FR2783253A1 - Procede et trousse pour la detection d'un desequilibre intrachromosomique dans des noyaux interphasiques et leurs applications - Google Patents

Abstract

La présente Invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, qui caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'hybridation in situ du chromosome suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents et respectivement spécifiques du bras long et du bras court de ce chromosome; (b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes; (c) le calcul du rapport (Ra ) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.L'Invention se rapporte également à une trousse propre à permettre la mise en oeuvre de ce procédé, et aux applications de cette trousse et de ce procédé, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.

Description

t

PROCEDE ET TROUSSE POUR LA DETECTION D'UN DESEQUILIBRE

INTRACHROMOSOMIQUE DANS DES NOYAUX INTERPHASIQUES ET

LEURS APPLICATIONS

La présente Invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, à une trousse propre à permettre la mise en oeuvre de ce procédé ainsi qu'aux applications de ce procédé et de cette trousse, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au

sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.

L'étude cytogénétique des cellules tumorales a montré l'existence, dans ces cellules, de nombreux remaniements chromosomiques consistant notamment en des pertes et des gains de matériel génétique, pouvant conduire jusqu'à la disparition de bras chromosomiques, ou, au contraire, à la présence de bras chromosomiques surnuméraires et se traduisant ainsi par des modifications du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains

chromosomes que l'on désignera ci-après sous le terme de déséquilibres intra-

chromosomiques.

Ainsi, par exemple, DUTRILLAUX et al. (Cancer Genet.

Cytogenet., 1990, 49, 203-217) ont mis en évidence, à partir de 30 cas, la survenue dans les cancers du sein de multiples réarrangements affectant, à une fréquence particulièrement élevée, les chromosomes 1 et 16 et se manifestant principalement par un gain du bras long du chromosome 1 et une perte du bras long du chromosome 16, et, à une fréquence moindre, les chromosomes 4, 6, 8, 9, 11, 13 et 17. De manière similaire, TESTA et SIEGFRIED (Cancer Research, 1992, 52, 2702s-2706s) ont montré, également à partir de 30 cas, la présence, dans les cancers du poumon non à petites cellules, de nombreux réarrangements affectant de manière préférentielle le chromosome 7 (principalement sous la forme d'une polysomie 7 ou d'un gain de tout ou partie du bras court de ce chromosome), mais aussi les chromosomes 1, 3, 6, 7, 11,

13, 15, 17 et 19.

En fait, il est maintenant bien établi que le processus de cancérogenèse est un événement multi-étapes, nécessitant des modifications génétiques successives dont l'accumulation au cours du temps va conduire à des cellules au potentiel transformant qui sera de plus en plus agressif, conduisant à une tumeur cliniquement détectable et éventuellement métastasiante. Aussi, une définition précise des paramètres cytogénétiques caractéristiques de la tumorogénèse apparaît constituer une étape capitale, tant dans l'élaboration du diagnostic positif que de celle du diagnostic évolutif des tumeurs, permettant ainsi une mise en oeuvre des

thérapeutiques les plus adaptées.

Actuellement, les cytogénéticiens disposent principalement de deux approches dans l'investigation du génome et de ses anomalies: - d'une part, la cytogénétique classique, qui permet d'avoir accès au caryotype détaillé d'une cellule et d'appréhender les anomalies de structure et de nombre de l'ensemble des chromosomes qu'elle comporte et qui consiste, après une période de culture in vitro des cellules dont la durée varie avec le type de cellules étudiées, à bloquer ces cellules en métaphase et à traiter les chromosomes selon différentes méthodes permettant l'observation au microscope otique de bandes s'étendant sur quelques mégabases, d'o le fait qu'on la désigne généralement par le nom anglo-saxon de banding. Après photographie, les chromosomes sont appariés et ordonnés selon leur longueur, la position du centromère et la topographie des bandes,

et ce classement aboutit à l'élaboration du caryotype.

Cette approche dont l'intérêt majeur est de conduire à une "image" globale du génome, trouve un certain nombre de limites. La première tient au fait qu'elle nécessite une mise en culture préalable des cellules étudiées, de manière à obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase. Or, il est maintenant bien acquis que, dans le cas d'une population polyclonale, la réalisation d'une culture cellulaire est susceptible d'introduire des biais importants dans les résultats d'une analyse cytogénétique, en raison de ce que seules les cellules adaptées aux conditions de culture se divisent et donnent des métaphases. Une autre limite réside dans le pouvoir de résolution de la cytogénétique classique qui ne permet d'appréhender que partiellement les remaniements chromosomiques souvent relativement complexes dans les tumeurs solides, lesquelles représentent la majorité des cancers. Enfin, de par son principe, cette approche se heurte à toute possibilité d'un dépistage automatisé des

anomalies chromosomiques complexes et/ou multiples.

- d'autre part, l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), qui permet de repérer une séquence d'ADN chromosomique au moyen d'une sonde de séquence spécifique homologue à celle qui est étudiée. Fondée sur la complémentarité existant entre les nucléotides (adénine-thymine, adénineuridine, cytosine-guanine), elle consiste à hybrider l'ADN cible avec une sonde marquée, soit directement, soit indirectement par un fluorochrome, et à utiliser la fluorescence émise par ce dernier

comme témoin de l'hybridation.

L'hybridation in situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, voire d'un locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible s'étant hybridés avec les sondes. Toutefois, en analyse pathologique de routine, l'hybridation in situ en fluorescence est mise en oeuvre sur des noyaux interphasiques et elle utilise alors des sondes spécifiques des régions centromériques des chromosomes. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par un comptage des spots fluorescents, soit manuellement au microscope, soit de manière automatisée au moyen d'un cytomètre d'image, le nombre des spots étant dans tous les cas suppose

correspondre au nombre de copies des chromosomes étudiés.

Si le développement des techniques de la FISH a incontestablement amélioré le pouvoir de résolution de la cytogénétique (jusqu'à l'ordre de quelques kilobases), permettant ainsi de mieux cerner les gains et pertes en matériel chromosomique et les anomalies de structure des chromosomes, ces techniques telles

qu'elles existent aujourd'hui, ne sont toutefois pas totalement satisfaisantes.

En effet, s'agissant de la FISH sur chromosomes métaphasiques, une étape préalable de culture in vitro des cellules est indispensable, comme dans le cas de la cytogénétique classique, pour obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase

avec les inconvénients précités que cela implique.

Quant à la FISH sur noyaux interphasiques, si elle présente l'avantage d'éviter l'étape de culture et, partant, la sélection potentielle de certaines cellules au cours de cette culture, elle présente l'inconvénient que le comptage manuel des spots ne peut être effectué que sur un nombre restreint de cellules et est à l'origine d'erreurs importantes lorsqu'il est appliqué à une petite population de cellules anormales (KIBBELAAR et al., Cytometry, 1993, 14, 716-724), tandis que le comptage automatisé demeure à ce jour très imparfait, en dépit des efforts qui ont été tentés pour améliorer la qualité de l'hybridation, la qualité des signaux qu'elle génère et la sensibilité des caméras dont sont équipés les cytomètres d'image (TRUONG et al., Anal. Cell Path., 1997, 13, 137-146). Au surplus, il s'avère qu'un certain nombre d'anomalies chromosomiques n'affectent pas les régions centromériques des chromosomes, mais leurs bras, et échappent à toute possibilité de détection par cette technique. Les Inventeurs se sont, donc, fixés pour but de fournir un procédé propre à permettre la détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans les cellules d'un échantillon biologique, et qui soit exempt, d'une manière générale, de tous les

inconvénients des procédés de l'état antérieur de la technique.

Plus spécifiquement, les Inventeurs se sont fixés pour but de fournir un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique qui, tout en étant sensible, spécifique et reproductible de manière à garantir la fiabilité de cette détection, puisse: - d'une part, être mis en oeuvre sur des cellules en interphase pour s'affranchir de la nécessité de soumettre préalablement les cellules devant être étudiées à une culture in vitro, d'autre part, s'appliquer non seulement à une population cellulaire monoclonale, mais également à une population cellulaire polyclonale afin de permettre la détection de la présence éventuelle, au sein de cette population, de clones cellulaires anormaux même lorsque ceux-ci sont minoritaires, et - en outre, être au moins partiellement automatisé afin de rendre possible, pour un coût raisonnable, le traitement d'une quantité importante

d'échantillons biologiques tout en limitant les risques d'erreurs dans ce traitement.

Ces buts sont atteints selon la présente Invention par un procédé de s détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, qui est caractérisé en ce qu'il comprend: (a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long de ce chromosome tandis que la deuxième sonde est spécifique du bras court de ce même chromosome; (b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes; (c) le calcul du rapport entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au

moins une valeur de référence.

Au sens de la présente Invention, on entend par "déséquilibre intrachromosomique", toute modification du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court d'un chromosome, résultant d'une perte ou d'un gain de matériel génétique tels qu'une délétion ou, au contraire, une duplication de tout ou

partie d'un bras chromosomique.

Par ailleurs, pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible", le chromosome suspecté d'être affecté par un déséquilibre tel que ci-avant défini et dont on cherche à vérifier s'il présente effectivement ce déséquilibre. Conformément à l'invention, les deux sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible sont constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit chromosome. De manière préférée, ces sondes sont constituées par un ensemble de

sondes recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome cible.

De telles sondes, que l'on désigne communément par le nom de peinture chromosomique, peuvent être préparées spécialement pour les besoins de la

mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention.

Ainsi, par exemple, ces sondes sont susceptibles d'être préparées à partir de cellules connues pour présenter, au niveau du même chromosome que le o10 chromosome cible, une anomalie (délétion, isochromosome,...) du bras court ou du bras long telle que ce chromosome altéré corresponde sensiblement à l'un des bras du chromosome cible, en triant les chromosomes de ces cellules, par exemple par cytométrie de flux, de manière à ne conserver que les chromosomes propres à servir à la préparation des sondes, puis en soumettant ces derniers à une amplification, par exemple par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR telle que décrite par MILAN et al. (Mammalian Genome, 1996, 7, 194-199), suivie d'un marquage des

produits résultant de cette amplification par un fluorochrome.

En variante, elles peuvent aussi être préparées à partir de cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, par micro-dissection au laser ou par aiguille du chromosome de ces cellules correspondant au chromosome cible de manière à en individualiser le bras long et/ou le bras court, suivie d'une amplification du ou des bras chromosomiques ainsi obtenus, puis d'un marquage des produits résultant de cette amplification par un fluorochrome, comme décrit par exemple par

GUAN et al. (Hum. Molec. Genet., 1993, 2, 1117-1121).

Il est, bien entendu, également possible de recourir, pour la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, à des sondes commerciales prêtes à l'emploi. Ainsi, par exemple, des sondes spécifiques des bras courts et longs des différents chromosomes humains et marquées par de la biotine sont disponibles

auprès de la Société ALTECHNOLOGIES (USA).

Par ailleurs, bien que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible puissent être des sondes directement couplées à un fluorochrome, ces sondes sont, de préférence, des sondes à marquage fluorescent indirect, les Inventeurs ayant en effet constaté que ce type de marquage conduit à des résultats particulièrement satisfaisants. Aussi, selon une disposition préférée de mise en oeuvre du procédé conforme à l'Invention, le marquage des sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécifiquement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction

avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.

A titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage indirect des sondes utiles dans la présente Invention, on peut notamment citer: - la digoxigénine, le dinitrophénol et le 2-acétylaminofluorène, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome; - la biotine, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps dirigés contre ces derniers et qui

sont conjugués à un fluorochrome.

De préférence, l'une des sondes est couplée à de la digoxigénine

tandis que l'autre sonde est couplée à de la biotine.

Quel que soit le type de marquage des sondes (direct ou indirect), celles-ci sont marquées, conformément à l'Invention, par deux fluorochromes différents destinés à permettre, par l'émission de deux lumières de couleurs différentes, une révélation des bras longs d'une part, et des bras courts d'autre part, du chromosome cible s'étant hybridés avec les sondes qui leur sont respectivement spécifiques. Ces fluorochromrnes peuvent être indifféremment choisis parmi les différents composés fluorescents utilisés pour le marquage de sondes nucléiques tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les dérivés de la rhodamine comme l'isothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101 (Texas red ), le Cascade blue ou encore le Bopidy FL, à condition toutefois de veiller à ce qu'ils présentent des maxima de longueurs d'onde d'émission situées dans

des bandes qui ne se recouvrent pas.

Ainsi, par exemple, dans le cas o l'une des sondes sera marquée par du FITC dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 543 nm, l'autre sonde sera avantageusement marquée par de l'isothiocyanate de rhodamine b dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 590 nm ou, mieux encore, par du Texas red qui présente une longueur d'onde maximale d'émission encore plus

éloignée (604 nm) de celle du FITC.

De préférence, l'un des deux fluorochromes est du FITC, tandis que

i5 l'autre est du Texas red .

Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du

procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, de plus, une contre-

coloration des noyaux destinée à permettre leur révélation préalablement à la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans ces noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission des deux fluorochromes couplés aux sondes. Cette contre-coloration est donc réalisée avant de procéder à cette mesure, au moyen d'un fluorochrome

différent de ceux utilisés pour le marquage des sondes, tel que le 4',6diamidino-2-

phénylindole (DAPI) ou le 4',6-bis-2' imidazolinyl 4H-SH (DIPI).

Comme précédemment indiqué, le procédé de détection comprend une étape visant à mesurer l'intensité de la fluorescence émise dans les noyaux aux bandes de longueur d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes

couplés aux sondes.

Ainsi, par exemple, si l'hybridation in situ du chromosome cible a été réalisée en utilisant une sonde spécifique du bras long de ce chromosome marquée par du FITC qui émet une lumière verte, et une sonde spécifique du bras court de ce chromosome marquée par du Texas red qui émet une lumière rouge, on mesure successivement l'intensité de la fluorescence verte émise par les noyaux, puis l'intensité de la fluorescence rouge émise par ces mêmes noyaux. On obtient de la sorte deux valeurs d'intensité de fluorescence qui sont fonction respectivement du nombre de bras longs et du nombre de bras courts du chromosome cible s'étant

hybridés avec les sondes qui leur sont spécifiques.

Conformément à l'Invention, on calcule ensuite le rapport (R,,) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées. Avantageusement, ce rapport est calculé par l'une et/ou l'autre des méthodes suivantes: une première méthode consistant à déterminer, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour l'ensemble des noyaux analysés, et à calculer le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues; et - une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des deux fluorescences, et à déterminer la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues

pour l'ensemble des noyaux analysés.

Puis, on compare la valeur du rapport (Ra) ainsi obtenue avec au

moins une valeur de référence.

De manière préférée, cette valeur de référence correspond au rapport (R. ) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés. Avantageusement, les cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, comme par exemple des lymphocytes provenant de sujets sains. Ainsi, une différence significative (c'est-à-dire en pratique, au moins égale à 20%) entre les valeurs des rapports (Ra) et (Rt) respectivement obtenues pour les noyaux analysés et les noyaux des cellules témoins traduit l'existence, dans au moins un certain nombre des noyaux analysés, du déséquilibre intrachromosomique

recherché.

Il est, toutefois, possible d'utiliser également comme cellules témoins, des cellules affectées par le déséquilibre intrachromosomique que l'on souhaite détecter telles que des cellules d'une lignée cellulaire connues pour présenter

de manière constante ce déséquilibre intrachromosomique.

Selon encore une autre disposition préférée du procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, en outre, une étape consistant à déterminer, pour les noyaux analysés, un indice (1) de déséquilibre. Là également, cet indice de déséquilibre peut avantageusement être établi par l'une et/ou l'autre des méthodes suivantes: - une première méthode consistant à calculer le ratio entre les valeurs des rapports (Rj) et (Rt) respectivement obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés et l'ensemble des noyaux des cellules témoins; et - une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, le ratio entre les valeurs des rapports (R,) et (Rt), et à retenir, par exemple à partir d'un histogramme représentant le nombre de noyaux analysés en fonction du ratio Ra/Rt, la valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés. Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, les étapes b), c), d) correspondant à la mesure des intensités de fluorescence, au calcul du rapport entre ces intensités de fluorescence et à la comparaison de la valeur de ce rapport avec une valeur de référence, ainsi que l'étape de détermination de l'indice (1) de déséquilibre des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend: - une source de lumière susceptible de fournir de la lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et il -des moyens de traitement et d'analyse des intensités de

fluorescence ainsi mesurées.

A titre d'exemple d'appareillage susceptible de convenir à la mise en oeuvre desdites étapes, on peut citer l'analyseur automatique d'images commercialisé par la Société BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS sous la

marque enregistrée DISCOVERY.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de détection conforme à l'Invention, le déséquilibre intrachromosomique que l'on cherche à détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une

délétion du bras court de ce chromosome.

La présente Invention a, également, pour objet une trousse pour la mise en oeuvre du procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase tel que précédemment défini, qui est caractérisée en ce qu'elle comprend: - une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras long du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre, - une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras court de ce même chromosome, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant le déséquilibre que l'on souhaite

détecter.

Selon une première disposition avantageuse de la trousse conforme à l'Invention, les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme

d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.

Selon une autre disposition avantageuse de la trousse conforme à l'Invention, les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend, pour chaque sonde, une quantité appropriée d'un ligand dirigé spécifiquement contre cet haptène et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome, auquel

cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriée dudit contreligand.

Selon encore une autre disposition avantageuse de cette trousse, elle comprend en outre: - une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules; et/ou - une quantité appropriée d'un troisième fluorochrome propre à permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires; et/ou - une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine,...) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage,...) propres à permettre

l'hybridation in situ du chromosome par les sondes.

La présente Invention a, également, pour objet l'application du procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase et de la trousse propre à permettre la mise en oeuvre de ce procédé tels que précédemment définis, à la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique tel qu'une cytoponction, un épanchement séreux (pleural,

péritonéal,...), une tumorectomie ou encore une aspiration bronchique.

En effet, le procédé de détection conforme à l'Invention présente un intérêt tout à fait particulier dans le domaine de la cancérologie humaine et, plus spécialement, pour l'établissement du diagnostic positif et/ou du diagnostic évolutif des pathologies cancéreuses dans lesquelles on observe de manière récurrente un certain nombre de remaniements chromosomiques se traduisant par des déséquilibres du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes, tels que la duplication du bras long des chromosomes 1 et 8, la délétion du bras court des chromosomes I et 3 ou encore la délétion du bras long du

chromosome 6.

Ce procédé est également susceptible de trouver des applications dans des domaines autres que la cancérologie, et notamment dans l'établissement du diagnostic positif de pathologies humaines innées ou acquises liées à une anomalie chromosomique comme, par exemple, la maladie dite du cri du chat qui se caractérise

par une délétion d'une partie du bras court du chromosome 5.

Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore

d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui suit, qui se réfère à un

exemple de mise en oeuvre et d'application du procédé de détection conforme à l'Invention ainsi qu'à la Figure 1 annexée qui illustre, sous la forme d'histogrammes, les répartitions du nombre de noyaux en fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour le bras long (lq) d'une part, et le bras court (lp) d'autre part, du chromosome 1 par la mise en oeuvre dudit procédé sur des cellules provenant d'un

prélèvement tumoral.

Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention et n'en constitue en aucune

manière une limitation.

EXEMPLE: DETECTION D'UN DESEQUILIBRE ENTRE LES BRAS LONG

ET COURT DU CHROMOSOME 1 DANS DES CELLULES DE CANCERS

DU SEIN

Le procédé de détection conforme à l'Invention et l'intérêt de son utilisation à des fins diagnostiques ont été validés par une série d'expérimentations visant à appliquer ce procédé à la recherche du déséquilibre entre le bras long (ci-après "bras lq") et le bras court (ci-après "bras lp") du chromosome 1 fréquemment observé dans les cas de cancers du sein, et à comparer les résultats obtenus avec ceux observés en mettant en oeuvre deux techniques classiquement utilisées en cytogénétique, à savoir la technique du R-banding d'une part, et la technique d'hybridation in situ en

fluorescence (FISH) sur chromosomes métaphasiques d'autre part.

1) Matériel biologique: Les expérimentations ont été réalisées sur 2 types de cellules de cancers du sein: - d'une part, des cellules tumorales appartenant à 3 lignées cellulaires: ZR 75, BT 20 et H 466 et provenant respectivement des souches déposées

auprès de l'ATCC (AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) sous les n CRL- 1500, HTB-19 et HTB-171; et - d'autre part, des cellules tumorales

provenant de prélèvements biologiques effectués chez 16 patientes d'âge compris entre 33 et 73 ans, et correspondant à 13 tumeurs et 6 cytoponctions, 2 patientes ayant fait l'objet à la fois d'une cytoponction, puis d'une tumorectomie, et 1 patiente ayant fait l'objet de 2

tumorectomies (sein droit et sein gauche).

Parmi ces prélèvements biologiques, 3 se sont révélés correspondre à des tumeurs de stade I, 4 à des tumeurs de stade IIA, 8 à des tumeurs de stade IB3, 1 à une tumeur de stade IlIA et 1 à une tumeur de stade IIIB, selon le groupement par stade de l'AMERICAN JOINT COMMITTEE OF CANCER (AJCC). Par ailleurs, l'histologie a permis de montrer qu'il s'agissait dans 10 cas de carcinomes canalaires infiltrants, dans 3 cas de carcinomes lobulaires infiltrants, et dans 3 autres cas d'un carcinome indifférencié, d'un carcinome colloide et d'un carcinome intracanalaire Selon la méthode du grade de SCARFF-BLOOM-RICHARDSON (SBR), 3 tumeurs

étaient de grade II tandis que 5 étaient de grade III.

2) Préparation des lames de cellules tumorales

Les lignées cellulaires ont été cultivées dans des conditions standard.

Elles ont été fixées soit par du liquide de CARNOY, soit par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS avec, dans ce dernier cas, une post-fixation par de l'éthanol

à 70%, puis étalées sur lames.

Les tumeurs et la moitié des cytoponctions ont été mises en cultures de courte durée (72 heures) comme décrit par MULERIS et al. (Genes, Chromosomes & Cancer, 1994, 10, 160-170). Puis, les cellules provenant de ces cultures ont été

fixées par du liquide de CARNOY et étalées sur lames.

Les autres cytoponctions, après dilution (10 fois) dans du milieu dissociant n C 1419 (SIGMA), ont été fixées par du paraformaldéhyde à 0, 5% dans du tampon PBS, post-fixées par de l'éthanol à 70%, puis étalées sur lames par

centrifugation au moyen d'une centrifugeuse Cytospin 3 (SHANDON).

3) Préparation des lames de cellules témoins Des lames de cellules témoins ont été préparées par étalement de cellules lymphocytaires dénuées de toute anomalie chromosomique, après fixation de ces cellules pour une partie de ces lames, par du liquide de CARNOY et pour l'autre partie, par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS, suivie dans ce dernier

cas d'une post-fixation par de l'éthanol à 70%.

4) Préparation des sondes: Pour l'obtention des sondes spécifiques du bras lq et du bras lp, des suspensions chromosomiques des lignées cellulaires H 466 et DU 145 (souche disponible auprès de l'ATCC sous le n HTB-81), se caractérisant respectivement par un réarrangement chromosomique iso(lq) et par un réarrangement chromosomique del(1)(q1O- qter), ont été préparées selon la technique décrite par VAN DEN ENGH et

al. (Cytometry, 1984, 5, 108-117).

Un total de 300 chromosomes correspondant soit à des iso(lq), soit à des del(1)(qlO-qter) ont été triés par cytométrie en flux. Puis, ces chromosomes ont été amplifiés par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR à l'aide d'amorces (GAG)7 et marqués selon les protocoles décrits par MILAN et al. (Mammalian Genome, 1996, 7, 194-199), en utilisant comme marqueurs, de la digoxigénine-11-dUTP (BOEHRINGER MANNHEIM) pour les chromosomes destinés à servir de sondes pour le bras lq et de la biotine-11-dUTP (SIGMA) pour les

chromosomes destinés à servir de sondes pour le bras lp.

) Hybridation in situ: L'hybridation in situ a été conduite en apportant au protocole décrit par TRUONG et al. (Anal. Cell Path., 1997, 13, 137146) quelques modifications mineures. En pratique, après un traitement par l'ARNase (100 ig/ml, SIGMA) à 37 C pendant une heure, suivi de deux rinçages dans du tampon 2 x SSC et un rinçage dans du tampon PBS, les lames de cellules tumorales et de cellules témoins ont été incubées à 37 C, pendant 10 minutes, en présence de pepsine (SIGMA) à une concentration de 4 gg/ml dans de lHCI 0,01M. Puis, elles ont été rincées 2 fois dans du tampon PBS, pendant 5 minutes et à la température ambiante, post-fixées dans du liquide de

CARNOY et séchées à l'air.

L'ADN des chromosomes destinés à servir de sondes a été dénaturé à

C pendant 10 minutes dans un tampon d'hybridation classique. L'ADN cible, c'est-

à-dire l'ADN des lames de cellules tumorales et de cellules témoins, a été, lui, dénaturé à 70 C pendant 3 minutes dans du tampon 2 x SSC comprenant 70% de formamide (FLUKA), pH 7. Les lames ont été ensuite rincées dans du tampon 2 x SSC, puis déshydratées en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol et

séchées à l'air.

L'hybridation a été conduite à 37 C pendant toute une nuit, puis les lames d'échantillons ont été soumises à des rinçages post-hybridation dans du tampon

2 x SSC, pendant 5 minutes et à 72 C.

6) Mesure des intensités de fluorescence et détermination du rapport entre les valeurs de ces intensités: Pour permettre une révélation des bras 1 q et lp des chromosomes I des cellules tumorales et des cellules témoins s'étant hybridés avec les sondes, les lames ont été incubées: d'une part, avec des anticorps anti-digoxigénine marqué par du FITC (BOEHRINGER MANNHEIM) qui émet une fluorescence de couleur verte, et a d'autre part, avec des anticorps de souris anti-biotine, puis des anticorps anti-imnmunoglobulines de souris marqués par du Texas Red

(MOLECULAR PROBES), ce dernier émettant une fluorescence de couleur rouge.

Les lames ont été ensuite contre-colorées par du DAPI (1 ktg/ml,

MOLECULAR PROBES), puis montées dans de la p-phenylène-diamine.

La mesure des intensités des fluorescences verte et rouge correspondant respectivement aux bras lq et lp des chromosomes 1 s'étant hybridés avec les sondes a été réalisée en utilisant un analyseur automatique d'images DISCOVERY (BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS) comprenant: - une source lumineuse constituée par une lampe à vapeur de mercure d'une puissance de 100 W (OSRAM), - un microscope AUTOPLAN (LEITZ) muni d'un objectif à immersion dans l'huile et de grossissement 40 (ouverture numérique: 1,3), - une caméra CCD noir et blanc XILLIX 1400 munie d'un obturateur permettant de faire varier le temps d'intégration de l'exposition à la lumière entre 30 msec et 10 sec, - une carte d'acquisition d'images propre à assurer la numérisation du signal délivré par la caméra, et - relié à cette carte, un micro-ordinateur comportant une unité centrale commercialisée par la Société INTEL sous la référence 486 et muni du

logiciel de traitement d'images DISCOVERY .

Pour chaque lame, le contre-colorant DAPI a été dans un premier temps excité à la longueur d'onde de 330 nm de manière à révéler les zones de l'image formée par le système optique sur le capteur de la caméra, occupées par les noyaux et à définir la mise au point optimale de cette image. Puis, les intensités des fluorescences verte et rouge émises dans ces noyaux ont été mesurées successivement, en utilisant comme zones pertinentes de ces fluorescences, les zones de l'image ayant

été détectées comme correspondant à des zones occupées par des noyaux.

Le temps d'intégration optimum a été déterminé pour chacune des fluorescences par rapport à une lame de cellules témoins et a été ensuite utilisé pour

toutes les lames de cellules tumorales devant être analysées.

Par lame, 500 à 700 noyaux ont été comptés et une seule mesure des fluorescences a été réalisée. Les artefacts, les zones d'image n'ayant pas été reconnues conmme correspondant à des zones occupées par un noyau et les noyaux dénués de toute fluorescence verte et rouge ont été éliminés par un opérateur. La quantité de noyaux ainsi exclus pouvant dans certains cas atteindre 20% en fonction de la qualité de l'hybridation, des résultats analysables ont pu être obtenus pour un minimum de

400 noyaux pour chaque lame.

Le logiciel d'analyse d'images DISCOVERY a permis d'obtenir une analyse de ces résultats sous la forme d'histogrammes. A titre d'illustration, la Figure 1 montre les histogrammes obtenus pour une lame correspondant à l'un des prélèvements biologiques (prélèvement 94T) et représentant le nombre de noyaux en fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour le bras l q d'une part,

et le bras lp d'autre part.

Dans le cas des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, le rapport (Rn) entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras l q et au bras lp a été calculé par deux méthodes différentes: - une première méthode (ci-après "méthode 1") consistant à déterminer pour chaque lame, au moyen du logiciel d'analyse d'images DISCOVERY , la moyenne des intensités de fluorescence verte (bras lq) et la moyenne des intensités de fluorescence rouge (bras lp) émises dans les noyaux et à calculer le rapport entre les moyennes ainsi obtenues; et - une deuxième méthode (ci-après "méthode 2") consistant à déterminer le rapport entre l'intensité de fluorescence verte (bras lq) et l'intensité de fluorescence rouge (bras lp) émise dans chaque noyau, à établir au moyen du logiciel EXCEL commercialisé par la Société MICROSOFT, l'histogramme représentant le nombre de noyaux en fonction de la valeur des rapports ainsi obtenus pour l'ensemble

d'une lame et à calculer, à partir de cet histogramme, la moyenne de ces rapports.

Dans le cas des prélèvements biologiques (tumeurs et cytoponctions), seule la deuxième méthode de calcul a été utilisée dans la mesure o les deux méthodes de calcul s'étant révélées conduire à des résultats comparables comme il sera démontré ci-après, cette deuxième méthode permet d'obtenir des

résultats plus rapidement.

Dans tous les cas, l'existence d'un déséquilibre entre les bras lq et lp dans les cellules tumorales analysées a été apprécié en caractérisant ces cellules par un indice de déséquilibre (Ii) calculé comme suit: Ra

i --------

Ri Ri représentant entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp obtenu pour des lames de cellules lymphocytaires traitées et

analysées exactement dans les mêmes conditions.

7) Mesure du bruit de fond: L'importance du bruit de fond a été appréciée en analysant des lames de cellules tumorales n'ayant été soumises à aucune hybridation et en comparant les résultats obtenus avec ceux observés pour des lames de cellules tumorales ayant fait l'objet d'une hybridation in situ dans les conditions précédemment décrites. Il a pu ainsi être vérifié que le bruit de fond représente en moyenne moins de 20% des signaux spécifiques et que, de ce fait, il n'interfere pas de manière significative avec

les mesures de fluorescence.

8) Analyses cytogénétiques de contrôle: A chaque fois qu'il a été possible d'obtenir, à partir des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, et des prélèvements biologiques, des lames comprenant un nombre suffisant de cellule en métaphase, ces lames ont été également soumises à deux analyses cytogénétiques destinées à servir de contrôles: une analyse cytogénétique classique par la technique du R-banding d'une part, et une analyse cytogénétique moléculaire par la technique de la FISH sur chromosomes

métaphasiques d'autre part.

L'analyse cytogénétique classique a été réalisée conformément aux méthodes décrites par DUTRILLAUX et COUTURIER (La Pratique de l'Analyse Chromosomique, 1981, MASSON, 12, 7-87) tandis que l'analyse cytogénétique moléculaire a été, elle, réalisée selon le protocole décrit par MULERIS et al.

(Oncogene, 1994, 2, 2717-2722).

Ces analyses ont permis d'observer un certain nombre de remaniements affectant les chromosomes I des cellules analysées - qui ne sont pas rapportés ici -, et d'établir pour chaque population cellulaire, à partir de ces observations, un indice de déséquilibre (Im) calculé comme suit: Quantité de copies du bras 1 q (couleur verte)

- - --------

Quantité de copies du bras lp (couleur rouge) 9) Résultats: a) Cellules tumorales des li2nées cellulaires Les lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 représentent des populations de cellules tumorales qui présentent le double avantage d'être très homogènes puisqu'issues d'un même clone, et de fournir, dans la mesure o on les maintient par une culture permanente, un nombre suffisant de cellules en métaphase pour permettre un contrôle systématique des résultats obtenus avec le procédé de détection objet de l'Invention par les techniques de R-banding et de FISH sur

chromosomes métaphasiques.

C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont choisi d'utiliser ces lignées cellulaires pour vérifier la fiabilité du procédé de détection conforme à l'Invention et tester l'influence, sur les résultats obtenus, du mode de fixation des cellules devant être analysées ainsi que de la méthode de calcul du rapport entre les

intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp.

Le Tableau 1 ci-après présente: - d'une part, les indices de déséquilibre (Ii) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour les 3 lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 par le procédé de détection conforme à l'Invention et ce, en fonction du type de fixateur [liquide de CARNOY ou paraformaldéhyde (PBA)] utilisé lors de la préparation des lames, et en fonction de la méthode [méthode 1 ou méthode 2] utilisée pour le calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp, et - d'autre part, les indices de déséquilibre (Im) entre les bras Iq et lp tels qu'obtenus pour ces mêmes lignées cellulaires par les techniques du R- banding et

de FISH sur noyaux métaphasiques.

TABLEAU1

Lignées cellulaires Fixation Méthode 1 Méthode 2 R-banding FISH

ZR 75 CARNOY 2,2 1,8 2 2

CARNOY 2,3 2,2

PFA 1,8 2,2

PFA 2 2,2

BT 20 CARNOY 1 1 1,5 1

CARNOY 1 l,1

PFA 1

PFA 0,9 1,1

H 466 CARNOY 1,5 *2 2 2

CARNOY 1,8 1,9

Ces résultats montrent que les indices de déséquilibre entre les bras lq et lp obtenus par le procédé de détection conforme à l'Invention sont tout à fait concordants à ceux déterminés par les techniques de R- banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques et ce, indépendamment du mode de fixation des cellules analysées et de la méthode de calcul du rapport entre les intensités de fluorescence

correspondant respectivement au bras lq et au bras lp.

b) Cellules tumorales des prélèvements biologiques: Le Tableau 2 ci- après présente - d'une part, les indices de déséquilibre (Ii) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour les 13 tumeurs et les 6 ponctions par le procédé conforme à l'Invention, et - d'autre part, les indices de déséquilibre (I,,) entre les bras lq et lp tels que déterminés pour ces prélèvements biologiques par les techniques du R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques, lorsqu'il a été possible de

mettre en oeuvre ces deux techniques.

TIABLEAU 2

i lm Prélèvements biologiques R-banding FISH

84T 3,3 3 3

86T 2,1 1,5

94T 1,8 2 2

152T 1,4 1,3 ---

221T 2,2 2 2

230T 1 1,3 ---

1007TR 1,3 1,5 1,5

1007TL 1,5 1,5 ---

1015T 1,6 1,5 1,5

1024T 1 1 ---

1040T 1,5 1,5 1,5

1F 1 i.

2F 1,7 -

252T 1 1,3 ---

252F 1, ---

253F 1 1,5 ---

256F 1,5 >1 ---

1039T 1,3 1-1,5 ---

1039F 1,3..

R L

T = tumeur; T = tumeur du sein droit; T = tumeur du sein gauche F = cytoponction Ces résultats mettent en évidence une excellente corrélation (r = 0,89 déterminé par méthode de régression linéaire au moyen du logiciel STATVIEW* commercialisé par la Société MICROSOFT) entre les indices de déséquilibre obtenus par le procédé de détection conforme à l'Invention et ceux déterminés par la technique du R-banding sauf dans 4 cas (86T, 230T, 252T et 253F) dans lesquels cette dernière technique apparaît ne pas avoir permis de détecter tous les bras lq et lp présents en raison de la complexité des caryotypes.5 Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui

viennent d'être décrits de façon plus explicite; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1. Procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, caractérisé en ce qu'il comprend: (a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long de ce chromosome et la deuxième étant spécifique du bras court de ce même chromosome; (b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes; (c) le calcul du rapport (Ra,) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au

moins une valeur de référence.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome sont constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit chromosome. 3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome sont constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du

chromosome cible.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que le marquage des sondes est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affminité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécifiquement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit

rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'une des

sondes est couplée à de la digoxigénine tandis que l'autre est couplée à de la biotine.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que les deux fluorochromes sont choisis parmi l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les dérivés de la rhodamine comme l'isothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101, le Cascade blue et le Bopidy FL.

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que l'un des deux fluorochromes est de l'isothiocynate de fluorescéine, tandis que le deuxième fluorochrome est du chlorure de sulfonate de

sulforhodamine 101.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce qu'il comprend de plus une contre-coloration des noyaux par un

fluorochrome différent des fluorochromes utilisés pour le marquage des sondes.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que, pour le calcul du rapport (Ri) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour l'ensemble des noyaux analysés, et on calcule le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8,

caractérisé en ce que, pour le calcul du rapport (Rj) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des fluorescences, et on calcule la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour l'ensemble des

noyaux analysés.

1 l. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que la valeur de référence correspond au rapport (Rt) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins

traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés.

12. Procédé selon la revendication 1l1, caractérisé en ce que les

cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique.

13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une étape consistant à déterminer, pour les

noyaux analysés, un indice de déséquilibre (1).

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'indice de déséquilibre (1) est déterminé en calculant le ratio entre les valeurs des rapports (Rn) et (Rt) respectivement obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés et l'ensemble des

noyaux des cellules témoins.

15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'indice de déséquilibre (1) est déterminé en calculant, pour chaque noyau analysé, le ratio entre les valeurs des rapports (Rn) et (Rt), et en retenant la valeur de ce ratio

correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés.

16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que les étapes b), c), d) de ce procédé ainsi que l'étape de détermination de l'indice de remaniement des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend: - une source de lumière susceptible de fournir de la lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et - des moyens de traitement et d'analyse des intensités de

fluorescence ainsi mesurées.

17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes,

caractérisé en ce que le déséquilibre intrachromosomique que l'on cherche à détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une délétion

du bras court de ce chromosome.

18. Trousse pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase selon

l'une quelconque des revendications I à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend:

- une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras long du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre, - une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras court de ce même chromosome, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement, un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant le déséquilibre que l'on souhaite détecter. 19. Trousse selon la revendication 18, caractérisée en ce que les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme d'étalements sur lames

prêts à être soumis à une hybridation in situ.

20. Trousse selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisées en ce que les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend, pour chaque sonde, une quantité appropriée d'un ligand dirigé spécifiquement contre cet haptène et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriée dudit contre-ligand.

21. Trousse selon l'une quelconque des revendications 18 à 20,

caractérisée en ce qu'elle comprend en outre: - une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules; et/ou - une quantité appropriée d'un troisième fluorochrome propre à permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires; et/ou - une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine,...) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage,...) propres à permettre

l'hybridation in situ du chromosome par les sondes.

22. Application d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux en interphase selon l'une quelconque des

revendications I à 17 et/ou d'une trousse pour la mise en oeuvre d'un tel procédé selon

l'une quelconque des revendications 18 à 21, à la détection de cellules cancéreuses

dans un échantillon biologique. 23. Application d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux en interphase selon l'une quelconque des

revendications 1 à 17 et/ou d'une trousse pour la mise en oeuvre d'un tel procédé selon

l'une quelconque des revendications 18 à 21, au diagnostic positif et/ou au diagnostic

évolutif des pathologies cancéreuses chez l'homme.