CA2343107A1 - Procede et trousse pour la detection d'un desequilibre intrachromosomique dans des noyaux interphasiques et leurs applications - Google Patents
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Abstract
La présente invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'hybridation in situ du chromosome suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents et respectivement spécifiques du bras long et du br as court de ce chromosome; (b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émis e dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes; (c) le calcul du rapport (Ra) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence. L'invention se rapporte également à une trousse propre à permettre la mise e n oeuvre de ce procédé, et aux applications de cette trousse et de ce procédé, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.
Description
WO 00/15841 PCTlFR99/02179 I
PROCEDE ET TROUSSE POUR LA DETEC7~ION D'UN DESEQUILIBRE
INTRACHROMOSOMIQUE DANS DES NOYAUX INTERPHASIQUES ET
LEURS APPLICATIONS
La présente Invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, à
une trousse propre à permettre la mise en ceuvre de ce procédé ainsi qu'aux applications de ce procédé et de cette trousse, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.
L'étude cytogénétique des cellules tumorales a montré (existence, io dans ces cellules, de nombreux remaniements chromosomiques consistant notamment en des pertes et des gains de matériel génétique, pouvant conduire jusqu'à la disparition de bras chromosomiques, ou, au contraire, à la présence de bras chromosomiques surnuméraires et se traduisant ainsi par des modifications du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes que fon désignera ci-après sous le: terme de déséquilibres inira-chromosomiques.
Ainsi, par exemple, DUTRILL.!~UX et al. (Cancer Genet.
Cytogenet., 1990, 4~, 203-2I7) ont mis en évidence, à partir de 30 cas, la survenue dans les cancers du sein de multiples réarrangements affectant, à une fréquence 2o particulièrement élevée, les chromosomes 1 et 16 et se manifestant principalement par un gain du bras long du chromosome 1 et une perte du bras Iong du chromosome 16, et, à une fréquence moindre, les chromosomes 4, 6, 8, 9, 11, 13 et I7. De maniëre similaire, TESTA et SIEGFRIED (Cancer Research, 1992, ~2,, 2702s-2706s) ont montrë, également à partir de 30 cas, la présence, dans les cancers du poumon non à
petites cellules, de nombreux réarrangements affectant de manière préférentielle le chromosome 7 (principalement sous la forme d'une polysomie 7 ou d'un gain de tout ou partie du bras court de ce chromosome), mais aussi les chromosomes 1, 3, 6, 7, 11, 13, 15, 17 et i9.
En fait, il est maintenant bien. établi que le processus de 3o cancérogenèse est un événement multi-étapes, nécessitant des modifications
PROCEDE ET TROUSSE POUR LA DETEC7~ION D'UN DESEQUILIBRE
INTRACHROMOSOMIQUE DANS DES NOYAUX INTERPHASIQUES ET
LEURS APPLICATIONS
La présente Invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, à
une trousse propre à permettre la mise en ceuvre de ce procédé ainsi qu'aux applications de ce procédé et de cette trousse, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.
L'étude cytogénétique des cellules tumorales a montré (existence, io dans ces cellules, de nombreux remaniements chromosomiques consistant notamment en des pertes et des gains de matériel génétique, pouvant conduire jusqu'à la disparition de bras chromosomiques, ou, au contraire, à la présence de bras chromosomiques surnuméraires et se traduisant ainsi par des modifications du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes que fon désignera ci-après sous le: terme de déséquilibres inira-chromosomiques.
Ainsi, par exemple, DUTRILL.!~UX et al. (Cancer Genet.
Cytogenet., 1990, 4~, 203-2I7) ont mis en évidence, à partir de 30 cas, la survenue dans les cancers du sein de multiples réarrangements affectant, à une fréquence 2o particulièrement élevée, les chromosomes 1 et 16 et se manifestant principalement par un gain du bras long du chromosome 1 et une perte du bras Iong du chromosome 16, et, à une fréquence moindre, les chromosomes 4, 6, 8, 9, 11, 13 et I7. De maniëre similaire, TESTA et SIEGFRIED (Cancer Research, 1992, ~2,, 2702s-2706s) ont montrë, également à partir de 30 cas, la présence, dans les cancers du poumon non à
petites cellules, de nombreux réarrangements affectant de manière préférentielle le chromosome 7 (principalement sous la forme d'une polysomie 7 ou d'un gain de tout ou partie du bras court de ce chromosome), mais aussi les chromosomes 1, 3, 6, 7, 11, 13, 15, 17 et i9.
En fait, il est maintenant bien. établi que le processus de 3o cancérogenèse est un événement multi-étapes, nécessitant des modifications
2 génétiques successivés dont l'accumulation au cours du, temps va conduire à
des cellules au potentiel transformant qui sera de plus en plus agressif, conduisant à une tumeur cliniquement détectable et éventuellement métastasiante. Aussi, une dëfinition précise des paramètres cytogénétiques caractéristiques de la tumorogénèse apparaît constituer une étape capitale, tant dans (élaboration dru diagnostic positif que de celle du diagnostic évolutif des tumeurs, permettant ainsi une mise en oeuvre des thérapeutiques les plus adaptées.
Actuellement, Ies cytogénéticiens disposent principalement de deux approches dans l'investigation du génome et de ses anomalies - d'une part, la cytogénétique classique, qui permet d'avoir accës au caryotype détaillë d'une cellule et d'appréhender les anomalies de structure et de nombre de l'ensemble des chromosomes qu'elle comporte et qui consiste, après une période de culture ih vitro des cellules dont la durée varie avec le type de cellules étudiées, à bloquer ces cellules en métaphase et à traiter les chromosomes selon différentes méthodes permettant l'observation au microscope otique de bandes s'étendant sur quelques mégabases, d'oü le fait qu'on la désigne généralement par le nom anglo-saxon de banding. Après photographie, les chromosomes sont appariés et ordonnés selon leur longueur, la position du centromère et la topographie des bandes, et ce classement aboutit à l'élaboration du caryotype.
2o Cette approche dont l'intérêt majeur est de conduire à une "image"
globale du génome, trouve un certain nombre de limites. La première tient au fait qu'elle nécessite une mise en culture préalable des cellules étudiées, de manière à
obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase. nr, il est maintenant bien acquis que, dans le cas d'une population polyclonalé, la réalisation d'une culture cellulaire est susceptible d'introduire des biais importants dans les résultats d'une .
analyse cytogénétique, en raison de ce que seules Ies cellulles adaptées aux conditions de culture se divisent et donnent des métaphases. Une autre limite réside dans le pouvoir de résolution de la cytogénétique classique qui ne permet d'appréhender que partiellement les remaniements chromosomiques souvent relativement complexes 3o dans les tumeurs solides, lesquelles représentent la majorité des cancers.
Enfin, de par
des cellules au potentiel transformant qui sera de plus en plus agressif, conduisant à une tumeur cliniquement détectable et éventuellement métastasiante. Aussi, une dëfinition précise des paramètres cytogénétiques caractéristiques de la tumorogénèse apparaît constituer une étape capitale, tant dans (élaboration dru diagnostic positif que de celle du diagnostic évolutif des tumeurs, permettant ainsi une mise en oeuvre des thérapeutiques les plus adaptées.
Actuellement, Ies cytogénéticiens disposent principalement de deux approches dans l'investigation du génome et de ses anomalies - d'une part, la cytogénétique classique, qui permet d'avoir accës au caryotype détaillë d'une cellule et d'appréhender les anomalies de structure et de nombre de l'ensemble des chromosomes qu'elle comporte et qui consiste, après une période de culture ih vitro des cellules dont la durée varie avec le type de cellules étudiées, à bloquer ces cellules en métaphase et à traiter les chromosomes selon différentes méthodes permettant l'observation au microscope otique de bandes s'étendant sur quelques mégabases, d'oü le fait qu'on la désigne généralement par le nom anglo-saxon de banding. Après photographie, les chromosomes sont appariés et ordonnés selon leur longueur, la position du centromère et la topographie des bandes, et ce classement aboutit à l'élaboration du caryotype.
2o Cette approche dont l'intérêt majeur est de conduire à une "image"
globale du génome, trouve un certain nombre de limites. La première tient au fait qu'elle nécessite une mise en culture préalable des cellules étudiées, de manière à
obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase. nr, il est maintenant bien acquis que, dans le cas d'une population polyclonalé, la réalisation d'une culture cellulaire est susceptible d'introduire des biais importants dans les résultats d'une .
analyse cytogénétique, en raison de ce que seules Ies cellulles adaptées aux conditions de culture se divisent et donnent des métaphases. Une autre limite réside dans le pouvoir de résolution de la cytogénétique classique qui ne permet d'appréhender que partiellement les remaniements chromosomiques souvent relativement complexes 3o dans les tumeurs solides, lesquelles représentent la majorité des cancers.
Enfin, de par
3 son principe, cette approche se heurte à toute possibilité d'un dépistagé
automatisé des anomalies chromosomiques complexes et/ou multiples.
- d'autre part, l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), qui permet de repérer une séquence d'ADN chromosomique au moyen d'une sonde de séquence spécifique homologue à celle qui est étudiée.. Fondée sur la complémentarité
existant entre les nucléotides (adénine-thymine, adénine-uridine, cytosine-guanine), elle consiste à hybrider l'ADN cible avec une sonde marquée, soit directement, sait indirectement par un fluorochrome, et à utiliser la fluorescence émise par ce dernier comme témoin de l'hybridation.
l0 L'hybridation ih situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, voire d'un locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible s'étant hybridés avec les sondes. Toutefois, en analyse pathologique de routine, l'hybridation in situ en fluorescence est mise en oeuvre sur des noyaux interphasiques et elle utilise alors des sondes spécifiques des régions centromériques des chromosomes. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par un comptage des spots fluorescents, soit manuellement au microscope, soit de manière automatisée au moyen d'un cytamétre d'image, le nombre des spots étatxt dans tous les cas supposé
correspondre au nombre de copies des chromosomes étudiés.
Si le développement des techniques de la FISH a incontestablement amélioré le pouvoir de résolution de Ia cytogénétique {jusqu'à l'ordre de quelques kilobases), permettant ainsi de mieux cerner les gains et pertes en matériel chromosomique et les anomalies de structure des chromosomes, ces techniques telles qu'elles existent aujourd'hui, ne sont toutefois pas totalement satisfaisantes.
En effet, s'agissant de ia FISH sur chromosomes métaphasiques, une étape préalable de culture in vitro des cellules est indispensable, comme dans Ie cas de ia cytogénétique classique, pour obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase avec Ies inconvénients précités que cela implique.
automatisé des anomalies chromosomiques complexes et/ou multiples.
- d'autre part, l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), qui permet de repérer une séquence d'ADN chromosomique au moyen d'une sonde de séquence spécifique homologue à celle qui est étudiée.. Fondée sur la complémentarité
existant entre les nucléotides (adénine-thymine, adénine-uridine, cytosine-guanine), elle consiste à hybrider l'ADN cible avec une sonde marquée, soit directement, sait indirectement par un fluorochrome, et à utiliser la fluorescence émise par ce dernier comme témoin de l'hybridation.
l0 L'hybridation ih situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, voire d'un locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible s'étant hybridés avec les sondes. Toutefois, en analyse pathologique de routine, l'hybridation in situ en fluorescence est mise en oeuvre sur des noyaux interphasiques et elle utilise alors des sondes spécifiques des régions centromériques des chromosomes. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par un comptage des spots fluorescents, soit manuellement au microscope, soit de manière automatisée au moyen d'un cytamétre d'image, le nombre des spots étatxt dans tous les cas supposé
correspondre au nombre de copies des chromosomes étudiés.
Si le développement des techniques de la FISH a incontestablement amélioré le pouvoir de résolution de Ia cytogénétique {jusqu'à l'ordre de quelques kilobases), permettant ainsi de mieux cerner les gains et pertes en matériel chromosomique et les anomalies de structure des chromosomes, ces techniques telles qu'elles existent aujourd'hui, ne sont toutefois pas totalement satisfaisantes.
En effet, s'agissant de ia FISH sur chromosomes métaphasiques, une étape préalable de culture in vitro des cellules est indispensable, comme dans Ie cas de ia cytogénétique classique, pour obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase avec Ies inconvénients précités que cela implique.
4 Quant à la FISH sur noyaux interphasiques, si elle présente l'avantage d'éviter (étape de culture et, partant, la s-élection potentielle de certaines cellules au cours de cette culture, elle présente l'inconvénient que le comptage manuel des spots ne peut être effectué que sur un nombre restreint de cellules et est à l'origine d'erreurs importantes lorsqu'il est appliqué à une petité population de cellules anormales (IüBBELAAR et al., Cytametry, 1993, 14, 7I6-724), tandis que le comptage automatisé demeure à ce jour très imparfait:, en dépit des efforts qui ont été
tentés pour améliorer la qualité de l'hybridation, la qualité des signaux qu'elle génère et la sensibilité des caméras dont sont équipés les cy~tomètres d'image (TRUONG et al., Anal. Cell Path., 1997, ~,,3_, 137-146). Au surplus;, il s'avère qu'un certain nombre d'anomalies chromosomiques n'affectent pas les régions centramériques des chromosomes, mais leurs bras, et échappent à toute possibilité de détection par cette technique.
Les Inventeurs se sont, donc, fixés poux but de fournir un procédé
propre à permettre la détection d'un déséquilibre intrac;hromosomique dans les cellules d'un échantillon biologique, et qui soit exempt, d'une manière générale, de tous les inconvénients des procédés de (état antérieur de Ia technique.
Plus spécifiquement, les Inventeurs ;>e sont fixés pour but de fournir un procédé de détection d'un déséquilibre intrachrc>mosomique qui; tout en étant 2o sensible, spécifique et reproductible de manière à. garantir la fiabilité
de cette détection, puisse - d'une part, être mis en oeuvre sur des cellules en interphase pour s'affranchir de la nécessité de soumettre préalablement les cellules devant être étudiées à une culture in vitro, - d'autre part, s'appliquer non seulement à une population cellulaire monoclonale, mais également à une population cellulaire polyclanale afin de permettre la détection de la présence éventuelle, au sein de cette population, de clones cellulaires anormaux même lorsque ceux-ci sont minoritaires, et - en outre, être au moins partiellement, automatisé afin de rendre possible, pour un coût raisonnable, le traitement d'une quantité importante d'échantillons biologiques tout en limitant les risques d'erreurs dans ce traitement.
Ces buts sont atteints selon la présente Invention par un procédé de
tentés pour améliorer la qualité de l'hybridation, la qualité des signaux qu'elle génère et la sensibilité des caméras dont sont équipés les cy~tomètres d'image (TRUONG et al., Anal. Cell Path., 1997, ~,,3_, 137-146). Au surplus;, il s'avère qu'un certain nombre d'anomalies chromosomiques n'affectent pas les régions centramériques des chromosomes, mais leurs bras, et échappent à toute possibilité de détection par cette technique.
Les Inventeurs se sont, donc, fixés poux but de fournir un procédé
propre à permettre la détection d'un déséquilibre intrac;hromosomique dans les cellules d'un échantillon biologique, et qui soit exempt, d'une manière générale, de tous les inconvénients des procédés de (état antérieur de Ia technique.
Plus spécifiquement, les Inventeurs ;>e sont fixés pour but de fournir un procédé de détection d'un déséquilibre intrachrc>mosomique qui; tout en étant 2o sensible, spécifique et reproductible de manière à. garantir la fiabilité
de cette détection, puisse - d'une part, être mis en oeuvre sur des cellules en interphase pour s'affranchir de la nécessité de soumettre préalablement les cellules devant être étudiées à une culture in vitro, - d'autre part, s'appliquer non seulement à une population cellulaire monoclonale, mais également à une population cellulaire polyclanale afin de permettre la détection de la présence éventuelle, au sein de cette population, de clones cellulaires anormaux même lorsque ceux-ci sont minoritaires, et - en outre, être au moins partiellement, automatisé afin de rendre possible, pour un coût raisonnable, le traitement d'une quantité importante d'échantillons biologiques tout en limitant les risques d'erreurs dans ce traitement.
Ces buts sont atteints selon la présente Invention par un procédé de
5 détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, qui est caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long de ce 1o chromosome tandis que la deuxième sonde est spécifique du bras court de ce même chromosome ;
(b) la mesure de (intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de iongueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes ;
(c) le calcul du rapport entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées ; et {d) la comparaison de ia valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.
Au sens de la présente Invention., on entend par "déséquilibre 2o intrachromosomique", toute modification du rapport normal entre le nombre etlou la longueur des bras long et court d'un chromosome, résultant d'une perte ou d'un gain de matériel génétique tels qu'une délétion ou, au contraire, une duplication de tout ou partie d'un bras chromosomique.
Par ailleurs, pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible", le chromosome suspecté d'être affecté par un déséquilibre tel que ci-avant défini et dont on cherche à vérifier s'il présente effectivement ce déséquilibre.
Conformément à (Invention, les deux sondes utilisées pour (hybridation in situ du chromosome cible sont constituées par un ensemble de sondes
(b) la mesure de (intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de iongueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes ;
(c) le calcul du rapport entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées ; et {d) la comparaison de ia valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.
Au sens de la présente Invention., on entend par "déséquilibre 2o intrachromosomique", toute modification du rapport normal entre le nombre etlou la longueur des bras long et court d'un chromosome, résultant d'une perte ou d'un gain de matériel génétique tels qu'une délétion ou, au contraire, une duplication de tout ou partie d'un bras chromosomique.
Par ailleurs, pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible", le chromosome suspecté d'être affecté par un déséquilibre tel que ci-avant défini et dont on cherche à vérifier s'il présente effectivement ce déséquilibre.
Conformément à (Invention, les deux sondes utilisées pour (hybridation in situ du chromosome cible sont constituées par un ensemble de sondes
6 non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit chromosome.
De manière préférée, ces sondes sor.~t constituées par un ensemble de sondes recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome cible.
De telles sondes, que fon désignE; communément par le nom de peinture chromosomique, peuvent être préparées spécialement pour les besoins de la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à (Invention.
Ainsi, par exemple, ces sondes sort susceptibles d'être préparées à
partir de cellules connues pour présenter, au niveau du même chromosome que le i0 chromosome cible, une anomalie (délétion, isochromosome, ...) du bras court ou du bras long telle que ce chromosome altéré correspond<; sensiblement à fun des bras du chromosome cible, en triant les chromosomes de ces cellules, par exemple par cytométrie de flux, de manière à ne conserver que les chromosomes propres à
servir à
la préparation des sondes, puis en soumettant ces derniers à une amplification, par exemple par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR telle que décrite par MILAN et al. (Mammalian Genome, 1996, 7, 19~E-199), suivie d'un marquage des produits résultant de cette amplification par un fluoroc;hrome.
En variante, elles peuvent aussi ên-e préparées à partir de cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, par micro-dissection au laser ou par aiguille du chromosome de ces cellules correspondant au chromosome cible de manière à en individualiser le bras long etJou le bras court, suivie d'une amplification du ou des bras chromosomiques ainsi obtenus, puis d'un marquage des produits .résultant de cette amplification par un fluorochrome,, comme décrit par exemple par GUAN et al: (Hum. Molec. Genet., 1993, ~, 1117-I 121).
Il est, bien entendu, également possible de recourir, pour la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à Flnventüon, à des sondes commerciales prêtes à (emploi. Ainsi, par exemple, des sondes spécifiques des bras courts et longs des différents chromosomes humains et marquées par de la biotine sont disponibles auprès de la Société ALTECHNOLOGIES (USA).
De manière préférée, ces sondes sor.~t constituées par un ensemble de sondes recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome cible.
De telles sondes, que fon désignE; communément par le nom de peinture chromosomique, peuvent être préparées spécialement pour les besoins de la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à (Invention.
Ainsi, par exemple, ces sondes sort susceptibles d'être préparées à
partir de cellules connues pour présenter, au niveau du même chromosome que le i0 chromosome cible, une anomalie (délétion, isochromosome, ...) du bras court ou du bras long telle que ce chromosome altéré correspond<; sensiblement à fun des bras du chromosome cible, en triant les chromosomes de ces cellules, par exemple par cytométrie de flux, de manière à ne conserver que les chromosomes propres à
servir à
la préparation des sondes, puis en soumettant ces derniers à une amplification, par exemple par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR telle que décrite par MILAN et al. (Mammalian Genome, 1996, 7, 19~E-199), suivie d'un marquage des produits résultant de cette amplification par un fluoroc;hrome.
En variante, elles peuvent aussi ên-e préparées à partir de cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, par micro-dissection au laser ou par aiguille du chromosome de ces cellules correspondant au chromosome cible de manière à en individualiser le bras long etJou le bras court, suivie d'une amplification du ou des bras chromosomiques ainsi obtenus, puis d'un marquage des produits .résultant de cette amplification par un fluorochrome,, comme décrit par exemple par GUAN et al: (Hum. Molec. Genet., 1993, ~, 1117-I 121).
Il est, bien entendu, également possible de recourir, pour la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à Flnventüon, à des sondes commerciales prêtes à (emploi. Ainsi, par exemple, des sondes spécifiques des bras courts et longs des différents chromosomes humains et marquées par de la biotine sont disponibles auprès de la Société ALTECHNOLOGIES (USA).
7 Par ailleurs, bien que les sondes utilisées pour l'h~bridation in situ du chromosome cible puissent être des sondes directement couplées à un fluorochrome, ces sondes sont, de préférence, des sondes à marquage fluorescent indirect, les Inventeurs ayant en effet constaté que ce type de marquage conduit à des résultats particulièrement satisfaisants.
Aussi, selon une disposition préférée de mise en oeuvre du procédé
conforme à (Invention, le marquage des sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécif quement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
A titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage indirect des sondes utiles dans la présente Invention, on peut notamment citer - la digoxigénine, le dinitrophénol et Ie 2-acétylaminofluorène, auquel cas la réaction d'affinité haptènelligand est avantageusennent réalisée au moyen d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome ;
- la biotine, auquel cas la réaction d'aff nité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en 2o utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps cfirigés contre ces derniers et qui sont conjugués à un fluorochrome.
De préférence, fane des sondes est couplée à de la digoxigénine tandis que (autre sonde est couplée à de la biotine.
Quel que soit le type de marquage des sondes (direct ou indirect), celles-ci sont marquées, conformément à l'Invention; par deux fluorochromes différents destinés à permettre, par l'émission de; deux lumières de couleurs différentes, une révélation des bras longs d'une part, e1: des bras courts d'autre part, du chromosome cible s'étant hybridés avec les sondes qui Leur sont respectivement spécifiques.
Aussi, selon une disposition préférée de mise en oeuvre du procédé
conforme à (Invention, le marquage des sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécif quement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
A titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage indirect des sondes utiles dans la présente Invention, on peut notamment citer - la digoxigénine, le dinitrophénol et Ie 2-acétylaminofluorène, auquel cas la réaction d'affinité haptènelligand est avantageusennent réalisée au moyen d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome ;
- la biotine, auquel cas la réaction d'aff nité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en 2o utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps cfirigés contre ces derniers et qui sont conjugués à un fluorochrome.
De préférence, fane des sondes est couplée à de la digoxigénine tandis que (autre sonde est couplée à de la biotine.
Quel que soit le type de marquage des sondes (direct ou indirect), celles-ci sont marquées, conformément à l'Invention; par deux fluorochromes différents destinés à permettre, par l'émission de; deux lumières de couleurs différentes, une révélation des bras longs d'une part, e1: des bras courts d'autre part, du chromosome cible s'étant hybridés avec les sondes qui Leur sont respectivement spécifiques.
8 Ces fluorochromes peuvent être indifféremment choisis parmi les différents composés fluorescents utilisés pour le marG~uage de sondes nucléiques tels que l'isothiocyanate de fluorescéine {FITC), les dénués de la rhodamine comme fisothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de suiforhodamine {Texas red°), le Cascade blué ou encore Ie Bopidy FL, à condition toutefois de veiller à ce qu'ils présentent des maxima de longueurs d'onde d'émission situées dans des bandes qui ne se recouvrent pas.
Ainsi, par exemple, dans le cas où l'u,ne des sondes sera marquée par du FITC dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 543 nm, l'autre sonde io sera avantageusement marquée par de l'isothiocyanate de rhodamine b dont Ia longueur d'onde maximale d'émission se situe à 590 nm ou, mieux encore, par du Texas red~ qui présente une longueur d'onde maximale d'émission encore plus éloignée (604 nm) de celle du FITC.
De préférence, l'un des deux fluorocl':zromes est du FITC, tandis que i s l'autre est du Texas red~.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, de plus, une contre-coloration des noyaux destinée à permettre leur révélation préalablement à la mesure de f intensité de la fluorescence émise dans . ces noyaux aux bandes de longueurs 20 d'onde d'émission des deux fluorochromes couplés aux sondes. Cette contre-coloration est donc réalisée avant de procéder à cette mesure, au moyen d'un fluorochrome différent de ceux utilisés pour le marquage des sondes, tel que Ie 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou le 4',6-bis-2' imidazolinyl 4H-5H {DIPI}.
Comme précédemment indiqué, le procédé de détection comprend 25 une étape visant à mesurer f intensité de la fluorescence émise dans les noyaux aux bandes de longueur d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes couplés aux sondes.
Ainsi, par exemple, si (hybridation in situ du chromosome cible a été réalisée en utilisant une sonde spécifique du bras long de ce chromosome marquée 3o par du FITC qui émet une lumière verte, et une sonde; spéci$que du bras court de ce
Ainsi, par exemple, dans le cas où l'u,ne des sondes sera marquée par du FITC dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 543 nm, l'autre sonde io sera avantageusement marquée par de l'isothiocyanate de rhodamine b dont Ia longueur d'onde maximale d'émission se situe à 590 nm ou, mieux encore, par du Texas red~ qui présente une longueur d'onde maximale d'émission encore plus éloignée (604 nm) de celle du FITC.
De préférence, l'un des deux fluorocl':zromes est du FITC, tandis que i s l'autre est du Texas red~.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, de plus, une contre-coloration des noyaux destinée à permettre leur révélation préalablement à la mesure de f intensité de la fluorescence émise dans . ces noyaux aux bandes de longueurs 20 d'onde d'émission des deux fluorochromes couplés aux sondes. Cette contre-coloration est donc réalisée avant de procéder à cette mesure, au moyen d'un fluorochrome différent de ceux utilisés pour le marquage des sondes, tel que Ie 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) ou le 4',6-bis-2' imidazolinyl 4H-5H {DIPI}.
Comme précédemment indiqué, le procédé de détection comprend 25 une étape visant à mesurer f intensité de la fluorescence émise dans les noyaux aux bandes de longueur d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes couplés aux sondes.
Ainsi, par exemple, si (hybridation in situ du chromosome cible a été réalisée en utilisant une sonde spécifique du bras long de ce chromosome marquée 3o par du FITC qui émet une lumière verte, et une sonde; spéci$que du bras court de ce
9 chromosome marquée par du Texas red~ qui émet une .lumière rouge, on mesure successivement (intensité de la fluorescence verte; émise par les noyaux, puis (intensité de la fluorescence rouge émise par ces mêmes noyaux. On obtient de la sorte deux valeurs d'intensité de fluorescence qui sont fonction respectivement du nombre de bras Longs et du nombre de bras courts du chromosome cible s'étant hybridés avec les sondes qui leur sont spécifiques.
Conformément à (Invention, on calcule ensuite le rapport (R°) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi nnesurées. Avantageusement, ce rapport est calculé par l'une et/ou (autre des méthodes suivantes - une première méthode consistant à déterminer, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour (ensemble des noyaux analysés, et à calculer le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues ; et - une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des deux fluorescentes, et à déterminer la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour (ensemble des noyaux analysés.
Puis, on compare la vaieur du rapport (R~,) ainsi obtenue avec au mains une valeur de référence.
De manière préférée, cette valeur de référence correspond au rapport (R~) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés.
Avantageusement, les cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, comme par exemple des lymphocytes provenant de sujets sains. Ainsi, une différence significative (c'est-à-dire en pratique, au moins égale à 20%) entre les valeurs des rapports (Rrt) et (Rt) respectivement obtenues pour les noyaux analysés et les noyaux des ceilules témoins traduit l'existence, dans au mains un certain nombre des noyaux analysës, du déséquilibre intrachromosomique 3o recherché.
Il est, toutefois, possible d'utilise.r également comme cellules témoins, des cellules affectées par le déséquilibre intrachromosomique que fon souhaite détecter telles que des cellules d'une lignée cellulaire connues pour présenter de manière constante ce déséquilibre intrachromosomidue.
Selon encore une autre disposition préférée du procédé de détection conforme à (Invention, celui-ci comprend, en outre, unie étape consistant à
déterminer, pour les noyaux analysés, un indice (I) de déséquilibre. Là également, cet indice de déséquilibre peut avantageusement être établi par fane et/ou (autre des méthodes suivantes ~ une premiëre méthode consistant à calculer le ratio entre les valeurs des rapports (R~) et (R~) respectivement obtenues poux l'ensemble des noyaux analysés et (ensemble des noyaux des cellules témoins. ; et - une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, Ie ratio entre les valeurs des rapports (R~) et (R~), et à retenir, par exemple à
partir d'un histogramme représentant le nombre de noyaux analysés en fonction du ratio R~IRt, Ia valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du procédé de détection conforme à (Invention, les étapes b), c), d) correspondant à la 2o mesure des intensités de fluorescence, au calcul du rapport entre ces intensités de fluorescence et à la comparaison de la valeur de ce rapport avec une valeur de référence, ainsi que l'étape de détermination de (indice (~ de déséquilibre des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend - une source de lumière susceptible de fournir de Ia lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité
de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et - des moyens de traitement et d'analyse dés intensités de fluorescence ainsi mesurées.
A titre d'exemple d'appareillage susceptible de convenir à la mise en oeuvre desdites étapes, on peut citer l'analyseur automatique d'images commercialisé
par la Société BECTON DICIüNSON IMAGE CY'TOMETRY SYSTEMS sous la marque enregistrée DISCOVERY.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de détection conforme à l'Invention, le déséquilibre intrachronnosomique que fon cherche à
détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une 1o délétion du bras court de ce chromosome.
La présente Invention a, également, pour obj et une trousse pour la mise en couvre du procédé de détection d'un déséqttilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase tel que précédemment défini, qui est caractérisée en ce qu'elle comprend - une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique; du bras Iong du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre, - une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant, spécifique du bras court de ce même chromosome, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant ie déséquilibre que l'on souhaite détecter.
Selon une premiére disposition avantageuse de la trousse conforme à
l'Invention, les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.
Selon une autre disposition avantageuse de la trousse conforme à
3o flnvention, les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend;
WO 00/I5841 PCTIFR99/02I~9 pour chaque sonde; une quantité appropriée d'un lig<~nd dirigé spécifiquement contre cet hapténe et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriÉ:e dudit contre-ligand.
Selon encore une autre disposition avantageuse de cette trousse, elle comprend en outre - une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules ; et/ou - une quantité appropriée d'un troisiéme fluorochrome propre à
lo permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; etlou - une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ..:) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à
perinettre (hybridation ih situ du chromosome par les sondes.
La présente Invention a, également, pour objet (application du procédé de détection d'un dëséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase et de la trousse propre à permettre ia mise en ouvre de ce procédé tels que précédemment définis, à la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique tel qu'une cytoponction, wn épanchement séreux (pleural, péritonéal, ...), une tumorectomie ou encore une aspiration bronchique.
2o En effet, le procédé de détection conforme à (Invention présente un intérêt tout à fait particulier dans le domaine de l.a cancérologie humaïne et, plus spécialement, pour l'établissement du diagnostic positif et/ou du diagnostic évolutif des pathoiogies cancéreuses dans lesquelles on observe de manière récurrente un certain nombre de remaniements chromosomiques se traduisant par des déséquilibres du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes, tels que la duplication du bras long des chromosomes 1 et 8; la délétion du bras court des chromosomes 1 et 3 ou encore Ia délétion du bras long du chromosome 6.
Ce procédé est également susceptible de trouver des applications dans des domaines autres que 1a cancérologie, et notamment dans (établissement du diagnostic positif de pathôlogies humaines innées ou acquises liées à une anomalie chromosomique comme, par exemple, la maladie dite; du cri du chat qui se caractérise par une délétion d'une partie du bras court du chromosome 5.
Outre Ies dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui suit, qui se iréfere à un exemple de mise en oeuvre et d'application du procédé de détection conforme à
l'Invention ainsi qu'à la Figur 1 â~nexée qui illustre;, sous la forme d'histogrammes, les répartitions du nombre de noyaux en fonction des. intensités de fluorescence telles que mesurées pour le bras long (lq) d'une part, et lE; bras court (lp) d'autre part, du lo chromosome 1 par la mise en oeuvre dudit procédé sur des cellules provenant d'un prélévement tumoral.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné
uniquement à titre d'illustration de l'objet de I'inverEtion et n'en constitue en aucune manière une limitation.
EXE .,MPLE : DETECTION D'UN DESEQUILIBItE ENTRE LES BRAS LONG
ET COURT DU CHROMOSOME I DANS DE;> CELLULES DE CANCERS
DU SEIN
Le procédé de détection conforme à (Invention et (intérêt de son utilisation à des fins diagnostiques ont été validés par une série d'expérimentations 2o visant à appliquer ce procédé à la recherche du déséquilibre entre le bras long (ci-après "bras lq") et Ie bras court (ci-après "bras lp") du chromosome 1 fréquemment observé
dans les cas de cancers du sein, et à comparer les résultats obtenus avec ceux observés en mettant en ceuvre deux techniques classiquement utilisées en cytogénétique, à
savoir la technique du R-banding d'une part, et la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur chromosomes rnétaphasiques d'autre part.
1) Matériel biolo~iaue Les expérimentations ont été réalisées sur 2 types de cellules de cancers du sein - d'une part, des cellules tumorales appartenant à 3 lignées cellulaires : ZR 75, BT 20 et H 466 et provenant respectivement des souches déposées auprès de l'ATCC {AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) sous les n° CRL-I500, HTB-19 et HTB-171 ; et - d'autre part, des cellules tumorales provenant de prélèvements biologiques effectués chez 16 patientes d'âge compris entre 33 et 73 ans, et correspondant à 13 tumeurs et 6 cytoponctions, 2 patientes âyant fait l'objet à ia fois d'une cytoponction, puis d'une tumorectomie, et I patiente ayant fait (objet de 2 tumorectomies (sein droit et sein gauche).
Parmi ces prélèvements biologiques, 3 se sont révélés correspondre à
des tumeurs de stade I, 4 à des tumeurs de stade IIA, 8 à des tumeurs de stade IB, 1 à
1 o une tumeur de stade IIIA et 1 à une tumeur de stade IIIB, selon le groupement par stade de fAMERICAN JOINT COMMITTEE OF t:ANCER (AJCC). Par ailleurs, l'histologie a permis de montrer qu'il s'agissait dans :l0 cas de carcinomes canalaires infiltrants, dans 3 cas de carcinomes lobulaires infiltrants, et dans 3 autres cas d'un carcinome indifférencié, d'un carcinome colloïde et. d'un carcinome intracanalaire Selon la méthode du grade de SCARFF-BLOOM-RIt~HARDSON (SBR), 3 tumeurs étaient de grade II tandis que 5 étaient de grade III.
Z) Pré~arat~,on des lamg~ de cellules tumorales Les lignées cellulaires ont été cultivées dans des conditions standard.
Elles ont été fixées soit par du liquide de CARNOY, soit par du paraformaldéhyde à
0,5% dans du tampon PBS avec, dans ce dernier cas, t;Gne post-fixation par de féthanol à 70%, puis étalées sur lames.
Les tumeurs et la moitié des cytoporictions ont été mises en cultures de courte durée (72 heures) comme décrit par MLTLEF:IS et al. (Genes, Chromosomes & Cancer, 1994, IQ, 160-170). Puis, les cellules provenant de ces cultures ont été
fixées par du liquide de CARNOY et étalées sur lames.
Les autres cytoponctions, après dilution (10 fois) dans du milieu dissociant n° C 1419 (SIGMA), ont été fixées par du paraformaldéhyde à
0,5% dans du tampon PBS, post-fixées par de féthanol à 70''%, puis étalées sur lames par centrifugation au moyen d'une centrifugeuse Cytospïn~~ 3 {SHANDON).
3) ~ré~aration des lames de cellules témoins Des lames de cellules témoins ont été préparées par étalement de cellules lymphocytaires dénuées de toute anomalie chromosomique, après fixation de ces cellules pour une partie de ces lames, par du liquide de CARNOY et pour l'autre 5 partie, par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS, suivie dans ce dernier cas d'une post-fixation par de I'éthanol à 70%.
4) Préparation des sondes Pour (obtention des sondes spécifiques du bras lq et du bras lp, des suspensions chromosomiques des lignées cellulaires H 466 et DU 145 (souche
Conformément à (Invention, on calcule ensuite le rapport (R°) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi nnesurées. Avantageusement, ce rapport est calculé par l'une et/ou (autre des méthodes suivantes - une première méthode consistant à déterminer, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour (ensemble des noyaux analysés, et à calculer le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues ; et - une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des deux fluorescentes, et à déterminer la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour (ensemble des noyaux analysés.
Puis, on compare la vaieur du rapport (R~,) ainsi obtenue avec au mains une valeur de référence.
De manière préférée, cette valeur de référence correspond au rapport (R~) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés.
Avantageusement, les cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, comme par exemple des lymphocytes provenant de sujets sains. Ainsi, une différence significative (c'est-à-dire en pratique, au moins égale à 20%) entre les valeurs des rapports (Rrt) et (Rt) respectivement obtenues pour les noyaux analysés et les noyaux des ceilules témoins traduit l'existence, dans au mains un certain nombre des noyaux analysës, du déséquilibre intrachromosomique 3o recherché.
Il est, toutefois, possible d'utilise.r également comme cellules témoins, des cellules affectées par le déséquilibre intrachromosomique que fon souhaite détecter telles que des cellules d'une lignée cellulaire connues pour présenter de manière constante ce déséquilibre intrachromosomidue.
Selon encore une autre disposition préférée du procédé de détection conforme à (Invention, celui-ci comprend, en outre, unie étape consistant à
déterminer, pour les noyaux analysés, un indice (I) de déséquilibre. Là également, cet indice de déséquilibre peut avantageusement être établi par fane et/ou (autre des méthodes suivantes ~ une premiëre méthode consistant à calculer le ratio entre les valeurs des rapports (R~) et (R~) respectivement obtenues poux l'ensemble des noyaux analysés et (ensemble des noyaux des cellules témoins. ; et - une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, Ie ratio entre les valeurs des rapports (R~) et (R~), et à retenir, par exemple à
partir d'un histogramme représentant le nombre de noyaux analysés en fonction du ratio R~IRt, Ia valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du procédé de détection conforme à (Invention, les étapes b), c), d) correspondant à la 2o mesure des intensités de fluorescence, au calcul du rapport entre ces intensités de fluorescence et à la comparaison de la valeur de ce rapport avec une valeur de référence, ainsi que l'étape de détermination de (indice (~ de déséquilibre des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend - une source de lumière susceptible de fournir de Ia lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité
de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et - des moyens de traitement et d'analyse dés intensités de fluorescence ainsi mesurées.
A titre d'exemple d'appareillage susceptible de convenir à la mise en oeuvre desdites étapes, on peut citer l'analyseur automatique d'images commercialisé
par la Société BECTON DICIüNSON IMAGE CY'TOMETRY SYSTEMS sous la marque enregistrée DISCOVERY.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de détection conforme à l'Invention, le déséquilibre intrachronnosomique que fon cherche à
détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une 1o délétion du bras court de ce chromosome.
La présente Invention a, également, pour obj et une trousse pour la mise en couvre du procédé de détection d'un déséqttilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase tel que précédemment défini, qui est caractérisée en ce qu'elle comprend - une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique; du bras Iong du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre, - une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant, spécifique du bras court de ce même chromosome, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant ie déséquilibre que l'on souhaite détecter.
Selon une premiére disposition avantageuse de la trousse conforme à
l'Invention, les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.
Selon une autre disposition avantageuse de la trousse conforme à
3o flnvention, les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend;
WO 00/I5841 PCTIFR99/02I~9 pour chaque sonde; une quantité appropriée d'un lig<~nd dirigé spécifiquement contre cet hapténe et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriÉ:e dudit contre-ligand.
Selon encore une autre disposition avantageuse de cette trousse, elle comprend en outre - une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules ; et/ou - une quantité appropriée d'un troisiéme fluorochrome propre à
lo permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; etlou - une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ..:) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à
perinettre (hybridation ih situ du chromosome par les sondes.
La présente Invention a, également, pour objet (application du procédé de détection d'un dëséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase et de la trousse propre à permettre ia mise en ouvre de ce procédé tels que précédemment définis, à la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique tel qu'une cytoponction, wn épanchement séreux (pleural, péritonéal, ...), une tumorectomie ou encore une aspiration bronchique.
2o En effet, le procédé de détection conforme à (Invention présente un intérêt tout à fait particulier dans le domaine de l.a cancérologie humaïne et, plus spécialement, pour l'établissement du diagnostic positif et/ou du diagnostic évolutif des pathoiogies cancéreuses dans lesquelles on observe de manière récurrente un certain nombre de remaniements chromosomiques se traduisant par des déséquilibres du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes, tels que la duplication du bras long des chromosomes 1 et 8; la délétion du bras court des chromosomes 1 et 3 ou encore Ia délétion du bras long du chromosome 6.
Ce procédé est également susceptible de trouver des applications dans des domaines autres que 1a cancérologie, et notamment dans (établissement du diagnostic positif de pathôlogies humaines innées ou acquises liées à une anomalie chromosomique comme, par exemple, la maladie dite; du cri du chat qui se caractérise par une délétion d'une partie du bras court du chromosome 5.
Outre Ies dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui suit, qui se iréfere à un exemple de mise en oeuvre et d'application du procédé de détection conforme à
l'Invention ainsi qu'à la Figur 1 â~nexée qui illustre;, sous la forme d'histogrammes, les répartitions du nombre de noyaux en fonction des. intensités de fluorescence telles que mesurées pour le bras long (lq) d'une part, et lE; bras court (lp) d'autre part, du lo chromosome 1 par la mise en oeuvre dudit procédé sur des cellules provenant d'un prélévement tumoral.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné
uniquement à titre d'illustration de l'objet de I'inverEtion et n'en constitue en aucune manière une limitation.
EXE .,MPLE : DETECTION D'UN DESEQUILIBItE ENTRE LES BRAS LONG
ET COURT DU CHROMOSOME I DANS DE;> CELLULES DE CANCERS
DU SEIN
Le procédé de détection conforme à (Invention et (intérêt de son utilisation à des fins diagnostiques ont été validés par une série d'expérimentations 2o visant à appliquer ce procédé à la recherche du déséquilibre entre le bras long (ci-après "bras lq") et Ie bras court (ci-après "bras lp") du chromosome 1 fréquemment observé
dans les cas de cancers du sein, et à comparer les résultats obtenus avec ceux observés en mettant en ceuvre deux techniques classiquement utilisées en cytogénétique, à
savoir la technique du R-banding d'une part, et la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur chromosomes rnétaphasiques d'autre part.
1) Matériel biolo~iaue Les expérimentations ont été réalisées sur 2 types de cellules de cancers du sein - d'une part, des cellules tumorales appartenant à 3 lignées cellulaires : ZR 75, BT 20 et H 466 et provenant respectivement des souches déposées auprès de l'ATCC {AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) sous les n° CRL-I500, HTB-19 et HTB-171 ; et - d'autre part, des cellules tumorales provenant de prélèvements biologiques effectués chez 16 patientes d'âge compris entre 33 et 73 ans, et correspondant à 13 tumeurs et 6 cytoponctions, 2 patientes âyant fait l'objet à ia fois d'une cytoponction, puis d'une tumorectomie, et I patiente ayant fait (objet de 2 tumorectomies (sein droit et sein gauche).
Parmi ces prélèvements biologiques, 3 se sont révélés correspondre à
des tumeurs de stade I, 4 à des tumeurs de stade IIA, 8 à des tumeurs de stade IB, 1 à
1 o une tumeur de stade IIIA et 1 à une tumeur de stade IIIB, selon le groupement par stade de fAMERICAN JOINT COMMITTEE OF t:ANCER (AJCC). Par ailleurs, l'histologie a permis de montrer qu'il s'agissait dans :l0 cas de carcinomes canalaires infiltrants, dans 3 cas de carcinomes lobulaires infiltrants, et dans 3 autres cas d'un carcinome indifférencié, d'un carcinome colloïde et. d'un carcinome intracanalaire Selon la méthode du grade de SCARFF-BLOOM-RIt~HARDSON (SBR), 3 tumeurs étaient de grade II tandis que 5 étaient de grade III.
Z) Pré~arat~,on des lamg~ de cellules tumorales Les lignées cellulaires ont été cultivées dans des conditions standard.
Elles ont été fixées soit par du liquide de CARNOY, soit par du paraformaldéhyde à
0,5% dans du tampon PBS avec, dans ce dernier cas, t;Gne post-fixation par de féthanol à 70%, puis étalées sur lames.
Les tumeurs et la moitié des cytoporictions ont été mises en cultures de courte durée (72 heures) comme décrit par MLTLEF:IS et al. (Genes, Chromosomes & Cancer, 1994, IQ, 160-170). Puis, les cellules provenant de ces cultures ont été
fixées par du liquide de CARNOY et étalées sur lames.
Les autres cytoponctions, après dilution (10 fois) dans du milieu dissociant n° C 1419 (SIGMA), ont été fixées par du paraformaldéhyde à
0,5% dans du tampon PBS, post-fixées par de féthanol à 70''%, puis étalées sur lames par centrifugation au moyen d'une centrifugeuse Cytospïn~~ 3 {SHANDON).
3) ~ré~aration des lames de cellules témoins Des lames de cellules témoins ont été préparées par étalement de cellules lymphocytaires dénuées de toute anomalie chromosomique, après fixation de ces cellules pour une partie de ces lames, par du liquide de CARNOY et pour l'autre 5 partie, par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS, suivie dans ce dernier cas d'une post-fixation par de I'éthanol à 70%.
4) Préparation des sondes Pour (obtention des sondes spécifiques du bras lq et du bras lp, des suspensions chromosomiques des lignées cellulaires H 466 et DU 145 (souche
10 disponible auprès de l'ATCC sous le n° HTB-8l), se caractérisant respectivement par un réarrangement chromosomique iso(lq) et par un réarrangement chromosomique del( 1 )(q10-qter}, ont été préparées selon la technique décrite par VAN DEN
ENGH et al. (Cytometry, 1984, ,~, 108-117).
Un total de 300 chromosomes correspondant soit à des iso(Iq), soit à
15 des del(I)(q10-qter) ont été triés par cytométrie en flux. Puis, ces chromosomes ont été amplifiés par Ia technique de polymérisation e:n chaîne PARM-PCR à l'aide d'amorces (GAG)7 et marqués selon Ies protocoles décrits par MILAN et al.
(Mammalian Genome, 1996, 7, 194-199), en utili:>ant comme marqueurs, de Ia digoxigénine-11-dUTP (BOEHRINGER MANNF-IEIM) pour les chromosomes 2o destinés à servir de sondes pour le bras lq et de la biotine-11-dUTP
{SIGMA) pour Ies chromosomes destinés à servir de sondes pour Ie bras llp.
S) ~Iy~ridation i~ situ L'hybridation in situ a été conduite ~en apportant au protocole décrit par TRUONG et al. {Anal. Cell Path., 1997, ~, 137-146) quelques modifications mineures. En pratique, après un traitement par l'ARN2~se (I00 p,g/ml, SIGMA) à
37°C
pendant une heure, suivi de deux rinçages dans du tampon 2 x SSC et un rinçage dans du tampon PBS, les lames de cellules turnôraies et de <:ellules témoins ont été incubées à 37°C, pendant 10 minutes, en présence de pepsine (SIGMA) à une concentration de 4 lZg/ml dans de l'HCI 0,01M. Puis, elles ont été rincées 2 fois dans du tampon PBS, WO 00/15841 PCTlFR99102179 pendant S minutes et à la température ambiante, post-fixées dans du liquide de CA.RNOY et séchées à l'air.
L'ADN des chromosomes destinés à aervir de sondes a été dénaturé à
70°C pendant 10 minutes dans un tampon d'hybridation classique. L'ADN
cible, c'est-à-dire fADN des lames de cellules tumorales et d.e cellules témoins, a été, lui, dénaturé à 70°C pendant 3 minutes dans du tampon 2 x SSC comprenant 70%
de formamide (FLLTKA), pH 7. Les lames ont été ensuite rincées dans du tampon 2 x SSC, puis déshydratées en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol et séchées à Pair.
L'hybridation a été conduite à 37°C pendant' toute une nuit, puis les lames d'échantillons ont été soumises à des rinçages post-hybridation dans du tampon 2 x SSC, pendant 5 minutes et à 72°C.
6) Mes_nre dg~ intensités de uorescence et détermin 'on du rapuort entre les valeurs ~ ces intensités is Pour permettre une révélation des bras 1 q et lp des chromosomes 1 des cellules tumorales et des cellules témoins s'étant hybridés avec Ies sondes, les lames ont été incubées ~ d'une part, avec des anticorps anti-digoxigénine marqué par du FITC (BOEHRINGER MANNHEIM) qui émet une fluorescence de couleur verte, et ~ d'autre part, avec des anticorps de souris anti-biotine, puis des anticorps anti-immunoglobulines de souris manqués par du Texas Red°
(MOLECULAR PROBES), ce dernier émettant une fluorescence de couleur rouge.
Les lames ont été ensuite contre-colorées par du DAPI (1 ~g/ml, MOLECULAR PROBES), puis montées dans de la p-I>henylène-diamine.
La mesure des intensités des iEluorescences verte et rouge correspondant respectivement aux bras I q et l p des chromosomes 1 s'étant hybridés avec les sondes a été réalisée en utilisant un analyseur automatique d'images DISCOVERY° (BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS) comprenant WO 00/15841 PCTlFR99102179 - une source lumineuse constituée par une larripe à vapeur de mercure d'une puissance de 100 W (OSRA1V~, - un microscope AUTOPLAN° (LEITZ) muni d'un objectif à
immersion dans l'huile et de grossissement 40 (ouverh~re numérique : 1,3), = une caméra CCD noir et blanc XILLIX° 1400 munie d'un obturateur permettânt de faire varier le temps d'intégration de l'exposition à
ia lumière entre 30 msec et 10 sec, - une carte d'acquisition d'images propre à assurer la numérisation dtz signal délivré par la caméra, et t o - relié à cette carte, un micro-ordinateur comportant une unité
centrale commercialisée par la Société ïN'TEL sous la référence 486 et muni du logiciel de traitement d'images DISCOVERY~.
Pour chaque lame, le contre-coiora~nt DAPI a été dans un premier temps excité à la longueur d'onde de 330 nm de mani~,re à révéler les zones de (image formée par le système optique sur le capteur de la caméra, occupées par les noyaux et à définir la mise au point optimale de cette image. Puis, les intensités des fluorescences verte et rouge émises dans ces noyaux ont été mesurées successivement, en utilisant comme zones pertinentes de ces fluorescences, les zones de l'image ayant été détectées comme correspondant à des zones occupc;es par des noyaux.
2o Le temps d'intégration optimum a c;té déterminé pour chacune des fluorescences par rapport à une lame de cellules témoins et a été ensuite utilisé pour toutes les lames de cellules tumorales devant être analysées.
Par lame, 500 à 700 noyaux ont été s~omptés et une seule mesure des fluorescences a été réalisëe. Les artefacts, les zones d'image n'ayant pas été
reconnues comme correspondant à des zones occupées par un noyau et les noyaux dénués de toute fluorescence verte et rouge ont été éliminés p;ar un opérateur. La quantité de noyaux ainsi exclus pouvant dans certains cas atteindre 20% en fonction de la qualité
de l'hybridation, des résultats analysables ont pu être obtenus pour un minimum de 400 noyaux pour chaque lame.
!I
i8 Le logiciel d'analyse d'images DISCOVERY° a permis d'obtenir une analyse de ces résultats sous Ia forme d'histogrammes. A titre d'illustration, la Figure 1 montre les histogrammes obtenus pour une lame correspondant à l'un des prélèvements biologiques (prélèvement 94T) et représentant le nombre de noyaux en fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour ie bras lq d'une part, et le bras lp d'autre part.
Dans le cas des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, le rapport (R~) entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras 1 q et au bras lp a été calculé par deux méthodes différentes t0 - une première méthode (ci-après "méthode 1") consistant à
déterminer pour chaque lame, au moyen du logiciel d'analyse d'images DISCOVERY°, la moyenne des intensités de fluorescence verte (bras 1q) et la moyenne des intensités de fluorescence rouge (bras lp) émises dans les noyaux et à
calculer le rapport entre les moyennes ainsi obtenues ; et - une deuxième méthode (ci-aprf;s "méthode 2") consistant à
déterminer le rapport entre (intensité de fluorescence verte (bras lq) et (intensité de fluorescence rouge (bras lp) émise dans chaque noyaui, à établir au moyen du logiciel EXCEL° commercialisé par la Société MICROSOFT', (histogramme représentant Ie nombre de noyaux en fonction de Ia valeur des rapports ainsi obtenus pour l'ensemble d'une lame et à calculer, à partir de cet histogramme, la. moyenne de ces rapports.
Dans ie cas des prélëvements biologiques (tumeurs et cytoponctions), seule la deuxième méthode de calcul .a été utilisée dans la mesure où
les deux méthodes de calcul s'étant révélées conduire à des résultats comparables comme il sera démontré ci-après, cette deuxième méthode permet d'obtenir des résultats plus rapidement.
Dans tous les cas, (existence d'un dé;>équilibre entre les bras lq et lp dans les cellules tumorales analysées a été apprécié en caractérisant ces cellules par un indice de déséquilibre {I;) calculé comme suit R
j~ ~ ________ Rr R~ représentant entre les intensités de fluorescence correspondant réspectivement au bras lq et au bras lp obtenu pour des lames de celllules lymphocytaires traitées et analysées exactement dans les mêmes conditions.
7) Mesure du bruit e fond L'importance du bruit de fond a été appréciée en analysant des lames de cellules tumorales n'ayant été soumises à aucune hybridation et en comparant les résultats obtenus avec ceux observés pour des lames de cellules tumorales ayant fait l'objet d'une hybridation in situ dans Ies conditions précédemment décrites.
Il a pu ainsi être vérifié que le bruit de fond représente en moyenne moins de 20% des 1o signaux spécifiques et que, de ce fait, il n'interf'ere pas de manière significative avec les mesures de fluorescence.
8) Analyses cytogénéti~, ues de contrôle A chaque fois qu'il a été possible d'obtenir, à partir des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 4b6, et des prélèvf;ments biologiques, des lames comprenant un nombre suffisant de cellule en métaphase, ces lames ont été
également soumises à deux analyses cytogénétiques destinées à servir de contrôles : une analyse cytogénétique classique par la technique du R-banding d'une part, et une analyse cytogénétique moléculaire par la technique de la FISH sur chromosomes métaphasiques d'autre part.
2o L'analyse cytogénétique classique a été réalisée conformément aux méthodes décrites par DUTRILLAUX et COUTURIER (La Pratique de l'Analyse Chromosomique, 1981, MASSON, ~?, 7-$7) tandis que (analyse cytogénétique moléculaire a été, elle, réalisée selon le protocole décrit par MULERIS et al.
(Oncogene, 1994, ~, 2717-2722).
Ces analyses ont permis d'obsc;rver un certain nombre de remaniements affectant les chromosomes 1 des cellules analysées - qui ne sont pas rapportés ici -, et d'établir pour chaque population cellulaire, à partir de ces observations, un indice de déséquilibre (.Im) calculé comme suit Quantité de copies du bras lq (couleur verte) jm - ________________________________________..___________________ Quantité de copies du bras Ip (c;ouleur rouge) 9) Résu ts a) Cellules tumorales des lignées ~ ell 'res Les lignées cellulaires ZR 75, BT' 20 et H 466 représentent des populations de cellules tumorales qui présentent le double avantage d'être très 5 homogènes puisqu'issues d'un même clone, et de fournir, dans la mesure où on les maintient par une culture permanente, un nombre su;Ffisant de cellules en métaphase pour permettre un contrôle systématique des résulta ts obtenus avec le procédé
de détection objet de l'Invention par les techniques de R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques.
1o C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont choisi d'utiliser ces lignées cellulaires pour vérifier la fiabilité du procédé de détection conforme à
l'Invention et tester l'influence, sur les résultats obtenus, du mode de fixation des cellules devant être analysées ainsi que de la méthode de calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp.
is Le Tableau 1 ci-après présente - d'une part, les indices de déséquilibre (I;) entre les bras Iq et ip tels qu'obtenus pour les 3 lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 par le procédé de détection conforme à flnvention et ce, en fonction du type de fixateur [liquide de CARNOY ou paraformaldéhyde (PBA)] utilisé lors de; la préparation des lames, et en 2o fonction de la méthode [méthode 1 ou méthode 2] utilisée pour le calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp, et - d'autre part, les indices de déséquülibre (Im) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour ces mêmes lignées cellulaires par les techniques du R-banding et de FISH sur noyaux métaphasiques.
TABLEAU l, ~t Lignes cellulaires Fixation R-bahding Mthode . FISH
1 Mthode ZR 75 CARNOY 2,2 1,8 2 2 CARNOY 2,3 2,2 PFA 1,8 2,2 PFA 2 2,2 BT 20 CARNOY 1 I 1,5 1 CARNOY 1 l;l PFA 0,9 l,I
H 466 CARNOY 1,5 2 2 2 CARNOY 1,8 1,9 Ces résultats montrent que les indices de déséquilibre entre Ies bras lq et lp obtenus par Ie procédé de détection confornie à l'Invention sont tout à fait concordants à ceux déterminés par les techniques de R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques et ce, indépendamment d.u mode de f xation des cellules analysées et de la méthode de calcul du rapport entrE: les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras 1q et au bras 1p.
lo b) Celllxles tumor,~~~s des prélèvements biologiaues Le Tableau 2 ci-aprés présente - d'une part, les indices de déséquilibre (I;) entre les bras 1q et lp tels qu'obtenus pour Ies 13 tumeurs et les 6 ponctions par le procédé conforme à
l'Invention, et - d'autre part, les indices de déséquilibre (jm) entre les bras lq et lp tels que déterminés pour ces prélèvements biologiques par les techniques du R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasidues, lorsqu'il a été possible de mettre en oeuvre ces deux techniques.
s TABLEAU 2 j; jm Prlvements biologiques R-banding FISH
84T 3,3 3 3 86T 2,1 1,5 ---94T 1,8 2; 2 I SZT 1,4 1,3 ---221 T 2,2 2'. 2 230T 1 1,3 ---1007TR 1,3 1,5 1,5 1007TL 1,5 1,5 ---IOIST 1,6 1,5 i,5 1024T 1 i ---1040T 1,5 1,5 1,5 1 F 1 ~ __- __ 2F 1,7 -__ ___ 252T 1 1,3 ---252F 1,1 ---253F 1 1,.5 ---256F i,5 >1 ---I039T 1,3 1-1,5 ---1039F 1,3 --_ ---T = tumeur ; TR = tumeur du sein droit ; TL = tumeur du sein' gauche F = cytoponction Ces résultats mettent en évidence unE; excellente corrélation (r = 0,89 déterminé par méthode de régression linéaire au moyen du logiciel STATVIEW°
commercialisé par la Société MICROSOFT) entre les indices de déséquilibre obtenus par le procédé de détection conforme à flnvention et ceux .déterminés par la technique du R-banding sauf dans 4 cas (86T, 230T, 252T et Z:i3F) dans lesquels cette dernière technique apparaît ne pas avoir permis de détecter tous les bras lq et lp présents en raison de la complexité des caryotypes.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, /'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
ENGH et al. (Cytometry, 1984, ,~, 108-117).
Un total de 300 chromosomes correspondant soit à des iso(Iq), soit à
15 des del(I)(q10-qter) ont été triés par cytométrie en flux. Puis, ces chromosomes ont été amplifiés par Ia technique de polymérisation e:n chaîne PARM-PCR à l'aide d'amorces (GAG)7 et marqués selon Ies protocoles décrits par MILAN et al.
(Mammalian Genome, 1996, 7, 194-199), en utili:>ant comme marqueurs, de Ia digoxigénine-11-dUTP (BOEHRINGER MANNF-IEIM) pour les chromosomes 2o destinés à servir de sondes pour le bras lq et de la biotine-11-dUTP
{SIGMA) pour Ies chromosomes destinés à servir de sondes pour Ie bras llp.
S) ~Iy~ridation i~ situ L'hybridation in situ a été conduite ~en apportant au protocole décrit par TRUONG et al. {Anal. Cell Path., 1997, ~, 137-146) quelques modifications mineures. En pratique, après un traitement par l'ARN2~se (I00 p,g/ml, SIGMA) à
37°C
pendant une heure, suivi de deux rinçages dans du tampon 2 x SSC et un rinçage dans du tampon PBS, les lames de cellules turnôraies et de <:ellules témoins ont été incubées à 37°C, pendant 10 minutes, en présence de pepsine (SIGMA) à une concentration de 4 lZg/ml dans de l'HCI 0,01M. Puis, elles ont été rincées 2 fois dans du tampon PBS, WO 00/15841 PCTlFR99102179 pendant S minutes et à la température ambiante, post-fixées dans du liquide de CA.RNOY et séchées à l'air.
L'ADN des chromosomes destinés à aervir de sondes a été dénaturé à
70°C pendant 10 minutes dans un tampon d'hybridation classique. L'ADN
cible, c'est-à-dire fADN des lames de cellules tumorales et d.e cellules témoins, a été, lui, dénaturé à 70°C pendant 3 minutes dans du tampon 2 x SSC comprenant 70%
de formamide (FLLTKA), pH 7. Les lames ont été ensuite rincées dans du tampon 2 x SSC, puis déshydratées en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol et séchées à Pair.
L'hybridation a été conduite à 37°C pendant' toute une nuit, puis les lames d'échantillons ont été soumises à des rinçages post-hybridation dans du tampon 2 x SSC, pendant 5 minutes et à 72°C.
6) Mes_nre dg~ intensités de uorescence et détermin 'on du rapuort entre les valeurs ~ ces intensités is Pour permettre une révélation des bras 1 q et lp des chromosomes 1 des cellules tumorales et des cellules témoins s'étant hybridés avec Ies sondes, les lames ont été incubées ~ d'une part, avec des anticorps anti-digoxigénine marqué par du FITC (BOEHRINGER MANNHEIM) qui émet une fluorescence de couleur verte, et ~ d'autre part, avec des anticorps de souris anti-biotine, puis des anticorps anti-immunoglobulines de souris manqués par du Texas Red°
(MOLECULAR PROBES), ce dernier émettant une fluorescence de couleur rouge.
Les lames ont été ensuite contre-colorées par du DAPI (1 ~g/ml, MOLECULAR PROBES), puis montées dans de la p-I>henylène-diamine.
La mesure des intensités des iEluorescences verte et rouge correspondant respectivement aux bras I q et l p des chromosomes 1 s'étant hybridés avec les sondes a été réalisée en utilisant un analyseur automatique d'images DISCOVERY° (BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS) comprenant WO 00/15841 PCTlFR99102179 - une source lumineuse constituée par une larripe à vapeur de mercure d'une puissance de 100 W (OSRA1V~, - un microscope AUTOPLAN° (LEITZ) muni d'un objectif à
immersion dans l'huile et de grossissement 40 (ouverh~re numérique : 1,3), = une caméra CCD noir et blanc XILLIX° 1400 munie d'un obturateur permettânt de faire varier le temps d'intégration de l'exposition à
ia lumière entre 30 msec et 10 sec, - une carte d'acquisition d'images propre à assurer la numérisation dtz signal délivré par la caméra, et t o - relié à cette carte, un micro-ordinateur comportant une unité
centrale commercialisée par la Société ïN'TEL sous la référence 486 et muni du logiciel de traitement d'images DISCOVERY~.
Pour chaque lame, le contre-coiora~nt DAPI a été dans un premier temps excité à la longueur d'onde de 330 nm de mani~,re à révéler les zones de (image formée par le système optique sur le capteur de la caméra, occupées par les noyaux et à définir la mise au point optimale de cette image. Puis, les intensités des fluorescences verte et rouge émises dans ces noyaux ont été mesurées successivement, en utilisant comme zones pertinentes de ces fluorescences, les zones de l'image ayant été détectées comme correspondant à des zones occupc;es par des noyaux.
2o Le temps d'intégration optimum a c;té déterminé pour chacune des fluorescences par rapport à une lame de cellules témoins et a été ensuite utilisé pour toutes les lames de cellules tumorales devant être analysées.
Par lame, 500 à 700 noyaux ont été s~omptés et une seule mesure des fluorescences a été réalisëe. Les artefacts, les zones d'image n'ayant pas été
reconnues comme correspondant à des zones occupées par un noyau et les noyaux dénués de toute fluorescence verte et rouge ont été éliminés p;ar un opérateur. La quantité de noyaux ainsi exclus pouvant dans certains cas atteindre 20% en fonction de la qualité
de l'hybridation, des résultats analysables ont pu être obtenus pour un minimum de 400 noyaux pour chaque lame.
!I
i8 Le logiciel d'analyse d'images DISCOVERY° a permis d'obtenir une analyse de ces résultats sous Ia forme d'histogrammes. A titre d'illustration, la Figure 1 montre les histogrammes obtenus pour une lame correspondant à l'un des prélèvements biologiques (prélèvement 94T) et représentant le nombre de noyaux en fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour ie bras lq d'une part, et le bras lp d'autre part.
Dans le cas des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, le rapport (R~) entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras 1 q et au bras lp a été calculé par deux méthodes différentes t0 - une première méthode (ci-après "méthode 1") consistant à
déterminer pour chaque lame, au moyen du logiciel d'analyse d'images DISCOVERY°, la moyenne des intensités de fluorescence verte (bras 1q) et la moyenne des intensités de fluorescence rouge (bras lp) émises dans les noyaux et à
calculer le rapport entre les moyennes ainsi obtenues ; et - une deuxième méthode (ci-aprf;s "méthode 2") consistant à
déterminer le rapport entre (intensité de fluorescence verte (bras lq) et (intensité de fluorescence rouge (bras lp) émise dans chaque noyaui, à établir au moyen du logiciel EXCEL° commercialisé par la Société MICROSOFT', (histogramme représentant Ie nombre de noyaux en fonction de Ia valeur des rapports ainsi obtenus pour l'ensemble d'une lame et à calculer, à partir de cet histogramme, la. moyenne de ces rapports.
Dans ie cas des prélëvements biologiques (tumeurs et cytoponctions), seule la deuxième méthode de calcul .a été utilisée dans la mesure où
les deux méthodes de calcul s'étant révélées conduire à des résultats comparables comme il sera démontré ci-après, cette deuxième méthode permet d'obtenir des résultats plus rapidement.
Dans tous les cas, (existence d'un dé;>équilibre entre les bras lq et lp dans les cellules tumorales analysées a été apprécié en caractérisant ces cellules par un indice de déséquilibre {I;) calculé comme suit R
j~ ~ ________ Rr R~ représentant entre les intensités de fluorescence correspondant réspectivement au bras lq et au bras lp obtenu pour des lames de celllules lymphocytaires traitées et analysées exactement dans les mêmes conditions.
7) Mesure du bruit e fond L'importance du bruit de fond a été appréciée en analysant des lames de cellules tumorales n'ayant été soumises à aucune hybridation et en comparant les résultats obtenus avec ceux observés pour des lames de cellules tumorales ayant fait l'objet d'une hybridation in situ dans Ies conditions précédemment décrites.
Il a pu ainsi être vérifié que le bruit de fond représente en moyenne moins de 20% des 1o signaux spécifiques et que, de ce fait, il n'interf'ere pas de manière significative avec les mesures de fluorescence.
8) Analyses cytogénéti~, ues de contrôle A chaque fois qu'il a été possible d'obtenir, à partir des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 4b6, et des prélèvf;ments biologiques, des lames comprenant un nombre suffisant de cellule en métaphase, ces lames ont été
également soumises à deux analyses cytogénétiques destinées à servir de contrôles : une analyse cytogénétique classique par la technique du R-banding d'une part, et une analyse cytogénétique moléculaire par la technique de la FISH sur chromosomes métaphasiques d'autre part.
2o L'analyse cytogénétique classique a été réalisée conformément aux méthodes décrites par DUTRILLAUX et COUTURIER (La Pratique de l'Analyse Chromosomique, 1981, MASSON, ~?, 7-$7) tandis que (analyse cytogénétique moléculaire a été, elle, réalisée selon le protocole décrit par MULERIS et al.
(Oncogene, 1994, ~, 2717-2722).
Ces analyses ont permis d'obsc;rver un certain nombre de remaniements affectant les chromosomes 1 des cellules analysées - qui ne sont pas rapportés ici -, et d'établir pour chaque population cellulaire, à partir de ces observations, un indice de déséquilibre (.Im) calculé comme suit Quantité de copies du bras lq (couleur verte) jm - ________________________________________..___________________ Quantité de copies du bras Ip (c;ouleur rouge) 9) Résu ts a) Cellules tumorales des lignées ~ ell 'res Les lignées cellulaires ZR 75, BT' 20 et H 466 représentent des populations de cellules tumorales qui présentent le double avantage d'être très 5 homogènes puisqu'issues d'un même clone, et de fournir, dans la mesure où on les maintient par une culture permanente, un nombre su;Ffisant de cellules en métaphase pour permettre un contrôle systématique des résulta ts obtenus avec le procédé
de détection objet de l'Invention par les techniques de R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques.
1o C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont choisi d'utiliser ces lignées cellulaires pour vérifier la fiabilité du procédé de détection conforme à
l'Invention et tester l'influence, sur les résultats obtenus, du mode de fixation des cellules devant être analysées ainsi que de la méthode de calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp.
is Le Tableau 1 ci-après présente - d'une part, les indices de déséquilibre (I;) entre les bras Iq et ip tels qu'obtenus pour les 3 lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 par le procédé de détection conforme à flnvention et ce, en fonction du type de fixateur [liquide de CARNOY ou paraformaldéhyde (PBA)] utilisé lors de; la préparation des lames, et en 2o fonction de la méthode [méthode 1 ou méthode 2] utilisée pour le calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp, et - d'autre part, les indices de déséquülibre (Im) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour ces mêmes lignées cellulaires par les techniques du R-banding et de FISH sur noyaux métaphasiques.
TABLEAU l, ~t Lignes cellulaires Fixation R-bahding Mthode . FISH
1 Mthode ZR 75 CARNOY 2,2 1,8 2 2 CARNOY 2,3 2,2 PFA 1,8 2,2 PFA 2 2,2 BT 20 CARNOY 1 I 1,5 1 CARNOY 1 l;l PFA 0,9 l,I
H 466 CARNOY 1,5 2 2 2 CARNOY 1,8 1,9 Ces résultats montrent que les indices de déséquilibre entre Ies bras lq et lp obtenus par Ie procédé de détection confornie à l'Invention sont tout à fait concordants à ceux déterminés par les techniques de R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques et ce, indépendamment d.u mode de f xation des cellules analysées et de la méthode de calcul du rapport entrE: les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras 1q et au bras 1p.
lo b) Celllxles tumor,~~~s des prélèvements biologiaues Le Tableau 2 ci-aprés présente - d'une part, les indices de déséquilibre (I;) entre les bras 1q et lp tels qu'obtenus pour Ies 13 tumeurs et les 6 ponctions par le procédé conforme à
l'Invention, et - d'autre part, les indices de déséquilibre (jm) entre les bras lq et lp tels que déterminés pour ces prélèvements biologiques par les techniques du R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasidues, lorsqu'il a été possible de mettre en oeuvre ces deux techniques.
s TABLEAU 2 j; jm Prlvements biologiques R-banding FISH
84T 3,3 3 3 86T 2,1 1,5 ---94T 1,8 2; 2 I SZT 1,4 1,3 ---221 T 2,2 2'. 2 230T 1 1,3 ---1007TR 1,3 1,5 1,5 1007TL 1,5 1,5 ---IOIST 1,6 1,5 i,5 1024T 1 i ---1040T 1,5 1,5 1,5 1 F 1 ~ __- __ 2F 1,7 -__ ___ 252T 1 1,3 ---252F 1,1 ---253F 1 1,.5 ---256F i,5 >1 ---I039T 1,3 1-1,5 ---1039F 1,3 --_ ---T = tumeur ; TR = tumeur du sein droit ; TL = tumeur du sein' gauche F = cytoponction Ces résultats mettent en évidence unE; excellente corrélation (r = 0,89 déterminé par méthode de régression linéaire au moyen du logiciel STATVIEW°
commercialisé par la Société MICROSOFT) entre les indices de déséquilibre obtenus par le procédé de détection conforme à flnvention et ceux .déterminés par la technique du R-banding sauf dans 4 cas (86T, 230T, 252T et Z:i3F) dans lesquels cette dernière technique apparaît ne pas avoir permis de détecter tous les bras lq et lp présents en raison de la complexité des caryotypes.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, /'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.
Claims (23)
1. Procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long de ce chromosome et la deuxième étant spécifique du bras court de ce même chromosome ;
(b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes ;
(c) le calcul du rapport (R a) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées ; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.
(b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes ;
(c) le calcul du rapport (R a) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées ; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome sort constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit chromosome.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome sort constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome cible.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le marquage des sondes est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à
se lier spécifiquement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
se lier spécifiquement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'une des sondes est couplée à de la digoxigénine tandis que l'autre est couplée à de la biotine.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les deux fluorochromes sont choisis parmi l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les dérivés de la rhodamine comme l'isothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101, le Cascade blue~ et le Bopid~ FL.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes;
caractérisé en ce que l'un des deux fluorochromes est de l'isothiocynate de fluorescéine, tandis que le deuxième fluorochrome est du chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101.
caractérisé en ce que l'un des deux fluorochromes est de l'isothiocynate de fluorescéine, tandis que le deuxième fluorochrome est du chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une congre-coloration des noyaux par un fluorochrome différent des fluorochromes utilisés pour le marquage des sondes.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour le calcul du rapport (R a) entre les deux valeurs d'intensité
de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour l'ensemble des noyaux analysés, et on calcule le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues.
de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour l'ensemble des noyaux analysés, et on calcule le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, pour le calcul du rapport (R a) entre les deux valeurs d'intensité
de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des fluorescences, et on calcule la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés.
de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des fluorescences, et on calcule la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la valeur de référence correspond au rapport (R t) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une étape consistant à déterminer, pour les noyaux analysés, un indice de déséquilibre (~).
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'indice de déséquilibre (~) est déterminé en calculant le ratio entre les valeurs des rapports (R a) et (R t) respectivement obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés et l'ensemble des noyaux des cellules témoins.
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'indice de déséquilibre (~) est déterminé en calculant, pour chaque noyau analysé, le ratio entre les valeurs des rapports (R a) et (R t), et en retenant la valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés.
16. Procédé selon fane quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes b), c), d) de ce procédé ainsi que l'étape de détermination de l'indice de remaniement des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend:
- une source de lumière susceptible de fournir de la lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité
de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et - des moyens de traitement et d'analyse des intensités de fluorescence ainsi mesurées.
- une source de lumière susceptible de fournir de la lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité
de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et - des moyens de traitement et d'analyse des intensités de fluorescence ainsi mesurées.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le déséquilibre intrachromosomique que l'on cherche à
détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une délétion du bras court de ce chromosome.
détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une délétion du bras court de ce chromosome.
18. Trousse pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend:
- une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras long du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre, - une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras court de ce même chromosome, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement, - un ou plusieurs échantillons d'une; population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant le déséquilibre que l'on souhaite détecter.
- une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras long du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre, - une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras court de ce même chromosome, - un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement, - un ou plusieurs échantillons d'une; population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant le déséquilibre que l'on souhaite détecter.
19. Trousse selon la revendication 18, caractérisée en ce que les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.
20. Trousse selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisées en ce que les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend, pour chaque sonde, une quantité appropriée d'un ligand dirigé
spécifiquement contre cet haptène et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à
un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité
appropriée dudit contre-ligand.
spécifiquement contre cet haptène et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à
un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité
appropriée dudit contre-ligand.
21. Trousse selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre - une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules ; et/ou - une quantité appropriée d'un troisième fluorochrome propre à
permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; et/ou - une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ...) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à
permettre l'hybridation in situ du chromosome par les sondes.
permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; et/ou - une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ...) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à
permettre l'hybridation in situ du chromosome par les sondes.
22. Application d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux en interphase selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et/ou d'une trousse pour la mise en oeuvre d'un tel procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, à la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique.
23. Application d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux en interphase selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et/ou d'une trousse pour la mise en oeuvre d'un tel procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, au diagnostic positif et/ou au diagnostic évolutif des pathologies cancéreuses chez l'homme.
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