WO2003087377A1 - Proteines insecticides photorabdus luminescens - Google Patents

Proteines insecticides photorabdus luminescens Download PDF

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WO2003087377A1
WO2003087377A1 PCT/FR2003/001239 FR0301239W WO03087377A1 WO 2003087377 A1 WO2003087377 A1 WO 2003087377A1 FR 0301239 W FR0301239 W FR 0301239W WO 03087377 A1 WO03087377 A1 WO 03087377A1
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plant
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Inventor
Eric Duchaud
Franck Kunst
Philippe Glaser
Carmen Buchrieser
Lionel Frangeul
Farid Chetouani
Christophe Rusniok
Seand Taourit
Christina Nielsen-Le-Roux
Noël BOEMARE
Alain Givaudan
Rachel Vincent
Sylvie Pages
Vincent P. M. Wingate
Kerrie M. Powell
Richard Derose
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Institut Pasteur
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Inra - Institut National De La Recherche Agronomique
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    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the invention relates in particular to nucleotide sequences isolated from Photorhabdus luminescens, toxins encoded by said sequences, methods for obtaining such toxins, compositions comprising such toxins intended for the fight against insects, transformed plants expressing such toxins .
  • insects are the cause of serious damage to field crops, including cereals, flowers, fruit.
  • chemical insecticide agents intended to fight against insects.
  • some of the existing products pose problems of selectivity against a particular category of insects and resistance against these substances.
  • WO 99/54472 describes insecticidal toxins isolated from Xenorhabdus nematophilus, and nucleotide sequences coding for such toxins.
  • Photorhabdus luminescens is an entomopathogenic, intestinal commensal bacterium of a nematode of the genus Heterorhabditis.
  • the document WATERFIELD NICHOLAS R. et al. (Trends Microbiol., 2001 Apr., 9 (4): 185-91) relates to a comparison of te nucleotide sequences (toxin complex genes) coding for bacterial toxins.
  • the nucleotide sequences coding for insecticidal toxins from Photorhabdus luminescens are disclosed under their GenBank accessibility number: Accession numbers: AQ991079, AQ989921, AQ989724 and AQ991 166.
  • the invention aims to obtain plants and / or compositions containing such toxins capable of inactivating or destroy insects.
  • the invention also relates to the use of such toxins, for treatment - preventive or curative - of crops against pests.
  • bacterial artificial chromosome prepared from Photorhabdus luminescens, nucleotide sequences coding for insecticidal toxins which are particularly effective against lepidoptera belonging in particular to the genera Plutella, Heliothis,
  • the subject of the invention is, according to a first aspect, a nucleotide sequence isolated from Photorhabdus luminescens comprising a nucleotide sequence chosen from SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4, said nucleotide sequence coding for at least one polypeptide active against insects.
  • sequence SEQ ID N ° 2 corresponds to nucleotides nt 20872 to nt 21306 of the sequence SEQ ID N ° 1 which is the nucleotide sequence of a BAC, designated BAC8C1 1, deposited at the CNCM on July 12, 2001 under number 1- 2700.
  • BAC8C1 1 is a genomic DNA fragment from Photorhabdus luminescens subsp. laumondii, strain TTOl (Fischer - Le Saux M. et al., 1998 - Appl. Environ. Microbiol., vol. 64, 4246), clone in the vector pBeloBACl l (Kim VJ et al., 1996, Genomics, vol.
  • the sequence SEQ ID No. 4 corresponds to nucleotides nt 21345 to nt 22598 of the sequence SEQ ID No. 1 of this BAC8C1 1.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences chosen from: a) a nucleotide sequence comprising at least 70% identity with SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4; b) a nucleotide sequence hybridizing under conditions of high stringency with SEQ ID No. 2 or SEQ ID No.
  • nucleotide sequence with insecticidal expression will be used to designate these nucleotide sequences SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, and the variant sequences defined in a) to f).
  • sequence SEQ ID No. 2 is the nucleotide sequence of an open reading frame designated ORF1 (435 nucleotides) and codes for the protein of 144 amino acids of sequence SEQ ID No. 3.
  • sequence SEQ ID No. 4 is the nucleotide sequence of an open reading frame designated ORF2 (1254 nucleotides) and codes for a protein of 417 amino acids of sequence SEQ ID No. 5.
  • sequences SEQ ID No 2, SEQ ID No 3, SEQ ID No 4, SEQ ID No 5 are clearly distinguished from the prior art. No significant similarity has been identified, using for example the BESTFIT program known to those skilled in the art, between these sequences and the sequences SEQ ID No 12, No 13, No 14 of the document
  • insecticidal activity or “active compound against insects” means that the toxins are capable of fighting against insects, by killing or inactivating them, for example by a decrease or loss of appetite vis- with regard to the plants of interest cultivated. The result is typically the destruction, or reduced growth and / or reproduction of the target pest.
  • insecticide also means “biopesticide”.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • These nucleic acids are isolated from their natural environment, and are natural or artificial.
  • homologous nucleotide sequence is meant any nucleotide sequence which differs from the nucleotide sequences comprising SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4 (in particular which differs from the nucleotide sequences SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4), by substitution, deletion, and / or insertion of a nucleotide or of a reduced number of nucleotides, at positions such that these homologous nucleotide sequences have an insecticidal activity as described above.
  • such a homologous nucleotide sequence is identical to at least 70.75% of the nucleotide sequences SEQ ID No 2 and SEQ ID No 4, preferably at least 80.85%, more preferably at least 90.92, 95, 98, 99%.
  • percentage of identity between two nucleic acid sequences is meant a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared, obtained after their best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Optimal alignment of sequences for comparison can be achieved using mathematical algorithms.
  • BLAST2 Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402
  • BLASTN BLASTN
  • BLAST2 Altschul et al., 1999, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250
  • gapped BLAST Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402
  • such a homologous nucleotide sequence hybridizes specifically to the sequence complementary to a sequence coding for an insecticidal toxin, under stringent conditions.
  • stringent conditions For example, the following conditions will be used:
  • nucleotide fragment is meant on the one hand any fragment of a nucleotide sequence comprising SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4 (and in particular any fragment of SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4) , or any fragment of sequences homologous to these sequences, said fragments coding for a peptide with insecticidal activity as defined above.
  • These nucleotide fragments have at least 10 nucleotides, preferably at least 10, 15, 30, 45, 75, 150, 300 consecutive nucleotides of the sequence from which they are derived.
  • these nucleotide fragments code for peptides having an insecticidal activity preferably of at least 10, 20, 30, 50, 80, 90%, or even more than 100%, of the insecticidal activity of the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 coded by the sequences with insecticidal expression SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4.
  • an insecticidal activity preferably of at least 10, 20, 30, 50, 80, 90%, or even more than 100%, of the insecticidal activity of the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5 coded by the sequences with insecticidal expression SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 4.
  • probes or primers which can be used in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequences.
  • These methods can involve amplification techniques of the PCR type (described for example in document US Pat. No. 4,683,202) or PCR like, such as for example the techniques known to those skilled in the art SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription- based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction).
  • a probe or primer is defined, within the meaning of the invention, as being a fragment of single-stranded nucleic acid or a denatured double-stranded fragment comprising at least 10 bases, preferably at least 15, 20, 25 and 30 bases, and having a specificity of hybridization under conditions determined to form a hybridization complex with a target nucleic acid.
  • Such probes will be in particular usable in marker assisted selection programs, for example to monitor the integration of the toxin gene in the transformed plant.
  • at least one of these probes is labeled, for example with a radioactive isotope, then brought into contact with the genomic DNA of the plant, previously digested with restriction enzymes, under conditions allowing specific hybridization of the probe labeled with the DNA in question.
  • the subject of the present invention is also the use of nucleotide sequences of fragments representative of the sequence SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 4, or of their complementary sequence as primers or probes for detection, identification, the assay or amplification of the sequences SEQ ID No 2 or SEQ ID No 4 or their complementary sequence.
  • the methods targeting such uses using these said fragments as primers or probes are also part of the invention.
  • modified nucleotide sequence any nucleotide sequence typically obtained by mutagenesis according to appropriate techniques, and comprising modifications with respect to the nucleotide sequences SEQ ID N ° 2 and SEQ ID NO:
  • the invention relates to an insecticidal polypeptide encoded by a nucleotide sequence with insecticidal expression as described above.
  • the invention also relates to the polypeptides chosen from: a) a polypeptide of sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5; b) a polypeptide homologous to the polypeptide defined in a) comprising at least 80%, preferably at least 85%, 87%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% of identity with said polypeptide of a) ; c) a fragment of at least 10 consecutive amino acids, preferably at least 15, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100 consecutive amino acids of a polypeptide defined in a), or b); d) a polypeptide variant of a polypeptide of amino acid sequences defined in a), b), or c); preferably, said polypeptide has insecticidal activity as described above.
  • insecticidal polypeptide or insecticidal toxin is used interchangeably to denote a polypeptide according to the invention having insecticidal activity (more precisely biopesticide) as described above.
  • polypeptide is used to also denote a protein or peptide.
  • a polypeptide according to the invention is a polypeptide consisting of the sequence SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 5 or of a sequence having at least 80% identity, preferably at least 85%, 90% , 95%, 98% and 99% identity with SEQ ID N ° 3 or SEQ ID N ° 5 after optimal alignment.
  • polypeptide whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably at least 85%, 90%, 95%, 98% and 99% after optimal alignment with a reference sequence is intended to denote the polypeptides having certain modifications with respect to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • polypeptide fragment is intended to denote a polypeptide comprising at least 15 consecutive amino acids, preferably at least 20, 25, 30, 40, 50, 100 consecutive amino acids.
  • the polypeptide fragments according to the invention obtained by cleavage of said polypeptide by a proteolytic enzyme, by a chemical reagent, or alternatively by placing said polypeptide in a very acidic environment are also part of the invention.
  • one or more consecutive or non-consecutive amino acids can be replaced by “equivalent” amino acids.
  • the term “equivalent” amino acid is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, modifying the desired essential functional characteristics or properties, in this case not causing loss of insecticidal activity.
  • These equivalent amino acids can be determined either on the basis of their structural homology with the amino acids for which they are substituted, or on the results of cross-biological activity tests to which the different polypeptides are liable to give rise.
  • substitutions which may be carried out without resulting in an in-depth modification of the biological activities of the corresponding modified polypeptides, the replacements, for example, of leucine by valine or isoleucine , aspartic acid by glutamic acid, glutamine by asparagine, Parginine by lysine etc., the reverse substitutions being naturally possible under the same conditions.
  • variant polypeptide will be understood to mean all of the mutated polypeptides which may exist naturally, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions of amino acid residues.
  • a variant polypeptide, a homologous polypeptide or a polypeptide fragment according to the invention has at least 10%, preferably at least 20, 30, 50, 80, 90%, or even more than 100, 120, 150%, of the insecticidal activity of the sequences SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 5.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences coding for the polypeptides as described above.
  • the invention in another aspect, relates to an expression cassette comprising a promoter sequence operably linked in the transformed plant to a nucleotide sequence according to the invention coding for an insecticidal toxin, and to a transcription termination region.
  • the preparation of a DNA expression cassette can be carried out in various ways suitable for those skilled in the art. Briefly, at least one nucleotide sequence with insecticidal expression as defined above, can be cloned downstream of the promoter using restriction enzymes to ensure its insertion in an appropriate orientation with respect to the promoter so that it is expressed. Once this sequence has been operatively linked to the promoter, the expression cassette thus formed can be cloned into a plasmid or other vector.
  • the promoter sequence controls transcription into a functional messenger RNA coding for an insecticidal protein.
  • the expression cassette can be chimeric or natural, but typically it is heterologous towards the host, which involves introduction into the host by a transformation.
  • a large number of plant promoters are known, recalled in particular in document WO 01/70778.
  • the expression of the gene of interest is regulated, in addition to the promoter sequence, by the use of appropriate sequences capable of enhancing the activity of this promoter sequence, such as introns, for example the actin 1 or 2 intron, the DSV intron of the tobacco yellow mosaic (Morris et al., 1992, Virology, 187: 633), “enhancer” sequences, for example certain elements of the CaMV35S promoter and octopine synthase genes (US 5,290,924), “leader” sequences (typically sequences located between the transcription initiation site and the start of the coding sequence, in particular consensus leader sequences which stabilize mRNA and prevent inappropriate initiation of transcription), for example the leader EMCV (Leroy-Stein et al., 1989, PNAS USA, 86: 6126-6130), the leader TMV (Gallie et al., 1989, Molecular Biology of RNA , pages 237-256).
  • introns for example the actin 1 or 2 intron, the DSV
  • the expression cassette contains subcellular targeting sequences, in particular a sequence coding for a signal peptide allowing the secretion of the protein, or a sequence coding for a transit peptide addressing the toxin in the chloroplasts (for example the optimized transit peptide described in EP 0 508 909.)
  • the invention relates to a cloning and / or expression vector comprising an expression cassette as described above.
  • vector is a virus type and comprises in its genome a polynucleotide sequence according to the invention, operably linked to an appropriate inducible or constitutive promoter.
  • the invention relates to a host cell transformed with the nucleic acid sequences described above.
  • the invention relates to a host cell comprising such an expression cassette.
  • the host organism is a bacterium, a yeast, a plant cell, a fungus.
  • the invention relates to a process for the preparation of a polypeptide using at least one vector or a cell as described above.
  • the invention also relates to a recombinant polypeptide capable of being obtained by this method.
  • the invention relates to a process for the preparation of a synthetic polypeptide using an amino acid sequence of an insecticidal polypeptide as defined above.
  • the invention relates to the use of a nucleotide sequence, of a vector, of a host cell as described above for the biosynthesis of insecticidal polypeptides.
  • the term “one” obviously refers to "at least one”.
  • the invention relates to the nucleotide sequences according to the invention, recorded on a support, called a recording support, the shape and nature of which facilitate the reading, analysis and exploitation of said sequences.
  • supports it is possible to prefer supports readable by a computer, such as magnetic, optical, electric or hybrid supports such as for example floppy disks or discs, CD-ROMs or recording cassettes.
  • the invention relates to plant cells transformed by a vector as defined above.
  • transformation refers to a genetic manipulation of plant cells capable of being transformed, such as callus cells, embryos, cells suspended in cultures (cultures derived for example from calluses, embryos, leaves, young inflorescences, anthers) of plants.
  • transgenic or “transformed” in reference to a plant cell, a part of a plant, refers to these elements comprising a DNA segment (preferably a nucleotide sequence or an expression cassette according to the invention ) preselected purified isolated which has been introduced into said element by a method of genetic transformation.
  • the protoplasts are typically isolated, either mechanically or enzymatically to separate the cell walls.
  • Protoplasts are typically obtained from callus cell lines obtained from immature embryos, immature inflorescences, mesocotyls, anthers.
  • the protoplasts can be transformed by Agrobacterium or by direct insertion of DNA facilitated by treatment with polyethylene glycol or by electroporation (Lazzeri, Methods Mol. Biol., 49: 95-106,1995).
  • the protoplasts of mesophylls can be isolated, a method which makes it possible to obtain results independent of the genotype.
  • Agrobacterium tumefaciens can be used, such as those described in the document Zupan, J. et al., 2000, The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J., 23: 11-28; US 6,037,522; US 6,265,538.
  • the transformation by Agrobacterium tumefaciens can be carried out for Dicotyledons (tobacco, potato) and Monocotyledons (wheat, barley, sorghum, corn, rice in particular) even if the latter are not generally their natural host.
  • We will use in particular known techniques for wheat McCormac et al., Euphytica, vol. 99 (1): 17-25, 1998), corn (Ishidia et al., 1996, Nat. Biotechnol., 14 (6) : 745-750.1996).
  • transgenic plants since the integration of genes is essentially random in the genome, we often observe variability between transgenic plants. It will preferably be sought to obtain transformants comprising a single copy of the transgene, segregated as a Mendelian character with a uniform expression from one generation to the next. We thus seek a stable expression of the transgene with a desired level of expression.
  • marker genes such as genes conferring resistance to an antibiotic or to herbicides, or of positive selection systems, cited for example in Gelvin 1998, in particular the system based on a selection on mannose, in the presence of the selection gene of MPI (Mannose-6-phosphate isomerase) (Hansen and Wright, 1999), or of selection systems coupled to elimination of marker genes after selection (Ebinuma et al., 1997).
  • MPI Mannose-6-phosphate isomerase
  • selection systems coupled to elimination of marker genes after selection
  • the invention relates to a process for obtaining a plant expressing at least one insecticidal toxin according to the invention in its tissues, comprising the introduction of an expression cassette comprising a nucleotide sequence with insecticidal expression such as described previously in at least one plant cell, then the culture of the cell thus transformed so as to regenerate a plant containing in its genome said expression cassette.
  • Said cassette is stably integrated into the genome.
  • the method further comprises the identification and selection of transformed cells capable of regenerating plants expressing insecticidal toxins compared to an untransformed plant.
  • the selection of transformation products that is to say immediately resulting from the transformation process, and of the transgenic plants resulting therefrom, can be carried out in different ways. Techniques for growing plant cultures are known to those skilled in the art, for example in McCormick, 1986, Plant Cell Reports, 5: 80-84.
  • the recombinant DNA comprising at least one nucleotide sequence according to the invention is transmitted during a reproductive cycle of the transgenic plant to its descendants so as to be expressed in the plants of the descendants.
  • the invention therefore also relates to the tissues or parts of plants, plants, or seeds containing the nucleic acid sequences according to the invention described above.
  • plant tissue refers to any tissue of a plant, in a plant or in a crop. This term includes whole plants, plant cells, plant organs, plant seeds, protoplasts, calluses, cell cultures and all other plant cells. organized as a functional and / or structural unit. Parts of regenerated plants such as flowers, seeds, leaves, stems, fruits, pollen, tubers and the like are also within the scope of the invention.
  • the tissues, parts of plants, plants or seeds, are resistant to insects.
  • the invention includes the fertile transgenic plants obtained as well as their progeny and the product of this progeny.
  • the transgenic plants according to the invention notably comprise a transgenic plant TO or RO, that is to say the first plant generated from cells of transformed plants, the transgenic plant TI or RI, that is to say the first progeny generation, and the progeny plants of subsequent generations obtained which include and express recombinant DNA.
  • TO or RO that is to say the first plant generated from cells of transformed plants
  • the transgenic plant TI or RI that is to say the first progeny generation
  • the progeny plants of subsequent generations obtained which include and express recombinant DNA.
  • Backcrossing can be done in order to obtain integration of the insecticidal DNA of interest.
  • a large number of suitable techniques can be used, for example PCR analysis or techniques of Southern blot hybridization, to determine the structure of recombinant DNA, detection of RNA transcribed from DNA of the gene of interest expressed in cells of transformed plants, techniques for tracking the production of coded proteins by the gene of interest, such as protein gel electrophoresis, Western blot techniques.
  • the plants transformed according to the methods described can be monocots or dicots, in particular corn, wheat, barley, sorghum, potato, peas, soybeans, tobacco, rapeseed, tomatoes, sunflower, cotton, rice, bean, cauliflower, broccoli, lettuce, radish, celery, spinach, onion, garlic, carrot, apple, pear, melon, cherry, peach, apricot, raspberry, strawberry, pineapple, avocado, banana, sugar cane.
  • the subject of the invention is a composition for the fight against harmful insects as well as methods implementing such compositions, these compositions comprising an insecticidal toxin or insecticidal compound according to the invention as described above.
  • insecticidal composition is understood to mean comprising, as active material, an effective non-phytotoxic amount of insecticidal toxin according to the invention in combination with a solid or liquid support, acceptable in agriculture and / or a surfactant also acceptable in agriculture.
  • the insecticide compound is used in effective but non-phytotoxic amounts.
  • effective and non-phytotoxic amount is meant an amount of active material sufficient to allow the control or destruction of insects present or likely to appear on the crops, and not causing for said crops any significant symptom of phytotoxicity.
  • Such an amount is likely to vary within wide limits depending on the insect to be controlled, the type of crop, the climatic conditions, and the compounds included in the insecticidal composition according to the invention. This amount can easily be determined by systematic field tests, within the reach of the skilled person.
  • an insecticidal composition at least one host cell as described above.
  • the various insecticidal compositions according to the invention are typically associated with a support, solid or liquid, usable in the field of agriculture, and optionally with at least one surfactant and / or one or more agents auxiliary.
  • a support solid or liquid
  • the inert and usual supports can be used; just as, as surfactants, the usual surfactants can be used in the field of formulating compositions intended for uses in agriculture, in particular for the treatment or protection of crops.
  • the insecticidal compositions according to the invention typically comprise between
  • support in the present description, we mean an organic or mineral, natural or synthetic material, with which the active material is associated to facilitate its application, in particular on the plant, or on seeds or on the soil.
  • This support is therefore generally inert and it must be acceptable in agriculture, in particular by the treated plant.
  • the support optionally used for the formulation of compositions according to the invention can be solid or liquid.
  • solid supports which can be used for the formulation of compositions according to the invention, mention may be made of natural or synthetic silicates, resins, waxes, fine powders or granules of clay, in particular kaolin clay, diatoms, bentonite or acid clay, synthetic hydrated silicon oxide, talcs, ceramics, other minerals including sericite, quartz, sulfur, activated carbon, calcium carbonate, hydrated silica , or industrial fertilizers such as ammonium sulphate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea or ammonium chloride.
  • natural or synthetic silicates resins, waxes, fine powders or granules of clay, in particular kaolin clay, diatoms, bentonite or acid clay, synthetic hydrated silicon oxide, talcs, ceramics, other minerals including sericite, quartz, sulfur, activated carbon, calcium carbonate, hydrated silica , or industrial fertilizers such as ammonium sulphate, ammonium phosphate, am
  • liquid carriers which can be used for the formulation of compositions according to the invention, mention may be made of water, alcohols and in particular methanol or ethanol, ketones and in particular acetone, methyl ethyl ketone or cyclohexanone, fractions petroleum, aromatic hydrocarbons, including benzene, toluene, xylene, ethylbenzene or mefhylnaphthalene, non-aromatic hydrocarbons, including hexane, cyclohexane, kerosene or diesel, liquefied gas, esters, including ethyl acetate and butyl acetate, nitriles including acetonitrile and isobutyronitrile, ethers including diisopropyl ether or dioxane, amides including N, N-dimethylformamide or N, N-dimethylacetamide, halogenated hydrocarbons including dichloromethane, trichloro
  • the presence of at least one surfactant is generally suitable when at least one of the active materials and / or the inert support is not soluble, in particular in water, in the case where the vector agent of the application is l 'water.
  • the surfactant can be an emulsifying, dispersing or wetting agent of ionic or nonionic type.
  • Mention may, for example, be made of salts of polyacrylic acids, salts of lignosulfonic acids, salts of phenolsulfonic or naphthalene sulfonic acids, polycondensates of ethylene oxide on fatty alcohols or on fatty acids or on fatty amines, substituted phenols, in particular alkylphenols or arylphenols, ester salts of sulfosuccinic acids, taurine derivatives, in particular alkyltaurates, phosphoric esters of alcohols or polyoxyethylated phenols; mention may especially be made of the alkyl sulfonate salts, the alkylarylsulfonates, the alkylaryl ethers, their polyoxyethylene derivatives, the polyethylene glycol ethers, the polyalcohol esters, the sugar derivatives, alcohols and others.
  • the insecticidal compositions according to the invention can also contain any kind of other ingredients or agents such as, for example, protective colloids, adhesives, thickening agents, thixotropic agents, penetrating agents, stabilizing agents including phosphate isopropyl acid, 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, 2-tert-butyl-4-methoxyphenol and 3-tert-butyl-4-methoxyphenol, vegetable or mineral oils, acids fatty or their esters, sequestering agents, dispersing agents including casein, gelatin, saccharides and in particular starch powder, gum arabic, certain derivatives of cellulose or alginic acid, derivatives of lignin, bentonite, synthetic polymers soluble in water, in particular polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, polyacrylic acids, etc., as well as other active materials known for their pesticidal properties, in particular insect icides or fungicides; or for their properties favoring the growth of plants, in
  • insecticidal compound can be combined with all the solid or liquid additives corresponding to the usual techniques of formulation, particularly the formulation of products or compositions intended for uses or uses in agriculture or in public hygiene.
  • compositions according to the invention can take the form of quite a number of formulations among which mention may be made of oily solutions, emulsifiable concentrates, wettable powders, fluid formulations and in particular aqueous suspensions or aqueous emulsions, granules, powders, aerosols, formulations for nebulization, in particular formulations for misting, very low volume formulations, pastes, emulsions, concentrated suspensions, as well as possible mixtures, associations or combinations of these different forms.
  • oily solutions emulsifiable concentrates, wettable powders, fluid formulations and in particular aqueous suspensions or aqueous emulsions, granules, powders, aerosols, formulations for nebulization, in particular formulations for misting, very low volume formulations, pastes, emulsions, concentrated suspensions, as well as possible mixtures, associations or combinations of these different forms.
  • the content of insecticidal compound can range up to 100%; similarly, for formulations in the form of granules, in particular those obtained by extrusion, by compaction, by impregnation of a granulated support, by granulation from a powder, the content of insecticidal compound in these granules is most often understood. between 0.5 and 80%.
  • compositions according to the invention comprising an insecticidal compound which are in the form of emulsifiable or soluble concentrates most often comprise from 25 to 100% of active materials, the emulsions or solutions ready for application containing, as to them, from 0.00001 to 20% of active ingredients.
  • the active material A is combined, where appropriate, with at least one other active material or insecticidal compound derived from Photorhabdus luminescens or other microorganisms.
  • the emulsifiable concentrates can contain, when necessary, 2 to 20% of suitable additives such as stabilizers, surfactants, penetrating agents, corrosion inhibitors, dyes or adhesives previously cited.
  • insecticide compositions according to the invention in the form of concentrated suspensions, also applicable in spraying are prepared so as to obtain a fluid, stable product, which does not deposit; they usually contain from 2 to
  • active ingredient 75% active ingredient, 0.5 to 15% surfactants, 0.1 to 10% agents thixotropic, from 0 to 10% of suitable additives, such as anti-foaming agents, corrosion-inhibiting agents, stabilizing agents, penetrating agents and adhesives; and, as a support, water or an organic liquid in which the active material (s) is sparingly or not soluble, or alternatively mixtures of several of these solvents, organic or not.
  • suitable additives such as anti-foaming agents, corrosion-inhibiting agents, stabilizing agents, penetrating agents and adhesives
  • Certain solid organic matter or mineral salts can be dissolved in the support to slow down or prevent sedimentation; or even such materials can be used as antifreeze agents for water.
  • insecticidal compositions according to the invention which take the form of wettable or sprayable powders are usually prepared so that they contain from 20 to 95% of active ingredients.
  • ком ⁇ онентs usually contain, in addition to a solid support, from 0 to 5% of a wetting agent, from 3 to 10% of a dispersing agent, and, where appropriate, from 0 to 10% of one or more stabilizers and / or other additives, such as penetrating agents, adhesives, or anti-caking agents, coloring agents, etc.
  • the active ingredient (s) are intimately mixed in appropriate mixers with the additional substances, and are ground with mills or other suitable grinders. Powders to be sprayed are thus obtained, the wettability and the suspension of which are particularly advantageous.
  • They can be suspended with water at any desired concentration.
  • insecticide compositions according to the invention can be produced which are in the form of pastes.
  • aqueous dispersions and emulsions for example the insecticidal compositions obtained by diluting with water a wettable powder or an emulsifiable concentrate according to the invention, are included in the general scope of the present invention .
  • the emulsions can be of the water-in-oil or oil-in-water type and they can have a thick or fairly thick consistency.
  • compositions according to the invention can take many forms of formulations; thus, one can use these compositions comprising an insecticidal compound in aerosol generator; bait (ready to use); concentrate for bait preparation; bait in stock; suspension of capsules; product for cold nebulization; powder for dusting; emulsifiable concentrate; aqueous / aqueous type emulsion; oily / reverse type emulsion; encapsulated granule; fine granulate; concentrated suspension for seed treatment; compressed gas; gas generating product; bait on grain; granulated bait; granulated; product for hot nebulization; macrogranulate; microgranulated; powder to disperse in oil; concentrated suspension dilutable in oil; liquid miscible in oil; dough ; stick for agropharmaceutical use; bait in wafer; powder for dry seed treatment; broken bait; treated or coated seeds; smoke candle; smoke cartridge; smoke; smoke granule; smoke stick; smoke tablet; smoke box; soluble concentrate;
  • the invention also relates to a process for obtaining insecticidal toxins comprising: - obtaining at least one host cell as described above,
  • the invention also relates to a strain comprising a vector as described above, deposited at the CNCM on July 12, 2001 under the reference plgl ⁇ gl CNCM 1-2698, a strain comprising a vector as described above, deposited with the CNCM on July 12, 2001 under the reference plbac ⁇ cl 1 CNCM 1-2700 and a strain comprising a vector as described previously, deposited with the CNCM on July 12, 2001 under the reference plgl4a7: CNCM 1-2697.
  • the library of BACs containing DNA fragments of Photorhabdus was screened in full in order to identify clones of Escherichia coli having insecticidal activity.
  • This bank constructed using the vector pBeloBACl 1, was deposited (CNCM n ° 1-2478) on July 12, 2001.
  • the inventors have thus succeeded in identifying a clone (BAC8C1 1) having entomotoxic activity in particular on larvae of Plutella xylostella (lepidoptera).
  • the inventors carried out entomopathogenic activity tests using this BAC on different species of lepidoptera, demonstrating their effectiveness in particular in Plutella xylostella, Ostrinia nubilalis (corn), Heliothis virescens (tobacco), Helicoverpa zea (corn) , Spodoptera.
  • the inventors used the DNA of the TT01 strain of Photorhabdus luminescens to undertake the sequencing of its genome, the size of which is estimated at 5.7 million base pairs.
  • Different genomic DNA libraries of Photorhabdus luminescens have been constructed for these purposes. From clones of these different libraries, 65,000 sequence readings of approximately 500 quality base pairs were performed - corresponding to a coverage of 7 times the length of the genome -, thus covering approximately 98-99% of this genome with non-redundant sequences. The assembly of these sequences using computer tools (Ewing B. et al., 1998, Génome Res., 8: 175-185; Ewing B.
  • the contigs obtained were linked using different techniques briefly summarized below. - Using vectors with low number of copies, a "scaffold" was constructed covering the entire genome. In order to achieve this, the inventors used genomic DNA libraries of Photorhabdus luminescens in particular a library constructed using vector BAC (one copy per cell), the average sizes of the inserted DNA fragments being approximately 50 kb. The sequencing of the ends of these fragments allows the prediction of the links between adjacent contigs.
  • the inventors have prepared a genomic DNA library of the TT01 strain of
  • Plasmid pSYX34 was prepared by carrying out in parallel two midipreps, KIT QIAGEN according to the conditions recommended by the manufacturer.
  • the chloroform extraction makes it possible to stop the enzymatic digestion, and to eliminate all protein traces.
  • the nucleotides are thus diluted to 1/10, we have a concentration of 10 mM.
  • a second 1/10 dilution in 10 mM TRIS buffer will be made; we therefore have a concentration of 1 mM.
  • the nucleotides are diluted 1/20 (2.5 ⁇ l in 50 ⁇ l). The final concentration is indeed 50 ⁇ M in nucleotides.
  • a dry pellet of genomic DNA from the TTOl strain was taken up in 200 ⁇ l of TE 10: 1 and then dissolved for 30 minutes at 65 ° C. Its concentration has been estimated at 0.15 ⁇ g / ⁇ l.
  • B.2 Partial digestion of genomic DNA by the restriction enzyme Sau3A
  • the chloroform extraction makes it possible to stop the enzymatic digestion, and to eliminate all protein traces.
  • Vortex centrifuge for 1 min at 1000 rpm Recover the aqueous phase, upper phase, containing chromosomal DNA.
  • the nucleotides are thus diluted to 1/10, we have a concentration of 10 mM.
  • a second 1/10 dilution in H2O will be made, so there is a concentration of 1 mM.
  • the chloroform extraction makes it possible to stop the enzymatic digestion, and to eliminate all protein traces. After digestion, 53 ⁇ l of chromosomal DNA are recovered.
  • Chloroform extraction eliminates all protein traces.
  • the clone 8C1 1 (CNCM deposit 1-2700), the size of the inserted fragment of which is 22.5 kb, comprises the gene coding for SEQ ID No. 3, flanked by the gene coding for SEQ ID No. 5.
  • E. coli DH10B strain, containing a plasmid pBeloBACl 1 were cultured overnight in 5 ml LB + chloramphenicol at 28 ° C with stirring at 200 rpm. The OD 40 of each culture was systematically taken. Each culture is diluted with LB until a concentration of 5 ⁇ 10 7 bacteria / ml is obtained. Six leaves (3 cm in diameter) are incubated in a culture diluted for one hour with 0.05% Tween 20 (Sigma). The treated leaves are placed in 6-well plates and 5 larvae are placed in each well, ie 30 larvae tested per clone. Each well contains an agar support containing 15 g / l of agar (Difco) and 1.5 g / l of antifungal (nipagine, Sigma).
  • the larvae used for this test are larvae in the late phase of the L2 stage (2 nd larval stage), selected just before their moult towards the L3 stage.
  • the inventors observed that the larvae were clearly more sensitive to the bacterium at this stage L2 and that the tests there were much more reproducible.
  • Strains from two different geographic origins (Benin B, Martinique M) of Plutella xylostella were used and the results were observed depending on the strain used.
  • the larval mortality rate was corrected for the negative control using the Abbott equation (Abbott W.S., 1925, J. Econ. Entomol., 18: 265-267).
  • the results on the larvae of Plutella xylostella are linked to the strain, and to its stage of development. This explains why some clones may not give positive results in other tests.

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Abstract

L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, des procédés d'obtention de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes ravageurs des cultures ou nuisibles (car vecteurs de maladies) pour l'homme et les animaux, des plantes transformées exprimant de telles toxines.

Description

PROTEINES INSECTICIDES PHOTORABDUS LUMINESCENS
L'invention concerne notamment des séquences nucléotidiques isolées de Photorhabdus luminescens, des toxines codées par lesdites séquences, des procédés d'obtention de telles toxines, des compositions comprenant de telles toxines destinées à la lutte contre des insectes, des plantes transformées exprimant de telles toxines.
De très nombreux types d'insectes sont à l'origine de graves dégâts sur les plantes de grande culture, notamment céréalières, florales, fruitières. Il existe un très grand nombre d'agents insecticides chimiques destinés à lutter contre les insectes. Toutefois, certains des produits existants posent des problèmes de sélectivité contre telle ou telle catégorie d'insectes et de résistance contre ces substances.
Différentes techniques alternatives ont été développées, en particulier la lutte biologique par d'autres insectes ou par des agents biologiques tels que des bactéries capables de produire des toxines insecticides. On connaît également des plantes transgéniques exprimant de telles toxines insecticides.
Par exemple, le document WO 99/54472 décrit des toxines insecticides isolées de Xenorhabdus nematophilus, et des séquences nucléotidiques codant pour de telles toxines.
Le document US 6,281,413 décrit des toxines insecticides isolées de Photorhabdus luminescens. Photorhabdus luminescens est une bactérie entomopathogène, commensale intestinale d'un nématode du genre Heterorhabditis.
Ces nématodes colonisent les larves d'insectes qu'ils détruisent et sur lesquelles ils se développent.
Le document WATERFIELD NICHOLAS R. et al. (Trends Microbiol., 2001 Apr., 9(4): 185-91) a pour objet une comparaison de séquences nucléotidiques te (toxin complex gènes) codant pour des toxines bactériennes. Notamment, les séquences nucléotidiques codant pour des toxines insecticides de Photorhabdus luminescens sont divulguées sous leur numéro d'accessibilité GenBank: Accession numbers: AQ991079, AQ989921, AQ989724 et AQ991 166. II existe toujours un besoin important de trouver des toxines efficaces contre les insectes nuisibles, en particulier contre des lépidoptères. L'invention vise à obtenir des plantes et/ou des compositions contenant de telles toxines capables d'inactiver ou de détruire des insectes. L'invention concerne également l'utilisation de telles toxines, pour des traitements -préventifs ou curatifs- des cultures contre des ravageurs.
A cet effet, les inventeurs ont réussi à identifier à l'aide d'une banque de BAC
(chromosome artificiel bactérien), préparée à partir de Photorhabdus luminescens, des séquences nucléotidiques codant pour des toxines insecticides particulièrement efficaces contre des lépidoptères appartenant notamment aux genres Plutella, Heliothis,
Helicoverpa, Spodoptera, Ostrinia.
A cet effet, l'invention a pour objet selon un premier aspect une séquence nucléotidique isolée de Photorhabdus luminescens comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
La séquence SEQ ID N° 2 correspond aux nucléotides nt 20872 à nt 21306 de la séquence SEQ ID N° 1 qui est la séquence nucléotidique d'un BAC, désigné BAC8C1 1, déposé à la CNCM le 12 Juillet 2001 sous le numéro 1-2700. Le BAC8C1 1 est un fragment d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens subsp. laumondii, souche TTOl (Fischer - Le Saux M. et al., 1998 - Appl. Environ. Microbiol., vol. 64, 4246), clone dans le vecteur pBeloBACl l (Kim V. J. et al., 1996, Genomics, vol. 34, 213) dans la bactérie E. coli DH10B TH (Calvin N. M. and Hanawalt P. C, 1998, J.Bacteriol., 170, 2796). La séquence SEQ ID N° 4 correspond aux nucléotides nt 21345 à nt 22598 de la séquence SEQ ID N° 1 de ce BAC8C1 1.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques choisies parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70 % d'identité avec SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie en a) ou b) ; d) un fragment représentatif d'une séquence définie en a), b) ou c), d'au moins 10 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e) ; de préférence, ladite séquence code pour au moins un polypeptide actif contre des insectes. Dans le présent document, on utilisera l'expression « séquence nucléotidique à expression insecticide » pour désigner ces séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, et les séquences variantes définies en a) à f).
La séquence SEQ ID N° 2 est la séquence nucléotidique d'un cadre ouvert de lecture désigné ORF1 (435 nucléotides) et code pour la protéine de 144 acides aminés de séquence SEQ ID N° 3.
La séquence SEQ ID N° 4 est la séquence nucléotidique d'un cadre ouvert de lecture désigné ORF2 (1254 nucléotides) et code pour une protéine de 417 acides aminés de séquence SEQ ID N° 5.
Les séquences SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5 se distinguent nettement de l'art antérieur. Aucune similarité significative n'a été identifiée, en utilisant par exemple le programme BESTFIT connu de l'homme du métier, entre ces séquences et les séquences SEQ ID N° 12, N° 13, N° 14 du document
US 6,281,413.
Seule une faible similarité (inférieure à 50 %) entre la séquence SEQ ID N° 3, et la protéine codée par l'ORFl du document WO 99/54472 (SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 13) a été notée.
De même, seule une faible similarité (inférieure à 50 %) entre la séquence SEQ ID N° 5, et les protéines codées par l'ORF 2 du document WO 99/54472 (SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 1 1, SEQ ID N° 14) a été notée. Par l'expression « activité insecticide » ou « composé actif contre des insectes », on entend que les toxines sont capables de lutter contre des insectes, en les tuant ou en les inactivant par exemple par une baisse ou une perte d'appétit vis-à-vis des plantes d'intérêt cultivées. Le résultat est typiquement la destruction, ou la baisse de croissance et/ou de la reproduction de l'insecte nuisible cible. Par insecticide, on entend également « biopesticide ».
La liste d'insectes lépidoptères ci-dessus n'est pas exhaustive : l'efficacité insecticide des séquences selon l'invention sur d'autres insectes peut être criblée sans effort excessif par l'homme du métier, maintenant que sont connus le BAC8C11 et le protocole de test d'activité biologique, notamment à l'aide des techniques appropriée présentées dans la description détaillée, en particulier de l'exemple 2. Des tests semblables, utilisant par exemple une autre espèce d'insecte cible, permettent également de mesurer ladite activité insecticide.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN. Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel, et sont naturels ou artificiels.
Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère des séquences nucléotidiques comprenant SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 (en particulier qui diffère des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4), par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucleotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues possèdent une activité insecticide telle que décrite précédemment. De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 70, 75 % des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4, de préférence au moins 80, 85 %, de préférence encore au moins 90, 92, 95, 98, 99 %.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends Guide, 1998:5:7-9, notamment les algorithmes de Karlin et Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 872264, modifié dans Karlin et Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877. On pourra utiliser en particulier les programmes :
- BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17):3389- 3402),
- FASTA (Altschul S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410),
- Clustal W (Thompson, J. D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-80),
- BESTFIT. L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBI http:ww.ncbi.nih.gov.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire d'une séquence codant pour une toxine insecticide, dans des conditions stringentes. On utilisera par exemple les conditions suivantes :
(1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20mM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCl + 0.015 M de citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 42°C pour une sonde de taille supérieure à 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2X SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0. IX SSC + 0.1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0. IX SSC + 0.1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille supérieur à 100 nucléotides.
Les conditions d'hybridations de fortes stringences décrites ci-dessus peuvent être adaptées par l'homme du métier pour les polynucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon les enseignements appropriés connus de l'homme du métier, notamment décrit dans Sambrook et al., 1989, Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor ; Maniatis et al., 1982, Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab.CSH, N.Y. USA, ou l'une de ses récentes rééditions, et dans Ausubel et al., Eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y.).
Par « fragment nucléotidique », on entend d'une part tout fragment d'une séquence nucléotidique comprenant SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 (et en particulier tout fragment de SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4), ou tout fragment de séquences homologues à ces séquences, lesdits fragments codant pour un peptide à activité insecticide telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 10, 15, 30, 45, 75, 150, 300 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus. De préférence, ces fragments nucléotidiques codent pour des peptides présentant une activité insecticide de préférence d'au moins 10, 20, 30, 50, 80, 90 %, voire plus de 100 %, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 5 codées par les séquences à expression insecticide SEQ ID N° 2 et SEQ ID N° 4. Pour tester cette activité insecticide, l'homme du métier dispose notamment de la méthode présentée dans les exemples détaillés décrits ci-après. Le présent document enseigne ainsi à l'homme du métier d'utiliser également les fragments ou les homologues définis précédemment, notamment d'utiliser les éléments fonctionnels de ces séquences qui déterminent l'expression insecticide, et donc de ne pas utiliser nécessairement les éléments non essentiels à cette expression. L'invention concerne ainsi selon un aspect les séquences nucléotidiques qui comprennent au moins un tel fragment et codent pour un polypeptide ayant une activité insecticide.
Par fragments représentatifs selon l'invention on entend également des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques d'amplification du type PCR (décrite par exemple dans le document US 4,683,202) ou PCR like, comme par exemple les techniques connues de l'homme du métier SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription- based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction). Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant au moins 10 bases, de préférence au moins 15, 20, 25 et 30 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible. De telles sondes seront en particulier utilisables dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'intégration du gène de la toxine dans la plante transformée. Pour cela au moins une de ces sondes est marquée, par exemple par un isotope radioactif, puis mise en contact avec de l'ADN génomique de la plante, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de la sonde marquée à l'ADN en question.
Ainsi, la présente invention a également pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques de fragments représentatifs de la séquence SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4, ou de leur séquence complémentaire comme amorces ou sondes pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification des séquences SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4 ou de leur séquence complémentaire. Les procédés visant de telles utilisations mettant en œuvre ces dits fragments en tant qu'amorces ou sondes font également partie de l'invention.
Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue typiquement par mutagenèse selon des techniques appropriées, et comportant des modifications par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N° 2 et SEQ ID
N° 4, ou de séquences variantes (séquences nucléotidiques définies en a) à e) précédemment). Ces modifications peuvent entraîner selon une variante préférée une augmentation du niveau d'expression insecticide. On peut par exemple utiliser la mutagenèse dirigée site spécifique, décrite dans Upender et al., 1995, Biotechniques
18(l):29-30, ou des techniques de mutagenèse du type DNA shuffling décrite dans le document US 5,605,793. On peut par exemple obtenir des séquences mutées de SEQ ID
N° 2 et SEQ ID N° 4, par délétions, et cribler des mutants actifs pour identifier des régions toutes particulièrement associées au niveau d'activité insecticide. L'invention concerne selon un autre aspect un polypeptide insecticide codé par une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment.
L'invention concerne également les polypeptides choisis parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 87 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15, 20, 23, 25, 30, 40, 50, 100 amino acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), ou b) ; d) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c) ; de préférence, ledit polypeptide a une activité insecticide telle que décrite précédemment.
On emploie dans ce texte indifféremment le terme polypeptide insecticide ou toxine insecticide pour désigner un polypeptide selon l'invention ayant une activité insecticide (plus exactement biopesticide) telle que décrite précédemment. Le terme polypeptide est utilisé pour désigner également une protéine ou un peptide.
De préférence, un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimum 15 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 20, 25, 30, 40, 50, 100 amino acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention.
Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés « équivalents ». L'expression acide aminé « équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles souhaitées, en l'occurrence n'entraînant pas une perte de l'activité insecticide. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de Parginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d 'amino acides. Un polypeptide variant, un polypeptide homologue ou un fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence au moins 20, 30, 50, 80, 90 %, voire plus de 100, 120, 150 %, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 5.
L'invention concerne également les séquences nucléotidiques codant pour les polypeptides tels que décrits précédemment.
L'invention concerne, selon un autre aspect, une cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle dans la plante transformée à une séquence nucléotidique selon l'invention codant pour une toxine insecticide, et à une région de terminaison de la transcription. La préparation d'une cassette d'expression ADN peut être réalisée de différentes manières appropriées par l'homme du métier. Brièvement, au moins une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que définie précédemment, peut être clonée en aval du promoteur en utilisant des enzymes de restriction pour assurer son insertion dans une orientation appropriée au regard du promoteur de manière qu'il soit exprimé. Une fois cette séquence liée opérationnellement au promoteur, la cassette d'expression ainsi formée peut être clonée dans un plasmide ou autre vecteur. La séquence promoteur contrôle la transcription en un ARN messager fonctionnel codant pour d'une protéine insecticide. La cassette d'expression peut être chimérique ou naturelle, mais typiquement elle est hétérologue vis-à-vis de l'hôte, ce qui implique l'introduction dans l'hôte par une transformation. On connaît un grand nombre de promoteurs de plantes, rappelés notamment dans le document WO 01/70778. On peut utiliser un promoteur constitutif ou inductible, un promoteur spécifique d'un tissu, d'un organe, d'un stade de développement, par exemple spécifique du phloème afin de lutter contre des insectes qui prélèvent la sève élaborée.
Selon un mode de réalisation, l'expression du gène d'intérêt est régulée, en plus de par la séquence promoteur, par l'utilisation de séquences appropriées capables de renforcer l'activité de cette séquence promoteur, telles que des introns, par exemple l'intron de l'actine 1 ou 2, l'intron DSV de la mosaïque jaune du tabac (Morris et al., 1992, Virology, 187:633), des séquences « enhancers », par exemple certains éléments du promoteur CaMV35S et de gènes de l'octopine synthase (US 5,290,924), des séquences « leaders » (typiquement des séquences situées entre le site d'initiation de la transcription et le début de la séquence codante, en particulier des séquences leader consensus qui stabilisent l'ARNm et empêchent une initiation inappropriée de la transcription), par exemple le leader EMCV (Leroy-Stein et al., 1989, PNAS USA, 86:6126-6130), le leader TMV (Gallie et al., 1989, Molecular Biology of RNA, pages 237-256). Parmi les séquences terminateurs, on peut citer le terminateur nos (réf: Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res., 1 1(2):369-385, et le terminateur de gène d'histone (EP 0 633 317). Selon une variante, la cassette d'expression contient des séquences d'adressage subcellulaire, en particulier une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion de la protéine, ou une séquence codant pour un peptide de transit adressant la toxine dans les chloroplastes (par exemple le peptide de transit optimisé décrit dans EP 0 508 909). Selon un autre aspect, l'invention concerne un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une cassette d'expression telle que décrite précédemment. Selon une réalisation, le vecteur est un type virus et comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'invention, liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié. Selon un autre aspect, l'invention concerne une cellule hôte transformée avec les séquences nucléiques décrites ci-dessus. Selon un autre aspect, l'invention concerne une cellule hôte comprenant une telle cassette d'expression. Typiquement l'organisme hôte est une bactérie, une levure, une cellule de plante, un champignon.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide mettant en oeuvre au moins un vecteur ou une cellule tels que décrits précédemment. L'invention concerne aussi un polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par ce procédé.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé de préparation d'un polypeptide synthétique utilisant une séquence d'acides aminés d'un polypeptide insecticide tel que défini précédemment.
Selon un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation d'une séquence nucléotidique, d'un vecteur, d'une cellule hôte tels que décrit précédemment pour la biosynthèse de polypeptides insecticides. Le terme « une » fait bien entendu référence à « au moins une ». Selon un autre aspect, l'invention concerne les séquences nucléotidiques selon l'invention, enregistrées sur un support, dénommé support d'enregistrement, dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et l'exploitation desdites séquences. On pourra préférer parmi ces supports des supports lisibles par un ordinateur, tels que les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides comme par exemple les disquettes ou disques « floppy », les CD-ROM ou les cassettes d'enregistrement.
Selon un autre aspect, l'invention concerne les cellules végétales transformées par un vecteur tel que défini précédemment.
La transformation des plantes peut être obtenue par différentes techniques appropriées connues de l'homme du métier, notamment rappelées dans les références : Ed. DUNOD Physiologie végétale, Tome 2 Développement Heller, Esnault et Lance, 2000, Methods of Molecular Biology: Plant gène transfer and expression protocols ; Hansen et al., 1999, Récent advances in the transformation of plants, Trends in plant science, vol. 4, n° 6, 226, S.B. Gelvin, The introduction and expression of transgenes in plants, Current opinion in biotechnology, 1998, 227 ; Hellens et al., 2000, Trends in plant science, vol. 5, n° 10, A guide to Agrobacterium binary Ti Vectors, 446 ; Franken et al., Recombinant proteins from transgenic plants, Current opinion in biotechnology, 8:41 1-416 ; Schuler et al., 1998, Insect-resistant transgenic plants, Tibtech, vol. 16, 168 ; Michelmore. M, 2000, Genomic approaches to plant disease résistance, Current opinion in biotechnology, 3:125-131.
Le terme transformation fait référence à une manipulation génétique de cellules végétales susceptibles d'être transformées tels que des cellules de cals, d'embryons, des cellules en suspension dans des cultures (cultures issues par exemple de cals, d'embryons, de tissus de feuilles, d'inflorescences jeunes, d'anthères) des plantes. Le terme "transgénique" ou "transformée" en référence à une cellule de plante, une partie de plante, fait référence à ces éléments comprenant un segment d'ADN (de manière préférée une séquence nucléotidique ou une cassette d'expression selon l'invention) présélectionné isolé purifié qui a été introduit dans ledit élément par une méthode de transformation génétique.
On citera notamment : la transformation de protoplastes, les techniques biolistiques ou de bombardement de microprojectiles, la transformation à l'aide de bactéries notamment d' Agrobacterium ou de vecteurs viraux, des procédés directement in planta.
Dans le cas d'une transformation de protoplastes, les protoplastes sont typiquement isolés, soit mécaniquement, soit par voie enzymatique pour séparer les parois cellulaires. Les protoplastes sont obtenus typiquement à partir de lignées cellulaires de cals obtenues d'embryons immatures, d'inflorescences immatures, de mésocotyles, d'anthères. Les protoplastes peuvent être transformés par Agrobacterium ou par insertion directe d'ADN facilitée par un traitement au polyéthylène glycol ou par électroporation (Lazzeri, Methods Mol. Biol., 49:95-106,1995). Dans certaines espèces, on peut isoler les protoplastes de mésophylles, méthode qui permet d'obtenir des résultats indépendants du génotype. Parmi les méthodes biolistiques rappelées dans Finer et al., T. Particle bombardment-mediated transformation, Current Topics in Microbiology and Immunology, Vol. 240, on pourra utiliser notamment le bombardement par canon de particules recouvertes de l'ADN plasmidique d'intérêt, en particulier en utilisant un canon à particules de tungstène ou d'or. On pourra préférer aux méthodes biolistiques des méthodes agrolistiques décrites dans Hansen et al., Agrolistic transformation of plant cells: intégration of T- strands generated in planta. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93: 14978-14983, notamment afin d'intégrer un faible nombre de copies du transgène.
De nombreuses techniques de transformation utilisant Agrobacterium sont utilisables, telles que celles décrites dans le document Zupan, J. et al., 2000, The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights. Plant J., 23: 11-28 ; US 6,037,522 ; US,6,265,538. La transformation par Agrobacterium tumefaciens peut être effectuée pour des Dicotylédones (tabac, pomme de terre) et des Monocotylédones (blé, orge, sorgho, maïs, riz notamment) même si ces dernières ne sont généralement pas leur hôte naturel. On utilisera notamment des techniques connues pour le blé (McCormac et al., Euphytica, vol. 99( 1): 17-25, 1998), le maïs (Ishidia et al.,1996, Nat. Biotechnol.,14(6):745-750,1996).
En outre, dans la mesure où l'intégration des gènes se fait essentiellement au hasard dans le génome, on observe souvent une variabilité entre les plantes transgéniques. On cherchera à obtenir de préférence des transformants comprenant une copie unique du transgène, ségrégée comme un caractère mendélien avec une expression uniforme d'une génération à la suivante. On recherche ainsi une expression stable du transgène avec un niveau d'expression souhaité.
L'homme du métier connaît un grand nombre de plasmides utilisables dans le cadre de l'invention, rappelés notamment dans le document Trends in plant science, Oct. 2000, vol. 5, n° 10, p 446, et adaptera les conditions de transformation au plasmide utilisé. On pourra par exemple utiliser de manière préférée, certains plasmides Ti binaires, tels que pBIN19, pMON, pGREEN, dont la séquence accessible permet la définition de cartes de restriction précise.
La transformation dite in planta, décrite notamment dans Bechtold et al., 1993, In planta Agrobacterium-mediated gène transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants, C.R. Acad. Sci., Paris, Life Sciences, 316: 1 194-1199, et Clough et al., 1998, Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana, Plant J., 16:735-743, a l'avantage de ne pas nécessiter d'étape de culture de tissus. Le transgène est introduit dans des plantes intactes sous forme d'ADN nu ou par Agrobacterium, généralement au stade de la formation du zygote.
Les techniques et les agents pour sélectionner les cellules végétales et/ou les tissus végétaux incorporant des séquences nucléotidiques marqueurs associées au gène d'intérêt sont également bien connues de l'homme de métier, et comprennent, de manière non exclusive, l'utilisation de gènes marqueurs tels que des gènes conférant des résistances à un antibiotique ou à des herbicides, ou de systèmes de sélection positive, cités par exemple dans Gelvin 1998, en particulier le système basé sur une sélection sur mannose, en présence du gène de sélection de la MPI (Mannose-6-phosphate isomérase) (Hansen et Wright, 1999), ou de systèmes de sélection couplés à l'élimination des gènes marqueurs après sélection (Ebinuma et al., 1997). Enfin, les plantes transformées peuvent également être sélectionnées par criblage PCR en l'absence de gènes marqueurs de sélection (McGarvey et Kaper, 1991). Selon un autre aspect l'invention concerne un procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine insecticide selon l'invention dans ses tissus, comprenant l'introduction d'une cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression. Ladite cassette est intégrée de manière stable dans le génome.
Selon une réalisation le procédé comprend en outre l'identification et la sélection des cellules transformées capables de régénérer des plantes exprimant des toxines insecticides par rapport à une plante non transformée. La sélection de produits de la transformation, c'est-à-dire résultant immédiatement du processus de transformation, et des plantes transgéniques en résultant, peut être réalisée de différentes manières. Les techniques de croissance de cultures de plantes sont connues de l'homme du métier, par exemple dans McCormick, 1986, Plant Cell Reports, 5:80-84. L'ADN recombinant comprenant au moins une séquence nucléotidique selon l'invention est transmis au cours d'un cycle de reproduction de la plante transgénique à sa descendance de manière à être exprimé dans les plantes de la descendance. L'invention concerne donc également les tissus ou parties de plantes, plantes, ou graines contenant les séquences d'acide nucléique selon l'invention décrites précédemment. Le terme "tissu de plante" fait référence à n'importe quel tissu d'une plante, dans une plante ou dans une culture. Ce terme inclut des plantes entières, des cellules de plantes, des organes de plantes, des graines de plantes, des protoplastes, des cals, des cultures de cellules et toutes autres cellules de plantes organisées en tant qu'unité fonctionnelle et/ou structurelle. Des parties de plantes régénérées telles que des fleurs, des graines, des feuilles, des tiges, des fruits, du pollen, des tubercules et analogues sont également dans le cadre de l'invention.
Les tissus, parties de plantes, plantes ou graines, sont résistants aux insectes. L'invention inclut les plantes transgéniques fertiles obtenues ainsi que leur descendance et le produit de cette descendance. Les plantes transgéniques hybrides, obtenues par le croisement d'au moins une plante selon l'invention avec une autre, font aussi partie de l'invention. Les plantes transgéniques selon l'invention comprennent notamment une plante transgénique TO ou RO, c'est-à-dire la première plante générée à partir de cellules de plantes transformées, la plante transgénique TI ou RI c'est-à-dire la première génération de descendance, et les plantes de la descendance de générations suivantes obtenues qui comprennent et expriment l'ADN recombinant. Par exemple, on procédera selon les étapes suivantes :
- obtention de plantes parentes d'une première lignée, et d'une deuxième lignée (lignée donneuse comprenant un transgène selon l'invention),
- pollinisation de fleurs du premier parent par le pollen du deuxième parent,
- récolte des graines produites par le premier parent.
On peut effectuer des backcross afin d'obtenir l'intégration de l'ADN insecticide d'intérêt. Pour confirmer la présence de la cassette d'expression, et en particulier du gène de toxine insecticide, selon l'invention dans les plantes régénérées, on peut utiliser un grand nombre de techniques appropriées, par exemple l'analyse PCR ou des techniques d'hybridation Southern blot, pour déterminer la structure de l'ADN recombinant, la détection de l'ARN transcrit à partir de l'ADN du gène d'intérêt exprimé dans des cellules de plantes transformées, des techniques de repérage de la production de protéines codées par le gène d'intérêt, telles que l'électrophorèse de protéines sur gel, des techniques Western blot.
Les plantes transformées selon les méthodes décrites peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, la pomme de terre, le pois, le soja, le tabac, le colza, la tomate, le tournesol, le coton, le riz, le haricot, le chou-fleur, le brocoli, la laitue, le radis, le céleri, l'épinard, l'oignon, l'ail, la carotte, la pomme, la poire, le melon, la cerise, la pêche, l'abricot, la framboise, la fraise, l'ananas, l'avocat, la banane, la canne à sucre.
L'homme du métier sera en outre capable d'augmenter le niveau de production par les plantes transformées en augmentant le contenu en base GC des séquences codantes. En outre l'homme du métier utilisera des séquences le cas échéant modifiées pour obtenir une expression appropriée selon qu'il s'agisse de plantes monocotylédones ou dicotylédones.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet une composition pour la lutte contre des insectes nuisibles ainsi que des procédés mettant en œuvre de telles compositions, ces compositions comprenant une toxine insecticide ou composé insecticide selon l'invention telle que décrite précédemment. Par composition insecticide on entend comprenant comme matière active une quantité efficace non phytotoxique de toxine insecticide selon l'invention en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture.
Au sein des différentes variantes de compositions insecticides selon la présente invention, le composé insecticide est mis en œuvre dans des quantités efficaces mais non phytotoxiques. Par quantité efficace et non phytotoxique, on entend une quantité de matière active suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des insectes présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon l'insecte à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés compris dans la composition insecticide selon l'invention. Cette quantité peut aisément être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.
Selon une réalisation, une composition insecticide au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment.
Pour leur emploi dans la pratique, les différentes compositions insecticides selon l'invention sont typiquement associées à un support, solide ou liquide, utilisable dans le domaine de l'agriculture, et éventuellement à au moins un agent tensioactif et/ou un ou plusieurs agents auxiliaires. En particulier, comme supports, sont utilisables les supports inertes et usuels ; de même que, comme agents tensioactifs, sont utilisables les agents tensioactifs usuels dans le domaine de la mise en formulation de compositions destinées à des usages en agriculture, notamment pour le traitement ou la protection des cultures. Les compositions insecticides selon l'invention comprennent typiquement entre
0,00001 et 100 %, de préférence entre 0,001 et 80 %, de composé insecticide. Les proportions et pourcentages employées ou décrits dans ce texte sont des proportions ou pourcentages en poids.
Par le terme support, dans le présent exposé, on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est associée pour faciliter son application, notamment sur la plante, ou encore sur des graines ou sur le sol. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture, notamment par la plante traitée. Le support éventuellement mis en œuvre pour la formulation de compositions selon l'invention peut être solide ou liquide. Comme exemples de supports solides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner les silicates naturels ou synthétiques, les résines, les cires, les poudres fines ou les granules d'argile, notamment d'argile kaolinique, de terre de diatomées, de bentonite ou d'argile acide, l'oxyde de silicium hydraté synthétique, les talcs, les céramiques, d'autres minéraux dont la séricite, le quartz, le soufre, le charbon actif, le carbonate de calcium, la silice hydratée, ou encore les engrais industriels comme le sulfate d'ammonium, le phosphate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, l'urée ou le chlorure d'ammonium.
Comme exemples de supports liquides utilisables pour la formulation de compositions selon l'invention, on peut mentionner l'eau, les alcools et notamment le méthanol ou l'éthanol, les cétones et notamment l'acétone, la méthyléthylcétone ou la cyclohéxanone, les fractions de pétrole, les hydrocarbures aromatiques dont le benzène, le toluène, le xylène, l'éthylbenzène ou le méfhylnaphtalène, les hydrocarbures non aromatiques dont l'hexane, le cyclohexane, le kérosène ou le gazole, le gaz liquéfié, les esters dont l'acétate d'éthyle et l'acétate de butyle, les nitriles dont l'acétonitrile et l'isobutyronitrile, les éthers dont l'éther diisopropylique ou le dioxanne, les amides dont le N,N-diméthylformamide ou le N,N-diméthylacétamide, les hydrocarbures halogénées dont le dichlorométhane, le trichloroéthane ou le tétrachlorure de carbone, le diméthylsulfoxyde, les huiles végétales dont l'huile de soja ou l'huile de coton.
La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement appropriée lorsque au moins une des matières actives et/ou le support inerte ne sont pas solubles, notamment dans l'eau, dans le cas où l'agent vecteur de l'application est l'eau. L'agent tensioactif peut être un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique.
On peut, par exemple, citer des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylène sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des aminés grasses, des phénols substitués, notamment des alkylphénols ou des arylphénols, des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine, notamment des alkyltaurates, des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés ; on peut tout particulièrement citer les sels d'alkylsulfonates, les alkylarylsulfonates, les éthers alkylaryliques, leurs dérivés polyoxyéthyléniques, les polyéthylèneglycoléthers, les esters de polyalcools, les dérivés de sucres, alcools et autres.
Les compositions insecticides selon l'invention peuvent également contenir toute sorte d'autres ingrédients ou agents tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des agents épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des agents stabilisants dont le phosphate acide d'isopropyle, le 2,6-di-tert- butyl-4-méthylphénol, le 2-tert-butyl-4-méthoxyphénol et le 3-tert-butyl-4- méthoxyphénol, des huiles végétales ou minérales, des acides gras ou leurs esters, des agents séquestrants, des agents dispersants dont la caséine, la gélatine, des saccharides et notamment la poudre d'amidon, la gomme arabique, certains dérivés de la cellulose ou l'acide alginique, des dérivés de la lignine, la bentonite, des polymères synthétiques solubles dans l'eau, notamment l'alcool polyvinylique, la polyvinylpyrrolidone, les acides polyacryliques, etc., ainsi que d'autres matières actives connues pour leurs propriétés pesticides, notamment insecticides ou fongicides ; ou pour leurs propriétés favorisant la croissance des plantes, notamment des engrais ; ou pour leurs propriétés régulatrices de la croissance des plantes ou des insectes.
Plus généralement, le composé insecticide peut être associé à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation, particulièrement la mise en formulation de produits ou compositions destinées à des usages ou à des utilisations en agriculture ou en hygiène publique.
Ainsi, les compositions selon l'invention peuvent prendre la forme d'assez nombreuses formulations parmi lesquelles on peut citer les solutions huileuses, les concentrés émulsionnables, les poudres mouillables, les formulations fluides et notamment les suspensions aqueuses ou les émulsions aqueuses, les granulés, les poudres, les aérosols, les formulations pour nébulisation notamment les formulations pour brumisation, les formulations à très bas volume, les pâtes, les émulsions, les suspensions concentrées, de même que d'éventuels mélanges, associations ou combinaisons de ces différentes formes.
Le plus souvent, pour les formulations de type poudres pour poudrage ou dispersion, la teneur en composé insecticide peut aller jusqu'à 100 % ; de même, pour les formulations sous forme de granulés, notamment ceux obtenus par extrusion, par compactage, par imprégnation d'un support granulé, par granulation à partir d'une poudre, la teneur en composé insecticide dans ces granulés est le plus souvent comprise entre 0,5 et 80 %.
Les compositions insecticides selon l'invention, dites compositions concentrées, comprenant un composé insecticide qui sont sous forme de concentrés émulsionnables ou solubles comprennent le plus souvent de 25 à 100 % de matières actives, les émulsions ou solutions prêtes à l'application contenant, quant à elles, de 0,00001 à 20 % de matières actives.
Selon une réalisation, la matière active A est combinée le cas échéant à au moins une autre matière active ou composé insecticide issue de Photorhabdus luminescens ou d'autres microorganismes. En plus du solvant, les concentrés émulsionnables peuvent contenir, lorsque c'est nécessaire, 2 à 20 % d'additifs appropriés tels les agents stabilisants, les agents tensioactifs, les agents de pénétration, les inhibiteurs de corrosion, les colorants ou les adhésifs précédemment cités.
Les compositions insecticides selon l'invention sous forme de suspensions concentrées, également applicables en pulvérisation, sont préparées de manière à obtenir un produit fluide, stable, ne se déposant pas ; elles contiennent habituellement de 2 à
75 % de matière active, de 0,5 à 15 % d'agents tensioactifs, de 0,1 à 10 % d'agents thixotropes, de 0 à 10 % d'additifs appropriés, comme des agents anti-mousse, des agents inhibiteurs de corrosion, des agents stabilisants, des agents de pénétration et des adhésifs ; et, comme support, de l'eau ou un liquide organique dans lequel la, ou les, matière active est peu ou pas soluble, ou encore des mélanges de plusieurs de ces solvants, organiques ou non.
Certaines matières organiques solides ou des sels minéraux peuvent être dissous dans le support pour freiner ou interdire la sédimentation ; ou bien encore de telles matières peuvent être employées comme agents antigel pour l'eau.
Les compositions insecticides selon l'invention qui prennent la forme de poudres mouillables ou à pulvériser sont habituellement préparées de sorte qu'elles contiennent de 20 à 95 % de matières actives.
Par ailleurs, elles contiennent habituellement, outre un support solide, de 0 à 5 % d'un agent mouillant, de 3 à 10 % d'un agent dispersant, et, le cas échéant, de 0 à 10 % d'un ou plusieurs agents stabilisants et/ou autres additifs, comme des agents de pénétration, des adhésifs, ou des agents anti-mottants, colorants, etc.
Pour obtenir ces poudres à pulvériser ou poudres mouillables, sont intimement mélangées la ou les matières actives dans des mélangeurs appropriés avec les substances additionnelles, et on les broie avec des moulins ou autres broyeurs appropriés. On obtient alors des poudres à pulvériser dont la mouillabilité et la mise en suspension sont particulièrement avantageuses.
On peut les mettre en suspension avec de l'eau à toute concentration désirée.
Plutôt que des poudres mouillables, on peut réaliser des compositions insecticides selon l'invention qui soient sous forme de pâtes.
Les conditions et modalités de réalisation et d'utilisation de ces pâtes sont similaires à celles des poudres mouillables ou à pulvériser.
Comme cela a déjà été dit, les dispersions et émulsions aqueuses, par exemple les compositions insecticides obtenues en diluant à l'aide d'eau une poudre mouillable ou un concentré émulsionnable selon l'invention, sont comprises dans le cadre général de la présente invention. Les émulsions peuvent être du type eau-dans-1'huile ou huile-dans-1'eau et elles peuvent avoir une consistance épaisse ou assez épaisse. De manière plus générale, les compositions selon l'invention peuvent prendre de nombreuses formes de formulations ; ainsi, on peut employer ces compositions comprenant un composé insecticide en générateur d'aérosol ; appât (prêt à l'emploi) ; concentré pour préparation d'appâts ; appât en stock ; suspension de capsules ; produit pour nébulisation a froid ; poudre pour poudrage ; concentré émulsionnable ; émulsion de type aqueux/aqueuse ; émulsion de type huileux/inverse ; granulé encapsulé ; granulé fin ; suspension concentrée pour traitement de semences ; gaz comprimé ; produit générateur de gaz ; appât sur grain ; appât granulé ; granulé ; produit pour nébulisation a chaud ; macrogranulé ; microgranulé ; poudre à disperser dans l'huile ; suspension concentrée diluable dans l'huile ; liquide miscible dans l'huile ; pâte ; bâtonnet à usage agropharmaceutique ; appât en plaquette ; poudre pour traitement de semences à sec ; appât sur brisures ; semences traitées ou enrobées ; bougie fumigène ; cartouche fumigène ; fumigène ; granulé fumigène ; bâtonnet fumigène ; comprimé fumigène ; boite fumigène ; concentré soluble ; poudre soluble ; liquide pour traitement de semences ; suspension concentrée (= concentré fluidifiable) ; poudre de piste ; liquide pour application à très bas volume ; suspension pour application à très bas volume ; produit diffuseur de vapeur ; granulés ou comprimés à disperser dans l'eau ; poudre mouillable pour traitement humide ; granulés ou comprimés solubles dans l'eau ; poudre soluble pour traitement de semences ; poudre mouillable. De nombreux exemples (notamment A à E) de compositions insecticides décrites dans le document FR 2 805 971 peuvent être utilisés avec les toxines selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé d'obtention de toxines insecticides comprenant : - l'obtention d'au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment,
- la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'invention conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes,
- la collecte de toxines produites. L'invention concerne également une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM le 12 Juillet 2001 sous la référence plglόgl CNCM 1-2698, une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM le 12 Juillet 2001 sous la référence plbacδcl 1 CNCM 1-2700 et une souche comprenant un vecteur tel que décrit précédemment, déposée à la CNCM le 12 Juillet 2001 sous la référence plgl4a7 : CNCM 1-2697.
D'autres avantages de l'invention apparaîtront lors de la description détaillée qui suit.
On décrit la démarche globale utilisée pour l'obtention d'une banque de BAC testés ensuite pour leur activité entomotoxique, puis les modes opératoires de manière détaillée. Dans un premier temps, la totalité de la séquence du génome de la bactérie entomopathogène Photorhabdus luminescens, souche TT01 a été identifiée. Plusieurs banques de fragments d'ADN génomique ont été construites selon des procédés décrits (L.Frangeul et al., 1999, Microbiology, 145:2625-2634), et introduites par transformation chez Escherichia coli DH10B : une banque de petite taille (1 à 2 kb), une de taille moyenne (5 à 20 kb) et une banque BAC contenant des fragments de grande taille (50 kb en moyenne). L'approche choisie, de type "shotgun", implique le séquençage de fragments aléatoires de petite taille. Ces fragments ont été ensuite assemblés à l'aide des logiciels Phred et Phrap (développés par P. Green, Université de Washington) pour obtenir des séquences contiguës (contigs). Les extrémités séquencées de fragments de la banque de taille moyenne et celles de la banque BAC, et le séquençage de produits de PCR combinatoire, ont permis de relier ces séquences contiguës et d'obtenir la séquence génomique, sous forme d'un contig de 5,7 Mb. Pour identifier des BAC présentant une activité insecticide, les inventeurs ont procédé en parallèle à deux méthodes. Selon une première méthode, les inventeurs ont identifié par des recherches de similitude "in silico", à partir des séquences génomiques, des gènes potentiellement responsables d'une activité entomotoxique.
Selon une deuxième méthode, la banque de BAC contenant des fragments d'ADN de Photorhabdus a été criblée en totalité afin d'identifier des clones d'Escherichia coli possédant une activité insecticide. Cette banque, construite à l'aide du vecteur pBeloBACl 1, a été déposée (CNCM n° 1-2478) le 12 juillet 2001. Les inventeurs ont ainsi réussi à identifier un clone (BAC8C1 1) ayant une activité entomotoxique notamment sur des larves de Plutella xylostella (lépidoptère). Suite à cette identification, les inventeurs ont effectué des tests d'activité entomopathogène en utilisant ce BAC sur différentes espèces de lépidoptères, démontrant leur efficacité notamment chez Plutella xylostella, Ostrinia nubilalis (maïs), Heliothis virescens (tabac), Helicoverpa zea (maïs), Spodoptera.
On décrit maintenant de manière détaillée les modes opératoires utilisés pour le séquençage et l'analyse du génome de Photorhabdus luminescens en particulier du BAC8C1 1 (EXEMPLE 1), et les tests d'activité entomopathogène sur Plutella xylostella (EXEMPLE 2).
EXEMPLE 1 : séquençage et analyse du génome de Photorhabdus luminescens
Les inventeurs ont utilisé l'ADN de la souche TT01 de Photorhabdus luminescens pour entreprendre le séquençage de son génome dont la taille est estimée à 5,7 millions de paires de bases. Différentes banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens ont été construites à ces fins. A partir de clones de ces différentes banques 65 000 lectures de séquences d'environ 500 paires de bases de qualité ont été réalisées - correspondant à une couverture de 7 fois la longueur du génome -, couvrant ainsi environ 98-99 % de ce génome avec des séquences non redondantes. L'assemblage de ces séquences à l'aide d'outils informatiques (Ewing B. et al., 1998, Génome Res., 8: 175-185 ; Ewing B. & Green P., 1998, Génome Res., 8:186-194 ; Gordon et al., 1998, Génome Res., 8:195-202 ; Contigs-Tool-Box, L.Frangeul et al., Résultats non publiés, Laboratoires de Génomique des Microorganismes Pathogènes, Institut Pasteur, Paris) a permis d'obtenir environ 450 contigs (séquences contiguës), le but final étant de relier ces contigs pour obtenir un contig de 5 681 324 paires de base correspondant à la séquence génomique totale de Photorhabdus luminescens.
Les contigs obtenus ont été reliés à l'aide de différentes techniques brièvement résumées ci-dessous. - A l'aide de vecteurs à bas nombre de copies a été construit un "échafaudage" couvrant la totalité du génome. Afin de réaliser celui-ci, les inventeurs ont utilisé des banques d'ADN génomique de Photorhabdus luminescens en particulier une banque construite à l'aide de vecteur BAC (une copie par cellule) dont les tailles moyennes des fragments d'ADN insérés sont d'environ 50 kb. Le séquençage des extrémités de ces fragments permet la prédiction des liens entre contigs adjacents.
- La comparaison des extrémités des contigs obtenus avec le génome "témoin" d'une bactérie phylogénétiquement proche (Escherichia coli), dont la séquence est connue, a été utilisée pour prédire des liens entre contigs adjacents dans le génome étudié (Photorhabdus).
- Différentes techniques PCR (PCR combinatoire, reverse PCR, la technique de "marche sur le chromosome") ont ensuite été utilisées pour combler les brèches entre contigs adjacents.
Les inventeurs ont préparé une banque d'ADN génomique de la souche TT01 de
Photorhabdus luminescens clonée dans un vecteur bactérien à faible nombre de copies
(pSYX34), taille moyenne des inserts lOkb, en utilisant une technique de remplissage partiel (PARTIAL FILL-IN). Dans le cas présent, la digestion par l'enzyme de restriction Sal I du vecteur pSYX34 libère les extrémités suivantes :
5' TCGAC- G- 5' Le PARTIAL FILL-IN a été réalisé, en présence des déoxynucléotides dCTP et dTTP. 5' TCGAC-
CTG- 5' A) Préparation du vecteur : pSYX34 A.l) Obtention du vecteur
Du plasmide pSYX34 a été préparé en réalisant en parallèle deux midipreps, KIT QIAGEN selon les condition préconisées par le fabriquant.
A.2) Digestion du plasmide pSYX34 par l'enzyme de restriction Sal I Le volume final sera de 100 μl : 20 μl pSYX34 10 μl de tampon H 66 μl d'H2O
4 μl Sal I Incuber 2 h à 37°C. Un aliquot, ainsi qu'un marqueur de poids moléculaire, a été déposé sur un minigel d'agarose pour valider la qualité de la purification.
A.3) Extraction au chloroforme
L'extraction au chloroforme, permet d'arrêter la digestion enzymatique, et d'éliminer toutes traces protéiques.
Après digestion, on récupère 95 μl
+ 105 μl TE 10 mM
+ 200 μl chloroforme
Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm Récupérer la phase aqueuse (phase supérieure)
A.4) Précipitation à l'acétate de sodium
Ajouter 1/10 du volume, d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 20 μl.
Puis 2,5 volumes d'éthanol absolu propre, soit 500 μl (Flacon gardé à -20°C).
Laisser à -20°C, au moins 1 heure (il est possible de laisser à -20°C durant la nuit).
Centrifuger à 4°C (chambre froide) durant 30 min, à 14.000 tpm.
Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.
Ajouter 400 μl d'éthanol à 70 %, centrifuger à 4°C, 5 min à 14.000 tpm.
Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide, laisser sécher environ une heure sur la paillasse.
Resuspendre le culot dans 20 μl de TE 10 mM (1/10).
A.5) Partial fill-in
Volume final de la réaction : 50 μl 20 μl de pSYX34 digéré par Sal I
5 μl de tampon synthesis 2,5μl de mix nucléotides (C-T) 1 mM
20,5 μl d'eau
2 μL de Klenow (2 U/μl)
Laisser 30 min à température ambiante.
Vérification sur minigel d'agarose à 1 % et congélation à -20°C. Mix des nucléotides C-T : mélanges
2 μl de nucléotides T (100 mM)
2μl de nucléotides C (100 mM) 16 μl de TRIS 10 mM, pH= 7,5.
Les nucléotides sont ainsi dilués au 1/10, on a une concentration de 10 mM.
Une seconde dilution au 1/10 dans du tampon TRIS 10 mM, sera réalisée ; on a donc une concentration de 1 mM. D'autre part, au cours de la réaction, les nucléotides sont dilués au 1/20 (2,5 μl dans 50 μl). La concentration finale est bien de 50 μM en nucléotides.
A.6) Purification du vecteur pSYX34 : gel préparatif
Préparer un gel d'agarose à 1 %, en TAE ; des grands puits seront prévus pour les échantillons. Reprendre 30 μl de pGB2 après le partial fill-in, ajouter 6 μl de solution de dépôt. En parallèle, déposer le marqueur de poids moléculaire dans les proportions suivantes :
5 μl H2O
5 μl du marqueur 1 Kb DNA 2 μl de la solution de dépôt.
Laisser migrer à 70 Volts.
Découper le gel côté marqueur à l'aide d'un scalpel, et repérer la région recherchée, en l'occurrence la bande correspondant à 4 Kb.
A.7) Purification du vecteur pSYX34 Reprendre dans 3 volumes de solution Iodure de Sodium (1 ml pour un échantillon de 0,2 g), mettre à 49°C, en agitant toutes les 2 minutes, jusqu'à complète dissolution de l'agarose.
Ajouter 8 μl de micro-billes : GLASSMILK R, laisser 5-10 min à température ambiante, l'ADN se fixe sur les micro-billes. Centrifuger 2 min à 14.000 tpm, éliminer le surnageant par aspiration.
Laver 3 fois avec la solution New Wash (600 μl / eppendorf, vortexer, centrifuger quelques secondes à 10.000 tpm), cette solution a été préparée et, est gardée à -20°C.
Resuspendre le culot dans 10 μl d'H2O, Vortexer, laisser 5 min à 49°C. Ceci permet à l'ADN de se décrocher des micro-billes.
Centrifuger 2 min à 14.000 tpm.
Récupérer les surnageants dans de nouveaux eppendorfs. Ajouter à nouveau 10 μl d'H20 sur les culots, pour être sûr de tout récupérer, vortexer, laisser 2 min à 49°C.
Centrifuger 2 min à 14.000 tpm.
Récupérer les surnageants dans les eppendorfs précédents. Environ 20 μl de surnageant sont obtenus, centrifuger 2 min à 14.000 tpm.
Transférer les surnageants dans de nouveaux eppendorfs, de manière à être sûr qu'il ne reste plus de micro-billes.
Déposer sur un minigel d'agarose à 1 %, 1 μl de chaque préparation (+ 5 μl d'H2O + 2 μl de solution de dépôt), laisser migrer à 80 volts, 2 heures. On gardera les échantillons les plus concentrés, ils seront alors congelés à -20°C.
B) Préparation de l'ADN chromosomique de Photorhabdus luminescens souche TTOl
B.1) Dissolution de l'ADN
Un culot sec d'ADN génomique de la souche TTOl a été repris dans 200 μl de TE 10:1 puis dissous 30 minutes à 65°C. Sa concentration a été estimée à 0,15 μg/μl. B.2) Digestion partielle de l'ADN génomique par l'enzyme de restriction Sau3A
15 μl d'ADN ont été digérés par 2 ou 1 ou 0,5 ou 0,25 ou 0,125 ou 0,0625 ou 0,03125 unités d'enzyme de restriction Sau3A pendant 1 h à 37°C.
B.3) Extraction au chloroforme
L'extraction au chloroforme permet d'arrêter la digestion enzymatique, et d'éliminer toutes traces protéiques.
Après digestion, on récupère 100 μl d'ADN chromosomique.
+ lOO μl TE lO mM
+ 200 μl chloroforme
Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm Récupérer la phase aqueuse, phase supérieure, comportant l'ADN chromosomique.
B.4) Précipitation à l'acétate de sodium
Ajouter 1/10 du volume, d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 20 μl.
Puis 2,5 volumes d'éthanol absolu propre, soit 500 μl (Flacon gardé à -20°C). Laisser à -20°C, au moins 1 heure (il est possible de laisser à -20°C durant la nuit).
Centrifuger à 4°C (chambre froide) durant 30 min, à 14.000 tpm. Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.
Ajouter 400 μl d'éthanol à 70 %, centrifuger à 4°C, 5 min à 14.000 tpm.
Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide, laisser sécher environ une heure sur la paillasse. Resuspendre le culot dans 20 μl H2O.
B.5) Vérification des digestions partielles, après précipitation à l'acétate de sodium
Préparer un gel d'agarose à 1 % en TBE. Déposer 1/10 du volume total des précipitations, soit 2μl d'ADN + 8μl H2O+ 2μl de solution de dépôt. En parallèle, déposer un marqueur de poids moléculaire : 1 μl + 9 μl H2O + 2 μl de solution de dépôt.
B.6) Partial Fill-in
Volume final de la réaction (environ 50 μl) :
- 36 μl d'ADN partiellement digéré (ADN digéré par 0,25 ou 0, 125 ou 0,0625 ou 0,03125 unités d'enzyme de restriction Sau3A)
- 5μl de tampon synthesis
- 10 μl de mix nucléotides (A-G) ImM => concentration finale : 200 μM
- 2 μL de Klenow (2U/μl)
Laisser 30 min à température ambiante. Mix des nucléotides A-G : mélanger :
2 μl de nucléotides A (100 mM)
2 μl de nucléotides G (100 mM)
16 μl de TRIS 10 mM, pH= 7,5.
Les nucléotides sont ainsi dilués au 1/10, on a une concentration de 10 mM. Une seconde dilution au 1/10 dans H2O, sera réalisée, on a donc une concentration de 1 mM.
B.7) Extraction au chloroforme
L'extraction au chloroforme permet d'arrêter la digestion enzymatique, et d'éliminer toutes traces protéiques. Après digestion, on récupère 53 μl d'ADN chromosomique.
+ 47 μl TE 10 mM
+ 100 μl chloroforme Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm
Récupérer la phase aqueuse, phase supérieure, comportant l'ADN chromosomique.
B.8) Précipitation à l'acétate de sodium Ajouter 1/10 du volume d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 10 μl.
Puis 2,5 volumes d'éthanol absolu propre, soit 250 μl (Flacon gardé à -20°C).
Laisser à -20°C, au moins 1 heure (il est possible de laisser à -20°C durant la nuit).
Centrifuger à 4°C (chambre froide) durant 30 min, à 14.000 tpm. Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.
Ajouter 400 μl d'éthanol à 70 %, centrifuger à 4°C, 5 min à 14.000 tpm.
Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide, laisser sécher environ une heure sur la paillasse.
Resuspendre le culot dans 20 μl H2O. B.9) Purification de l'ADN chromosomique : gel préparatif
Préparer un gel d'agarose à 1 %, en TAE, des grands puits seront prévus pour les échantillons.
Reprendre la totalité de l'ADN, soit 20 μl, ajouter 4 μl de solution de dépôt. En parallèle déposer le marqueur de poids moléculaire dans les proportions suivantes : 5 μl H2O
5 μl du marqueur 1 Kb DNA
2 μl de la solution de dépôt.
Laisser migrer à 70 Volts.
Découper le gel côté marqueur à l'aide d'un scalpel, et repérer, en prenant une photo et à l'aide d'une règle, la région intéressante. Ayant des fragments d'ADN longs, on utilisera pour purifier l'ADN, des colonnes SPIN X de chez COSTAR, ceci évitera de couper l'ADN chromosomique.
B.10) Purification
Après avoir récupéré les différents morceaux d'agarose, dans des colonnes SPIN X, ajouter 200 μl de TE 10 mM, puis broyer à l'aide d'une spatule. Ceci pourra être gardé, à 4°C. Puis centrifuger 20 min à 5000 tpm. L'agarose sera retenu sur les filtres, alors que l'ADN chromosomique, sera retrouvé au fond du tube.
B .1 1 ) Extraction au chloroforme L'extraction au chloroforme, permet d'éliminer toutes traces protéiques.
On récupère 800 μl d'ADN chromosomique.
+ 800 μl chloroforme
Vortexer, centrifuger 1 min à 1000 tpm
Récupérer la phase aqueuse, phase supérieure, comportant l'ADN chromosomique.
B.12) Précipitation à l'acétate de sodium
Ajouter 1/10 du volume, d'acétate de sodium (3M, pH : 5,2) soit 80 μl.
Puis, 800 μl d'isopropanol.
Laisser à -20°C, au moins 1 heure (il est possible de laisser à -20°C durant la nuit).
Centrifuger à 4°C (chambre froide) durant 30 min, à 14.000 tpm.
Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide.
Ajouter 400 μl d'éthanol à 70 %, centrifuger à 4°C, 5 min à 14.000 tpm.
Eliminer le surnageant à l'aide de la pompe à vide, laisser sécher environ une demi heure sur la paillasse, et 2 min sous vide.
Resuspendre le culot dans 20 μl TE (0,1 X soit ImM).
Incuber 10 min à 65°C.
Incuber environ 4 heures à 4°C, de manière à ce que l'ADN soit bien resuspendu.
Vérification sur minigel d'agarose à 1 %, mettre en parallèle un marqueur de poids moléculaire.
C) Ligation de l'ADN chromosomique de Photorhabdus luminescens souche TTOl dans le vecteur pSYX34
Reprendre 6 μl d'ADN chromosomique
Ajouter 2 μl de pSYX34 Ajouter 2 μl de tampon de ligation (LB : ligation buffer)
Ajouter 2 μl de ligase
Puis 8 μl H2O (volume total : 20 μl). En parallèle, faire un témoin de ligation, en remplaçant l'ADN chromosomique, par du TE O,l X (l mM).
Vortexer, laisser une nuit à 16°C.
Transformation de cellules ultra compétentes XLIO-Gold Kanr (Stratagene) La banque d'ADN génomique obtenue à l'étape précédente a été intégrée dans les cellules ultra compétentes XL10 Gold Kanr (Stratagene) selon les conditions préconisées par le fabriquant.
L'analyse des inserts de 24 clones par digestion par l'enzyme de restriction Sali et par séquençage des extrémités a été effectuée et a donné des résultats satisfaisants. D) Cartographie des clones BAC sur le génome de Photorhabdus luminescens
Connaissant la presque totalité de la séquence du génome de la bactérie Photorhabdus luminescens, ainsi que les séquences des extrémités des inserts des clones des différentes librairies, les inventeurs ont effectué une cartographie permettant de positionner le clone BAC8C1 1. Le clone 8C1 1 (dépôt CNCM 1-2700), dont la taille du fragment inséré est de 22,5 kb, comprend le gène codant pour SEQ ID N° 3, flanqué du gène codant pour SEQ ID N° 5.
EXEMPLE 2 : tests d'activité entomopathogène sur les larves de Plutella xylostella, menés à partir de la banque de BAC décrite précédemment. Une série de tests a été effectuée selon le protocole suivant. Des bactéries
(souche E. coli DH10B, contenant un plasmide pBeloBACl 1) ont été mises en culture une nuit dans 5 ml LB+chloramphenicol à 28°C sous agitation à 200 rpm. La DO 40 de chaque culture a été systématiquement prise. Chaque culture est diluée avec du LB jusqu'à obtenir une concentration de 5xl07 bactéries/ml. Six feuilles (3 cm de diamètre) sont incubées dans une culture diluée pendant une heure avec 0,05 % Tween 20 (Sigma). Les feuilles traitées sont mises dans des plaques 6 puits et 5 larves sont placées dans chaque puits, soient 30 larves testées par clone. Chaque puits contient un support gélose contenant 15 g/1 d'agar (Difco) et 1 ,5 g/1 d'antifongique (nipagine, Sigma).
De préférence, les larves utilisées pour ce test sont des larves en phase tardive du stade L2 (2eme stade larvaire), sélectionnées juste avant leur mue vers le stade L3. En effet, les inventeurs ont observé que les larves étaient nettement plus sensibles à la bactérie à ce stade L2 et que les essais y étaient bien plus reproductibles. Des souches de deux origines géographiques différentes (Bénin B, Martinique M) de Plutella xylostella ont été utilisées et les résultats ont été observés en fonction de la souche utilisée.
Tous les essais ont été effectués à 28°C avec une photopériode de 1 1 h : 13 h (nuit : jour). Après 2 jours, les feuilles traitées ont été remplacées par des feuilles non traitées. Le niveau de mortalité des larves a été observé à 48 h, 72 h et 144 h après le contact des larves avec les feuilles traitées. Des contrôles ont été utilisés pour les tests de criblage, incluant : Photorhabdus TTOl, et ou le BAC8dl0 (contenant le locus te) comme contrôles positifs et le BAC 0 (souche DH10B contenant le plasmide pBeloBACl 1 mais sans insert) comme contrôle négatif.
Le taux de mortalité des larves a été corrigé par rapport au contrôle négatif à l'aide de l'équation Abbott (Abbott W.S., 1925, J. Econ. Entomol., 18:265-267). Les résultats sur les larves de Plutella xylostella sont liés à la souche, et à son stade de développement. Cela explique pourquoi certains clones sont susceptibles de ne pas donner de résultats positifs par d'autres essais.
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0002
* un % de mortalité d'Abbott supérieur à 20 % est considéré comme significatif
N'ont été pris en compte que les bio-essais pour lesquels le % de mortalité du contrôle négatif est inférieur à 20 %
(Origine géographique des souches Px : B : Bénin; M : Martinique) REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4, ladite séquence nucléotidique codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
2. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi : a) une séquence nucléotidique comportant au moins 70 % d'identité avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; b) une séquence nucléotidique hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléotidique selon la revendication 1 ; c) une séquence nucléotidique complémentaire d'une séquence définie en a) ou b) ; d) un fragment représentatif de la séquence SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 4, ou de leur séquence complémentaire, d'au moins 10 paires de base ; e) une séquence nucléotidique comprenant une séquence telle que définie en a), b), c) ou d) ; f) une séquence nucléotidique modifiée d'une séquence nucléotidique telle que définie en a), b), c), d) ou e) ; ladite séquence codant pour au moins un polypeptide actif contre des insectes.
3. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il est codé par une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1 et 2.
4. Polypeptide insecticide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence polypeptidique choisie parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins
80 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, d'un polypeptide défini en a).
5. Séquence nucléotidique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce qu'elle code pour un polypeptide correspondant à une séquence choisie parmi SEQ ID
N° 3 et SEQ ID N° 5.
6. Séquence nucléotidique selon les revendications 1, 2, et 5, caractérisée en ce que la toxine est active contre les lépidoptères appartenant notamment aux genres Plutella, Heliothis, Helicoverpa, Spodoptera, Ostrinia. . Cassette d'expression comprenant une séquence promoteur liée de manière opérationnelle à une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications
1, 2, 5 et 6.
8. Vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon la revendication 7 ou une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6.
9. Vecteur de type virus caractérisé en ce qu'il comprend dans son génome une séquence polynucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6 liée opérationnellement à un promoteur inductible ou constitutif approprié.
10. Cellule hôte comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7.
1 1. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en qu'il s'agit d'une bactérie, d'une levure, d'une cellule de plante.
12. Composition insecticide caractérisée en ce qu'elle comprend un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 4, ou une cellule hôte selon la revendication 10 ou 1 1 , accompagnés d'un support approprié.
13. Procédé d'obtention d'une plante exprimant au moins une toxine contre des insectes, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une cassette d'expression selon la revendication 7 dans au moins une cellule de plante, puis la culture de la cellule ainsi transformée de manière à régénérer une plante contenant dans son génome ladite cassette d'expression.
14. Plante ou partie de plante, comprenant une cassette d'expression selon la revendication 7, les plantes ou parties de plantes étant transformées et résistantes aux insectes.
15. Plante ou partie de plante selon la revendication 14, présentant une augmentation de l'expression d'une toxine contre les insectes par rapport à une plante non transformée.
16. Plante selon la revendication 14 ou 15, caractérisée en ce que la cassette d'expression est intégrée de manière stable dans le génome de la cellule.
17. Plante ou partie de plante selon l'une quelconque des revendications 14 à 16, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une mono ou une dicotylédone, notamment le blé ou le maïs.
18. Procédé de lutte contre des insectes caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur des plantes infectées par lesdits insectes d'une quantité efficace sur le plan insecticide d'une composition insecticide selon la revendication 12 ou de vecteurs recombinants selon la revendication 8.
19. Procédé d'obtention de toxines insecticides caractérisé en ce qu'il comprend : - l'obtention d'au moins une cellule hôte selon la revendication 11 ; la culture dans des conditions appropriées pour l'expression d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6 conduisant à la production d'au moins une toxine active contre des insectes ; la collecte de toxines produites.
20. Procédé d'obtention d'une plante résistante aux insectes, caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'une séquence nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 5 et 6 l'expression de ladite séquence nucléotidique étant à un niveau suffisant pour agir contre les insectes.
21. Séquence nucléotidique selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend le fragment ADN de Photorhabdus luminescens d'environ 26 kb désigné plBAC8Cl l déposé le 12 juillet 2001 sous le numéro CNCM-2700, présent dans la souche E. coli DH10B.
22. Séquence nucléotidique isolée caractérisée en ce qu'elle correspond à SΕQ ID N° 1.
23. Souche comprenant un vecteur selon la revendication 8, déposée le 12 juillet
2001 à la CNCM sous la référence plbac8cl 1 CNCM 1-2700.
24. Utilisation d'une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 1, 2, 5 et 6, d'un vecteur selon la revendication 8, d'une cellule selon la revendication 10 ou 1 1 , pour la préparation d'un polypeptide insecticide.
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