FR2880356A1 - Plantes transplastomiques exemptes du gene marqueur de selection - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet des plantes transplastomiques exemptes du gène marqueur de sélection, une méthode d'obtention de telles plantes, ainsi que les vecteurs utilisés.

Description

PLANTES TRANSPLASTOMIQUES EXEMPTES DU GENE MARQUEUR DE SELECTION

La présente invention a pour objet des plantes transplastomiques exemptes du gène marqueur 5 de sélection, une méthode d'obtention de telles plantes, ainsi que les vecteurs utilisés.

La transgénèse végétale consiste à introduire dans une plante un ou des gènes provenant de différents organismes (bactéries, virus, insectes, plantes), dans le but de lui apporter de nouveaux caractères et d'améliorer certaines qualités agronomiques ou alimentaires. La 1 o grande diversité de gènes, associée au développement des techniques de transformation génétique classiques, a abouti à la création de nouvelles variétés végétales. Dans certains cas, grâce à l'introduction de caractères conférant une résistance à un herbicide, à des pathogènes ou à divers stress, les pratiques culturales peuvent être facilitées et les rendements augmentés. Dans d'autres cas, la valeur nutritive de la plante et la teneur en certains composés essentiels peuvent être améliorées.

De nombreuses techniques pour obtenir des plantes transgéniques stables consistent à introduire le gène étranger dans le génome nucléaire de la plante. Mais les gènes étrangers intégrés dans les chromosomes nucléaires de la plante hôte peuvent être dispersés dans la nature via le pollen. Des méthodes qui réduisent le risque de dispersion de transgènes dans l'environnement sont de ce fait hautement bénéfiques.

Un autre moyen d'obtention de plantes transgéniques est la transformation directe des plastes. En effet, la transformation des plastes présente de nombreux avantages parmi lesquels on peut citer: La transformation des plastes, par laquelle les gènes sont insérés par une double recombinaison homologue dans une ou plusieurs copies multiples du génome plastidial circulaire (ou plastome) présent dans chaque cellule présente l'avantage de cibler précisément la région du plastome où l'on souhaite intégrer le gène d'intérêt, grâce à des séquences plastidiales positionnées de part et d'autre du transgène sur le vecteur de transformation. Ce ciblage précis évite l'effet dit de position observé fréquemment en transgenèse nucléaire.

- L'obtention d'un très grand nombre de copies du transgène par cellule. En effet, selon le stade de développement, une cellule de feuille peut contenir jusqu'à 10 000 copies d'un petit génome circulaire de 120 à 160 kilobases, chaque molécule portant une large séquence répétée. Les cellules de plantes peuvent être ainsi manipulées de manière à contenir jusqu'à 20 000 copies d'un gène d'intérêt.

Ceci conduit à des niveaux d'expression élevés, les produits des transgènes pouvant présenter plus de 40% des protéines solubles totales (De Cosa et al., 2001).

La transformation plastidiale présente l'autre avantage de fortement limiter le risque de dispersion des transgènes dans l'environnement. Les traits codés au niveau des plastes n'étant généralement pas transmissibles via le pollen, le risque potentiel de transmission du transgène aux espèces sauvages est limité.

Des techniques de transformation de plastes sont décrites dans l'article McBride et al., 1994, dans les brevets américains U.S. Pat. N . 5,451,513; 5,545,817; 5,545,818 et 5,576,198, ainsi que dans les demandes de brevet internationale WO 95/16783 et WO 97/32977. La transformation des plastes par biolistique a été réalisée initialement dans l'algue unicellulaire Chlamydomonas reinhardtii (Boynton et al., 1988) et cette approche a été étendue au tabac (Svab et al., 1990).

La technique classique de transformation de plastes implique le bombardement de feuilles à l'aide de micro-projectiles sur lesquels est fixé l'ADN (Svab et al., 1993).

A l'heure actuelle, la transformation stable des plastes des végétaux supérieurs est pratiquée de manière courante seulement chez le tabac, N. tabacum (Svab et Maliga, 1990; Svab et al., 1993). Quelques progrès récents ont néanmoins été réalisés avec la transformation des plastes de riz (Khan and Maligna, 1999), Arabidopsis thaliana (Sikdar et al., 1998), la pomme de terre (Sidorov et al., 1999), le colza (Chaudhuri et al., 1999) et la tomate (Ruf et al., 2001).

Des plantes transplastomiques fertiles ont été obtenues dans le cas du tabac, de la tomate, de la pomme de terre et du soja (WO 04/053133) .

L'utilisation de la transformation directe des plastes a été utilisée pour obtenir un bon niveau de tolérance à des herbicides ou de résistance aux insectes ou encore pour la production de protéines en grande quantité. Ainsi, la surexpression à partir du plastome de tabac de gènes de tolérance à des herbicides tels que le glyphosate (Daniell, 1998; W099/10513; Ye et al., 2000; WO 01/04331, WO 01/04327), ou la phosphinothricine (Basta) (Lutz et al., 2001), confère une excellente tolérance à ces herbicides. D'autres applications ont conduit à l'obtention de plantes transplastomiques tolérantes aux insectes ou surproduisant des protéines thérapeutiques (McBride et al., 1995; US Patent 5,451,513; Staub et al. (2000); W099/10513).

Cependant, un des désavantages majeurs de la transformation directe des plastes de plantes supérieures, telle qu'elle est classiquement pratiquée, est l'utilisation d'un gène de résistance à un antibiotique comme marqueur de sélection.

Le marqueur de sélection généralement employé pour la sélection des lignées transplastomiques est le gène bacterien aadA, exprimé sous le contrôle d'éléments régulateurs plastidiaux (Svab et al, 1993; Staub et al, 1993). L'expression du gène aadA, codant pour une aminoglycoside 3'adenylyltransferase, confère une résistance à deux antibiotiques, la spectinomycine et la streptomycine. Le produit du gène aadA empêche la spectinomycine (ou la streptomycine) de se lier à l'ARN16S, un composant de la sous-unité 30S des ribosomes plastidiaux, intervenant dans la reconnaissance du codon d'initiation de la traduction, et donc d'inhiber la traduction au sein du plaste. Seules les cellules qui contiendront des plastes exprimant le produit du gène aadA pourront continuer à croître de façon optimale in vitro et rester vertes. Un marqueur de sélection alternatif est une séquence d'ARN16S possédant une mutation ponctuelle qui le rend insensible à la spectinomycine.

Malheureusement cet antibiotique contrôle également les infections bactériennes chez l'homme et l'animal. Il y a de ce fait une grande anxiété au sujet des risques potentiels pour la santé et l'environnement liée à la présence d'un gène de résistance à un antibiotique dans des cultures transgéniques. Les méthodes qui permettent l'élimination des gènes marqueurs de sélection, en particulier antibiotiques, tout en maintenant présent le gène d'intérêt dans la plante transgénique, sont donc d'un intérêt majeur.

Un certain nombre de techniques plus ou moins complexes ont été décrites pour l'élimination d'un gène marqueur de sélection intégré dans les chromosomes. Si le gène marqueur n'est pas lié génétiquement au gène d'intérêt, on peut espérer l'éliminer par des croisements et analyse de la descendance. Lorsque le marqueur de sélection est lié génétiquement, d'autres techniques comme celles basées sur l'utilisation d'éléments transposables (PCT/US91/04679; Yoder et al 1993) ou sur l'utilisation de systèmes de recombinaison à des sites spécifiques tels que le système cre/lox du bactériophage Pl ou le système FLP/FRT de la levure (FliPase recombinase; Lyzrik et al., 1997) peuvent être utilisées.

La recombinaison site-spécifique a également été appliquée à l'élimination d'un gène marqueur transplastomique par introduction dans le génome nucléaire de la plante d'un second transgène codant pour une protéine CRE adressée dans les chloroplastes grâce à son peptide de transit (EP1218488).

Chez les algues C. reinhardtii, des méthodes de sélection basées sur des mutants photosynthétiques ont permis l'introduction de gènes d'intérêt étrangers dans le génome plastidial sans l'utilisation de gènes marqueurs de sélection antibiotiques tels que aadA. Mais ces méthodes ne sont pas utilisables dans les plantes supérieures car ils se basent sur l'existence de mutants photosynthétiques.

Le phénomène de double recombinaison homologue qui est à la base de la transformation des génomes plastidiaux peut également servir à l'élimination subséquente d'une partie du transgène, notamment du marqueur de sélection. Le principe de cette élimination a été décrit chez Chlamydomonas (Fischer et al, 1996) et chez le tabac (WO 01/81600). La technique utilisée consiste à transformer le gènome plastidial avec une séquence d'acide nucléique comprenant le gène d'intérêt et un gène marqueur de sélection encadré par deux séquences d'ADN identiques, dans la même orientation, et suffisamment longues pour activer le système de recombinaison homologue. La sélection des événements de transformation se fait par culture sur un premier milieu de sélection correspondant au gène marqueur de sélection utilisé. Les cals sont propagés en milieu sélectif de façon à obtenir des plantes homoplasmiques dans lesquelles tous les génomes plastidiaux contiennent le gène marqueur de sélection et le gène d'intérêt. Les plantes et leur descendances sont ensuite cultivées en milieu non sélectif de façon à permettre l'excision du gène marqueur de sélection.

Un système permettant la sélection des plantes ayant éliminé le gène marqueur a été utilisé chez Arabidopsis, mais il s'adresse à une transformation du génome nucléaire (WO01/96583). Dans cette méthode, les plantes sont transformées en utilisant un vecteur qui comprend deux copies du gène d'intérêt dans la même orientation entourant un gène marqueur de sélection positive et un gène marqueur de sélection négative. Le gène marqueur de sélection positive permet la sélection des événements ayant incorporé dans leur génome le transgène. La présence des deux copies du gène d'intérêt permet par recombinaison homologue l'élimination des deux gènes marqueurs de sélection (positive et négative) ainsi qu'une des deux copies du gène d'intérêt. Les événements qui ont subi cette recombinaison homologue sont alors sélectionnés par culture sur le marqueur de sélection négative qui empêche la croissance des cellules qui ont toujours le gène marqueur de sélection correspondant. Un exemple d'un tel gène marqueur de sélection négative est CodA (Escherichia coli cytosine deaminase) qui déamine le 5-fluorocytosine (non-toxique) en 5- fluorouracile, toxique.

Dans le cadre de la présente demande, les auteurs ont réussi à mettre au point un procédé incluant lors d'une transformation plastidiale la sélection des plantes ayant éliminé le gène marqueur. Cette méthode permet d'obtenir de façon fiable des événements homoplasmiques pour la présence du gène d'intérêt et l'absence du marqueur de sélection, en particulier antibiotique. Cette méthode présente en outre l'avantage que l'expression du gène d'intérêt est corrélée à et dépendante de l'élimination du gène marqueur, et que cette élimination ne laisse pas subsister lors de la recombinaison d'ADN exogène autre que le gène d'intérêt. Cette méthode présente en plus le grand intérêt, lorsqu'un caractère sélectif est apporté par l'expression du gène d'intérêt, de favoriser et d'accélérer l'obtention de plantes homoplasmiques pour la présence du gène d'intérêt. Cela est le cas par exemple lorsque le gène d'intérêt est un gène de tolérance à des herbicides tels que les isoxaflutoles, le glyphosate ou la phosphinothricine (Basta).

Description des figures:

Figure 1: carte du plasmide pCLT146

Description détaillée de l'invention:

La présente invention a pour objet un procédé d'obtention de plantes transplastomiques exemptes de marqueur de sélection, en particulier antibiotique, comprenant au moins les étapes suivantes: a) transformation d'au moins une cellule végétale avec un vecteur adapté à la transformation des plastes comprenant dans le sens de la transcription une séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt, un gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection conférant une résistance à un agent de sélection, un fragment (iii) de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i), une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt; b) culture des cellules comprenant les plastes transformés sur un premier milieu comprenant l'agent de sélection; c) culture des cellules sur un second milieu ne comprenant pas l'agent de sélection Dans un mode de réalisation particulier, n représente au moins 25 nucléotides, de préférence au moins 30, de préférence au moins 50 nucléotides.

Par vecteur adapté à la transformation des plantes , on peut noter à titre d'exemple un 5 vecteur de transformation comprenant deux régions de recombinaison homologue du plastome de la plante, encadrant une construction génétique ou construit selon l'invention.

Ces régions, situées en amont (RRHG) et en aval (RRF-ID) du(des) gène(s) chimère(s) élémentaires, permettent la double recombinaison homologue avec une région intergénique du 10 plastome qui comprend les régions contigües RRHG et RRHD.

De façon préférentielle, les deux régions de recombinaison homologues selon l'invention correspondent à des séquences contigües permettant l'intégration du gène chimère dans une région intergénique du plastome. Dans un mode de réalisation particulier, cette région correspond à la région de l'opéron des ARN ribosomiques du plastome. Dans un autre mode de réalisation particulier, cette région intergénique comprend l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco, et que l'autre séquence homologue comprend à l'extrémité du gène 5' accD, codant pour une sous unité de l'acétyl-CoA-carboxylase. Et plus particulièrement, cette région intergénique comprend[ l'extrémité 3' du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco correspondant aux nucléotides 57755 à 59297 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana et que l'autre séquence homologue comprend l'extrémité 5' du gène accD correspondant aux nucléotides 59298 à 60526 du plastome de N. tabacum, cv. Petit Havana.

Par partie 3' restante du gène chimère d'intérêt on entend le fait que la juxtaposition dans 25 le sens de la transcription de la séquence (i) et de la séquence (iv) reconstitue le gène chimère d'intérêt dans sa totalité.

Par gène chimère d'intérêt on entend une séquence nucléotidique comprenant, liés entre eux de manière opérationnelle dans le sens de la transcription, une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plastes, une séquence codant pour une protéine d'intérêt, un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales.

Par gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection on entend une séquence nucléotidique comprenant, liés entre eux de manière opérationnelle dans le sens de la transcription, une séquence de régulation promotrice fonctionnelle dans les plastes, une séquence codant pour un marqueur de sélection, un terminateur fonctionnel dans les plastes de cellules végétales.

Par gène chimère, on entend généralement un gène pour lequel certains éléments ne sont pas présents dans le gène natif, mais ont été substitués à des éléments présents dans le gène natif ou ont été ajoutés.

Selon l'invention, le terme gène chimère pourra également correspondre au cas où tous les éléments du gène sont présents dans le gène natif, et alternativement, le terme gène pourra 1 o correspondre à un gène chimère.

D'autres éléments tels que les introns, enhancers, séquences de polyadénylation et dérivées, ayant pour rôle d'améliorer l'expression ou le fonctionnement du gène transformant, peuvent également être présents pour améliorer l'expression du gène.

L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère élémentaire sont liés entre eux de manière à ce que leur fonctionnement soit coordonné et permette l'expression de la séquence codante. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'assurer l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant 1[e gène chimère est essentiellement fonction de la plante et du type de plaste dans lesquelles ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans une plante donnée.

Parmi les promoteurs fonctionnels dans les plastes de cellules végétales utilisables pour mettre en oeuvre la présente invention, on peut noter à titre d'exemple le promoteur du gène psbA, codant pour la protéine Dl du PSII (Staub et al., 1993, EMBO Journal 12(2): 601-606), ou le promoteur constitutif de l'opéron des ARN ribosomaux, Prrn (Staub et al., 1992, Plant Cell 4: 39-45), ou le promoteur Prrn de Tabac associé à une portion 5' de la région 5' non-traduite du gène rbcL de tabac (Svab et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. 90: 913-917). D'une manière générale, tout promoteur issu d'un gène de plastome de plantes ou d'un gène de bactérie conviendra, et l'homme du métier saura faire le choix adéquat parmi les différents promoteurs disponibles de manière à obtenir un mode d'expression désiré (constitutif ou inductible).

Parmi les terminateurs fonctionnels dans les plastes de cellules végétales, on peut noter à titre d'exemple le terminateur du gène psbA, du gène rbcL codant pour la large sous-unité de la Rubisco, du gène rps16 codant une protéine ribosomale de tabac (Shinozaki et al., 1986; Staub et al., 1993).

Le gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection permet de sélectionner les plastes et les cellules effectivement transformées, c'est-à-dire celles ayant incorporé le(s) gène(s) chimère(s) dans leur plastome. La sélection des transformants est accomplie en cultivant les cellules ou tissus transformés sur un milieu contenant l'agent de sélection.

Les gènes marqueurs de sélection couramment utilisés incluent les gènes codant pour des gènes de résistance à des antibiotiques, des herbicides, ou à d'autres composés, qui peuvent être létaux pour les cellules, organelles ou tissus qui n'expriment pas le gène ou l'allèle de résistance. L'agent de sélection est alors l'antibiotique, l'herbicide ou le composé sélectif correspondant. Si celui-ci est létal pour la cellule, seules les cellules transformées vivront et se développeront sur ce milieu, alors que les cellules non transformées mourront. Si l'agent de sélection n'est pas létal pour la cellule, les cellules transformées et non transformées se distingueront pas un comportement différent qui pourra être mis en évidence. Un marqueur de sélection peut être non-létal au niveau cellulaire mais létal au niveau de l'organelle. Par exemple, l'antibiotique spectinomycine inhibe la traduction des ARNm en protéine dans les plastes, mais pas dans le cytoplasme. Les tissus contenant des plastes non-résistants seront blanchâtres, alors que les tissus contenant des plastes résistants seront verts. Dans une cellule en division contenant des plastes transformés et des plastes non-transformés, les plastes non-transformés disparaîtront sous la pression de la sélection au profit des plastes transformés et une population de cellules ne comprenant que des plastes transformés pourra être obtenue.

Par gène marqueur de sélection , on entend un gène codant pour un marqueur de sélection, ou un gène chimère codant pour un marqueur de sélection.

Parmi les gènes utilisables codant pour des marqueurs de sélection, on peut citer des gènes de résistance aux antibiotiques spectinomycinestreptomycine et kanamycine tel que, par exemple, les gènes chimères aadA codant une aminoglycoside 3"-adenylyltransférase (Svab et al., 1993) et neo codant pour une néomycine phosphotransférase (Carrer et al., 1993) respectivement, mais également un gène de tolérance au bétaïne aldéhyde tel que le gène codant la bétaïne aldéhyde déshydrogénase (Daniell et al., 2001), mais aussi des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18(4):1062) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate. On peut également utiliser des gènes rapporteurs codant pour des enzymes Io facilement identifiables comme l'enzyme GUS (13glucuronidase) (Staub et al., 1993) ou la GFP (green fluorescent protein) (Sidorov et al., 199?), des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, WO 97/04103 et WO 01/64023.

De manière préférentielle, le gène codant pour le marqueur de sélection est un gène de résistance à un antibiotique. Un gène préféré codant pour le marqueur de sélection est le gène aadA codant pour une amino glycoside 3"-adénylyltransférase conférant la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine (Svab et al., 1993).

Selon l'invention, le gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection est flanqué de part et d'autre des deux fragments d'un même gène chimère d'intérêt, de telle sorte que la juxtaposition, dans le sens de la transcription, de ces deux fragments reconstitue le gène chimère d'intérêt. Ces deux fragments sont la séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt et la séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt. En addition, un fragment de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i) est présent entre le gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection et la séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt. Ce fragment de n nucléotides correspond à l'extrémité 3' du premier fragment du gène d'intérêt flanqué à l'extrémité 5' du gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection, et est dupliqué à l'extrémité 5' du second fragment du gène d'intérêt flanqué à l'extrémité 3' du gène chimère comprenant une séquence codant pour le marqueur de sélection. De cette façon, une séquence répétée directe de n nucléotides du gène d'intérêt encadre le gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection. Ce fragment identique de n nucléotides doit être d'une taille permettant l'activation du système de recombinaison homologue entre les deux fragments identiques flanquant le gène chimère codant pour un marqueur de sélection. La recombinaison homologue entre ces deux fragments identiques provoque l'excision du gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection, ainsi que l'excision d'un des deux fragments identiques de n nucleotides, et conduit à la reconstitution d'un gène chimère d'intérêt complet et fonctionnel, lequel peut alors s'exprimer dans la cellule.

Le construit selon l'invention est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Il peut également être totalement ou partiellement synthétique et produit par des techniques conventionnelles de synthèses chimiques.

Une séquence répétée directe est une séquence d'acides nucléiques qui est dupliquée et dont la séquence dupliquée est orientée dans le même sens que la séquence originale, et non pas en sens inverse.

Préférentiellement, la séquence répétée de part et d'autre du gène chimère comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection est une séquence d'au moins 50 nucléotides, plus préférentiellement d'au moins 100 nucléotides.

Par "plantes transplastomiques", on entend selon l'invention des plantes ayant intégré de manière stable dans leur plastome un gène chimère fonctionnel dans les plastes, en particulier dans les chloroplastes. Le plastome est constitué par le génome des organites cellulaires autres que le noyau, en particulier le génome des chloroplastes.

La transformation des cellules peut s'effectuer par toute méthode de transformation de cellules végétales. Parmi les méthodes de transformation utilisables pour obtenir des cellules transformées selon l'invention, une de celles-ci consiste à mettre les cellules ou tissus des plantes à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et du vecteur de transformation (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Une autre méthode consiste à injecter directement les vecteurs dans les cellules ou les tissus par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). La transformation de cellules ou tissus végétaux peut également se faire à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16:357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28) génétiquement modifiés permettant ainsi l'adressage du T-DNA spécifiquement vers les plastes. De manière préférentielle, la transformation de cellules ou tissus végétaux par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750) .

Selon un mode de réalisation préféré du procédé selon l'invention, la méthode dite de bombardement de particules ou biolistique sera utilisée. Elle consiste à bombarder les tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs selon l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; US Patent No. 4,945,050).

Après transformation, une étape de sélection réalisée en utilisant un premier milieu de culture comprenant l'agent de sélection correspondant au gène marqueur de sélection utilisé, permet de sélectionner les événements de transformation ayant intégré 1' ADN exogène dans le génome plastidial. Par exemple, si le gène aadA est utilisé comme gène marqueur de sélection, le milieu de sélection utilisé comprendra de la spectinomycine et/ou de la streptomycine. Le matériel capable de croître sur ce milieu sera propagé et/ou régénéré en maintenant cette sélection spectinomycine et/ou streptomycine de façon à obtenir des tissus ou plantes qui contiendront l'ADN exogène dans l'ensemble des génomes plastidiaux.

Dans une étape suivante, les cellules ou tissus sélectionnés sur lepremier milieu de culture sont placés dans un second milieu, dit milieu non sélectif, pour permettre l'élimination du gène codant pour marqueur de sélection et l'obtention d'un gène d'intérêt complet et fonctionnel par recombinaison entre les séquences répétées. L'élimination du marqueur de sélection peut être mise en évidence en testant la sensibilité des cellules à l'agent de sélection, et/ou en testant l'expression du gène d'intérêt, et/ou par utilisation de techniques de biologie moléculaire telles que l'hybridation de type southern blot et la technique de PCR.

Par milieu non sélectif , on entend un milieu ne contenant pas l'agent de sélection.

Les milieux de culture utilisés sont bien connus de l'homme du métier, notamment ceux décrits dans Gamborg et al (1968, Exptl Cell Res 50,151-158) et Murashige et al (1962, Physiologia 5 Plantarum 15, 473-497) .

Un gène d'intérêt complet et fonctionnel désigne un gène d'intérêt capable d'être exprimé et de coder pour un peptide ou une protéine fonctionnelle. En outre, selon l'invention, il s'agit d'un gène qui a été reconstitué suite à l'excision du gène codant pour un marqueur de sélection par recombinaison homologue.

Le gène d'intérêt peut être tout gène apporté à la plante pour lui conférer un avantage particulier.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène d'intérêt code pour un peptide ou une protéine conférant un caractère sélectif, différent de celui apporté par le marqueur de sélection.

Dans ce mode particulier de réalisation, le procédé d'obtention de plantes transplastomiques selon l'invention peut avantageusement être favorisé par une étape de sélection supplémentaire sur un milieu comprenant un agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt.

Cette étape de sélection supplémentaire peut être réalisée conjointement à l'étape c) du procédé selon l'invention, les cellules étant alors cultivées sur un milieu ne comprenant pas l'agent de sélection correspondant au marqueur de sélection et comprenant l'agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt.

Alternativement, l'étape de sélection sur un milieu comprenant l'agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt est réalisée postérieurement à l'étape de culture sur un milieu ne comprenant pas l'agent de sélection correspondant au marqueur de sélection. Dans tous les cas, cette étape de sélection supplémentaire sur un milieu comprenant l'agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt est effectuée postérieurement à l'étape (b) de sélection sur le premier milieu comprenant l'agent de sélection correspondant au marqueur de sélection.

Dans ce mode particulier de réalisation, le procédé d'obtention de plantes transplastomiques exemptes du marqueur de sélection, en particulier antibiotique, comprend au moins les étapes suivantes: a) transformation d'au moins une cellule végétale avec un vecteur adapté à la transformation des plastes comprenant dans le sens de la transcription une séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif différent de celui apporté par le marqueur de sélection, un gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection conférant une résistance à un agent de sélection, un t o fragment (iii) de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i), une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt; b) culture des cellules comprenant les plastes transformés sur un premier milieu comprenant l'agent de sélection correspondant au marqueur de sélection; c) culture des cellules sur un second milieu ne comprenant pas l'agent de sélection correspondant au marqueur de sélection et comprenant l'agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt.

Dans un autre mode particulier de réalisation, une étape b') est réalisée entre l'étape b) et l'étape c) , cette étape b') consistant en la culture des cellules sur un troisième milieu ne comprenant ni l'agent de sélection correspond au gène marqueur, ni l'agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt.

Par gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif on entend un gène d'intérêt qui code pour un peptide ou une protéine qui confère un caractère particulier, permettant de sélectionner les cellules ou plastes qui expriment ce peptide ou cette protéine particulière à l'aide d'un agent de sélection correspondant à ce caractère particulier. Un tel gène est généralement un gène de résistance à un composé chimique létal pour les cellules végétales. D'une manière générale, tout gène ou groupe de gènes permettant de conférer une résistance à des cellules végétales vis-à-vis d'un composé chimique létal pour lesdites cellules peut être employé. En outre, la résistance audit composé chimique peut consister en une détoxication dudit composé par modification de sa structure, ladite modification conduisant à la suppression de l'effet létal dudit composé. Dans ce cas, le gène d'intérêt code généralement pour une enzyme de détoxication. Des exemples d'enzymes de détoxication sont les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899). La résistance peut également consister en une résistance par insensibilisation de la cible dudit composé. Dans ce cas, le gène d'intérêt code généralement pour une cible fonctionnelle modifiée, laquelle est rendue insensible au dit composé par modification de sa structure peptidique à l'aide de mutations, ajouts ou délétions d'acides aminés particulier. Des exemples d'enzymes fonctionnelles moins sensibles à l'herbicide ou à son métabolite actif sont les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S.R. et al, J. BIOL. Chem., 266,33, 1991; FR 2 736 926). La résistance peut également consister en la surexpression de l'enzyme sensible, de manière à produire dans la plante des quantités suffisantes d'enzyme cible au regard des constantes cinétiques de cette enzyme vis à vis de l'herbicide de manière à avoir suffisamment d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.

Selon un mode préféré de l'invention, le gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif est un gène de résistance à un herbicide.

De façon encore plus préférentielle, le gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif code pour une hydroxy-phényl pyruvate dioxygenases (HPPD).

Les hydroxy-phényl pyruvate dioxygénases (HPPD) sont des enzymes qui catalysent la réaction de transformation du para-hydroxy-phényl- pyruvate (HPP) en homogentisate 20 (Crouch N.P. & al., Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, 1997).

Par HPPD, on entend toute enzyme HPPD native, mutée ou chimère, présentant l'activité HPPD. De nombreuses HPPD sont décrites dans la littérature, notamment les HPPD de bactéries comme Pseudomonas (Rüetschi & al., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, WO 96/38567), de plantes comme d'Arabidopsis (WO 96/38567, Genebank AF047834) ou de carotte (WO 96/38567, Genebank 87257), de Coccicoides (Genebank COITRP) ou de mammifères comme l'homme, la souris ou le cochon.

Par HPPD mutée, on entend selon l'invention les HPPD mutées pour obtenir des propriétés de tolérance aux herbicides inhibiteurs d'HPPD améliorées par rapport à l'HPPD native correspondante. De manière avantageuse, l'HPPD mutée est une HPPD mutée dans sa partie C-terminale telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585. De manière avantageuse, l'HPPD mutée comprend la mutation W336 telle que décrite dans la demande de brevet WO 99/24585.

Par HPPD chimère, on entend une HPPD comprenant des éléments provenant de différentes HPPD, notamment les HPPD chimères décrites dans la demande de brevet WO 99/24586.

De manière avantageuse, l'HPPD est une HPPD de Pseudomonas fluorescens (WO 96/38567).

On connaît par ailleurs certaines molécules inhibitrices de cette enzyme, qui viennent se fixer à l'enzyme pour inhiber la transformation de l'HPP en homogentisate. Certaines de ces molécules ont trouvé un emploi comme herbicides, dans la mesure où l'inhibition de la réaction dans les plantes conduit à un blanchiment des feuilles des plantes traitées, et à la mort desdites plantes (Pallett K. E. et al. 1997 Pestic. Sei. 50 83-84). De tels herbicides ayant pour cible 1'HPPD décrits dans l'état de la technique sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole (IFT), herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles ou DKN (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano3-cyclopropyl-l-(2-SO2 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3-dione et la 2-cyano3-cyclopropyl-l-(2-SO2 CH3-4-2,3 C12 phényl) propane-1, 3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione ou encore les pyrazolinates.

Selon un autre mode de réalisation préférée de l'invention, le gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif code pour une 5- enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) L'EPSPS est une enzyme plastidiale impliquée dans la voie de biosynthèse du shikimate, conduisant à la synthèse des acides aminés aromatiques. L'EPSPS est connue pour être l'enzyme cible des herbicides de la famille des acides phosphoniques de type phophonométhylglycines.

Des séquences codant pour des EPSPS naturellement tolérantes, ou employées comme telles, vis-à-vis des herbicides de la famille des phophonométhylglycines, en particulier du glyphosate, sont connus. A titre d'exemple de gènes codant pour des enzymes EPSPS tolérante, on peut citer la séquence du gène AroA de la bactérie Salmonella typhimurium (Comai et al., 1983, Science 221, 370-371), la séquence du gène CP4 de la bactérie Agrobacterium sp. (WO 92/04449), ou les séquences des gènes codant l'EPSPS de Petunia (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), de Tomate (Gasser et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 4280-4289), ou d'Eleusine (WO 01/66704).

Des séquences codant pour des EPSPS rendues tolérantes au glyphosate par mutation sont également connus. A titre d'exemple, on peut citer les séquences des gènes codant des EPSPS mutées d'origine bactérienne (Stalker et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(8), 4724-4728), ou d'origine végétale (EP 0293358; Ruff et al., 1991, Plant Physiol. 96(S), Abstract 592; WO 91/04323; WO 92/06201; EP 0837944).

Selon un autre mode de réalisation préférée de l'invention, le gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif est le gène bar, qui confère la résistance à un herbicide tel que la phosphinothricine (Basta) (Lutz et al, 2001).

Selon l'invention, le gène marqueur de sélection est excisé par recombinaison, cette excision permettant la reconstitution du gène chimère d'intérêt complet, qui peut alors être exprimé et produire une protéine d'intérêt fonctionnelle. La sélection des plastes qui expriment le gène d'intérêt est accomplie en cultivant les cellules ou tissus transformés sur un milieu contenant un agent vis à vis duquel la production de ce peptide ou de cette protéine confère un avantage sélectif Lorsque les cellules se divisent, les plastes pour lesquels l'excision du marqueur de sélection ne se sera pas produite disparaîtront sous la pression de la sélection au profit des plastes pour lesquels l'excision du marqueur de sélection se sera produite et une population de cellules homoplasmiques pour la présence du gène d'intérêt et l'absence du marqueur de sélection pourra être obtenue plus rapidement qu'en absence de sélection basée sur la reconstitution du gène d'intérêt.

Par plantes, cellules ou tissus homoplasmiques , on entend des plantes, cellules ou tissus ne comprenant que des plastomes transformées, c'est à dire des plantes, cellules ou tissus qui ne comprennent pas de plastes sauvages.

L'invention concerne également une construction génétique ou construit comprenant dans le sens de la transcription une séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif différent de celui apporté par le marqueur de sélection, un gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection, un fragment (iii) de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i), une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le construit comprend dans le sens de la transcription une séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt conférant un caractère sélectif différent de celui apporté par le marqueur de sélection, un gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection, un fragment (iii) de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i), une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt, caractérisé en ce que la séquence (i) correspond à la partie 5' d'un gène chimère qui code pour un peptide ou une protéine conférant un caractère sélectif différend de celui apporté par le marqueur de sélection. De fait, la séquence (iv) correspond alors à la partie 3' restant de ce gène chimère d'intérêt qui code pour un peptide ou une protéine conférant un caractère sélectif différend de celui apporté par le marqueur de sélection.

Selon un mode préféré, le gène d'intérêt est un gène de résistance à un herbicide.

De façon encore plus préférentielle, le gène chimère d'intérêt code pour une hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenases (HPPD), pour une 5- enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase 20 (EPSPS), ou pour le gène bar.

L'invention concerne également un vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend un construit selon l'invention.

L'invention a également pour objet une cellule végétale transplastomique contenant un gène d'intérêt et sans marqueur de sélection antibiotique et susceptible d'être obtenue par l'une des méthodes précédemment décrites.

L'invention a également pour objet des plantes transplastomiques ou partie de ces plantes, et 30 la descendance de ces plantes, contenant un gène d'intérêt et sans marqueur de sélection antibiotique et susceptible d'être obtenue par l'une des méthodes précédemment décrites.

Les techniques de biologie moléculaire sont décrites dans Ausubel (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. (1994) : Maniatis T., Fritsch E. F. and Sambrook J. Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Les réactions de PCR sont réalisées dans un appareil Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600. Les réactions d'amplification pour chaque échantillon sont effectuées au cours de 30 cycles comportant différentes étapes: une étape de dénaturation à 94 C pendant une minute, une étape d'appariement de 45 secondes à une température de 50à 60 C, en fonction des amorces utilisées et une étape d'élongation à 72 C de 1 à 2 minutes selon la taille des produits PCR à amplifier. Ces cycles ont précédés d'une période de dénaturation à 94 C durant 5 minutes et suivis d'une période d'élongation finale de 5 minutes à 72 C. Une température de 4 C est appliquée après 30 cycles. Les produits PCR sont séparés sur gel d'agarose.

La position des différents fragments d'ADN issus du plastome de Nicotiana tabacum est indiquée conformément à la numérotation proposée par Shinozki et al., 1986 et repris dans Genebank sous le numéro d'accession Z00044.

L'invention sera plus particulièrement illustrée par les exemples qui suivent, étant entendu que ces exemples ne sont pas limitatifs.

Exemple 1: Construction d'un vecteur de transformation plastidial permettant 20 l'élimination du gène marqueur.

Le plasmide pCLT146 contient le gène chimère AADA-146 et deux gènes chimériques HPPD-146 incomplets, encadrés par deux fragments d'ADN, "RRHD" (Région de Recombinaison Homologue Droite) et "RRHG" (Région de Recombinaison Homologue Gauche), facilitant l'intégration de ces cassettes dans la région rbcL-accD du génome plastidial de tabac. Le fragment RRHG correspond à l'extrémité 3' du gène rbcL codant la large sous-unité de la Rubisco, et le fragment RRHD correspond à l'extrémité 5' du gène accD, ont été décrits dans le brevet FR 2848568-Al.

Le plasmide pCLT146 comprend dans le sens de la transcription une séquence (i) HPPD-146a correspondant à la partie 5' du gène chimère d'intérêt hppd, un gène chimère (ii) AADA-146 comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection, un fragment HPPD-146b comprenant la séquence (iii) identique à la partie 3' de la séquence (i) et la séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt hppd.

Le gène chimère AADA-146 est composée, de 5' en 3', du promoteur de l'opéron des ARN ribosomiques ("Prrn", nucléotides 102 564 à 102 680 du plastome de N. tabacum), d'une portion de la région 5' transcrite et non traduite du gène rbcL ("5'rbcL", nucléotides 57 577 à 57 594 du plastome de N. tabacum), de la séquence codante du gène aadA dont le produit confère la résistance à la spectinomycine (Svab and Maliga, 1993), et du terminateur du gène rps16 ("3' rpsl6" nucléotides 4930 à 5090 du plastome de N. tabacum). Elle est flanquée de part et d'autre de deux gènes chimères incomplets, HPPD-146a et HPPD-146b. HPPD-146a est située en 5' de AADA-146 et comprend de 5' en 3', le promoteur du gène psbA ("PpsbA ", FR 2848568-A1) et l'extrémité 5' du gène hppd de Pseudomonas fluorescens (WO9802562; séquence 1; nucléotides 1 à 579) (Fig. 1). HPPD- 146b est positionnée en 3' de AADA-146 et comporte, de 5' en 3', une séquence (iii) identique à l'extrémité 3' de HPPD-146a et correspondant aux nucléotides 177 à 579 sur la région codante du gène hppd, une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante de la séquence codante du gène hppd (nucléotides 580 à 1077) et au terminateur du gène psb,uA ("3 psbAA", FR 2848568-A1). La présence de part et d'autre de la cassette AADA-146 d'une séquence identique (iii) en répétition directe, permet l'élimination par recombinaison homologue du gène chimère marqueur AADA-146 et la reconstitution du gène chimère d'intérêt HPPD-146 clans sa totalité.

Exemple 2: transformation par biolistique des génomes plastidiaux de tabac.

Des plants de Nicotiana tabacum c.v. 'Petit Havana' sont cultivés en conditions stériles sur un milieu MS (Murashige T. and Skoog F., 1962) plus Vitamine Gamborg B5 (Kalys M231-1) et saccharose (30 g/1). Des feuilles de 3 à 5 cm sont bombardées sur leur face inférieure en utilisant un canon selon la technique de Finer et al. (1992), le "PIG" (Particule Inflow Gun). Les micro-projectiles d'or (particules de 0,6 m) sont complexés à l'ADN (5 g/ tir) en présence de CaCl2 (0,8 à 1 M) et de spermidine (14 à 16 mM). Les feuilles bombardées sont ensuite placées de manière à disposer la face inférieure bombardée sur un milieu MS supplémenté avec 0,05 mg/1 d'acide a-naphtalène acétique (ANA; Sigma), 2 mg/1 de 6-benzylaminopurine (BAP; Sigma), 30 g/1 de saccharose et 7g/1 de phytagar (milieu MS 0,05-2). Deux à trois jours après le bombardement les feuilles bombardées sont découpées en carrés de 5 mm de côtés (comme décrit dans le brevet FR 2848568-A1) et placées, toujours face inférieure sur un milieu MS 0,05-2 contenant 500 mg/1 de spectinomycine dihydrochloride. Les cals et les pousses résistants à la spectinomycine sont régénérées sur le même milieu et sont enracinés sur un milieu contenant 1/2 MS, 15 g/1 de saccharose et 500 mg/1 de spectinomycine pour obtenir les plantes T'0 (correspondant à un premier cycle de régénération appelé RI). De manière à favoriser le processus d'élimination, un deuxième cycle de régénération est réalisé sur un milieu MS 0,05-2 sans agent de sélection. Les pousses régénérées (appelées évènements R2) sont enracinées sur un milieu contenant '/2 MS, 15 g/l de saccharose et différentes concentrations de DKN. Les plantes TOR1 et TOR2 sont transférées en serre. Les premières générations de graines (issues des plantes TOR1 ou TOR2) sont des générations T 1.

Exemple 3: Obtention et analyses moléculaires de lignées transplastomiques CLT146 Des feuilles de tabac N. tabacum (cv. Petit Havana) ont été bombardées avec les plasmides pCLT146 dans les conditions expérimentales décrites dans l'exemple 2. La première étape de sélection des cals transformés a été effectuée sur spectinomycine (500 mg/1) dans un premier temps (cf exemple 2). 13 évènements tolérants à la spectinomycine (CLT146-1 à-13) ont été obtenus après une expérience de 20 tirs.

L'identification des lignées transplastomiques parmi les 13 évènements tolérants a été réalisée par PCR en dessinant des amorces spécifiques pour identifier l'intégration des gènes chimères AADA-146 et HPPD-146 dans le plastome. Les amorces sont choisies de façon à avoir une amorce qui s'hybride dans le génome plastidial natif, adjacent au point d'intégration tandis que l'autre amorce s'hybride sur le gène chimère. Les amorces suivantes: ORBCL52 (5'-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3') et psbA176R (5'-catcagggactcccaagcacactag-3'), qui s'hybrident respectivement au niveau du gène rbcL sur le plastome (nucléotides 57595 à 57620) et au niveau du promoteur PpsbA du gène chimère HPPD-146, ont été choisies. Un produit PCR de taille correspondant au fragment attendu a été observé uniquement dans les lignées transplastomiques et pas dans les plantes de tabac sauvages non bombardées. Les 13 évènements tolérants à la spectinomycine issus de la transformation avec le pCLT146 montrent tous une insertion des gènes chimériques dans le plastome de tabac.

La présence des deux gènes chimériques dans les évènements transplastomiques a été vérifié par analyse PCR. Les amorces OAAN5 (5'gaagcttccatggcagaagcggtgatcgccgaag-3') et OAAXba3 (5'actagttctagattatttgccgactaccttggtgatctcgcc-3') s'hybridant au niveau de l'extrémité 5' et 3', respectivement, de la région codante du gène aadA ont permis d'amplifier un produit PCR de 784 pb dans tous les évènements transplastomiques CLT146. Le couple d'amorces HPPD+ (5'caacagcatcgcctcctactttgcg-3') s'hybridant dans la séquence (i) juste en amont de la séquence (iii) et HPPD- (5'-ttcacggaagttgaacaatttctcg-3') dans l'extrémité 3' de la séquence (iii), conduit à l'amplification à partir d'ADN total de deux produits PCR attendus: un fragment d'ADN de 1876 pb correspondant au transplastome contenant le gène chimérique HPPD- 146 disrupté par le gène chimère AADA-146 ainsi qu'un produit PCR de 373 pb correspondant à la séquence (iii).

Le phénomène d'élimination de gène marqueur par recombinaison homologue a pu être mise en évidence par PCR en utilisant le couples d'oligonucléotides psbA230F (5'- tttgtagaaaactagtgtgcttggg-3') et 3'psbA (5'-ttgctcctttcttttcaaaacctcc-3') qui se fixent respectivement sur le promoteur PpsbA et le terminateur 3'psbA. Deux produits PCR ont été observés: un fragment d'ADN de 2689 pb correspondant au transplastome contenant le gène chimérique HPPD-146 disrupté par le gène AADA-146, ainsi qu'un produit PCR de 1186 pb correspondant au transplastome qui auraient potentiellement éliminé le gène chimère AADA- 146 par recombinaison homologue et reconstitué le gène hppd.

Exemple 4: Elimination du gène marqueur de sélection dans les lignées transplastomiques CLT146 et évaluation de la tolérance au DKN in vitro des lignées transplastomiques La sélection initiale des évènements transplastomiques ayant intégré le gène chimère AADA-146 est réalisée sur un milieu contenant de la spectinomycine. A partir de chaque plante transplastomique TOR1 régénérée sur spectinomycine, des morceaux de feuilles ont été découpés et placés sur un milieu de régénération M:S 0, 05-2 sans agent de sélection pendant environ un mois. Cette dernière étape permet de régénérer des plantes transplastomiques (TOR2) dans lesquelles les plastomes transgéniques ont non seulement éliminés, au cours des divisions cellulaires, l'AADA-146 par recombinaison homologue, mais ont acquis un gène chimère hppd reconstitué et fonctionnelle. La tolérance des plantules transplastomiques TOR2 de différentes lignées a ensuite été évaluée in vitro par repiquage sur un milieu d'enracinement contenant 1 ppm de DKN. Pour chaque lignée transplastomique testée, certaines plantules sont parfaitement tolérantes à 1 ppm DKN, contrairement aux plantes sauvages. Ces plantes restent vertes et présentent une croissance et un enracinement normal. Aucun symptôme de phytotoxicité n'est observé.

Exemple 5: Tolérance au DKN dans la descendance T1 des plantes transplastomiques 30 TOR1 500 graines environ des évènements CLT146-1,-2,3 correspondant aux générations T1, collectées de plantes transplastomiques TOR1 auto-fécondées sont semées sur des milieux de germination MS 1 /21 /2 en présence de DKN à 10 ppm. Des plantules présentant un phénotype vert normal ont été obtenus et possèdent donc des plastes dans lesquels le gène chimère AADA-146 a été éliminé.

Exemple 6: Analyses Western des plantes transplastomiques CLT146 Dans le but de détecter de la protéine HPPD reconstituée après élimination, des extraits protéiques de feuilles issus des plantes de tabacs sauvages, transplastomiques CLT146-1,-2 (TO) ont été séparés sur gel d'acrylamide en conditions dénaturantes, transférés sur membrane de nitrocellulose et incubés avec un anticorps primaire anti-HPPD monoclonal spécifique de l'HPPD de P. fluorescens. L'analyse Western Blot montre une bande d'environ 40 kDa, de taille identique à la protéine HPPD purifiée de référence, présente dans les extraits CLT146, mais non révélée dans l'extrait protéique de tabac sauvage.

Les analyses Western et les tests de tolérances au DKN démontrent que l'élimination du gène marqueur aadA a bien eu lieu par recombinaison homologue résultant en la production de protéines HPPD reconstituées et fonctionnelles dans les lignées transplastomiques CLT146. :23

BIBLIOGRAPHIE

* Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660 * Bevan and Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16: 357-384 * Boynton J.E., Gillham N.W., Harris E.H., Hosler J.P., Jones A.R., Randolph-Anderson 5 B.L., Robertson D., Klein T.M., and Shark K.B. (1988). Science 240, 1534-1538.

* Bruce et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696 * Carrer H. et al. (1993) Mol.Gen. Genet. 241: 49-56.

* Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115 * Chaudhuri S. (1999). WO 00/39313 1 o * Cornai et al, 1983, Science 221: 370-371 * Crouch et al, Tetrahedron, 1997, 53, 20, 6993-7010 * Daniell H., Datta R., Varma S., Gray S., and Lee S.B. (1998). Nat. Biotechnol. 16 (4) :345-348.

* Daniell H. et al. (2001) Curr Genet. 39: 109-116 * De Cosa B., Moar W., Lee S.B., Miller M., and Daniell H. (2001). Nat. Biotechnol. 19 (1):71-74.

* Fischer N., Stampacchia O., Redding K., and Rochaix J.D. (1996). Mol. Gen. Genet. 251:373-380.

* Gasser et al, 1988, J. Biol. Chem., 263: 4280-4289 * Gamborg et al, 1968, Exptl Cell Res 50, 151-158 * Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33(2) , 121-136 * Ishida et al, 1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750 * Khan M. S. and Maliga P. (1999). Nat. Biotechnol. 17, 910-915 * Klein et al, 1992, Biotechnology 10(3), 286-291 * Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173 * Lutz K.A., Knapp J.E., and Maliga P. (2001). Plant Physiol. 125 (4) :1585-1590. * McBride K.E., Svab Z., Schaaf D.J., Hogan P.S., Stalker D.M., and Maliga

P. (1995). Biotechnology 13 (4):362-365.

* Murashige et al, 1962, Physiologia Plantarum 15, 473-497 * Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517 * Padgette S.R. et al, 1991, J. Biol. Chem., 266: 33 * Pallett et al, 1997, pestc. Sci. 50: 83-84 * Rüetschi et al, Eur. J. Biochem. 1992, 205, 459-466 * Ruf et al, 1991, Plant Physiol. 96(S) Abstract 592 * Ruf S., Hermann M., Berger I.J., Carrer I-I., and Bock R. (2001). Nat. Biotechnol. 19 (9):870-875.

* Shah et al, 1986, Science 233: 478-481 * Shaw et al, 1983, Gene 23(3) : 315-330 * Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62 * Shinozaki K., Ohme M., Tanaka M., Wakasugi T., Hayashida N., Matsubayashi T., Zaita N., Chunwongse J., Obokata J., Yamaguchi-Shinozaki K., Ohto C., Torasawa K., Meng B.Y., Sugita M., Deno H., Kamogashira T., Yamada K., Kusuda J., Takaiwa F., Kato A., Tohdoh N., Shimada H., and Suguiara M. (1986). EMBO J. 5:2043-2049 * Sidorov V.A., Kasten D., Pang S. Z., Hajdukiewicz P.T., Staub J.M., and Nehra N.S. (1999). Plant J. 19(2) :209-216.

* Sikdar S. R., et al. (1998). Plant Cell Reports 18:20-24.

* Stalker et al, 1985, J. Biol. Chem. 260(8), 4724-4728 * Staub et al, 1992, Plant Cell 4:39-45 * Staub et al, 1993, EMBO Journal 12(2) : 601-606 * Staub J.M., Garcia B., Graves J., Hajdukiewicz P.T., Hunter P., Nehra N., Paradkar V., Schlitter M., Carroll J.A., Spatola L., Ward D., Ye G., and Russell D.A. (2000).. Nat. Biotechnol. 18 (3):333-338.

* Svab Z., Hajdukiewicz P., and Maliga P. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 20 (21):8526-8530.

* Svab et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 913-917 * Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28 * White et al, 1990, Nucleic Acid Res. 18(4) : 1062 * Ye G.N., Hajdukiewicz P.T., Broyles D., Rodriguez D., Xu C.W., Nehra N., and Staub 25 J.M. (2001). Plant J. 25 (3) :261-270.

* Yoder et al, 1993 * Lyzrik et al, 1997

Claims (15)

REVENDICATIONS

1) Procédé d'obtention d'une plante transplastomique exempte de marqueur de sélection comprenant les étapes suivantes: a) transformation d'au moins une cellule végétale avec un vecteur adapté à la transformation des plastes comprenant dans le sens de la transcription une séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt, un gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection conférant une résistance à un agent de sélection, un fragment (iii) de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i), une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt; b) culture des cellules comprenant les plastes transformés sur un premier milieu comprenant l'agent de sélection; c) culture des cellules sur un second milieu ne comprenant pas l'agent de sélection

2) Procédé d'obtention d'une plante transplastomique exempte du gène marqueur de sélection selon la revendication 1 caractérisé en ce que la séquence (i) correspond à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt qui confère un caractère sélectif différent de celui apporté par le marqueur de sélection, et en ce que le second milieu utilisé dans l'étape c) comprend de façon additionnelle un agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt.

3) Procédé d'obtention d'une plante transplastomique exempte du gène marqueur de sélection selon la revendication 2 caractérisé en ce que le procédé comprend une étape supplémentaire entre l'étape b) et l'étape c) consistant en une culture des cellules comprenant les plastes transformés sur un troisième milieu ne comprenant ni l'agent de sélection correspondant au marqueur de sélection, ni l'agent de sélection correspondant au gène chimère d'intérêt.

4) Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle le gène marqueur de sélection confère une résistance à un antibiotique

5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle le gène marqueur de sélection code pour une aminoglycoside 3-adenylyltransferase

6) Procédé selon l'une des revendications là 3, dans laquelle le gène marqueur de sélection confère une résistance au betaïne aldehyde.

7) Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle le gène d'intérêt code pour une protéine conférant une résistance à un herbicide.

8) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le gène d'intérêt code pour une hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD)

9) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le gène d'intérêt code pour une 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS)

10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le gène d'intérêt est le gène 15 bar.

11) Construit comprenant dans le sens de la transcription une séquence (i) correspondant à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt, un gène chimère (ii) comprenant une séquence codant pour un marqueur de sélection, un fragment (iii) de n nucléotides identique à la partie 3' de la séquence (i), une séquence (iv) correspondant à la partie 3' restante du gène chimère d'intérêt.

12) Construit selon la revendication 11) caractérisé en ce que la séquence (i) correspond à la partie 5' d'un gène chimère d'intérêt qui code pour une protéine ou un peptide qui confère un caractère sélectif différend de celui apporté par le marqueur de sélection.

13) Vecteur de transformation adapté à la transformation des plastes de plante caractérisé en ce qu'il comprend un construit selon l'une des revendications 11 ou 12.

14) Cellule végétale transplastomique contenant un gène d'intérêt et exempte de marqueur de 30 sélection susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications là 10

15) Plante transplastomique ou partie de cette plante, et la descendance de cette plante, contenant un gène d'intérêt et exempte de marqueur de sélection susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une des revendications 1 à 10.