, afin de prévenir toute réaction secondaire dans les étapes suivantes. Cette étape de « capping » est réalisée avec de l'anhydride acétique (16 mg, 0,16 mmol) et de la pipéridine (12 mg, 0,16 mmol) dans le DMF (2 mL) pendant 40 minutes à température ambiante. Après lavage, 0,14 g de cette résine est isolée et l'efficacité du « capping » est vérifiée par un test à la ninhydrine. Après plusieurs synthèses, 0,238 g de résine Fmoc-Lys (MC) -Ala-Wang sont placés dans le réacteur du synthétiseur automatique de peptide. Les acides aminés Nα-Fmoc (GIy, Pro et Val) sont utilisés avec un excès de 10 fois avec du HBTU en présence de HOBt et de DIEA pendant 16 heures. 0,368 g de peptide lié à la résine, qui est déprotégée à l'extrémité N-terminale. La Fmoc-Lys (DAC) réagit avec le peptide lié à la résine en présence de PyBOP (216,7 mg, 0,49 mmol), de HOBt (67,5 mg, 0,5 mmol) et de DIEA (129,2 mg, 1 mmol) dans DMF pendant 5 heures à température ambiante. La solution est filtrée et la résine est lavée pour donner 0,392 g de peptide lié à la résine. Après un traitement en présence de 20% de pipéridine dans le DMF à température ambiante, le peptide est clivé de la résine grâce à une solution de TFA/H2O/TIS (92 :2,5 :2,5) pendant 3 heures à température ambiante. La résine est éliminée par filtration et elle est lavée avec du TFA (2*1 mL) et du dichlorométhane (10 mL) . Le filtrat est évaporé sous pression réduite puis noyé dans de l'éther diéthylique froid. Après 12 h à -200C, un précipité est isolé
(100 mg) et collecté après filtration. Après purification par chromatographie HPLC préparative,
30,5 mg de peptide pur est obtenu.
b) Synthèse de l' acétate de docos-21-ényle
*Synthèse de docos-21-èn-l-ol Cette partie illustre la préparation du docos-21-èn-l-ol répondant à la formule suivante :
Figure imgf000060_0001
Cette synthèse comprend trois étapes : la formation du 11-bromomagnésium-l- undécène ; - la formation de l'alcoolate de lithium ;
- la formation du docos-21-èn-l-ol .
- Formation du 11-bromomagnésium-l-undécène
A une solution de THF anhydre contenant 2,7 g (107 mmoles) de magnésium sous forme de roublures, est ajoutée, goutte à goutte, une solution de 5 g (21,4 mmoles) de 11-bromo-l-undécène dans 21 mL de THF. Cette réaction est réalisée sous atmosphère inerte. L'exothermie de la réaction est régulée à l'aide d'un bain de glace. Puis 5 mL de dibromoéthane sont ajoutés à ce mélange. La réaction est maintenue active pendant une heure et le surnageant est prélevé à l'aide d'une seringue puis placé dans un ballon sous atmosphère inerte.
- Formation de l'alcoolate de lithium
A une solution de THF anhydre sont ajoutés 5,4 g (21,4 mmoles) de 10-bromoundécanol . La solution est placée à -78°C sous atmosphère inerte, puis à l'aide d'une ampoule équi-pression, 0,71 mL (23,45 mmoles) de méthyllithium laissée progressivement revenir à température ambiante.
- Formation du docos-21-èn-l-ol A la solution contenant le 11-bromomagnésium-l-undécène refroidie à -78°C, 0,21 g (1,1 mmoles) d' iodure de cuivre est additionné. La solution contenant le dérivé lithien y est ajoutée goutte à goutte par l'intermédiaire d'une canule. Le mélange est agité pendant une heure à cette température, puis 15 heures à température ambiante. La réaction est arrêtée par addition de 40 mL d'éthanol absolu. Un précipité noir se forme. Ce dernier est accentué par l'ajout de 3 mL d' HCl 10%. Après filtration sur fritte, la solution limpide obtenue est extraite trois fois à l'aide de diéthyléther . La phase éthérée restante est alors lavée à l'eau puis avec une solution saturée en NaHCθ3. La phase organique est alors récupérée, séchée sur MgSO4 puis concentrée par évaporation des solvants sous pression réduite. Le résidu restant est finalement reprécipité dans l' acétonitrile anhydride. Après filtration sur fritte, 4,86 g de docos-21-èn-l-ol sont obtenus (rendement=70%) .
^Synthèse de l'acétate de docos-21-ènyle L'acétate de docos-21-ènyle répond à la formule suivante :
Figure imgf000062_0001
A 2 g (6 mmoles) de docos-21-èn-l-ol sont ajoutés 20 mL de pyridine anhydre. Après quelques minutes d'agitation, la solution est refroidie par un bain de glace et 0,7 mL (7,2 mmoles) d'anhydride acétique sont ajoutés. Après un retour à température ambiante, la solution est agitée pendant 12 heures. La pyridine est alors co-évaporée à l'aide de toluène anhydre, puis le résidu est noyé dans 30 mL de dichlorométhane . Cette solution est lavée 3 fois à l'aide d'une solution aqueuse saturée en hydrocarbonate de sodium. Les phases organiques sont rassemblées après séchage sur MgSO4, les solvants sont évaporés sous pression réduite. Une poudre blanche est récupérée. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec comme éluant un mélange dichlorométhane/méthanol (98/2, v/v) , 1,34 g d'acétate de docos-21-ènyle désigné ci-après composé 6 sont récupérés sous forme d'une huile translucide, qui durcit et blanchit à température ambiante (Rendement : 62%) .
c) Synthèse du 1-O-acétyl-lO-O- [l-docos-21- ényl] triéthylèneglycol
^Synthèse du tosylate de docos-21-ène L'activation de l'extrémité hydroxyle du docos-21-èn-l-ol, par action du chlorure de tosyle en présence de triéathylamine dans le dichlorométhane à température ambiante a permis d'obtenir du tosylate de docos-21-ène de formule :
Figure imgf000063_0001
A une solution de 4 g (12 mmoles) de docos- 21-ène-l-ol dans 4 mL de triéthylamine anhydre et 30 mL de dichlorométhane anhydre, sont ajoutés, sous azote et à température ambiante, 4,6 g (34 mmoles) de chlorure de tosylate lui-même dilué dans 30 mL de dichlorométhane. Le mélange jaunâtre est agité pendant 12 heures. Après filtration sur fritte et évaporation des solvants sous pression réduite, le résidu est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice avec, pour éluant, le dichlorométhane à 100%. 3,4 g de tosylate de docos-21-ène sont récupérés (rendement=60%) . ^Synthèse du 2- (2- (2- (docos-21- ényloxy) éthoxy) éthoxy) éthanol
A 1,9 g (12,6 mmoles) de triéthylène glycol en solution dans 30 mL de THF anhydre sont additionnés 83 mg (2,1 mmoles) d'hydrure de sodium à 60% dans l'huile. Après 15 minutes d'agitation sous azote, 1 g (2,1 mmoles) du composé (2) en solution dans 40 mL de THF pendant 12 heures. Après retour à température ambiante, la solution est filtrée sur fritte, les solvants sont évaporés et le résidu est purifié par chromatographie sur colonne sur gel de silice avec, pour éluant, un mélange dichlorométhane/méthanol (98/2 v/v) . Il est récupéré 0,64 g de 2- (2- (2- (docos-21- ényloxy) éthoxy) éthoxy) éthanol de formule :
Figure imgf000064_0001
dit composé (3) .
^Synthèse du 2- (2- (2- (docos-21- ényloxy) éthoxy) éthoxy) éthylacétate
Dans une solution de 20 mL de dichlorométhane est dissous 0,5 g (1 mmole) de 2- (2- (2- (docos-21-ényloxy) éthoxy) éthoxy) éthanol (3), puis 0,26 mL (2,7 mmoles) d'anhydride acétique est ajouté. La solution est agitée sous azote pendant 1 heure puis au reflux avec du dichlorométhane pendant 12 heures. Après retour à température ambiante, la solution est extraite 3 fois à l'aide de 50 mL de dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée trois fois à l'aide d'une solution aqueuse saturée en hydrocarbonate de sodium. Après séchage sur MgSO4 et évaporation des solvants sous pression réduite de la phase organique, une pâte jaunâtre est récupérée. Après purification par chromatographie sur colonne de gel de silice avec, pour éluant un mélange dichlorométhane/méthanol (98/2 v/v) est récupéré 0,45 g de 1-O-acétyl-lO-O- [l-docos-21- ényl] triéthylèneglycol (ou acétate de 2- [2- (2-docos-21- ényloxy-éthoxy) -éthoxy] éthyle ci-après désigné par composé organique 4 répondant à la formule suivante :
Figure imgf000065_0001
d) Hydrosilylation des composés organiques 4 et 6 Les composés organiques 4 et 6 présentent à l'une de leur extrémité une insaturation. Cette double liaison a été fonctionnalisée à l'aide de chlorosilane pour fixer dans un deuxième temps ces composés à un support en silicium. Cette hydrosilylation a été effectuée par réaction du trichlorosilane sur les composés 4 et 6 dans du toluène en présence d'un catalyseur de Kàrstedt .
Le composé organique 4 (200 mg, 0,5 mmole) est placé dans un tube de Schlenk ayant préalablement été purgé par commutation alternative entre une rampe à vide et un rampe à argon. Après addition de 2 mL de toluène fraîchement distillé, la solution est soumise à une agitation, sous argon, jusqu'à complète dissolution du solide. Puis 300 μL de trichlorosilane fraîchement distillé sont ajoutés ainsi que 2 gouttes du catalyseur de Kàrstedt. La solution devenue jaune pâle est agitée 2 heures à 400C. Après évaporation sous pression réduite, un solide brut est obtenu puis est utilisé dans l'état pour l'étape de greffage. Ce solide correspond à l'acétate de 22- (trichlorosilanyl) - docosyle ci-après dénommé composé organique 7 de formule suivante :
Figure imgf000066_0001
A partir du composé 6 et dans les mêmes conditions opératoires, est obtenu le composé organique
5 correspondant au 1-O-acétyl-lO-O- [22- (trichlorosilanyl) -docosyl] triéthylèneglycol de formule :
Figure imgf000066_0002
e) Greffage des composés organiques 7 et 5 sur un support en silicium
Dans un premier temps, on procède à un mélange des deux types de composés dans une proportion équimolaire, dans le but d'obtenir une surface présentant une densité moyenne de sites actifs vis-à- vis du peptide. Ainsi, après nettoyage sous un flux d'ozone de 30 minutes, le substrat en silicium est introduit dans un réacteur. L'enceinte du réacteur permet de sécher le substrat à une température contrôlée en évitant toute contamination organique postérieure au nettoyage .
Plus précisément, les composés 5 et 7 sont solubilisés dans le mélange hexane/chloroforme 90/10 à une concentration finale de 6.10~3 M pour chaque composé. Cette solution dite « de silanisation » est alors introduite dans le réacteur, où se trouvent les substrats en silicium.
Après une nuit d' immersion, les substrats sont retirés de l'enceinte et plongés dans un bain d'eau osmosée soumis à des ultrasons sur une durée de 5 minutes. Ce type de traitement permet d'éliminer les composés organosiliciés seulement adsorbés sur le support sans fragiliser la couche greffée.
L'étape suivante est la déprotection de la fonction -OH par saponification des restes de composés 5 et 7 fixés sur support en utilisant de la potasse alcoolique à 0,5 M. Les substrats sont immergés dans cette solution de KOH pendant 20 minutes. Les supports sont ensuite retirés et les impuretés sont éliminées par 3 traitements successifs de 3 minutes par ultrasons dans un bain d'eau osmosée. Les substrats sont alors séchés sur papier adsorbant.
Il est à noter, qu'en présence d'un greffage hétérogène, KOH pénètre au sein de la couche greffée et rompt les liaisons liant les bras organosiliciés à la surface. Dans le cas d'un greffage homogène, les molécules de cette base forte ne trouvent pas d'espace entre les molécules greffées pour atteindre la surface. Le greffage de matériau inorganique restera donc intact. L'utilisation de potasse alcoolique permet donc aussi de tester l'homogénéité du greffage.
Une analyse par infrarouge en transmission et en imagerie FT-IR a été réalisée, afin de caractériser le nombre d'ondes correspondant aux groupements -CH2- des chaînes aliphatiques des composés 5 et 7 greffés. L'analyse confirme la présence en surface de la longue chaîne aliphatique par l'observation des bandes caractéristiques des liaisons CH2 (vas=2921 cm"1, vs= 2852 cm"1) (voir figures 1 A et IB représentant respectivement l'image par FT-IR du support de silicium avant et après greffage) . De plus, l'intensité des bandes obtenues ici (ΔDO=3.10"3) est comparable à la simulation effectuée avec une monocouche d' arachidate sur verre (ΔDO=2, 5.10"3) . Ceci indique donc bien la formation en surface du support d'une monocouche des composés 5 et 7. La couche greffée est suffisamment compacte et dense pour empêcher la pénétration de la potasse alcoolique au sein de la couche . L'image par ellipsométrie 3D du support après greffage est représentée sur la figure IC. Les résultats obtenus en ellipsométrie montrent également la formation d'une monocouche d' alkylsilanes d'une épaisseur de 2,3 nm, épaisseur comparable avec la longueur des bras greffés en surface. f) Fixation du peptide cible de la MMP-9
Chaque support fonctionnalisé est placé dans un pilulier, chacun des piluliers étant placé dans un réacteur, qui est purgé par commutation alternative entre une rampe à vide et une rampe à argon, dans lequel s'est déroulé le greffage. Un microbarreau aimanté est ajouté, afin d'assurer l'agitation. Les supports se trouvent donc sous atmosphère inerte.
Il est ajouté une solution dite d' activation comportant, par unité de support, 2 mmol de HOBt et 2 mmol d' iodure de [3- (N-éthylcarbodiimide) -
N-propyl] triéthylammonium (DiPC) mis en solution, sous atmosphère inerte, dans 1 mL de solvant de greffage
(eau osmosée à 9 g/L de NaCl) . La solution peptidique (par support, 1 mmol de peptide 1 mis en solution sous argon dans 1 mL de solvant de greffage) est ajoutée, goutte à goutte, très lentement, sous agitation, au support préalablement immergé dans la solution d' activation . L'agitation est maintenue 30 minutes puis est arrêtée. Les supports restent immergés pendant 20 heures. Les substrats sont ensuite retirés des piluliers et les molécules non fixées de façon covalente sont éliminées par ultrasons et par traitements successifs de 2 minutes dans de l'eau osmosée puis sont analysées comme précédemment.
L' observation du spectre met en évidence les bandes caractéristiques du groupe CO appartenant à un groupe amide (vCo=1651 cm"1) et du groupe -NH appartenant à un groupe amide (vNH=1556 cm -I1 Les substrats de silicium obtenus lors des différentes expériences ont été analysés par FT-IR
L' analyse des spectres révèle la présence de peptides uniquement sur les substrats préalablement greffés par les composés 5 et 7.
L'imagerie FT-IR des puces fonctionnalisées montre la présence du peptide en surface des peptides
(figure 2A) . La figure 2B confirme que la monocouche d' alkylsilanes est toujours présente à la surface du silicium après fonctionnalisation par les peptides. La figure 2C présente la répartition des peptides à la surface de la puce (image d' épifluorescence) .
La fonctionnalisation a été également confirmée par ellipsométrie avec une épaisseur de la couche d' alkylsilanes greffée par le peptide de 4,2 nm
(figure 2D) . Ce résultat est en accord avec la taille du peptide.
g) Cinétiques enzymatiques La puce préalablement préparée est soumis à l'action de l'enzyme MMP-9.
Pour ce faire, la puce est introduite dans une cellule de fluorescence représentée à la figure 3, cette cellule comprenant : - une cuve de quartz 1 ;
- un agitateur magnétique 3 ;
- la biopuce 5 ; et une solution 7 comprenant de l'enzyme MMP-9 surmontant la biopuce. La solution consiste en un volume réactionnel de 2 mL avec 2 nM de MMP-9 activée par de l'AMPA, ces 2 mL étant issus d'une préparation obtenue par mélange à 370C pendant 4 heures de 25 μL de MMP-9 commerciale (90% sous forme zymogène) activée avec une solution de AMPA (1 mM) avec une solution tampon contenant 0,1 N de TRIS, 0,1 M de NaCl et 10 mM de CaCl2 à pH=4, 6.
Après l'ajout de la solution sur la biopuce, il est procédé à la mesure de l'intensité de flurorescence à 470 nm de la sonde fluorescente relargué après clivage dans la solution (en l'espèce, ici, mesure de la fluorescence du groupe accepteur (N- diéthylaminocoumaryl) . En effet, l'extrémité C terminale étant liée de façon covalente au support, seule la moitié du peptide contenant la partie N- terminale est libérée dans la solution.
L'augmentation de l'intensité de fluorescence à 470 nm a été tracée en fonction du temps. Kcat/Km a été estimé à 153000 s'1. M"1, ce qui atteste du fait que l'enzyme MMP-9 a bien reconnu le peptide greffé sur la biopuce.
Une image de fluorescence a été réalisée de façon à présenter la surface de la puce après hydrolyse du peptide par la MMP-9. L'obtention de fluorescence dans la bleu confirme que le peptide a bien été hydrolyse (présence unique de l'extrémité C-terminale contenant le groupe donneur) .
Par la suite, la puce hydrolysée a été soumise à une analyse par imagerie FT-IR. Aucune bande d'absorption des amides n'a pu être observée, ce qui signifie que le peptide a donc bien été hydrolyse. L'analyse par ellipsométrie a permis de déterminer une épaisseur de la couche d' alkylsilanes et du peptide hydrolyse de 2,7 nm, ce qui, en comparant aux valeurs obtenues précédemment, permet de confirmer l'hydrolyse du peptide.

Claims

REVENDICATIONS
1. Biopuce destinée à la détection de l'activité d'une enzyme protéase comprenant un support comprenant des sites prédéterminés recouverts d'une couche, laquelle couche est susceptible d'être obtenue par :
- mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec un groupe fonctionnel du support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, le bras espaceur du premier composé silane et le bras espaceur du second composé silane étant une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d' atomes de carbone supérieur à 17, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ;
- mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi le substrat réagit, par le biais d'un groupe pendant, avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente .
2. Biopuce selon la revendication 1, dans laquelle le support est un support solide inorganique.
3. Biopuce selon la revendication 2, dans laquelle le support solide inorganique est choisi dans le groupe constitué par les verres, les quartz, les céramiques (telles que les céramiques oxydes, comme la silice), les métaux (tels que l'aluminium, le chrome, le cuivre, le zinc, l'argent, le nickel, l'étain ou l'or), les métalloïdes (tels que le silicium).
4. Biopuce selon la revendication 2 ou 3, dans lequel le support solide est un wafer en silicium.
5. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le premier composé silane répond à la formule (I) suivante :
X
\
X3 ~.Si
X3^ Φ
dans laquelle : - Xi, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en Ci-Ce, les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes Xi, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ; A correspond à un bras espaceur consistant en une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et
- B correspond à un groupe apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente.
6. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le second composé silane répond à la formule (II) suivante :
X2-Si -D
X3 (H)
dans laquelle : - Xi, X2 et X3, identiques ou différents, sont choisis dans le groupe constitué par les groupes alkyles, linéaires ou ramifiés en Ci-Ce, les groupes hydrolysables, à condition que l'un au moins des groupes Xi, X2 et X3 soit un groupe hydrolysable ; - A correspond à un bras espaceur consistant une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17 ; et
- D correspond à un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée.
7. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le groupe pendant du substrat est un groupe carboxyle ou aminé.
8. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle, lorsque le groupe pendant du substrat est un groupe carboxyle, le groupe B est un groupe polyéthylèneglycol, tel que le groupe triéthylèneglycol de formule suivante :
Figure imgf000076_0001
9. Biopuce selon la revendication 5, dans laquelle le premier composé silane répond à la formule (III) suivante :
Figure imgf000076_0002
le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl .
10. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle, lorsque le groupe pendant du substrat est un groupe carboxyle, le groupe D est un groupe hydroxyle lié directement au bras espaceur.
11. Biopuce selon la revendication 6, dans laquelle le second composé silane répond à la formule (IV) suivante :
Figure imgf000077_0001
( IV) le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl .
12. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'enzyme protéase est une enzyme métalloprotéase du type MMP.
13. Biopuce selon la revendication 12, dans laquelle l'enzyme métalloprotéase du type MMP est choisie parmi la MMP-I, MMP-2, MMP-3, MMP-5, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-IO, MMP-Il, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-I 6, MMP-17, MMP-I 9, MMP-23, MMP-25 et MMP- 26.
14. Biopuce selon la revendication 13, dans lequel le substrat comprend :
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-I répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala-
SEQ. 1
-Ala-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-
SEQ. 2
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln- SEQ.3 -Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Ile-
SEQ.4 -Gly-Pro-GIu-Gly-Leu-Arg-Val-GIy-
SEQ.5 5 -Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-
SEQ.6 -Ala-Gly-Leu-Gly-Val-Val-Glu-Arg-
SEQ.7
-Ala-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Ser-Thr- 10 SEQ.8
-Gly-Ala-Met-Phe-Leu-Glu-Ala-Ile-
SEQ.9 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.10 15 -Thr-Glu-Gly-Glu-Ala-Arg-Gly-Ser-
SEQ.11 -Arg-AIa-I'le-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12
-Leu-Arg-AIa-Tyr-Leu-Leu-Pro-AIa- 20 SEQ.13
-GIy-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ.14
-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- 25
SEQ.15
30
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg- SEQ. 16
35
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17
-Pro-Cha-Abu-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ.18
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 19
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ.21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly- SEQ. 22
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-
SEQ. 17
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23 -Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ. 24
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25
-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26 - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-2 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.10 -Pro-Pro-Gly-AIa-Tyr-His-Gly-AIa-
SEQ.27
-Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12
-Gly-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-Ala-
SEQ.28 -Leu-Arg-AIa-Tyr-Leu-Leu-Pro-AIa-
SEQ.13 -Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys-
SEQ.29
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-D-Arg-
SEQ. 16
-Pro-Leu-Ala-Nva-Dpa-Ala-Arg-
SEQ.30
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ.21
-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-
SEQ. 31 -Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH (CH3) 2] -CQ-Leu-Gly- SEQ. 32
-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-
SEQ. 33
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ.21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ.22 -Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ.23
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ.24 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25
-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-3 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Gly-Pro-Glu-Gly-Leu-Arg-Val-Gly- SEQ.5 -Arg-Val-Gly-Phe-Tyr-Glu-Ser-Asp-
SEQ.34 -Leu-Leu-Ser-Ala-Leu-Val-Glu-Thr-
SEQ.35
10 -Glu-Ala-Ile-Pro-Met-Ser-Ile-Pro-
SEQ.36
15
-Ile-Ala-Gly-Arg-Ser-Leu-Asn-Pro-
SEQ.37
20 -Ile-Pro-Glu-Asn-Phe-Phe-Gly-Val-
SEQ.10 -Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-
25
SEQ.38 -Asp-Val-Ala-Gln-Phe-Val-Leu-Thr-
30 SEQ.39 -Asp-Thr-Leu-Glu-Val-Met-Arg-Lys-
SEQ.40
35 -Asp-Val-GIy-His-Phe-Arg-Thr-Phe-
SEQ.41
40 -Asp-Ser-Gly-Gly-Phe-Met-Leu-Thr-
SEQ.42 -Arg-Val-Ala-Glu-Met-Arg-Gly-Glu-
45 SEQ.43 -Asp-Leu-Gly-Arg-Phe-Gln-Thr-Phe- SEQ.44
-Pro-Phe-Ser-Pro-Leu-Val-Ala-Thr-
SEQ.45
-Leu-Arg-AIa-Tyr-Leu-Leu-Pro-AIa- SEQ.13
-Ala-Pro-Gly-Asn-Ala-Ser-Glu-Ser-
SEQ.46
-Phe-Ser-Ser-Glu-Ser-Lys-Arg-Glu-
SEQ.47 -Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12
-GIy-Pro-His-Leu-Leu-Val-Glu-AIa-
SEQ.28
-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe-Gln-
SEQ.48
-GIy-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu- SEQ. 49
-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ. 15
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-Ala-Lys-
SEQ. 50 -Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16
-Pro-Tyr-AIa-Tyr-Trp-Met-Arg-
SEQ. 51
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-
SEQ. 52
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ. 22 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-
SEQ. 50 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-5 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-AIa-Lys-
SEQ. 50 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-7 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 -Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-Ser-
SEQ. 24
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly- SEQ. 22
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17
-Pro-Tyr-AIa-Tyr-Trp-Met-Arg- SEQ. 51
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-8 répondant à l'une au moins des formules suivantes : -Pro-Leu-Ala-Tyr-Trp-AIa-Arg-
SEQ. 53
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16 -Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ. 22
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ. 24
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25
ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-9 répondant à l'une au moins des formules suivantes : -GIy- Pro-Pro-Gly-Val -Val -GIy- Pro-
SEQ.54 -Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Gly-Glu-
SEQ.55
-GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro-
SEQ.56
-Ile-Pro-Gln-Asn-Phe-Phe-Gly-Val- SEQ.57
-Pro-Pro-Gly-Ala-Tyr-His-Gly-Ala-
SEQ.58
-Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu-
SEQ.12
-GIy-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-
SEQ. 14
-Pro-Gln-Gly-Leu-Glu-Ala-Lys- SEQ. 15
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-AIa-Lys- SEQ.50
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg- SEQ. 16
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 19
-Pro-Leu-Gly-SCH[CH2CH (CH3) 2] -CQ-Leu-Gly- SEQ. 32
-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Ala-Phe-
SEQ. 33
-Pro-β-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly- SEQ. 22
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg- SEQ. 23 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-IO répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Arg-Ala-Ile-His-Ile-Gln-Ala-Glu- SEQ.12
-GIy-Pro-H±s-Leu-Leu-Val-Glu-AIa-
SEQ.28
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 OU
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-Il répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-12 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala- SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly- SEQ. 22
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg- SEQ. 17
-Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg- SEQ. 23
-Pro-Tyr-Ala-Tyr-Trp-Met-Arg-
SEQ. 51
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp- SEQ. 52
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg-
SEQ. 24
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-
SEQ. 25 -Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met-
SEQ. 26
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-
SEQ. 50
-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln Phe-Trp- SEQ. 59 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-13 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-GIy-Pro-Leu-Gly-Met-Arg-Gly-Leu-
SEQ. 49
-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu-AIa-Lys-
SEQ. 50 -Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala-Dpa-
SEQ. 25 -Pro-Cha -Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly-
SEQ.22
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16
-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Ala-Arg-
SEQ. 17 -Pro-Leu-Gly-Cys (Me) -His-Ala-D-Arg-
SEQ. 23
-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-
SEQ. 31
-Pro-Tyr-AIa-Tyr-Trp-Met-Arg-
SEQ. 51
-Arg-Pro-Lys-Pro-Leu-Ala-Nva-Trp-
SEQ. 52
-Arg-Pro-Leu-Ala-Leu-Trp-Arg- SEQ. 24
-Pro-Leu-AIa-Tyr-Trp-AIa-Arg- SEQ. 53
-Pro-Cha-Gly-Nva-His-Ala- SEQ. 25
-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala-Nva-Trp-Met- SEQ. 26
-Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln Phe-Trp-
SEQ. 59 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-14 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Ala-Cys (p-OMeBz) -Trp-Ala-Arg-
SEQ. 60
-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-
SEQ. 20
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21
-Pro-Leu-Gly- [2-mercapto-4-methyl-pentanoyl] -Leu-Gly- SEQ. 22 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-15 répondant à l'une au moins des formules suivantes : -Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa -Ala -Arg- SEQ . 21 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-16 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-17 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 -Pro-Leu-Gly- [2-rnercapto-4 -methyl -pen tanoyl ] -Leu-Gly-
SEQ . 22 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-19 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg- SEQ. 21 ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme MMP-23 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21 ou
- une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-25 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-
SEQ. 21
ou - une séquence peptidique cible de l'enzyme
MMP-26 répondant à l'une au moins des formules suivantes :
-Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-AIa-D-Arg-
SEQ. 16
15. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le substrat adéquat susceptible de réagir avec les sites prédéterminés répond à la formule suivante :
(Xl) n-S- (X2 )m
dans laquelle S correspond à une séquence peptidique cible de l'enzyme protéase (dont on veut déterminer l'activité), cette séquence pouvant correspondre à l'une de celle explicitée à la revendication 14 ;
- n et m sont des entiers égaux à 0 ou 1 ; - lorsque m et n sont égaux à 1, Xi est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent, le groupe donneur et le groupe accepteur étant choisis, de préférence, de sorte à ce que le spectre d'émission de fluorescence du groupe donneur recouvre, au moins en partie, le spectre d'absorption du groupe accepteur.
16. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans laquelle le substrat adéquat susceptible de réagir avec les sites prédéterminés est un peptide cyclique comprenant la séquence suivante :
-Si-Xi-S2-X2-
dans laquelle Si est une première séquence peptidique cible d'une enzyme protéase Ei, S2 est une seconde séquence peptidique cible d'une enzyme protéase E2, Si et S2 pouvant être identiques ou différents, Ei et E2 pouvant correspondre à la même enzyme protéase ou à deux enzymes protéases distinctes, Xi est une sonde porteuse d'un groupe donneur fluorescent et X2 est une sonde porteuse d'un groupe accepteur fluorescent ou non fluorescent.
17. Biopuce selon la revendication 15 ou 16, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde Xi et le groupe accepteur porté par la sonde X2 comprennent un noyau aromatique.
18. Biopuce selon la revendication 17, dans laquelle le noyau aromatique est un noyau benzénique, anthracénique ou coumarine.
19. Biopuce selon la revendication 17, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde Xi et le groupe accepteur porté par la sonde X2 sont choisis parmi les couples suivants :
*Tryptophane/2, 4-dinitrophényle ; *Acide o-aminobenzoïque/2, 4-dinitrophényle ;
* (7-méthoxycoumarin-4-yl) -acétyle/2, 4-dinitrophényle ;
* (7-méthoxycoumarin-4-yl) -acétyle/N-3- (2, 4- dinitrophényl) -L-2, 3-diaminopropyle ;
*Tryptophane/Dansyle ; *N-méthylanthranoyle/2, 4-dinitrophényle ;
*6, 7-diméthoxycoumarin-4-yl-acétyle/acide 6-N- (7- nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-yl) aminohexanoïque ;
*Acide 5- (2 ' -aminométhyl) naphtalène suifonique/acide 4-
(4' -diméthylaminophénylaza) benzoïque * acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique/acide 7- diéthylaminocoumarin-3-carboxylique .
20. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 15 à 19, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde Xi et le groupe accepteur porté par la sonde X2 comprennent un noyau coumarine.
21. Biopuce selon la revendication 20, dans laquelle le groupe donneur porté par la sonde Xi et le groupe accepteur porté par la sonde X2 répondent respectivement aux formules suivantes :
Figure imgf000097_0001
MC
Figure imgf000097_0002
22. Biopuce selon l'une quelconque des revendications 15 à 21, dans laquelle les sondes Xi et X2 sont des restes d'acide aminé.
23. Biopuce selon la revendication 16, dans laquelle Si et S2 correspondent à une séquence cible répondant à l'une des formules suivantes :
-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Leu-Gly-Ala- ou
-GIy-Pro-Gly-Gly-Val-Val-GIy-Pro
24. Biopuce selon la revendication 23, dans laquelle le peptide cyclique répond à la formule suivante :
Figure imgf000098_0001
Xi, X2 répondant à la même définition que celle données selon l'une quelconque des revendications 16 à 22, Ri et R2 correspondent indépendamment à une liaison simple, un reste d'acide aminé ou une séquence peptidique et Y correspond à un groupe -CONH- ou -NHCO.
25. Biopuce selon la revendication 24, dans laquelle le peptide cyclique répond à la formule suivante :
Figure imgf000098_0002
les groupes -Lys (DAC) - et -Lys (MC] aux formules respectives suivantes :
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000099_0002
26. Biopuce selon la revendication 15, dans laquelle le peptide linéaire répond à la formule suivante :
Lys (DAC) -Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys (MC) -AIa Lys (DAC) et Lys (MC) correspondant aux formules respectives suivantes :
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000100_0002
27. Biopuce selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le support solide est un support en silicium, les premier et second composés répondent respectivement aux formules (III) et (IV) suivantes :
Figure imgf000101_0001
le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ;
Figure imgf000101_0002
(IV)
le groupe -OH étant éventuellement protégé par un groupe protecteur, tel qu'un groupe acétyl ; et le substrat répond à la formule suivante :
Lys (DAC) -Gly-Pro-Gly-Gly-Val-Val-Gly-Pro-Lys (MC) -AIa, Lys (DAC) et -Lys (MC) - répondant aux mêmes définitions que celles données à la revendication 26.
28. Procédé de préparation d'une biopuce telle que définie selon l'une quelconque des revendications 1 à 27, comprenant les étapes suivantes:
- éventuellement, une étape d' activation de la surface d'un support solide en des sites prédéterminés, de façon à créer des fonctions aptes à réagir avec un groupe des premier et deuxième composés silanes pour former une liaison covalente ;
- une étape de mise en contact des sites prédéterminés avec au moins un premier composé silane et au moins un deuxième composé silane, lesdits premier composé silane et second composé silane comprenant respectivement un groupe apte à réagir avec le support pour former une liaison covalente, un bras espaceur et un groupe terminal, le bras espaceur du premier composé silane et le bras espaceur du second composé silane étant une chaîne hydrocarbonée comprenant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 17, ledit groupe terminal du premier composé silane étant un groupe apte à réagir avec une fonction d'un substrat de l'enzyme protéase susmentionnée pour former une liaison covalente et ledit groupe terminal du second composé silane étant un groupe n'étant pas apte à réagir avec une fonction du substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennant quoi les sites prédéterminés sont greffés par le premier composé silane et le second composé silane ;
- une étape de mise en contact des sites prédéterminés ainsi greffés avec le substrat de l'enzyme protéase susmentionnée, moyennent quoi le substrat réagit avec le groupe terminal du premier composé silane pour former une liaison covalente.
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