FR2838749A1

FR2838749A1 - Proteines insecticides photorhabdus luminescens

Info

Publication number: FR2838749A1
Application number: FR0204798A
Authority: FR
Inventors: Eric Duchaud; Frank Kunst; Philippe Glaser; Carmen Buchrieser; Lionel Frangeul; Farid Chetouani; Christophe Rusniok; Sead Taourit; Le Roux Christina Nelsen; Noel Boemare
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Aventis CropScience SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Recherche Agronomique INRA; Bayer CropScience SA
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2003-10-24
Anticipated expiration: 2022-04-17
Also published as: AU2003246842A1; AU2003246842A8; FR2838749B1; WO2003087377A1; WO2003087377A9

Abstract

Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N°2 ou SEQ ID N°4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.

Description

L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, des procédés d'obtention de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes, des plantes transformées exprimant de telles toxines.

De très nombreux types d'insectes sont à l'origine de graves dégâts sur les plantes de grande culture, notamment céréalières, florales, fruitières. Il existe un très grand nombre d'agents insecticides chimiques destinés à lutter contre les insectes.

Toutefois certains des produits existants posent des problèmes de sélectivité contre telle ou telle catégorie d'insectes et de résistance contre ces substances.

Différentes techniques alternatives ont été développées, en particulier la lutte biologique par d'autres insectes ou par des agents biologiques tels que des bactéries capables de produire des toxines insecticides. On connaît également des plantes transgéniques exprimant de telles toxines insecticides.

Par exemple le document WO 99/54472 décrit des toxines insecticides isolées de Xenorhabdus nematophilus, et des séquences nucléotidiques codant pour de telles toxines.

Le document US 6 281 413 décrit des toxines insecticides isolées de Photorhabdus luminescens. Photorhabdus luminescens est une bactérie entomopathogène, commensale intestinale d'un nématode du genre Heterorhabditis. Ces nématodes colonisent les larves d'insectes qu'ils détruisent et sur lesquelles ils se développent.

Il existe toujours un besoin important de trouver des toxines efficaces contre les insectes nuisibles, en particulier contre des lépidoptères. L'invention vise à obtenir des plantes et/ou des compositions contenant de telles toxines capables d'inactiver ou de détruire des insectes. L'invention concerne également l'utilisation de telles toxines, pour des traitements-préventifs ou curatifs- des cultures contre des ravageurs.

A cet effet, les inventeurs ont réussi à identifier à l'aide d'une banque de BAC (chromosome artificiel bactérien), préparée à partir de Photorhabdus luminescens, des séquences nucléotidiques codant pour des toxines insecticides particulièrement

efficaces contre des lépidoptères appartenant notamment aux genres Plutella, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Ostrinia.

A cet effet l'invention a pour objet selon un premier aspect une séquence nucléotidique isolée de Photorhabdus luminescens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actifcontre des insectes.

La séquence SEQ ID N 2 correspond aux nucléotides nt 20872 à nt 21306 de la séquence SEQ ID N 1 qui est la séquence nucléotidique d'un BAC, désigné BAC 8C11, déposé à la CNCM sous le numéro 1-2700. Le BAC 8C11 est un fragment d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens subsp.laumondii, souche TT01 (Fischer - Le Saux M. et al.1998 - Appl. Environ. Microbiol., vol 64,4246), cloné dans le vecteur pBeloBACll (Kim V. J et al. 1996 Genomics, vol 34,213) dans la bactérie E.coli DH10B TH (Calvin N. M. and Hanawalt P. C, 1998, J. Bacteriol, 170, 2796).

La séquence SEQ ID N 4 correspond aux nucléotides nt 21345 à nt 22598 de la séquence SEQ ID N 1 de ce BAC8C11.

L'invention concerne également les séquences nucléotidiques choisies parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70% d'identité avec
SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie ena)oub); d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c), d'au moins 10 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e) ; ladite séquence codant pour au moins un polypeptide actifcontre des insectes.

Dans le présent document, on utilisera l'expression séquence nucléotidique à expression insecticide pour désigner ces séquences nucléotidiques SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, et les séquences variants définies en a) à f).

La séquence SEQ ID n 2 est la séquence nucléotidique d'un cadre ouvert de lecture désigné ORF1 (435 nucléotides) et code pour la protéine de 144 acides aminés de séquence SEQ ID N 3.

La séquence SEQ ID N 4 est la séquence nucléotidique d'un cadre ouvert de lecture désigné ORF2 (1254 nucléotides) et code pour une protéine de 417 acides aminés de séquence SEQ ID N 5.

Les séquences SEQ ID N 2, SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5 se distinguent nettement de l'art antérieur. Aucune similarité significative n'a été identifiée, en utilisant par exemple le programme BESTFIT connu de l'homme du métier, entre ces séquences et les séquences SEQ ID N 12,13,14 du document US 6 281 413.

Seule une faible similarité (inférieure à 50%) entre la séquence SEQ ID N 3, et la protéines codées par l'ORF 1 du document W099/54472 (SEQ ID N 2, SEQ ID N 5, SEQ ID n 9, SEQ ID N 13) a été notée.

De même, seule une faible similarité (inférieure à 50%) entre la séquence SEQ ID N 5, et les protéines codées par l'ORF 2 du document W099/54472 (SEQ ID N 3, SEQ ID N 7, SEQ ID N 11, SEQ ID N 14) a été notée.

Par l'expression activité insecticide ou composé actif contre des insectes , on entend que les toxines sont capables de lutter contre des insectes, en les tuant ou en les inactivant par exemple par une baisse ou une perte d'appétit vis-à-vis des plantes d'intérêt cultivées. Le résultat est typiquement la destruction, ou la baisse de croissance et/ou de la reproduction de l'insecte nuisible cible. Par insecticide, on entend également biopesticide .

La liste d'insectes lépidoptères ci-dessus n'est pas exhaustive : l'efficacité insecticide des séquences selon l'invention sur d'autres insectes peut être criblée sans effort excessif par l'homme du métier, maintenant que sont connus le BAC8C11 et le protocole de test d'activité biologique, notamment à l'aide des techniques appropriée présentées dans la description détaillée, en particulier de l'exemple 2. Des tests semblables, utilisant par exemple une autre espèce d'insecte cible, permettent également de mesurer ladite activité insecticide.

Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels.

Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère des séquences nucléotidiques comprenant SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 (en particulier qui diffère des séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4), par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues possèdent une activité insecticide telle que décrite précédemment. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 70, 75 % des séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, de préférence au moins 80,85 %, de préférence encore au moins 90,92, 95,98,99%.

Par pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends Guide, 1998 :5 : 7-9, notamment les algorithmes de Karlin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifié dans Karlin et Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873-5877. pourra utiliser en particulier les programmes : -BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucléotide séquences", FEMS Microbiol Lett.

174 :247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.

25 (17) : 3389-3402), -FASTA (Altschul S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410), , -Clustal W (Thompson, J. D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-80), -BESTFIT.

L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBI http : ww.ncbi.nih.gov.

De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire d'une séquence codant pour une toxine insecticide, dans des conditions stringentes. On utilisera par exemple les conditions suivantes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20mM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCI + 0. 015 M de citrate de sodium), 50% de formamide, 7% de sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5% de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 42 C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2X SSC + 2% SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0.1X SSC + 0.1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0.1 X SSC + 0.1% SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille supérieur à 100 nucléotides.

Les conditions d'hybridations de fortes stringences décrites ci-dessus peuvent être adaptées par l'homme du métier pour les polynucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon les enseignements appropriés connus de l'homme du métier, notamment décrit dans Sambrook et al., (1989, Molecular cloning, A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N. Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter
2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y.)
Par fragment nucléotidique , on entend d'une part tout fragment d'une séquence nucléotidique comprenant SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 (et en particulier tout fragment de SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4), ou tout fragment de séquences homologues à ces séquences, lesdits fragments codant pour un peptide à activité

insecticide telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 10,15, 30,45, 75,150, 300 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus. Ces fragments nucléotidiques codent pour des peptides présentant une activité insecticide de préférence d'au moins 10,20, 30,50, 80,90%, voire plus de 100%, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5 codées par les séquences à expression insecticide SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4. Pour tester cette activité insecticide, l'homme du métier dispose notamment de la méthode présentée dans les exemples détaillés décrits ci-après. Le présent document enseigne ainsi à l'homme du métier d'utiliser également les fragments ou les homologues définis précédemment, notamment d'utiliser les éléments fonctionnels de ces séquences qui déterminent l'expression insecticide, et donc de ne pas utiliser nécessairement les éléments non essentiels à cette expression. L'invention concerne ainsi selon un aspect les séquences nucléotidiques qui comprennent au moins un tel fragment et ont une activité insecticide.

Par fragments représentatifs selon l'invention on entend également des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques d'amplification du type PCR (décrite par exemple dans le document US 4,683,202) ou PCR like, comme par exemple les techniques connues de l'homme du métier SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription-based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction). Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant au moins 10 bases, de préférence au moins 15,30 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible.

De telles sondes seront en particulier utilisables dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'intégration du gène de la toxine dans la plante transformée. Pour cela au moins une de ces sondes est marquée, par exemple par un isotope radioactif, puis mise en contact avec de l'ADN génomique de

la plante, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de la sonde marquée à l'ADN en question.

Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue typiquement par mutagénèse selon des techniques appropriées, et comportant des modifications par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, ou de séquences variantes (séquences nucléotidiques définies a) à e) précédemment) . Ces modifications peuvent entraîner selon une variante préférée une augmentation du niveau d'expression insecticide. On peut par exemple utiliser la mutagenèse dirigée site spécifique, décrite dans Upender et al., 1995, Biotechniques 18(1):29-30, ou des techniques de mutagénèse du type DNA shuffling décrite dans le document US 5 605 793. On peut par exemple obtenir des séquences mutées de SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, par délétions, et cribler des mutants actifs pour identifier des régions toutes particulièrement associées au niveau d'activité insecticide.

L'invention concerne selon un autre aspect un polypeptide insecticide codé par une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment.

L'invention concerne également les polypeptides choisis parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins
80 %, de préférence au moins 85 %, 87 %, 90 %, 95 % , 97 % 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15,20, 23,25, 30,40, 50,100 amino-acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), ou b); d) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c) ; ledit polypeptide ayant une activité insecticide telle que décrite précédemment.

On emploie dans ce texte indifféremment le terme polypeptide insecticide ou toxine insecticide pour désigner un polypeptide selon l'invention ayant une activité insecticide (plus exactement biopesticide) telle que décrite précédemment. Le terme polypeptide est utilisé pour désigner également une protéine ou un peptide.

De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ou d'une séquence possédant au moins 80 %

d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.

Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 20,25, 30,40, 50,100 amino-acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l' invention.

Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés équivalents .

L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles souhaitées, en l'occurrence n'entraînant pas une perte de l'activité insecticide. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides. Un

polypeptide variant, un polypeptide homologue ou un fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence au moins 20,30, 50, 80 , 90%, voire plus de 100,120, 150%, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5.

L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides tels que décrits précédemment.

L'invention concerne selon un autre aspect une cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle dans la plante transformée à une séquence nucléotidique selon l'invention codant pour une toxine insecticide, et à une région de terminaison de la transcription. La préparation d'une cassette d'expression ADN peut être réalisée de différentes manières appropriées par l'homme du métier. Brièvement, au moins une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que définie précédemment, peut être clonée en aval du promoteur en utilisant des enzymes de restriction pour assurer son insertion dans une orientation appropriée au regard du promoteur de manière qu'il soit exprimé. Une fois cette séquence liée opérationnellement au promoteur, la cassette d'expression ainsi formée peut être clonée dans un plasmide ou autre vecteur. La séquence promoteur contrôle la transcription en un ARN messager fonctionnel codant pour d'une protéine insecticide. La cassette d'expression peut être chimérique ou naturelle, mais typiquement elle est hétérologue vis-à-vis de l'hôte, ce qui implique l'introduction dans l'hôte par une transformation. On connaît un grand nombre de promoteurs de plantes, rappelés notamment dans le document WO01/70778. On peut utiliser un promoteur constitutif ou inductible, un promoteur spécifique d'un tissu, d'un organe, d'un stade de développement, par exemple spécifique du phloème afin de lutter contre des insectes qui prélèvent la sève élaborée.

Selon un mode de réalisation l'expression du gène d'intérêt est régulée, en plus de par la séquence promoteur, par l'utilisation de séquences appropriées capables de renforcer l'activité de cette séquence promoteur, telles que des introns, par exemple l'intron de l'actine 1 ou 2, l'intron DSV de la mosaïque jaune du tabac (Morris et al.

(1992), Virology, 187 :633), des séquences enhancers , par exemple certains éléments du promoteur CaMV35S et de gènes de l'octopine synthase (US 5 290 924), des séquences leaders (typiquement des séquences situées entre le site

d'initiation de la transcription et le début de la séquence codante, en particulier des séquences leader consensus qui stabilisent l'ARNm et empêchent une initiation inappropriée de la transcription), par exemple le leader EMCV (Leroy-Stein et al., 1989, PNAS USA, 86 : 6126-6130), le leader TMV (Gallie et al., 1989, Molecular Biology of RNA, pages 237-256). Parmi les séquences terminateurs, on peut citer le terminateur nos (réf: Bevan et al.,1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), et le terminateur de gène d'histone (EPO 633 317).

Selon une variante, la cassette d'expression contient des séquences d'adressage subcellulaire, en particulier une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion de la protéine, ou une séquence codant pour un peptide de transit adressant la toxine dans les chloroplastes (par exemple le peptide de transit optimisé décrit EP 0 508 909).

Selon un autre aspect l'invention concerne un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une cassette d'expression telle que décrite précédemment. Selon une réalisation le vecteur est un type virus et comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'invention, liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié.

Selon un autre aspect l'invention concerne une cellule hôte transformée avec les séquences nucléiques décrites ci-dessus.

Selon un autre aspect l'invention concerne une cellule hôte comprenant une telle cassette d'expression. Typiquement l'organisme hôte est une bactérie, une levure, une cellule de plante, un champignon.

Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide mettant en #uvre au moins un vecteur ou une cellule tels que décrits précédemment. L'invention concerne aussi un polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par ce procédé.

Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide synthétique utilisant une séquence d'acides aminés d'un polypeptide insecticide tel que défini précédemment.

Selon un autre aspect l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique, d'un vecteur, d'une cellule hôte tels que décrit précédemment pour la

biosynthèse de polypeptides insecticides. Le terme une fait bien entendu référence à au moins une .

Selon un autre aspect l'invention concerne les séquences nucléotidiques selon l'invention, enregistrées sur un support, dénommé support d'enregistrement, dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et l'exploitation desdites séquences.

On pourra préférer parmi ces supports des supports lisibles par un ordinateur, tels que les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides comme par exemple les disquettes ou disques floppy , les CD ROM ou les cassettes d'enregistrement.

Selon un autre aspect l'invention concerne les cellules végétales transformées par un vecteur tel que défini précédemment.

La transformation des plantes peut être obtenue par différentes techniques appropriées connues de l'homme du métier, notamment rappelées dans les références : Ed. DUNOD Physiologie végétale, Tome 2 Développement Heller, Esnault et Lance, 2000, Methods of Molecular Biology : Plantgene transfer and expression protocols, Hansen et al., 1999, Recent advances in the transformation of plants, Trends in plant science, vol 4, n 6, 226, S.B.Gelvin, The introduction and expression of transgenes in plants, Current opinion in biotechnology, 1998,227, Hellens et al., 2000, Trends in plant science, vol 5, n 10, A guide to Agrobacterium binary Ti Vectors, 446, Franken et al., Recombinant proteins from transgenic plants, Current opinion in biotechnology, 8 :411-416, et al., 1998, Insect-resistant transgenic plants, Tibtech, vol 16,168, Michelmore.M, 2000, Genomic approaches to plant disease résistance, Current opinion in biotechnology, 3:125-131.

Le terme transformation fait référence à une manipulation génétique de cellules végétales susceptibles d'être transformées tels que des cellules de cals, d'embryons, des cellules en suspension dans des cultures (cultures issues par exemple de cals, d'embryons, de tissus de feuilles, d'inflorescences jeunes, d'anthères) des plantes. Le terme "transgénique" ou "transformée" en référence à une cellule de plante, une partie de plante, fait référence à ces éléments comprenant un segment d'ADN (de manière préférée une séquence nucléotidique ou une cassette d'expression selon l'invention) présélectionné isolé purifié qui a été introduit dans ledit élément par une méthode de transformation génétique.

On citera notamment : la transformation de protoplastes, les techniques biolistiques ou de bombardement de microprojectiles, la transformation à l'aide de bactéries notamment d'Agrobacterium ou de vecteurs viraux, des procédés directement in planta.

Dans le cas d'une transformation de protoplastes, les protoplastes sont typiquement isolés, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique pour séparer les parois cellulaires. Les protoplastes sont obtenus typiquement à partir de lignées cellulaires de cals obtenus d'embryons immatures, d'inflorescences immatures, de mésocotyles, d'anthères. Les protoplastes peuvent être transformés par Agrobacterium ou par insertion directe d'ADN facilitée par un traitement au polyéthylène glycol ou par électroporation (Lazzeri, Methods Mol Biol., 49 :95-106,1995). Dans certaines espèces, on peut isoler les protoplastes de mésophylles, méthode qui permet d'obtenir des résultats indépendants du génotype.

Parmi les méthodes biolistiques rappelées dans Finer et al., T. Particle bombardmentmediated transformation, Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol.

240, on pourra utiliser notamment le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt, en particulier en utilisant un canon à particules de tungstène ou d'or.

On pourra préférer aux méthodes biolistiques des méthodes agrolistiques décrites dans Hansen et al. Agrolistic transformation of plant cells : intégration of T-strands generated in planta. Proc Natl Acad Sci USA 1996,93 : 14978-14983, notamment afin d'intégrer un faible nombre de copies du transgène.

De nombreuses techniques de transformation utilisant Agrobacterium sont utilisables, telles que celles décrites dans le document Zupan, J. et al. (2000) The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants : a feast of fundamental insights. Plant J. 23 :11-28, US 6 037 522, US 6 265 538. La transformation par Agrobacterium tumefaciens peut être effectuée pour des Dicotylédones (tabac, pomme de terre) et des Monocotylédones (blé, orge, sorgho, maïs, riz notamment) mêmes si ces dernières ne sont généralement pas leur hôte naturel. On utilisera notamment des techniques connues pour le blé (McCormac et al., Euphytica, vol 99(1) :17-25,1998), le maïs (Ishidia et al.,1996, Nat Biotechnol.,14(6) : 745-750,1996).

En outre, dans la mesure où l'intégration des gènes se fait essentiellement au hasard dans le génome, on observe souvent une variabilité entre les plantes transgéniques. On cherchera à obtenir de préférence des transformants comprenant une copie unique du transgène, ségrégée comme un caractère mendélien avec une expression uniforme d'une génération à la suivante. On recherche ainsi une expression stable du transgène avec un niveau d'expression souhaité.

L'homme du métier connaît un grand nombre de plasmides utilisables dans le cadre de l'invention, rappelés notamment dans le document Trends in plant science oct 2000 vol 5 n 10 p 446, et adaptera les conditions de transformation au plasmide utilisé. On pourra par exemple utiliser de manière préférée, certains plasmides Ti binaires, tels que pBIN 19, pMON, pGREEN, dont la séquence accessible permet la définition de cartes de restriction précise.

La transformation dite in planta, décrite notamment dans Bechtold et al.,1993, In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C. R. Acad. Sci, Paris, Life Sciences 316, 1194-1199, et Clough et al, 1998, Floral dip : a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J. 16,735-743, a l'avantage de ne pas nécessiter d'étape de culture de tissus. Le transgène est introduit dans des plantes intactes sous forme d'ADN nu ou par Agrobacterium, généralement au stade de la formation du zygote.

Les techniques et les agents pour sélectionner les cellules végétales et/ou les tissus végétaux incorporant des séquences nucléotidiques marqueurs associées au gène d'intérêt sont également bien connues de l'homme de métier, et comprennent, de manière non exclusive, l'utilisation de gènes marqueurs tels que des gènes conférant des résistances à un antibiotique ou à des herbicides, ou de systèmes de sélection positive, cités par exemple dans Gelvin 1998, en particulier le système basé sur une sélection sur mannose, en présence du gène de sélection de la MPI (Mannose-6phosphate isomérase) (Hansen et Wright, 1999), ou de systèmes de sélection couplés à l'élimination des gènes marqueurs après sélection (Ebinuma et al., 1997). Enfin, les plantes transformées peuvent également être sélectionnées par criblage PCR en l'absence de gènes marqueurs de sélection (McGarvey et Kaper, 1991).

Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine insecticide selon l'invention dans ses

tissus, comprenant l'introduction d'une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression. Ladite cassette est intégrée de manière stable dans le génome.

Selon une réalisation le procédé comprend en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes exprimant des toxines insecticides par rapport à une plante non transformée.

La sélection de produits de la transformation, c'est-à-dire résultant immédiatement du processus de transformation, et des plantes transgéniques en résultant, peut être réalisée de différentes manières. Les techniques de croissance de cultures de plantes sont connues de l'homme du métier, par exemple dans Mcormick, 1986, Plant Cell Reports, 5,80-84. L'ADN recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique selon l'invention est transmis au cours d'un cycle de reproduction de la plante transgénique à sa descendance de manière à être exprimé dans les plantes de la descendance. L'invention concerne donc également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines contenant les séquences d'acide nucléique selon l'invention décrites précédemment. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules et analogues sont également dans le cadre de l'invention.

Les tissus, parties de plantes, plantes ou graines, sont résistants aux insectes.

L'invention inclut les plantes transgéniques fertiles obtenues ainsi que leur descendance et le produit de cette descendance. Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention. Les plantes transgéniques selon l'invention comprennent notamment une plante transgénique TO ou RO, c'est-à-dire la première plante générée à partir de cellules de plantes transformées, la plante transgénique Tl ou RI c'est-à-dire la première génération de descendance, et les plantes de la

descendance de générations suivantes obtenues qui comprennent et expriment l'ADN recombinant. Par exemple, on procèdera selon les étapes suivantes : - obtention de plantes parentes d'une première lignée, et d'une deuxième lignée (lignée donneuse comprenant un transgène selon l'invention) - pollinisation de fleurs du premier parent par le pollen du deuxième parent - récolte des graines produites par le premier parent.

On peut effectuer des backcross afin d'obtenir l'intégration de l'ADN insecticide d'intérêt.

Pour confirmer la présence de la cassette d'expression, et en particulier du gène de toxine insecticide, selon l'invention dans les plantes régénérées, on peut utiliser un grand nombre de techniques appropriées, par exemple l'analyse PCR ou des techniques d'hybridation Southern blot, pour déterminer la structure de l'ADN recombinant, la détection de l'ARN transcrit à partir de l'ADN du gène d'intérêt exprimé dans des cellules de plantes transformées, des techniques de repérage de la production de protéines codées par le gène d'intérêt, telles que l'électrophorèse de protéines sur gel, des techniques Western blot.

Les plantes transformées selon les méthodes décrites peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, la pomme de terre, le pois, le soja, le tabac, le colza, la tomate, le tournesol, le coton, le riz, le haricot, le chou-fleur, le brocoli, la laitue, le radis, le céleri, l'épinard, l'oignon, l'ail, la carotte, la pomme, la poire, le melon, la cerise, la pêche, l'abricot, la framboise, la fraise, l'ananas, l'avocat, la banane, la canne à sucre.

L'homme du métier sera en outre capable d'augmenter le niveau de production par les plantes transformées en augmentant le contenu en base GC des séquences codantes. En outre l'homme du métier utilisera des séquences le cas échéant modifiées pour obtenir une expression appropriée selon qu'il s'agisse de plantes monocotylédones ou dicotylédones.

Selon un autre aspect l'invention a pour objet une composition pour la lutte contre des insectes nuisibles ainsi que des procédés mettant en #uvre de telles compositions, ces compositions comprenant une toxine insecticide ou composé insecticide selon l'invention telle que décrite précédemment. Par composition insecticide on entend comprenant comme matière active une quantité efficace non

phytotoxique de toxine insecticide selon l'invention en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture.

Au sein des différentes variantes de compositions insecticides selon la présente invention, le composé insecticide est mis en #uvre dans des quantités efficaces mais non phytotoxiques. Par quantité efficace et non phytotoxique, on entend une quantité de matière active suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des insectes présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon l'insecte à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés compris dans la composition insecticide selon l'invention. Cette quantité peut aisément être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.

Selon une réalisation, une composition insecticide au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment.

Pour leur emploi dans la pratique, les différentes compositions insecticides selon l'invention sont typiquement associées à un support, solide ou liquide, utilisable dans le domaine de l'agriculture, et éventuellement à au moins un agent tensioactif et/ou un ou plusieurs agents auxiliaires.

En particulier, comme supports, sont utilisables les supports inertes et usuels ; de même que, comme agents tensioactifs, sont utilisables les agents tensioactifs usuels dans le domaine de la mise en formulation de compositions destinées à des usages en agriculture, notamment pour le traitement ou la protection des cultures.

Les compositions insecticides selon l'invention comprennent typiquement entre 0,00001 et 100%, de préférence entre 0,001 et 80%, de composé insecticide. Les proportions et pourcentages employées ou décrits dans ce texte sont des proportions ou pourcentages en poids.

Par le terme support, dans le présent exposé, on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est associée pour faciliter son application, notamment sur la plante, ou encore sur des graines ou sur le sol. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture,

notamment par la plante traitée. Le support éventuellement mis en #uvre pour la formulation de compositions selon l'invention peut être solide ou liquide.

Comme exemples de supports solides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner les silicates naturels ou synthétiques, les résines, les cires, les poudres fines ou les granules d'argile, notamment d'argile kaolinique, de terre de diatomées, de bentonite ou d'argile acide, l'oxyde de silicium hydraté synthétique, les talcs, les céramiques, d'autres minéraux dont la séricite, le quartz, le soufre, le charbon actif, le carbonate de calcium, la silice hydratée, ou encore les engrais industriels comme le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'urée ou le chlorure d'ammonium.

Comme exemples de supports liquides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner l'eau, les alcools et notamment le méthanol ou l'éthanol, les cétones et notamment l'acétone, la méthyléthylcétone ou la cyclohéxanone, les fractions de pétrole, les hydrocarbures aromatiques dont le benzène, le toluène, le xylène, l'éthylbenzène ou le méthylnaphtalène, les hydrocarbures non aromatiques dont l'hexane, le cyclohexane, le kérosène ou le gazole, le gaz liquéfié, les esters dont l'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle, les nitriles dont l'acétonitrile et l'isobutyronitrile, les éthers dont l'éther diisopropylique ou le dioxanne, les amides dont le N,N-diméthylformamide ou le N,Ndiméthylacétamide, les hydrocarbures halogénées dont le dichlorométhane, le trichloroéthane ou le tétrachlorure de carbone, le diméthylsulfoxyde, les huiles végétales dont l'huile de soja ou l'huile de coton.

La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement appropriée lorsque au moins une des matières actives et/ou le support inerte ne sont pas solubles, notamment dans l'eau, dans le cas où l'agent vecteur de l'application est l'eau. L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique.

On peut, par exemple, citer des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylène sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des amines grasses, des phénols substitués, notamment des alkylphénols ou des arylphénols, des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine,

notamment des alkyltaurates, des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés ; on peut tout particulièrement citer les sels d'alkylsulfonates, les alkylarylsulfonates, les éthers alkylaryliques, leurs dérivés polyoxyéthyléniques, les polyéthylèneglycoléthers, les esters de polyalcools, les dérivés de sucres, alcools et autres.

Les compositions insecticides selon l'invention peuvent également contenir toute sorte d'autres ingrédients ou agents tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des agents épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des agents stabilisants dont le phosphate acide d'isopropyle, le 2,6-ditert-butyl-4-méthylphénol, le 2-tert-butyl-4-méthoxyphénol et le 3-tert-butyl-4méthoxyphénol, des huiles végétales ou minérales, des acides gras ou leurs esters, des agents séquestrants, des agents dispersants dont la caséine, la gélatine, des saccharides et notamment la poudre d'amidon, la gomme arabique, certains dérivés de la cellulose ou l'acide alginique, des dérivés de la lignine, la bentonite, des polymères synthétiques solubles dans l'eau, notamment l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les acides polyacryliques, etc., ainsi que d'autres matières actives connues pour leurs propriétés pesticides, notamment insecticides ou fongicides ; ou pour leurs propriétés favorisant la croissance des plantes, notamment des engrais ; ou pour leurs propriétés régulatrices de la croissance des plantes ou des insectes.

Plus généralement le composé insecticide peut être associé à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation, particulièrement la mise en formulation de produits ou compositions destinées à des usages ou à des utilisations en agriculture ou en hygiène publique.

Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent prendre la forme d'assez nombreuses formulations parmi lesquelles on peut citer les solutions huileuses, les concentrés émulsionnables, les poudres mouillables, les formulations fluides et notamment les suspensions aqueuses ou les émulsions aqueuses, les granulés, les poudres, les aérosols, les formulations pour nébulisation notamment les formulations pour brumisation, les formulations à très bas volume, les pâtes, les émulsions, les suspensions concentrées, de même que d'éventuels mélanges, associations ou combinaisons de ces différentes formes.

Le plus souvent, pour les formulations de type poudres pour poudrage ou dispersion, la teneur en composé insecticide peut aller jusqu'à 100% ; de même, pour les formulations sous forme de granulés, notamment ceux obtenus par extrusion, par compactage, par imprégnation d'un support granulé, par granulation à partir d'une poudre, la teneur en composé insecticide dans ces granulés est le plus souvent comprise entre 0,5 et 80%.

Les compositions insecticides selon l'invention, dites compositions concentrées, comprenant un composé insecticide qui sont sous forme de concentrés émulsionnables ou solubles comprennent le plus souvent de 25 à 100% de matières actives, les émulsions ou solutions prêtes à l'application contenant, quant à elles, de 0,00001à 20% de matières actives.

Selon une réalisation, la matière active A est combinée le cas échéant à au moins une autre matière active ou composé insecticide issue de Photorhabdus luminescens ou d'autres microorganismes.

En plus du solvant, les concentrés émulsionnables peuvent contenir, lorsque c'est nécessaire, 2 à 20% d'additifs appropriés tels les agents stabilisants, les agents tensioactifs, les agents de pénétration, les inhibiteurs de corrosion, les colorants ou les adhésifs précédemment cités.

Les compositions insecticides selon l'invention sous forme de suspensions concentrées, également applicables en pulvérisation, sont préparées de manière à obtenir un produit fluide, stable, ne se déposant pas ; elles contiennent habituellement de 2 à 75% de matière active, de 0,5 à 15% d'agents tensioactifs, de 0,1 à 10% d'agents thixotropes, de 0 à 10% d'additifs appropriés, comme des agents anti-mousse, des agents inhibiteurs de corrosion, des agents stabilisants, des agents de pénétration et des adhésifs ; et, comme support, de l'eau ou un liquide organique dans lequel la, ou les, matière active est peu ou pas soluble, ou encore des mélanges de plusieurs de ces solvants, organiques ou non.

Certaines matières organiques solides ou des sels minéraux peuvent être dissous dans le support pour freiner ou interdire la sédimentation ; ou bien encore de telles matières peuvent être employées comme agents antigels pour l'eau.

Les compositions insecticides selon l' invention qui prennent la forme de poudres mouillables ou à pulvériser sont habituellement préparées de sorte qu'elles contiennent de 20 à 95% de matières actives.

Par ailleurs, elles contiennent habituellement, outre un support solide, de 0 à 5% d'un agent mouillant, de 3 à 10% d'un agent dispersant, et, le cas échéant, de 0 à 10% d'un ou plusieurs agents stabilisants et/ou autres additifs, comme des agents de pénétration, des adhésifs, ou des agents anti-mottants, colorants, etc.

Pour obtenir ces poudres à pulvériser ou poudres mouillables, sont intimement mélangées la ou les matières actives dans des mélangeurs appropriés avec les substances additionnelles, et on les broie avec des moulins ou autres broyeurs appropriés. On obtient alors des poudres à pulvériser dont la mouillabilité et la mise en suspension sont particulièrement avantageuses.

On peut les mettre en suspension avec de l'eau à toute concentration désirée.

Plutôt que des poudres mouillables, on peut réaliser des compositions insecticides selon l'invention qui soient sous forme de pâtes.

Les conditions et modalités de réalisation et d'utilisation de ces pâtes sont similaires à celles des poudres mouillables ou à pulvériser.

Comme cela a déjà été dit, les dispersions et émulsions aqueuses, par exemple les compositions insecticides obtenues en diluant à l'aide d'eau une poudre mouillable ou un concentré émulsionnable selon l'invention, sont comprises dans le cadre général de la présente invention.

Les émulsions peuvent être du type eau-dans-l'huile ou huile-dans-l'eau et elles peuvent avoir une consistance épaisse ou assez épaisse.

De manière plus générale, les compositions selon l'invention peuvent prendre de nombreuses formes de formulations ; ainsi on peut employer ces compositions comprenant un composé insecticide en générateur d'aérosol ; appât (prêt à l'emploi) ; concentré pour préparation d'appâts ; appât en stoc ; de capsules ; produit pour nébulisation a froid ; poudre pour poudrage ; concentré émulsionnable ; émulsion de type aqueux/aqueuse ; émulsion de type huileux/inverse ; granulé encapsulé ; granulé fin ; concentrée pour traitement de semences ; gaz comprimé ; produit générateur de gaz ; sur grain ; appât granulé ; granulé ; produit pour nébulisation a chaud ; macrogranulé ; microgranulé ; poudre à disperser

dans l'huile ; suspension concentrée diluable dans l'huile ; liquide miscible dans l'huile ; pâte ; bâtonnet à usage agropharmaceutique ; en plaquette ; poudre pour traitement de semences à sec ; appât sur brisures ; semences traitées ou enrobées ; bougie fumigène ; cartouche fumigène ; fumigène ; granulé fumigène ; bâtonnet fumigène ; comprimé fumigène ; boite fumigène ; concentré soluble ; poudre soluble ; liquide pour traitement de semences ; suspension concentrée (= concentré fluidifiable) ; de piste ; liquide pour application à très bas volume ; suspension pour application à très bas volume ; produit diffuseur de vapeur ; granulés ou comprimés à disperser dans l'eau ; poudre mouillable pour traitement humide ; granulés ou comprimés solubles dans l'eau ; poudre soluble pour traitement de semences ;poudre mouillable.

De nombreux exemples (notamment A à E) de compositions insecticides décrits dans le document FR2 805 971 peuvent être utilisées avec les toxines selon l'invention.

L'invention concerne également un procédé d'obtention de toxines insecticides comprenant : - l'obtention d'au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment, - la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'invention conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes ; - la collecte de toxines produites.

L'invention concerne également une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM sous la référence plgl6gl CNCM 1-2698, une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM sous la référence plbac8cll1 CNCM 1-2700 et une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM sous la référence plg14a7 : CNCM I- 2697.

D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description détaillée qui suit. On décrit la démarche globale utilisée pour l'obtention d'une banque de BAC testés ensuite pour leur activité entomotoxique, puis les modes opératoires de manière détaillée.

Dans un premier temps, la totalité de la séquence du génome de la bactérie entomopathogène Photorhabdus luminescens, souche TT01 a été identifiée. Plusieurs banques de fragments d'ADN génomique ont été construites selon des procédés décrits (L.Frangeul et al.,1999. Microbiology 145,2625-2634), et introduites par transformation chez Escherichia coli DH10B : une banque de petite taille (1 à 2 kb), une de taille moyenne (5 à 20 kb) et une banque BAC contenant des fragments de grande taille (50 kb en moyenne). L'approche choisie, de type "shotgun", implique le séquençage de fragments aléatoires de petite taille. Ces fragments ont été ensuite assemblés à l'aide des logiciels Phred et Phrap (développés par P. Green, Université de Washington) pour obtenir des séquences contiguës (contigs). Les extrémités séquencées de fragments de la banque de taille moyenne et celles de la banque BAC, et le séquençage de produits de PCR combinatoire, ont permis de relier ces séquences contiguës et d'obtenir la séquence génomique, sous forme d'un contig de 5,7 Mb. Pour identifier des BAC présentant une activité insecticide, les inventeurs ont procédé en parallèle à deux méthodes.

Selon une première méthode, les inventeurs ont identifié par des recherches de similitude "in silico", à partir des séquences génomiques, des gènes potentiellement responsables d'une activité entomotoxique.

Selon une deuxième méthode, la banque de BAC contenant des fragments d'ADN de Photorhabdus a été criblée en totalité afin d'identifier des clones d'Escherichia coli possédant une activité insecticide. Cette banque, construite à l'aide du vecteur pBeIoBACl 1 , a été déposée (CNCM n 1-2478) le 12 juillet 2001.

Les inventeurs ont ainsi réussi à identifier un clone (BAC8C11) ayant une activité entomotoxique notamment sur des larves de Plutella xylostella (lépidoptère). Suite à cette identification, les inventeurs ont effectué des tests d'activité entomopathogène en utilisant ce BAC sur différentes espèces de lépidoptères, démontrant leur efficacité notamment chez notramment Plutella xylostella, Ostrinia nubilalis (maïs), Heliothis virescens (tabac), Helicoverpa zea (maïs), Spodoptera .

On décrit maintenant de manière détaillée les modes opératoires utilisés pour le séquençage et l'analyse du génome de Photorhabdus luminescens en particulier du BAC8C11(EXEMPLE 1), et les tests d'activité entomopathogène sur Plutella xylostella (EXEMPLE 2).

EXEMPLE 1 : séquençage et analyse du génome de Photorhabdus luminescens Les inventeurs ont utilisé l'ADN de la souche TT01 de Photorhabdus luminescens pour entreprendre le séquençage de son génome dont la taille est estimée à 5,7 millions de paires de bases. Différentes banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens ont été construites à ces fins. A partir de clones de ces différentes banques 65 000 lectures de séquences d'environ 500 paires de bases de qualité ont été réalisées - correspondant à une couverture de 7 fois la longueur du génome-, couvrant ainsi environ 98-99 % de ce génome avec des séquences non redondantes. L'assemblage de ces séquences à l'aide d'outils informatiques (Ewing B et al., 1998. Genome Res.8, 175-185 ; Ewing B. & Green P. 1998. Genome Res.8, 186-194; Gordon et al. 1998. Genome Res.8, 195-202; Contigs-Tool-Box, L.Frangeul et al., Résultats non publiés, Laboratoires de Génomique des Microorganismes Pathogènes, Institut Pasteur, Paris) a permis d'obtenir environ 450 contigs (séquences contiguës), le but final étant de relier ces contigs pour obtenir un contig de 5 681 324 paires de base correspondant à la séquence génomique totale de Photorhabdus luminescens.

Les contigs obtenus ont été reliés à l'aide de différentes techniques brièvement résumées ci-dessous : - A l'aide de vecteurs à bas nombre de copies a été construit un "échafaudage" couvrant la totalité du génome. Afin de réaliser celui-ci, les inventeurs ont utilisé des banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens en particulier une banque construite à l'aide de vecteur BAC (une copie par cellule) dont les tailles moyennes des fragments d'ADN insérés sont d'environ 50 kb. Le séquençage des extrémités de ces fragments permet la prédiction des liens entre contigs adjacents.

- la comparaison des extrémités des contigs obtenus avec le génome "témoin" d'une bactérie phylogénétiquement proche (Escherichia coli), dont la séquence est connue, a été utilisé pour prédire des liens entre contigs adjacents dans le génome étudié (Photorhabdus).

- Différentes techniques PCR (PCR combinatoire, reverse PCR, la technique de "marche sur le chromosome") ont ensuite été utilisées pour combler les brèches entre contigs adjacents.

Les inventeurs ont préparé une banque d'ADN génomique de la souche TT01 de Photorhabdus luminescens clonée dans un vecteur bactérien à faible nombre de copies (pSYX34), taille moyenne des inserts lOkb, en utilisant une technique de remplissage partiel (PARTIAL FILL-IN). Dans le cas présent, la digestion par l'enzyme de restriction Sal 1 du vecteur pSYX34 libère les extrémités suivantes :
5' TCGAC-
G- 5' Le PARTIAL FILL-IN a été réalisé, en présence des déoxynucléotides dCTP et dTTP.

5' TCGAC-
CTG- 5' A) Préparation du vecteur : pSYX34.

A.1) Obtention du vecteur.

Du plasmide pSYX34 a été préparé en réalisant en parallèle deux midipreps, KIT QIAGEN selon les condition préconisées par le fabriquant.

A. 2) Digestion du plasmide pSYX34 par l'enzyme de restriction Sal I.

Le volume final sera de 100 l :
20 l pSYX34
10 (il de tampon H
66 l d'H20
4 l Sal I
Incuber 2 h à 37 C Un aliquot, ainsi qu'un marqueur de poids moléculaire, à été déposé sur un minigel d'agarose pour valider la qualité de la purification.

A.3) Extraction au chloroforme.

L'extraction au chloroforme, permet d'arrêter la digestion enzymatique, et d'éliminer toutes traces protéiques. après digestion, on récupère 95 (il + 105 l TE 10 mM + 200 l chloroforme
Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm
Récupérer la phase aqueuse (phase supérieure)

A. 4) Précipitation à l'acétate de sodium.

Ajouter 1/10 du volume, d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 20 (il.

Puis 2,5 volumes d'éthanol absolu propre, soit 500 l (Flacon gardé à -20 C).

Laisser à -20 C, au moins 1 heure (il est possible de laisser à -20 C durant la nuit).

Centrifuger à 4 C (chambre froide) durant 30 min, à 14. 000 tpm.

Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.

Ajouter 400 l d'éthanol à 70%, centrifuger à 4 C, 5 min à 14. 000 tpm.

Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide, laisser sécher environ une heure sur la paillasse.

Resuspendre le culot dans 20 l de TE 10 mM (1/10).

A. 5) Partial fill-in.

Volume final de la réaction : 50 l 20 l de pSYX34 digéré par Sal I 5 l de tampon synthesis 2,5ul de mix nucléotides (C-T) ImM 20,5ul d'eau 2 L de Klenow (2 U/ul) Laisser 30 min à température ambiante.

Vérification sur minigel d'agarose à 1 % et congélation à -20 C.

Mix des nucléotides C-T : mélanges 2 l de nucléotides T (100 mM) 2 l de nucléotides C (100 mM) 16 l de TRIS 10 mM, pH= 7,5 Les nucléotides sont ainsi dilués au 1/10, on a une concentration de 10 mM.

Une seconde dilution au 1/10 dans du tampon TRIS 10 mM, sera réalisée ; on a donc une concentration de 1 mM.

D'autre part, au cours de la réaction, les nucléotides sont dilués au 1/20 (2,5 l dans 50 l). La concentration finale est bien de 50 M en nucléotides.

A. 6) Purification du vecteur pSYX34 : gel préparatif

Préparer un gel d'agarose à 1%, en TAE ;des grands puits seront prévu pour les échantillons.

Reprendre 30 l de pGB2 après le partial fill-in, ajouter 6 l de solution de dépôt. En parallèle, déposer le marqueur de poids moléculaire dans les proportions suivantes :
5 l H20
5 l du marqueur 1 Kb DNA
2 }il de la solution de dépôt.

Laisser migrer à 70 Volts.

Découper le gel côté marqueur à l'aide d'un scalpel, et repérer la région recherchée, en l'occurrence la bande correspondant à 4 Kb.

A. 7) Purification du vecteur pSYX34.

Reprendre dans 3 volumes de solution Iodure de Sodium (lml pour un échantillon de 0,2g), mettre à 49 C, en agitant toutes les 2 minutes, jusqu'à complète dissolution de l'agarose.

Ajouter 8 l de micro-billes : GLASSMILK R, laisser 5-10 min à température ambiante, l'ADN se fixe sur les micro-billes.

Centrifuger 2 min à 14. 000 tpm, éliminer le surnageant par aspiration.

Laver 3 fois avec la solution New Wash (600 l / eppendorf, vortexer, centrifuger quelques secondes à 10. 000 tpm), cette solution a été préparée et, est gardée à -20 C. Resuspendre le culot dans 10 l d'H20, Vortexer, laisser 5 min à 49 C. Ceci permet à l'ADN de se décrocher des micro-billes.

Centrifuger 2 min à 14. 000 tpm.

Récupérer les surnageants dans de nouveaux eppendorfs.

Ajouter à nouveau 10 l d'H20 sur les culots, pour être sûr de tout récupérer, vortexer, laisser 2 min à 49 C.

Centrifuger 2 min à 14. 000 tpm.

Récupérer les surnageants dans les eppendorfs précédents.

Environ 20 l de surnageant sont obtenus, centrifuger 2 min à 14. 000 tpm.

Transférer les surnageants dans de nouveaux eppendorfs, de manière à être sûr qu'il ne reste plus de micro-billes.

Déposer sur un minigel d'agarose à 1%, 1 l de chaque préparation (+ 5 l d'H20 + 2 l de solution de dépôt), laisser migrer à 80 volts, 2 heures.

On gardera les échantillons les plus concentrés, ils seront alors congelés à -20 C.

B) Préparation de l'ADN chromosomique de Photorhabdus luminescens souche TT01.

B.1) Dissolution de l'ADN.

Un culot sec d'ADN génomique de la souche TT01 a été repris dans 200 l de TE 10 :1 puis dissous 30 minutes à 65 C. Sa concentration a été estimée à 0,15 g/ l.

B. 2) Digestion partielle de l'ADN génomique par l'enzyme de restriction Sau3A.

15 l d'ADN on été digérés par 2 ou 1 ou 0,5 ou 0,25 ou 0,125 ou 0,0625 ou 0,03125 unités d'enzyme de restriction Sau3A pendant lh à 37 C.

B. 3) Extraction au chloroforme.

L'extraction au chloroforme permet d'arrêter la digestion enzymatique, et d'éliminer toutes traces protéiques.

Après digestion, on récupère 100 l d'ADN chromosomique.

+ 100 l TE 10 mM + 200 (il chloroforme Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm Récupérer la phase aqueuse, phase supérieure, comportant l'ADN chromosomique.

B.4) Précipitation à l'acétate de sodium Ajouter 1/10 du volume, d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 20 l.

Puis 2,5 volumes d'éthanol absolu propre, soit 500 l (Flacon gardé à -20 C).

Centrifuger à 4 C (chambre froide) durant 30 min, à 14. 000 tpm.

Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.

Ajouter 400 l d'éthanol à 70%, centrifuger à 4 C, 5 min à 14. 000 tpm.

Resuspendre le culot dans 20 l H20.

B. 5) Vérification des digestions partielles, après précipitation à l'acétate de sodium.

Préparer un gel d'agarose à 1% en TBE. Déposer 1/10 du volume total des précipitations, soit 2 l d'ADN + 8 l H20+ 2 l de solution de dépôt.

En parallèle, déposer un marqueur de poids moléculaire : 1 l+ 9 l H20+ 2 l de solution de dépôt.

B.6)Partial Fill-in.

Volume final de la réaction (environ 50 (il) : - 361 d'ADN partiellement digéré (ADN digéré par 0,25 ou 0,125 ou 0,0625 ou 0,03125 unités d'enzyme de restriction Sau3A) - 5 l de tampon synthesis - 10 l de mix nucléotides (A-G) 1mM # concentration finale : 200 M - 2 L de Klenow (2U/ l) Laisser 30 min à température ambiante Mix des nucléotides A-G : mélanger : 2 ni de nucléotides A (100 mM)
2 l de nucléotides G (100 mM)
16 l de TRIS 10 mM, pH= 7,5 Les nucléotides sont ainsi dilués au 1/10, on a une concentration de 10 mM Une seconde dilution au 1/10 dans H20, sera réalisée, on a donc une concentration de 1 mM.

B.7) Extraction au chloroforme.

Après digestion, on récupère 53 fil d'ADN chromosomique.

+ 47 l TE 10 mM + 100 l chloroforme Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm Récupérer la phase aqueuse, phase supérieure, comportant l'ADN chromosomique.

B.8) Précipitation à l'acétate de sodium.

Ajouter 1/10 du volume d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 10 l.

Puis 2,5 volumes d'éthanol absolu propre, soit 250 l (Flacon gardé à -20 C).

Centrifuger à 4 C (chambre froide) durant 30 min, à 14. 000 tpm.

Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.

Ajouter 400 l d'éthanol à 70%, centrifuger à 4 C, 5 min à 14.000 tpm.

Resuspendre le culot dans 20 l H20.

B. 9) Purification de l'ADN chromosomique : gel préparatif Préparer un gel d'agarose à 1%, en TAE, des grands puits seront prévu pour les échantillons.

Reprendre la totalité de l'ADN, soit 20 l, ajouter 4 l de solution de dépôt. En parallèle déposer le marqueur de poids moléculaire dans les proportions suivantes :
5 l H20
5 l du marqueur 1 Kb DNA
2 l de la solution de dépôt.

Laisser migrer à 70 Volts.

Découper le gel côté marqueur à l'aide d'un scalpel, et repérer, en prenant une photo et à l'aide d'une règle, la région intéressante. Ayant des fragments d'ADN longs, on utilisera pour purifier l'ADN, des colonnes SPIN X de chez COSTAR, ceci évitera de couper l'ADN chromosomique.

B. 10) Purification.

Après avoir récupéré les différents morceaux d'agarose, dans des colonnes SPIN X, ajouter 200 (il de TE 10 mM, puis broyer à l'aide d'une spatule.

Ceci pourra être gardé, à 4 C. Puis centrifuger 20 min à 5000 tpm. L'agarose sera retenu sur les filtres, alors que l'ADN chromosomique, sera retrouvé au fond du tube.

B.l 1) Extraction au chloroforme L'extraction au chloroforme, permet d'éliminer toutes traces protéiques.

On récupère 800 l d'ADN chromosomique.

+ 800 [il chloroforme Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm Récupérer la phase aqueuse, phase supérieure, comportant l'ADN chromosomique.

B.12) Précipitation à l'acétate de sodium Ajouter 1/10 du volume, d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 80 l.

Puis, 800 (il d'isopropanol.

Centrifuger à 4 C (chambre froide) durant 30 min, à 14. 000 tpm.

Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.

Ajouter 400 l d'éthanol à 70%, centrifuger à 4 C, 5 min à 14. 000 tpm.

Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide, laisser sécher environ une demi heure sur la paillasse, et 2 min sous vide.

Resuspendre le culot dans 20 l TE (0,1 X soit 1 mM).

Incuber 10 min à 65 C.

Incuber environ 4 heures à 4 C, de manière à ce que l'ADN soit bien resuspendu.

Vérification sur minigel d'agarose à 1%, mettre en parallèle un marqueur de poids moléculaire.

C) Ligation de l'ADN chromosomique de Photorhabdus luminescens souche TT01 dans le vecteur pSYX34.

Reprendre 6 l d'ADN chromosomique Ajouter 2 l de pSYX34 Ajouter 2 {il de tampon de ligation (LB : ligation buffer) Ajouter 2 l de ligase Puis 8 l H20 (volume total : 20 l) En parallèle, faire un témoin de ligation, en remplaçant l'ADN chromosomique, par du TE 0,1X (1 mM).

Vortexer, laisser une nuit à 16 C.

Transformation de cellules ultra compétentes XL 1 O-Gold Kanr (Stratagene) La banque d'ADN génomique obtenue à l'étape précédente à été intégrée dans les cellules ultra compétentes XL10 Gold Kanr (Stratagene) selon les conditions préconisées par le fabriquant.

L'analyse des inserts de 24 clones par digestion par l'enzyme de restriction Sali et par séquençage des extrémités a été effectuée et a donné des résultats satisfaisant.

D) Cartographie des clones BAC sur le génome de Photorhabdus luminescens Connaissant la presque totalité de la séquence du génome de la bactérie Photorhabdus luminescens, ainsi que les séquences des extrémités des inserts des clones des différentes librairies, les inventeurs ont effectué une cartographie permettant de positionner le clone BAC8C11. Le clone 8C11(dépôt CNCM 1-2700), dont la taille du fragment inséré est de 22,5 kb, comprend le gène codant pour SEQ ID N 3, flanqué du gène codant pour SEQ ID N 5.

EXEMPLE 2 : d'activité entomopathogène sur les larves de Plutella xylostella, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment.

Une série de tests a été effectuée selon le protocole suivant. Des bactéries (souche E. coli DHlOB, contenant un plasmide pBeloBAC11) ont été mises en culture une nuit dans 5 ml LB+chloramphenicol à 28 C sous agitation à 200 rpm. La DO540 de chaque culture a été systématiquement prise. Chaque culture est diluée avec du LB jusqu'à obtenir une concentration de 5x10 bactéries/ml. Six feuilles (3 cm de diamètre) sont incubées dans une culture diluée pendant une heure avec 0,05 % Tween 20 (Sigma). Les feuilles traitées sont mises dans des plaques 6 puits et 5 larves sont placées dans chaque puits, soient 30 larves testées par clone. Chaque puits contient un support gélosé contenant 15 g/1 d'agar (Difco) et 1,5 g/1 d'antifongique (nipagine, Sigma).

De préférence, les larves utilisées pour ce test sont des larves en phase tardive du stade L2 (2eme stade larvaire), sélectionnées juste avant leur mue vers le stade L3. En effet, les inventeurs ont observé que les larves étaient nettement plus sensibles à la bactérie à ce stade L2 et que les essais y étaient bien plus reproductibles.

Des souches de deux origines géographiques différentes (Bénin B, Martinique M) de Plutella xylostella ont été utilisées et les résultats ont été observés en fonction de la souche utilisée.

Tous les essais ont été effectués à 28 C avec une photopériode de 11h : 13h (nuit : jour). Après 2 jours, les feuilles traitées ont été remplacées par des feuilles non traitées. Le niveau de mortalité des larves a été observé à 48h, 72h et 144h après le contact des larves avec les feuilles traitées. Des contrôles ont été utilisés pour les tests de criblage, incluant : Photorhabdus TT01, et/ou le BAC8dl0 (contenant le

locus te) comme contrôles positifs et le BAC 0 (souche DH 1 OB contenant le plasmide pBeloBACl 1 mais sans insert) comme contrôle négatif.

Le taux de mortalité des larves a été corrigé par rapport au contrôle négatif à l'aide de l'équation Abbott (Abbott W. S., 1925, J. Econ. Entomol., 18 : 265-267). Les résultats sur les larves de Plutella xylostella sont liés à la souche, et à son stade de développement. Cela explique pourquoi certains clones sont susceptibles de ne pas donner de résultats positifs par d'autres essais.

Clone <SEP> BAC <SEP> Souche <SEP> Px <SEP> Stade <SEP> larvaire <SEP> % <SEP> de <SEP> mortalité <SEP> des <SEP> larves
<tb> 48h <SEP> 72h
<tb> 8c11 <SEP> Bénin <SEP> L2 <SEP> non-triées <SEP> 0% <SEP> 0%
<tb> L2 <SEP> tardives <SEP> 55% <SEP> 66%
<tb> Clone <SEP> BAC <SEP> Souche <SEP> Px <SEP> % <SEP> de <SEP> mortalité <SEP> d'Abbott <SEP> *
<tb> 48h <SEP> 72h <SEP> 144h
<tb> 8c11 <SEP> B <SEP> 27% <SEP> 28% <SEP> 34%
<tb> M <SEP> 41% <SEP> 50% <SEP> 50%
<tb> M <SEP> 25% <SEP> 25% <SEP> 28%
<tb> M <SEP> 22% <SEP> 29% <SEP> 38,5%
<tb>
* un % de mortalité d'Abbott supérieur à 20% est considéré comme significatif N'ont été pris en compte que les bio-essais pour lesquels le % de mortalité du contrôle négatif est inférieur à 20% (Origine géographique des souches Px : B : Bénin ; M : Martinique)

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Claims

REVENDICATIONS 1. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
2. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70% d'identité avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie ena)oub); d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c), d'au moins 10 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c) ,d) ou e) ; ladite séquence codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
3. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 à 2.
4. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique choisie parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins 80 %, d'identité avec ledit polypeptide de a) ;

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c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, d'un polypeptide défini en a), ou b); d) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c).
5. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2 caractérisé en ce qu'elle code pour un polypeptide correspondant à une séquence choisie parmi SEQ

ID N 3 et SEQ ID N 5.
6. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, 2, et 5 caractérisé en ce que la toxine est active contre les lépidoptères appartenant notamment aux genres

Plutella, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Ostrinia..
7. Cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle à une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6.
8. Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 7 ou une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6.
9. Vecteur de type virus caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6 liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié
10. Cellule hôte comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7.
11. Cellule hôte selon la revendication 10 caractérisée en qu' il s'agit d'une bactérie, d'une levure, d'une cellule de plante.

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12. Composition insecticide caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 4, ou une cellule hôte selon la revendication 10 ou 11, accompagnés d'un support approprié.
13. Procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine contre des insectes caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une cassette d'expression selon la revendication 7 dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression.
14. Plante ou partie de plante, comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7, les plantes ou parties de plantes étant transformées et résistantes aux insectes.
15. Plante ou partie de plante selon la revendication 14 présentant une augmentation de l'expression d'une toxine contre les insectes par rapport à une plante non transformée.
16. Plante selon la revendication 14 ou 15 caractérisée en ce que la cassette d'expression est intégrée de manière stable dans le génome de la cellule.
17. Plante ou partie de plante selon l'une quelconque des revendications 14 à 16 caractérisée en ce qu'il s'agit d'une mono ou une dicotylédone, notamment le blé ou le maïs.
18. Procédé de lutte contre des insectes caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur des plantes infectées par lesdits insectes d'une quantité efficace sur le plan insecticide d'une composition insecticide selon la revendication 12 ou de vecteurs recombinants selon la revendication 8.
19. Procédé d'obtention de toxines insecticides caractérisé en ce qu'il comprend : - l'obtention d'au moins une cellule hôte selon la revendication 11;

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- la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2,5 et 6 conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes ; - la collecte de toxines produites.
20. Procédé d'obtention d'une plante résistante aux insectes, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2,5 et 6 l'expression de ladite séquence nucléotidique étant à un niveau suffisant pour agir contre les insectes.
21. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment ADN de Photorhabdus luminescens d'environ 26 kb désigné plBAC8Cll déposé sous le numéro CNCM-2700, présent dans la souche E.coli DH10B.
22. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle correspond à SEQ ID N 1.
23. Souche comprenant un vecteur selon la revendication 8, déposée à la CNCM sous la référence plbac8cl CNCM 1-2700.
24. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1, 2,

5 et 6, d'un vecteur selon la revendication 8, d'une cellule selon la revendication 10 ou 11, pour la préparation d'un polypeptide insecticide.