EP1112380A1 - Procede et trousse pour la detection d'un desequilibre intrachromosomique dans des noyaux interphasiques et leurs applications - Google Patents

Procede et trousse pour la detection d'un desequilibre intrachromosomique dans des noyaux interphasiques et leurs applications

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Publication number
EP1112380A1
EP1112380A1 EP99942963A EP99942963A EP1112380A1 EP 1112380 A1 EP1112380 A1 EP 1112380A1 EP 99942963 A EP99942963 A EP 99942963A EP 99942963 A EP99942963 A EP 99942963A EP 1112380 A1 EP1112380 A1 EP 1112380A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nuclei
imbalance
chromosome
probes
ratio
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99942963A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Khuong Truong
Marie-No[Lle Guilly
Bernard Malfoy
Philippe Vielh
Claire Bourgeois
Bernard Dutrillaux
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut Curie
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut Curie
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut Curie filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1112380A1 publication Critical patent/EP1112380A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting an intrachromosomal imbalance in interphase cell nuclei, to a kit suitable for allowing the implementation of this method as well as to the applications of this method and of this kit, in particular for the detection of cancer cells in a biological sample and the diagnosis of cancer pathologies.
  • DUTRILLAUX et al. Cancer Genêt. Cytogenet., 1990, 49_, 203-217
  • DUTRILLAUX et al. have demonstrated, from 30 cases, the occurrence in breast cancers of multiple rearrangements affecting, at a particularly high frequency, chromosomes 1 and 16 and manifested primarily by gain in the long arm of chromosome 1 and loss of the long arm in chromosome 16, and, at a lower frequency, chromosomes 4, 6, 8, 9, 11, 13 and 17.
  • TESTA and SIEGFRIED Cancer Research, 1992, 52, 2702s-2706s have shown, also from 30 cases, the presence, in non-small cell lung cancers, of numerous rearrangements preferentially affecting chromosome 7 (mainly under the shape of a polysomy 7 or a gain of all or part of the short arm of this chromosome), but also chromosomes 1, 3, 6, 7, 11, 13, 15, 17 and 19.
  • cytogeneticists mainly have two approaches in the investigation of the genome and its anomalies: - on the one hand, classical cytogenetics, which allows access to the detailed karyotype of a cell and to apprehend the anomalies of structure and number of the set of chromosomes which it comprises and which consists, after a period of in vitro culture of the cells whose duration varies with the type of cells studied, to block these cells in metaphase and to treat the chromosomes according to different methods allowing the observation with the otic microscope of bands extending on some megabases, from where the fact that one generally indicates it by the Anglo-Saxon name of banding.
  • the chromosomes are paired and ordered according to their length, the position of the centromere and the topography of the bands, and this classification leads to the development of the karyotype.
  • This approach finds a certain number of limits. The first is due to the fact that it requires prior culture of the cells studied, so as to obtain a sufficient number of cells in metaphase.
  • carrying out a cell culture is likely to introduce significant biases in the results of a cytogenetic analysis, due to the fact that only cells adapted to the culture conditions divide and give metaphases.
  • FISH fluorescence in situ hybridization
  • In situ fluorescence hybridization can be carried out on metaphasic chromosomes, in which case it uses probes specific for a chromosome, an arm, a chromosomal region, or even a given locus.
  • the revelation of the chromosomal anomalies is carried out by a visualization under the microscope of the fluorescent sites corresponding to the sites of the target DNA having hybridized with the probes.
  • in situ fluorescence hybridization is implemented on interphasic nuclei and it then uses probes specific to the centromeric regions of the chromosomes.
  • the revelation of chromosomal anomalies is carried out by counting the fluorescent spots, either manually under a microscope or automatically using an image cytometer, the number of spots being in all cases supposed to correspond to the number of copies of the chromosomes studied.
  • the inventors have therefore set themselves the goal of providing a method suitable for detecting an intrachromosomal imbalance in the cells of a biological sample, and which is generally free from all the disadvantages of the methods. of the prior art.
  • the inventors have set themselves the goal of providing a method for detecting an intrachromosomal imbalance which, while being sensitive, specific and reproducible so as to guarantee the reliability of this detection, can:
  • a method for detecting an intrachromosomal imbalance in interphase cell nuclei which is characterized in that it comprises:
  • intrachromosomal imbalance means any modification of the normal ratio between the number and / or the length of the long and short arms of a chromosome, resulting from a loss or gain of material. genetics such as a deletion or, on the contrary, a duplication of all or part of a chromosomal arm.
  • target chromosome the chromosome suspected of being affected by an imbalance as defined above and which it is sought to verify whether it actually presents this imbalance.
  • the two probes used for the in situ hybridization of the target chromosome consist of a set of probes not repeated covering all or part of the long arm or the short arm of said chromosome.
  • these probes consist of a set of probes covering the entire long arm or the short arm of the target chromosome.
  • Such probes which are commonly designated by the name of chromosomal paint, can be specially prepared for the needs of implementing the detection method according to the invention.
  • these probes are capable of being prepared from cells known to present, at the level of the same chromosome as the target chromosome, an abnormality (deletion, isochromosome, ...) of the short arm or of the long arm such that this altered chromosome corresponds substantially to one of the arms of the target chromosome, by sorting the chromosomes of these cells, for example by flow cytometry, so as to keep only the chromosomes suitable for the preparation of the probes, then in subjecting them to amplification, for example by the PARM-PCR chain polymerization technique as described by MILAN et al. (Mammalian Génome, 1996, 7, 194-199), followed by labeling of the products resulting from this amplification with a fluorochrome.
  • they can also be prepared from cells free of any chromosomal abnormality, by laser micro-dissection or by needle of the chromosome of these cells corresponding to the target chromosome so as to individualize the long arm and / or the short arm , followed by an amplification of the chromosomal arm or arms thus obtained, then by labeling of the products resulting from this amplification with a fluorochrome, as described for example by G AN et al (Hum. Molec. Genêt., 1993, 2, 1117-1121). It is, of course, also possible to use, for the implementation of the detection method in accordance with the invention, ready-to-use commercial probes.
  • probes of the short and long arms of the various human chromosomes and labeled with biotin are available from the company ALTECHNOLOGIES (USA).
  • the probes used for the in situ hybridization of the target chromosome may be probes directly coupled to a fluorochrome, these probes are preferably probes with indirect fluorescent labeling, the inventors having in fact found that this type marking results in particularly satisfactory results.
  • the labeling of the probes used for the in situ hybridization of the target chromosome is carried out by coupling each of them to a hapten, and by a reaction of affinity between this hapten and a ligand capable of specifically binding to said hapten and which is either conjugated to a fluorochrome, or made fluorescent by reaction with a counter-ligand conjugated to a fluorochrome.
  • hapten / ligand affinity reaction is advantageously carried out by means of avidin conjugated to a fluorochrome, or using anti-biotin antibodies, then antibodies directed against the latter and which are conjugated to a fluorochrome .
  • one of the probes is coupled to digoxigenin while the other probe is coupled to biotin.
  • fluorochromes can be indifferently chosen from the various fluorescent compounds used for labeling nucleic probes such as fluorescein isothiocyanate (FITC), rhodamine derivatives such as rhodamine b isothiocyanate and sulforhodamine sulfonate chloride 101 ( Texas red ® ), Cascade blue ® or Bopidy * FL, provided, however, that they have maximum wavelengths of emission located in bands which do not overlap.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • rhodamine derivatives such as rhodamine b isothiocyanate and sulforhodamine sulfonate chloride 101 ( Texas red ® )
  • Cascade blue ® or Bopidy * FL provided, however, that they have maximum wavelengths of emission located in bands which do not overlap.
  • the other probe will advantageously be marked with rhodamine isothiocyanate b whose maximum emission wavelength is 590 nm or, better still, by Texas Red ® which has a maximum emission wavelength even further away (604 nm) from that of the FITC.
  • one of the two fluorochromes is FITC, while the other is from Texas red ".
  • the detection method in accordance with the invention further comprises counterstaining the nuclei intended to allow their revelation before measuring the intensity of the fluorescence issued in. these nuclei at the emission wavelength bands of the two fluorochromes coupled to the probes.
  • This counterstaining is therefore carried out before carrying out this measurement, using a fluorochrome different from those used for labeling the probes, such as 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) or 4' , 6-bis-2 'imidazolinyl 4H-5H (DIPI).
  • DAPI 6-diamidino-2-phenylindole
  • DIPI 6-bis-2 'imidazolinyl 4H-5H
  • the detection method comprises a step aimed at measuring the intensity of the fluorescence emitted in the nuclei at the emission wavelength bands corresponding to each of the two fluorochromes coupled to the probes.
  • the ratio (R ⁇ ) between the two fluorescence intensity values thus measured is then calculated.
  • this ratio is calculated by one and / or the other of the following methods: a first method consisting in determining, for each fluorescence, the average of the intensity values of this fluorescence as measured for all of the kernels analyzed, and to calculate the ratio between the two means thus obtained; and
  • a second method consisting in calculating, for each nucleus analyzed, the ratio between the intensity values measured for each of the two fluorescences, and in determining the average of the values of this ratio as obtained for all the nuclei analyzed.
  • the value of the ratio (R ⁇ ) thus obtained is compared with at least one reference value.
  • this reference value corresponds to the ratio
  • control cells are cells free from any chromosomal abnormality, such as for example lymphocytes originating from healthy subjects.
  • a significant difference that is to say in practice, at least equal to 20%
  • the values of the ratios (R réelle) and (R,) respectively obtained for the nuclei analyzed and the nuclei of the control cells translated the existence, in at least a certain number of the nuclei analyzed, of the intrachromosomal imbalance sought.
  • control cells cells affected by the intrachromosomal imbalance which it is desired to detect, such as cells of a cell line known to exhibit this intrachromosomal imbalance constantly.
  • the detection method in accordance with the invention, it further comprises a step consisting in determining, for the nuclei analyzed, an index (I) of imbalance.
  • this imbalance index can advantageously be established by one and / or the other of the following methods: - a first method consisting in calculating the ratio between the values of the ratios (R réelle) and (R,) respectively obtained for all the nuclei analyzed and all the nuclei of the control cells; and
  • a second method consisting in calculating, for each analyzed nucleus, the ratio between the values of the ratios (R a ) and (R,), and in retaining, for example from a histogram representing the number of nuclei analyzed as a function of the ratio R ⁇ / R, the value of this ratio corresponding to the largest number of nuclei analyzed.
  • steps b), c), d) corresponding to the measurement of the fluorescence intensities, to the calculation of the ratio between these fluorescence intensities and to the comparison of the value of this ratio with a reference value, as well as the step of determining the index (i) of imbalance of the nuclei analyzed are carried out by means of an apparatus which comprises:
  • a light source capable of supplying light in three bands of different wavelengths, said source possibly being either a polychromatic source provided with filters, or a source constituted by a plurality of monochromatic sources,
  • the intrachromosomal imbalance which it is sought to detect results from a duplication of the long arm of human chromosome 1 and / or a deletion of the short arm of this chromosome.
  • the present invention also relates to a kit for implementing the method for detecting an intrachromosomal imbalance in intracellular interphase nuclei as defined above, which is characterized in that it comprises: - an appropriate quantity a first probe marked with a first fluorochrome, said probe being specific to the long arm of the chromosome present in said nuclei and suspected of being affected by said imbalance,
  • the samples of control cells are in the form of spreads on slides ready to be subjected to in situ hybridization.
  • the probes are probes coupled to a hapten
  • the kit comprises, for each probe, an appropriate quantity of a ligand directed specifically against this hapten and which is conjugated to a fluorochrome or capable of being made fluorescent by a reaction with a counter-ligand conjugated to a fluorochrome, in which case the kit contains, plus, an appropriate amount of said counter ligand.
  • this kit it further comprises:
  • RNAse, pepsin, ...) and buffer solutions suitable for allowing in situ hybridization of the chromosome by the probes.
  • the present invention also relates to the application of the method for detecting an intrachromosomal imbalance in interphase cell nuclei and of the kit suitable for allowing the implementation of this method as defined above, to the detection of cancer cells in a biological sample such as a cytopuncture, a serous effusion (pleural, peritoneal, ...), a lumpectomy or a bronchial aspiration.
  • a biological sample such as a cytopuncture, a serous effusion (pleural, peritoneal, ...), a lumpectomy or a bronchial aspiration.
  • the detection method in accordance with the invention is of very particular interest in the field of human oncology and, more specifically, for the establishment of the positive diagnosis and / or the progressive diagnosis of cancerous pathologies in which one repeatedly observes a certain number of chromosomal rearrangements resulting in imbalances in the normal ratio between the number and / or the length of the long and short arms of certain chromosomes, such as the duplication of the long arm of chromosomes 1 and 8, the deletion of the short arm of chromosomes 1 and 3 or the deletion of the long arm of chromosome 6.
  • This process is also likely to find applications in fields other than oncology, and in particular in the establishment of the positive diagnosis of innate or acquired human pathologies linked to a chromosomal abnormality such as, for example, the so-called cat cry disease which is characterized by a deletion of part of the short arm of chromosome 5.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to an example of implementation and application of the detection method in accordance with the invention as well as in attached Figure 1 which illustrates, in the form of histograms, the distributions of the number of nuclei as a function of the fluorescence intensities as measured for the long arm (lq) on the one hand, and the short arm (lp) d on the other hand, chromosome 1 by the implementation of said method on cells originating from a tumor sample.
  • tumor cells from biological samples taken from 16 patients aged between 33 and 73 years, and corresponding to 13 tumors and 6 cytopunctions, 2 patients having undergone both a cytopuncture , then a lumpectomy, and 1 patient who underwent 2 lumpectomies (right breast and left breast).
  • stage I tumors 3 were found to correspond to stage I tumors, 4 to stage II A tumors, 8 to stage IB tumors, 1 to stage IIIA tumor and 1 to stage IIIB tumor, according to the grouping by stage of the AMERICAN JOINT COMMUTEE OF CANCER (AJCC). Furthermore, histology has shown that in 10 cases it was infiltrative ductal carcinoma, in 3 cases of infiltrative lobular carcinoma, and in 3 other cases of undifferentiated carcinoma, colloid carcinoma and intracanal carcinoma According to the SCARFF-BLOOM-RICHARDSON (SBR) grade method, 3 tumors were grade II while 5 were grade III.
  • SBR SCARFF-BLOOM-RICHARDSON
  • the cell lines were cultivated under standard conditions. They were fixed either with CARNOY liquid or with 0.5% paraformaldehyde in PBS buffer with, in the latter case, post-fixation with 10% ethanol, then spread on slides.
  • the tumors and half of the cytopunctions were placed in short-term cultures (72 hours) as described by MULERIS et al. (Genes, Chromosomes & Cancer, 1994, 10, 160-170). Then, the cells originating from these cultures were fixed by CARNOY liquid and spread on slides.
  • chromosomal suspensions of the cell lines H 466 and DU 145 (strain available from the ATCC under the number HTB-81), characterized respectively by a chromosomal rearrangement iso (lq) and by a chromosomal rearrangement del (l) (q10-qter), were prepared according to the technique described by VAN DEN ENGH et al. (Cytometry, 1984, 5, 108-117).
  • a total of 300 chromosomes corresponding either to iso (lq) or to del (l) (q10-qter) were sorted by flow cytometry. Then, these chromosomes were amplified by the PARM-PCR chain polymerization technique using primers (GAG) 7 and labeled according to the protocols described by MILAN et al. (Mammalian Génome, 1996, 7, 194-199), using as markers, digoxigenin-11-dUTP (BOEHRINGER MANNHEIM) for the chromosomes intended to serve as probes for the lq arm and biotin- 11-dUTP ( SIGMA) for chromosomes intended to serve as probes for the lp arm.
  • GAG primers
  • SIGMA biotin- 11-dUTP
  • the in situ hybridization was carried out by adding to the protocol described by TRUONG et al. (Anal. Cell Path., 1997, 13, 137-146) some minor modifications.
  • RNAse 100 ⁇ g / ml, SIGMA
  • the tumor cell slides and control cells were incubated at 37 ° C for 10 minutes in the presence of pepsin (SIGMA) at a concentration of 4 ⁇ g / ml in 0.01M HCl. Then, they were rinsed 2 times in PBS buffer, for 5 minutes and at room temperature, post-fixed in liquid
  • the DNA of the chromosomes intended to serve as probes has been denatured at
  • the target DNA that is to say the DNA of the tumor cell and control cell slides, was denatured at 70 ° C. for 3 minutes in 2 ⁇ SSC buffer comprising 70% formamide ( FLUKA), pH 7. The slides were then rinsed in buffer
  • MOLECULAR PROBES MOLECULAR PROBES
  • DISCOVERY ® BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS including: - a light source consisting of a mercury vapor lamp with a power of 100 W (OSRAM),)
  • an image acquisition card suitable for digitizing the signal delivered by the camera and - connected to this card, a microcomputer comprising a central unit sold by the company INTEL under the reference 486 and provided with the software for DISCOVERY ® image processing.
  • the DAPI counter-dye was first excited at the wavelength of 330 nm so as to reveal the areas of the image formed by the optical system on the camera sensor, occupied by the cores and to define the optimal focus of this image. Then, the intensities of the green and red fluorescence emitted in these nuclei were measured successively, using as relevant areas of these fluorescences, the areas of the image having been detected as corresponding to areas occupied by nuclei. The optimum integration time was determined for each of the fluorescences with respect to a control cell slide and was then used for all the tumor cell slides to be analyzed.
  • Figure 1 shows the histograms obtained for a slide corresponding to one of the biological samples (sample 94T) and representing the number of nuclei as a function of the fluorescence intensities as measured for the arm lq of a on the one hand, and the lp arm on the other.
  • the ratio (R réelle) between the fluorescence intensities corresponding respectively to the lq arm and to the lp arm was calculated by two different methods: - a first method (ci- after “method 1") consisting in determining for each slide, using the DISCOVERY image analysis software, the average of the green fluorescence intensities (arm lq) and the average of the red fluorescence intensities (arm lp) emitted in the nuclei and calculating the ratio between the means thus obtained; and - a second method (hereinafter “method 2”) consisting in determining the ratio between the intensity of green fluorescence (arm lq) and the intensity of red fluorescence (arm lp) emitted in each nucleus, to be established by means EXCEL software marketed by the MICROSOFT Company, the histogram representing the number of nuclei as a function of the value of the ratios thus obtained for the whole of a slide and calculating,
  • R, R representing between the fluorescence intensities corresponding respectively to the lq arm and to the lp arm obtained for slides of lymphocyte cells treated and analyzed under exactly the same conditions. 7 Measurement of background noise: The importance of background noise was assessed by analyzing tumor cell slides which have not been subjected to any hybridization and by comparing the results obtained with those observed for tumor cell slides which have undergone subject of in situ hybridization under the conditions described above. It has thus been possible to verify that the background noise represents on average less than 20% of the specific signals and that, therefore, it does not significantly interfere with the fluorescence measurements.
  • Tumor cells of the cell lines The cell lines ZR 75, BT 20 and H 466 represent populations of tumor cells which have the double advantage of being very homogeneous since they result from the same clone, and from provide, insofar as they are maintained by a permanent culture, a sufficient number of cells in metaphase to allow a systematic control of the results obtained with the detection method object of the invention by the techniques of R-banding and FISH on metaphasic chromosomes. This is the reason why the inventors have chosen to use these cell lines to verify the reliability of the detection method in accordance with the invention and to test the influence, on the results obtained, of the mode of fixation of the cells to be analyzed. as well as the method of calculating the ratio between the fluorescence intensities corresponding respectively to the lq arm and to the lp arm. Table 1 below presents:
  • the indices of imbalance (/,) between the arms lq and lp as obtained for the 13 tumors and the 6 punctures by the process in accordance with the invention and - on the other hand, the imbalance indices (I m ) between the arms lq and lp as determined for these biological samples by the techniques of R-banding and FISH on metaphasic chromosomes, when it has been possible to put in place works these two techniques.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, caractérisé en ce qu'il comprend (a) l'hybridation in situ du chromosome suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents et respectivement spécifiques du bras long et du bras court de ce chromosome; (b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes; (c) le calcul du rapport (Ra) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées; et (d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence. L'invention se rapporte également à une trousse propre à permettre la mise en oeuvre de ce procédé, et aux applications de cette trousse et de ce procédé, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.

Description

PROCEDE ET TROUSSE POUR LA DETECTION D'UN DESEQUILIBRE INTRACHROMOSOMIQUE DANS DES NOYAUX INTERPHASIQUES ET LEURS APPLICATIONS
La présente Invention se rapporte à un procédé pour détecter un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, à une trousse propre à permettre la mise en œuvre de ce procédé ainsi qu'aux applications de ce procédé et de cette trousse, notamment pour la détection de cellules cancéreuses au sein d'un échantillon biologique et le diagnostic de pathologies cancéreuses.
L'étude cytogénétique des cellules tumorales a montré l'existence, dans ces cellules, de nombreux remaniements chromosomiques consistant notamment en des pertes et des gains de matériel génétique, pouvant conduire jusqu'à la disparition de bras chromosomiques, ou, au contraire, à la présence de bras chromosomiques surnuméraires et se traduisant ainsi par des modifications du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes que l'on désignera ci-après sous le terme de déséquilibres intra- chromosomiques.
Ainsi, par exemple, DUTRILLAUX et al. (Cancer Genêt. Cytogenet., 1990, 49_, 203-217) ont mis en évidence, à partir de 30 cas, la survenue dans les cancers du sein de multiples réarrangements affectant, à une fréquence particulièrement élevée, les chromosomes 1 et 16 et se manifestant principalement par un gain du bras long du chromosome 1 et une perte du bras long du chromosome 16, et, à une fréquence moindre, les chromosomes 4, 6, 8, 9, 11, 13 et 17. De manière similaire, TESTA et SIEGFRIED (Cancer Research, 1992, 52, 2702s-2706s) ont montré, également à partir de 30 cas, la présence, dans les cancers du poumon non à petites cellules, de nombreux réarrangements affectant de manière préférentielle le chromosome 7 (principalement sous la forme d'une polysomie 7 ou d'un gain de tout ou partie du bras court de ce chromosome), mais aussi les chromosomes 1, 3, 6, 7, 11, 13, 15, 17 et 19.
En fait, il est maintenant bien établi que le processus de cancerogenese est un événement multi-étapes, nécessitant des modifications génétiques successives dont l'accumulation au cours du temps va conduire à des cellules au potentiel transformant qui sera de plus en plus agressif, conduisant à une tumeur cliniquement détectable et éventuellement métastasiante. Aussi, une définition précise des paramètres cytogénétiques caractéristiques de la tumorogénèse apparaît constituer une étape capitale, tant dans l'élaboration du diagnostic positif que de celle du diagnostic évolutif des tumeurs, permettant ainsi une mise en oeuvre des thérapeutiques les plus adaptées.
Actuellement, les cytogénéticiens disposent principalement de deux approches dans l'investigation du génome et de ses anomalies : - d'une part, la cytogénétique classique, qui permet d'avoir accès au caryotype détaillé d'une cellule et d'appréhender les anomalies de structure et de nombre de l'ensemble des chromosomes qu'elle comporte et qui consiste, après une période de culture in vitro des cellules dont la durée varie avec le type de cellules étudiées, à bloquer ces cellules en métaphase et à traiter les chromosomes selon différentes méthodes permettant l'observation au microscope otique de bandes s'étendant sur quelques mégabases, d'où le fait qu'on la désigne généralement par le nom anglo-saxon de banding. Après photographie, les chromosomes sont appariés et ordonnés selon leur longueur, la position du centromère et la topographie des bandes, et ce classement aboutit à l'élaboration du caryotype. Cette approche dont l'intérêt majeur est de conduire à une "image" globale du génome, trouve un certain nombre de limites. La première tient au fait qu'elle nécessite une mise en culture préalable des cellules étudiées, de manière à obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase. Or, il est maintenant bien acquis que, dans le cas d'une population polyclonale, la réalisation d'une culture cellulaire est susceptible d'introduire des biais importants dans les résultats d'une analyse cytogénétique, en raison de ce que seules les cellules adaptées aux conditions de culture se divisent et donnent des métaphases. Une autre limite réside dans le pouvoir de résolution de la cytogénétique classique qui ne permet d'appréhender que partiellement les remaniements chromosomiques souvent relativement complexes dans les tumeurs solides, lesquelles représentent la majorité des cancers. Enfin, de par son principe, cette approche se heurte à toute possibilité d'un dépistage automatisé des anomalies chromosomiques complexes et/ou multiples.
- d'autre part, l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), qui permet de repérer une séquence d'ADN chromosomique au moyen d'une sonde de séquence spécifique homologue à celle qui est étudiée. Fondée sur la complémentarité existant entre les nucléotides (adénine-thymine, adénine-uridine, cytosine-guanine), elle consiste à hybrider l'ADN cible avec une sonde marquée, soit directement, soit indirectement par un fluorochrome, et à utiliser la fluorescence émise par ce dernier comme témoin de l'hybridation. L'hybridation in situ en fluorescence peut être mise en oeuvre sur des chromosomes métaphasiques, auquel cas elle utilise des sondes spécifiques d'un chromosome, d'un bras, d'une région chromosomique, voire d'un locus donné. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par une visualisation au microscope des sites fluorescents correspondant aux sites de l'ADN cible s'étant hybrides avec les sondes. Toutefois, en analyse pathologique de routine, l'hybridation in situ en fluorescence est mise en œuvre sur des noyaux interphasiques et elle utilise alors des sondes spécifiques des régions centromériques des chromosomes. La révélation des anomalies chromosomiques s'effectue par un comptage des spots fluorescents, soit manuellement au microscope, soit de manière automatisée au moyen d'un cytomètre d'image, le nombre des spots étant dans tous les cas supposé correspondre au nombre de copies des chromosomes étudiés.
Si le développement des techniques de la FISH a incontestablement amélioré le pouvoir de résolution de la cytogénétique (jusqu'à l'ordre de quelques kilobases), permettant ainsi de mieux cerner les gains et pertes en matériel chromosomique et les anomalies de structure des chromosomes, ces techniques telles qu'elles existent aujourd'hui, ne sont toutefois pas totalement satisfaisantes.
En effet, s'agissant de la FISH sur chromosomes métaphasiques, une étape préalable de culture in vitro des cellules est indispensable, comme dans le cas de la cytogénétique classique, pour obtenir un nombre suffisant de cellules en métaphase avec les inconvénients précités que cela implique. Quant à la FISH sur noyaux interphasiques, si elle présente l'avantage d'éviter l'étape de culture et, partant, la sélection potentielle de certaines cellules au cours de cette culture, elle présente l'inconvénient que le comptage manuel des spots ne peut être effectué que sur un nombre restreint de cellules et est à l'origine d'erreurs importantes lorsqu'il est appliqué à une petite population de cellules anormales (KIBBELAAR et al, Cytometry, 1993, 14, 716-724), tandis que le comptage automatisé demeure à ce jour très imparfait, en dépit des efforts qui ont été tentés pour améliorer la qualité de l'hybridation, la qualité des signaux qu'elle génère et la sensibilité des caméras dont sont équipés les cytomètres d'image (TRUONG et al, Anal. Cell Path., 1997, 13., 137-146). Au surplus, il s'avère qu'un certain nombre d'anomalies chromosomiques n'affectent pas les régions centromériques des chromosomes, mais leurs bras, et échappent à toute possibilité de détection par cette technique.
Les Inventeurs se sont, donc, fixés pour but de fournir un procédé propre à permettre la détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans les cellules d'un échantillon biologique, et qui soit exempt, d'une manière générale, de tous les inconvénients des procédés de l'état antérieur de la technique.
Plus spécifiquement, les Inventeurs se sont fixés pour but de fournir un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique qui, tout en étant sensible, spécifique et reproductible de manière à garantir la fiabilité de cette détection, puisse :
- d'une part, être mis en œuvre sur des cellules en interphase pour s'affranchir de la nécessité de soumettre préalablement les cellules devant être étudiées à une culture in vitro, - d'autre part, s'appliquer non seulement à une population cellulaire monoclonale, mais également à une population cellulaire polyclonale afin de permettre la détection de la présence éventuelle, au sein de cette population, de clones cellulaires anormaux même lorsque ceux-ci sont minoritaires, et - en outre, être au moins partiellement automatisé afin de rendre possible, pour un coût raisonnable, le traitement d'une quantité importante d'échantillons biologiques tout en limitant les risques d'erreurs dans ce traitement.
Ces buts sont atteints selon la présente Invention par un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, qui est caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long de ce chromosome tandis que la deuxième sonde est spécifique du bras court de ce même chromosome ;
(b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes ; (c) le calcul du rapport entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées ; et
(d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.
Au sens de la présente Invention, on entend par "déséquilibre intrachromosomique", toute modification du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court d'un chromosome, résultant d'une perte ou d'un gain de matériel génétique tels qu'une délétion ou, au contraire, une duplication de tout ou partie d'un bras chromosomique.
Par ailleurs, pour des raisons de commodité, on appelle dans ce qui suit "chromosome cible", le chromosome suspecté d'être affecté par un déséquilibre tel que ci-avant défini et dont on cherche à vérifier s'il présente effectivement ce déséquilibre.
Conformément à l'Invention, les deux sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible sont constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit chromosome.
De manière préférée, ces sondes sont constituées par un ensemble de sondes recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome cible. De telles sondes, que l'on désigne communément par le nom de peinture chromosomique, peuvent être préparées spécialement pour les besoins de la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention.
Ainsi, par exemple, ces sondes sont susceptibles d'être préparées à partir de cellules connues pour présenter, au niveau du même chromosome que le chromosome cible, une anomalie (délétion, isochromosome, ...) du bras court ou du bras long telle que ce chromosome altéré corresponde sensiblement à l'un des bras du chromosome cible, en triant les chromosomes de ces cellules, par exemple par cytométrie de flux, de manière à ne conserver que les chromosomes propres à servir à la préparation des sondes, puis en soumettant ces derniers à une amplification, par exemple par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR telle que décrite par MILAN et al. (Mammalian Génome, 1996, 7, 194-199), suivie d'un marquage des produits résultant de cette amplification par un fluorochrome.
En variante, elles peuvent aussi être préparées à partir de cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, par micro-dissection au laser ou par aiguille du chromosome de ces cellules correspondant au chromosome cible de manière à en individualiser le bras long et/ou le bras court, suivie d'une amplification du ou des bras chromosomiques ainsi obtenus, puis d'un marquage des produits résultant de cette amplification par un fluorochrome, comme décrit par exemple par G AN et al (Hum. Molec. Genêt., 1993, 2, 1117-1121). II est, bien entendu, également possible de recourir, pour la mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, à des sondes commerciales prêtes à l'emploi. Ainsi, par exemple, des sondes spécifiques des bras courts et longs des différents chromosomes humains et marquées par de la biotine sont disponibles auprès de la Société ALTECHNOLOGIES (USA). Par ailleurs, bien que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible puissent être des sondes directement couplées à un fluorochrome, ces sondes sont, de préférence, des sondes à marquage fluorescent indirect, les Inventeurs ayant en effet constaté que ce type de marquage conduit à des résultats particulièrement satisfaisants.
Aussi, selon une disposition préférée de mise en œuvre du procédé conforme à l'Invention, le marquage des sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome cible est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécifiquement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
A titre d'exemples d'haptènes susceptibles d'êtres employés pour un marquage indirect des sondes utiles dans la présente Invention, on peut notamment citer : - la digoxigénine, le dinitrophénol et le 2-acétylaminofluorène, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'anticorps dirigés contre ces composés et conjugués à un fluorochrome ;
- la biotine, auquel cas la réaction d'affinité haptène/ligand est avantageusement réalisée au moyen d'avidine conjuguée à un fluorochrome, ou en utilisant des anticorps anti-biotine, puis des anticorps dirigés contre ces derniers et qui sont conjugués à un fluorochrome.
De préférence, l'une des sondes est couplée à de la digoxigénine tandis que l'autre sonde est couplée à de la biotine.
Quel que soit le type de marquage des sondes (direct ou indirect), celles-ci sont marquées, conformément à l'Invention, par deux fluorochromes différents destinés à permettre, par l'émission de deux lumières de couleurs différentes, une révélation des bras longs d'une part, et des bras courts d'autre part, du chromosome cible s'étant hybrides avec les sondes qui leur sont respectivement spécifiques. Ces fluorochromes peuvent être indifféremment choisis parmi les différents composés fluorescents utilisés pour le marquage de sondes nucléiques tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les dérivés de la rhodamine comme l'isothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101 (Texas red®), le Cascade blue® ou encore le Bopidy* FL, à condition toutefois de veiller à ce qu'ils présentent des maxima de longueurs d'onde d'émission situées dans des bandes qui ne se recouvrent pas.
Ainsi, par exemple, dans le cas où l'une des sondes sera marquée par du FITC dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 543 nm, l'autre sonde sera avantageusement marquée par de l'isothiocyanate de rhodamine b dont la longueur d'onde maximale d'émission se situe à 590 nm ou, mieux encore, par du Texas red® qui présente une longueur d'onde maximale d'émission encore plus éloignée (604 nm) de celle du FITC.
De préférence, l'un des deux fluorochromes est du FITC, tandis que l'autre est du Texas red " .
Selon encore une autre disposition préférée de mise en œuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, de plus, une contre- coloration des noyaux destinée à permettre leur révélation préalablement à la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans . ces noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission des deux fluorochromes couplés aux sondes. Cette contre-coloration est donc réalisée avant de procéder à cette mesure, au moyen d'un fluorochrome différent de ceux utilisés pour le marquage des sondes, tel que le 4',6-diamidino-2- phénylindole (DAPI) ou le 4',6-bis-2' imidazolinyl 4H-5H (DIPI).
Comme précédemment indiqué, le procédé de détection comprend une étape visant à mesurer l'intensité de la fluorescence émise dans les noyaux aux bandes de longueur d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes couplés aux sondes.
Ainsi, par exemple, si l'hybridation in situ du chromosome cible a été réalisée en utilisant une sonde spécifique du bras long de ce chromosome marquée par du FITC qui émet une lumière verte, et une sonde spécifique du bras court de ce chromosome marquée par du Texas red" qui émet une lumière rouge, on mesure successivement l'intensité de la fluorescence verte émise par les noyaux, puis l'intensité de la fluorescence rouge émise par ces mêmes noyaux. On obtient de la sorte deux valeurs d'intensité de fluorescence qui sont fonction respectivement du nombre de bras longs et du nombre de bras courts du chromosome cible s'étant hybrides avec les sondes qui leur sont spécifiques.
Conformément à l'Invention, on calcule ensuite le rapport (Rπ) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées. Avantageusement, ce rapport est calculé par l'une et/ou l'autre des méthodes suivantes : - une première méthode consistant à déterminer, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour l'ensemble des noyaux analysés, et à calculer le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues ; et
- une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des deux fluorescences, et à déterminer la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés.
Puis, on compare la valeur du rapport (RΛ) ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence. De manière préférée, cette valeur de référence correspond au rapport
(R,) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés.
Avantageusement, les cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique, comme par exemple des lymphocytes provenant de sujets sains. Ainsi, une différence significative (c'est-à-dire en pratique, au moins égale à 20%) entre les valeurs des rapports (R„) et (R,) respectivement obtenues pour les noyaux analysés et les noyaux des cellules témoins traduit l'existence, dans au moins un certain nombre des noyaux analysés, du déséquilibre intrachromosomique recherché. Il est, toutefois, possible d'utiliser également comme cellules témoins, des cellules affectées par le déséquilibre intrachromosomique que l'on souhaite détecter telles que des cellules d'une lignée cellulaire connues pour présenter de manière constante ce déséquilibre intrachromosomique. Selon encore une autre disposition préférée du procédé de détection conforme à l'Invention, celui-ci comprend, en outre, une étape consistant à déterminer, pour les noyaux analysés, un indice (I) de déséquilibre. Là également, cet indice de déséquilibre peut avantageusement être établi par l'une et/ou l'autre des méthodes suivantes : - une première méthode consistant à calculer le ratio entre les valeurs des rapports (R„) et (R,) respectivement obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés et l'ensemble des noyaux des cellules témoins ; et
- une seconde méthode consistant à calculer, pour chaque noyau analysé, le ratio entre les valeurs des rapports (Ra) et (R,), et à retenir, par exemple à partir d'un histogramme représentant le nombre de noyaux analysés en fonction du ratio Rπ/R , la valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés.
Selon encore une autre disposition préférée de mise en oeuvre du procédé de détection conforme à l'Invention, les étapes b), c), d) correspondant à la mesure des intensités de fluorescence, au calcul du rapport entre ces intensités de fluorescence et à la comparaison de la valeur de ce rapport avec une valeur de référence, ainsi que l'étape de détermination de l'indice (i) de déséquilibre des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend :
- une source de lumière susceptible de fournir de la lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité de sources monochromatiques,
- des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et - des moyens de traitement et d'analyse des intensités de fluorescence ainsi mesurées.
A titre d'exemple d'appareillage susceptible de convenir à la mise en oeuvre desdites étapes, on peut citer l'analyseur automatique d'images commercialisé par la Société BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS sous la marque enregistrée DISCOVERY.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé de détection conforme à l'Invention, le déséquilibre intrachromosomique que l'on cherche à détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une délétion du bras court de ce chromosome.
La présente Invention a, également, pour objet une trousse pour la mise en œuvre du procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase tel que précédemment défini, qui est caractérisée en ce qu'elle comprend : - une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras long du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre,
- une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras court de ce même chromosome,
- un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement,
- un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant le déséquilibre que l'on souhaite détecter.
Selon une première disposition avantageuse de la trousse conforme à l'Invention, les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.
Selon une autre disposition avantageuse de la trousse conforme à l'Invention, les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend, pour chaque sonde, une quantité appropriée d'un ligand dirigé spécifiquement contre cet haptène et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriée dudit contre-ligand. Selon encore une autre disposition avantageuse de cette trousse, elle comprend en outre :
- une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules ; et/ou
- une quantité appropriée d'un troisième fluorochrome propre à permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; et/ou
- une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ...) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à permettre l'hybridation in situ du chromosome par les sondes.
La présente Invention a, également, pour objet l'application du procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase et de la trousse propre à permettre la mise en œuvre de ce procédé tels que précédemment définis, à la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique tel qu'une cytoponction, un épanchement séreux (pleural, péritonéal, ...), une tumorectomie ou encore une aspiration bronchique. En effet, le procédé de détection conforme à l'Invention présente un intérêt tout à fait particulier dans le domaine de la cancérologie humaine et, plus spécialement, pour l'établissement du diagnostic positif et/ou du diagnostic évolutif des pathologies cancéreuses dans lesquelles on observe de manière récurrente un certain nombre de remaniements chromosomiques se traduisant par des déséquilibres du rapport normal entre le nombre et/ou la longueur des bras long et court de certains chromosomes, tels que la duplication du bras long des chromosomes 1 et 8, la délétion du bras court des chromosomes 1 et 3 ou encore la délétion du bras long du chromosome 6.
Ce procédé est également susceptible de trouver des applications dans des domaines autres que la cancérologie, et notamment dans l'établissement du diagnostic positif de pathologies humaines innées ou acquises liées à une anomalie chromosomique comme, par exemple, la maladie dite du cri du chat qui se caractérise par une délétion d'une partie du bras court du chromosome 5.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui suit, qui se réfère à un exemple de mise en œuvre et d'application du procédé de détection conforme à l'Invention ainsi qu'à la Figure 1 annexée qui illustre, sous la forme d'histogrammes, les répartitions du nombre de noyaux en fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour le bras long (lq) d'une part, et le bras court (lp) d'autre part, du chromosome 1 par la mise en œuvre dudit procédé sur des cellules provenant d'un prélèvement tumoral.
Il doit être bien entendu, toutefois, que cet exemple est donné uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention et n'en constitue en aucune manière une limitation. EXEMPLE : DETECTION D'UN DESEQUILIBRE ENTRE LES BRAS LONG ET COURT DU CHROMOSOME 1 DANS DES CELLULES DE CANCERS DU SEIN
Le procédé de détection conforme à l'Invention et l'intérêt de son utilisation à des fins diagnostiques ont été validés par une série d'expérimentations visant à appliquer ce procédé à la recherche du déséquilibre entre le bras long (ci-après "bras lq") et le bras court (ci-après "bras lp") du chromosome 1 fréquemment observé dans les cas de cancers du sein, et à comparer les résultats obtenus avec ceux observés en mettant en œuvre deux techniques classiquement utilisées en cytogénétique, à savoir la technique du K-banding d'une part, et la technique d'hybridation in situ en fluorescence (FISH) sur chromosomes métaphasiques d'autre part.
1) Matériel biologique :
Les expérimentations ont été réalisées sur 2 types de cellules de cancers du sein :
- d'une part, des cellules tumorales appartenant à 3 lignées cellulaires : ZR 75, BT 20 et H 466 et provenant respectivement des souches déposées auprès de l'ATCC (AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION) sous les n° CRL- 1500, HTB-19 et HTB-171 ; et
- d'autre part, des cellules tumorales provenant de prélèvements biologiques effectués chez 16 patientes d'âge compris entre 33 et 73 ans, et correspondant à 13 tumeurs et 6 cytoponctions, 2 patientes ayant fait l'objet à la fois d'une cytoponction, puis d'une tumorectomie, et 1 patiente ayant fait l'objet de 2 tumorectomies (sein droit et sein gauche).
Parmi ces prélèvements biologiques, 3 se sont révélés correspondre à des tumeurs de stade I, 4 à des tumeurs de stade II A, 8 à des tumeurs de stade IB, 1 à une tumeur de stade IIIA et 1 à une tumeur de stade IIIB, selon le groupement par stade de l'AMERICAN JOINT COMMUTEE OF CANCER (AJCC). Par ailleurs, l'histologie a permis de montrer qu'il s'agissait dans 10 cas de carcinomes canalaires infiltrants, dans 3 cas de carcinomes lobulaires infiltrants, et dans 3 autres cas d'un carcinome indifférencié, d'un carcinome colloïde et d'un carcinome intracanalaire Selon la méthode du grade de SCARFF-BLOOM-RICHARDSON (SBR), 3 tumeurs étaient de grade II tandis que 5 étaient de grade III.
2) Préparation des lames de cellules tumorales :
Les lignées cellulaires ont été cultivées dans des conditions standard. Elles ont été fixées soit par du liquide de CARNOY, soit par du paraformaldéhyde à 0,5%o dans du tampon PBS avec, dans ce dernier cas, une post-fixation par de l'éthanol à 10%, puis étalées sur lames.
Les tumeurs et la moitié des cytoponctions ont été mises en cultures de courte durée (72 heures) comme décrit par MULERIS et al. (Gènes, Chromosomes & Cancer, 1994, 10, 160-170). Puis, les cellules provenant de ces cultures ont été fixées par du liquide de CARNOY et étalées sur lames.
Les autres cytoponctions, après dilution (10 fois) dans du milieu dissociant n° C 1419 (SIGMA), ont été fixées par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS, post-fixées par de l'éthanol à 70%, puis étalées sur lames par centrifugation au moyen d'une centrifugeuse Cytospin 3 (SHANDON). 3) Préparation des lames de cellules témoins :
Des lames de cellules témoins ont été préparées par étalement de cellules lymphocytaires dénuées de toute anomalie chromosomique, après fixation de ces cellules pour une partie de ces lames, par du liquide de CARNOY et pour l'autre partie, par du paraformaldéhyde à 0,5% dans du tampon PBS, suivie dans ce dernier cas d'une post-fixation par de l'éthanol à 70%.
4) Préparation des sondes :
Pour l'obtention des sondes spécifiques du bras lq et du bras lp, des suspensions chromosomiques des lignées cellulaires H 466 et DU 145 (souche disponible auprès de l'ATCC sous le n° HTB-81), se caractérisant respectivement par un réarrangement chromosomique iso(lq) et par un réarrangement chromosomique del(l)(ql0-qter), ont été préparées selon la technique décrite par VAN DEN ENGH et al. (Cytometry, 1984, 5, 108-117).
Un total de 300 chromosomes correspondant soit à des iso(lq), soit à des del(l)(ql0-qter) ont été triés par cytométrie en flux. Puis, ces chromosomes ont été amplifiés par la technique de polymérisation en chaîne PARM-PCR à l'aide d'amorces (GAG)7 et marqués selon les protocoles décrits par MILAN et al. (Mammalian Génome, 1996, 7, 194-199), en utilisant comme marqueurs, de la digoxigénine- 11-dUTP (BOEHRINGER MANNHEIM) pour les chromosomes destinés à servir de sondes pour le bras lq et de la biotine- 11-dUTP (SIGMA) pour les chromosomes destinés à servir de sondes pour le bras lp.
5) Hybridation in situ :
L'hybridation in situ a été conduite en apportant au protocole décrit par TRUONG et al. (Anal. Cell Path., 1997, 13, 137-146) quelques modifications mineures. En pratique, après un traitement par l'ARNase (100 μg/ml, SIGMA) à 37°C pendant une heure, suivi de deux rinçages dans du tampon 2 x SSC et un rinçage dans du tampon PBS, les lames de cellules tumorales et de cellules témoins ont été incubées à 37°C, pendant 10 minutes, en présence de pepsine (SIGMA) à une concentration de 4 μg/ml dans de l'HCl 0,01M. Puis, elles ont été rincées 2 fois dans du tampon PBS, pendant 5 minutes et à la température ambiante, post-fixées dans du liquide de
CARNOY et séchées à l'air.
L'ADN des chromosomes destinés à servir de sondes a été dénaturé à
70°C pendant 10 minutes dans un tampon d'hybridation classique. L'ADN cible, c'est- à-dire l'ADN des lames de cellules tumorales et de cellules témoins, a été, lui, dénaturé à 70°C pendant 3 minutes dans du tampon 2 x SSC comprenant 70% de formamide (FLUKA), pH 7. Les lames ont été ensuite rincées dans du tampon
2 x SSC, puis déshydratées en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol et séchées à l'air. L'hybridation a été conduite à 37°C pendant toute une nuit, puis les lames d'échantillons ont été soumises à des rinçages post-hybridation dans du tampon
2 x SSC, pendant 5 minutes et à 72°C.
6^ Mesure des intensités de fluorescence et détermination du rapport entre les valeurs de ces intensités : Pour permettre une révélation des bras 1 q et lp des chromosomes 1 des cellules tumorales et des cellules témoins s'étant hybrides avec les sondes, les lames ont été incubées :
• d'une part, avec des anticorps anti-digoxigénine marqué par du
FITC (BOEHRTNGER MANNHEIM) qui émet une fluorescence de couleur verte, et • d'autre part, avec des anticorps de souris anti-biotine, puis des anticorps anti-irrrmunoglobulines de souris marqués par du Texas Red
(MOLECULAR PROBES), ce dernier émettant une fluorescence de couleur rouge.
Les lames ont été ensuite contre-colorées par du DAPI (1 μg/ml,
MOLECULAR PROBES), puis montées dans de la p-phenylène-diamine. La mesure des intensités des fluorescences verte et rouge correspondant respectivement aux bras lq et lp des chromosomes 1 s'étant hybrides avec les sondes a été réalisée en utilisant un analyseur automatique d'images
DISCOVERY® (BECTON DICKINSON IMAGE CYTOMETRY SYSTEMS) comprenant : - une source lumineuse constituée par une lampe à vapeur de mercure d'une puissance de 100 W (OSRAM), )
- un microscope AUTOPLAN (LEITZ) muni d'un objectif à immersion dans l'huile et de grossissement 40 (ouverture numérique : 1,3), - une caméra CCD noir et blanc XILLIX® 1400 munie d'un obturateur permettant de faire varier le temps d'intégration de l'exposition à la lumière entre 30 msec et 10 sec,
- une carte d'acquisition d'images propre à assurer la numérisation du signal délivré par la caméra, et - relié à cette carte, un micro-ordinateur comportant une unité centrale commercialisée par la Société INTEL sous la référence 486 et muni du logiciel de traitement d'images DISCOVERY®.
Pour chaque lame, le contre-colorant DAPI a été dans un premier temps excité à la longueur d'onde de 330 nm de manière à révéler les zones de l'image formée par le système optique sur le capteur de la caméra, occupées par les noyaux et à définir la mise au point optimale de cette image. Puis, les intensités des fluorescences verte et rouge émises dans ces noyaux ont été mesurées successivement, en utilisant comme zones pertinentes de ces fluorescences, les zones de l'image ayant été détectées comme correspondant à des zones occupées par des noyaux. Le temps d'intégration optimum a été déterminé pour chacune des fluorescences par rapport à une lame de cellules témoins et a été ensuite utilisé pour toutes les lames de cellules tumorales devant être analysées.
Par lame, 500 à 700 noyaux ont été comptés et une seule mesure des fluorescences a été réalisée. Les artefacts, les zones d'image n'ayant pas été reconnues comme correspondant à des zones occupées par un noyau et les noyaux dénués de toute fluorescence verte et rouge ont été éliminés par un opérateur. La quantité de noyaux ainsi exclus pouvant dans certains cas atteindre 20% en fonction de la qualité de l'hybridation, des résultats analysables ont pu être obtenus pour un minimum de 400 noyaux pour chaque lame. Le logiciel d'analyse d'images DISCOVERY a permis d'obtenir une analyse de ces résultats sous la forme d'histogrammes. A titre d'illustration, la Figure 1 montre les histogrammes obtenus pour une lame correspondant à l'un des prélèvements biologiques (prélèvement 94T) et représentant le nombre de noyaux en fonction des intensités de fluorescence telles que mesurées pour le bras lq d'une part, et le bras lp d'autre part.
Dans le cas des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, le rapport (R„) entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp a été calculé par deux méthodes différentes : - une première méthode (ci-après "méthode 1") consistant à déterminer pour chaque lame, au moyen du logiciel d'analyse d'images DISCOVERY , la moyenne des intensités de fluorescence verte (bras lq) et la moyenne des intensités de fluorescence rouge (bras lp) émises dans les noyaux et à calculer le rapport entre les moyennes ainsi obtenues ; et - une deuxième méthode (ci-après "méthode 2") consistant à déterminer le rapport entre l'intensité de fluorescence verte (bras lq) et l'intensité de fluorescence rouge (bras lp) émise dans chaque noyau, à établir au moyen du logiciel EXCEL commercialisé par la Société MICROSOFT, l'histogramme représentant le nombre de noyaux en fonction de la valeur des rapports ainsi obtenus pour l'ensemble d'une lame et à calculer, à partir de cet histogramme, la moyenne de ces rapports.
Dans le cas des prélèvements biologiques (tumeurs et cytoponctions), seule la deuxième méthode de calcul a été utilisée dans la mesure où les deux méthodes de calcul s'étant révélées conduire à des résultats comparables comme il sera démontré ci-après, cette deuxième méthode permet d'obtenir des résultats plus rapidement.
Dans tous les cas, l'existence d'un déséquilibre entre les bras lq et lp dans les cellules tumorales analysées a été apprécié en caractérisant ces cellules par un indice de déséquilibre (/,) calculé comme suit :
/, =
R, R, représentant entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp obtenu pour des lames de cellules lymphocytaires traitées et analysées exactement dans les mêmes conditions. 7 Mesure du bruit de fond : L'importance du bruit de fond a été appréciée en analysant des lames de cellules tumorales n'ayant été soumises à aucune hybridation et en comparant les résultats obtenus avec ceux observés pour des lames de cellules tumorales ayant fait l'objet d'une hybridation in situ dans les conditions précédemment décrites. Il a pu ainsi être vérifié que le bruit de fond représente en moyenne moins de 20% des signaux spécifiques et que, de ce fait, il n'interfère pas de manière significative avec les mesures de fluorescence.
8^ Analyses cytogénétiques de contrôle :
A chaque fois qu'il a été possible d'obtenir, à partir des lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466, et des prélèvements biologiques, des lames comprenant un nombre suffisant de cellule en métaphase, ces lames ont été également soumises à deux analyses cytogénétiques destinées à servir de contrôles : une analyse cytogénétique classique par la technique du R-banding d'une part, et une analyse cytogénétique moléculaire par la technique de la FISH sur chromosomes métaphasiques d'autre part. L'analyse cytogénétique classique a été réalisée conformément aux méthodes décrites par DUTRILLAUX et COUTURIER (La Pratique de l'Analyse Chromosomique, 1981, MASSON, 12, 7-87) tandis que l'analyse cytogénétique moléculaire a été, elle, réalisée selon le protocole décrit par MULERIS et al. (Oncogene, 1994, 9, 2717-2722). Ces analyses ont permis d'observer un certain nombre de remaniements affectant les chromosomes 1 des cellules analysées - qui ne sont pas rapportés ici -, et d'établir pour chaque population cellulaire, à partir de ces observations, un indice de déséquilibre (Im) calculé comme suit :
Quantité de copies du bras lq (couleur verte)
/,
Quantité de copies du bras lp (couleur rouge) 9) Résultats : a) Cellules tumorales des lignées cellulaires : Les lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 représentent des populations de cellules tumorales qui présentent le double avantage d'être très homogènes puisqu'issues d'un même clone, et de fournir, dans la mesure où on les maintient par une culture permanente, un nombre suffisant de cellules en métaphase pour permettre un contrôle systématique des résultats obtenus avec le procédé de détection objet de l'Invention par les techniques de R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques. C'est la raison pour laquelle les Inventeurs ont choisi d'utiliser ces lignées cellulaires pour vérifier la fiabilité du procédé de détection conforme à l'Invention et tester l'influence, sur les résultats obtenus, du mode de fixation des cellules devant être analysées ainsi que de la méthode de calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp. Le Tableau 1 ci-après présente :
- d'une part, les indices de déséquilibre (/,-) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour les 3 lignées cellulaires ZR 75, BT 20 et H 466 par le procédé de détection conforme à l'Invention et ce, en fonction du type de fixateur [liquide de CARNOY ou paraformaldéhyde (PBA)] utilisé lors de la préparation des lames, et en fonction de la méthode [méthode 1 ou méthode 2] utilisée pour le calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp, et
- d'autre part, les indices de déséquilibre (Im) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour ces mêmes lignées cellulaires par les techniques du R-banding et de FISH sur noyaux métaphasiques. TABLEAU 1
Ces résultats montrent que les indices de déséquilibre entre les bras lq et lp obtenus par le procédé de détection conforme à l'Invention sont tout à fait concordants à ceux déterminés par les techniques de R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques et ce, indépendamment du mode de fixation des cellules analysées et de la méthode de calcul du rapport entre les intensités de fluorescence correspondant respectivement au bras lq et au bras lp. b) Cellules tumorales des prélèvements biologiques :
Le Tableau 2 ci-après présente :
- d'une part, les indices de déséquilibre (/,) entre les bras lq et lp tels qu'obtenus pour les 13 tumeurs et les 6 ponctions par le procédé conforme à l'Invention, et - d'autre part, les indices de déséquilibre (Im) entre les bras lq et lp tels que déterminés pour ces prélèvements biologiques par les techniques du R-banding et de FISH sur chromosomes métaphasiques, lorsqu'il a été possible de mettre en oeuvre ces deux techniques. TABLEAU 2
T = tumeur ; T = tumeur du sein droit ; T = tumeur du sein gauche F = cytoponction
Ces résultats mettent en évidence une excellente corrélation (r = 0,89 déterminé par méthode de régression linéaire au moyen du logiciel STATVIEW® commercialisé par la Société MICROSOFT) entre les indices de déséquilibre obtenus par le procédé de détection conforme à l'Invention et ceux déterminés par la technique du R-banding sauf dans 4 cas (86T, 230T, 252T et 253F) dans lesquels cette dernière technique apparaît ne pas avoir permis de détecter tous les bras lq et lp présents en raison de la complexité des caryorypes.
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux cellulaires en interphase, caractérisé en ce qu'il comprend :
(a) l'hybridation in situ du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre au moyen de deux sondes marquées par deux fluorochromes différents, la première sonde étant spécifique du bras long de ce chromosome et la deuxième étant spécifique du bras court de ce même chromosome ;
(b) la mesure de l'intensité de la fluorescence émise dans lesdits noyaux aux bandes de longueurs d'onde d'émission correspondant à chacun des deux fluorochromes ;
(c) le calcul du rapport (R„) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence ainsi mesurées ; et
(d) la comparaison de la valeur du rapport ainsi obtenue avec au moins une valeur de référence.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome sont constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant tout ou partie du bras long ou du bras court dudit chromosome.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les sondes utilisées pour l'hybridation in situ du chromosome sont constituées par un ensemble de sondes non répétées recouvrant la totalité du bras long ou du bras court du chromosome cible.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le marquage des sondes est réalisé par un couplage de chacune d'elles à un haptène, et par une réaction d'affinité entre cet haptène et un ligand apte à se lier spécifiquement audit haptène et qui est soit conjugué à un fluorochrome, soit rendu fluorescent par réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'une des sondes est couplée à de la digoxigénine tandis que l'autre est couplée à de la biotine.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les deux fluorochromes sont choisis parmi l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les dérivés de la rhodamine comme l'isothiocyanate de rhodamine b et le chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101, le Cascade blue et le Bopidy® FL.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'un des deux fluorochromes est de l'isothiocynate de fluorescéine, tandis que le deuxième fluorochrome est du chlorure de sulfonate de sulforhodamine 101.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend de plus une contre-coloration des noyaux par un fluorochrome différent des fluorochromes utilisés pour le marquage des sondes.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, pour le calcul du rapport (Ra) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque fluorescence, la moyenne des valeurs d'intensité de cette fluorescence telles que mesurées pour l'ensemble des noyaux analysés, et on calcule le rapport entre les deux moyennes ainsi obtenues.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que, pour le calcul du rapport (Ra) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées à l'étape b), on détermine, pour chaque noyau analysé, le rapport entre les valeurs d'intensité mesurées pour chacune des fluorescences, et on calcule la moyenne des valeurs de ce rapport telles qu'obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés.
1 1. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la valeur de référence correspond au rapport (Rr) entre les deux valeurs d'intensité de fluorescence mesurées pour des noyaux de cellules témoins traités exactement dans les mêmes conditions que les noyaux analysés.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les cellules témoins sont des cellules exemptes de toute anomalie chromosomique.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, une étape consistant à déterminer, pour les noyaux analysés, un indice de déséquilibre (I).
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'indice de déséquilibre (T) est déterminé en calculant le ratio entre les valeurs des rapports (Ra) et (R,) respectivement obtenues pour l'ensemble des noyaux analysés et l'ensemble des noyaux des cellules témoins.
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'indice de déséquilibre (T) est déterminé en calculant, pour chaque noyau analysé, le ratio entre les valeurs des rapports (Ra) et (R,), et en retenant la valeur de ce ratio correspondant au plus grand nombre de noyaux analysés.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes b), c), d) de ce procédé ainsi que l'étape de détermination de l'indice de remaniement des noyaux analysés sont réalisées au moyen d'un appareillage qui comprend :
- une source de lumière susceptible de fournir de la lumière dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, ladite source pouvant être soit une source polychromatique munie de filtres, soit une source constituée par une pluralité de sources monochromatiques, - des moyens de mesure de l'intensité de la fluorescence émise par des fluorochromes dans trois bandes de longueurs d'onde différentes, et
- des moyens de traitement et d'analyse des intensités de fluorescence ainsi mesurées.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le déséquilibre intrachromosomique que l'on cherche à détecter résulte d'une duplication du bras long du chromosome 1 humain et/ou d'une délétion du bras court de ce chromosome.
18. Trousse pour la mise en œuvre d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux intracellulaires en interphase selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, caractérisée en ce qu'elle comprend : - une quantité appropriée d'une première sonde marquée par un premier fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras long du chromosome présent dans lesdits noyaux et suspecté d'être affecté par ledit déséquilibre,
- une quantité appropriée d'une deuxième sonde marquée par un deuxième fluorochrome, ladite sonde étant spécifique du bras court de ce même chromosome,
- un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire exempte de toute anomalie chromosomique et, éventuellement,
- un ou plusieurs échantillons d'une population cellulaire constituée en partie ou en totalité par des cellules présentant le déséquilibre que l'on souhaite détecter.
19. Trousse selon la revendication 18, caractérisée en ce que les échantillons de cellules témoins se présentent sous la forme d'étalements sur lames prêts à être soumis à une hybridation in situ.
20. Trousse selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisées en ce que les sondes sont des sondes couplées à un haptène, et la trousse comprend, pour chaque sonde, une quantité appropriée d'un ligand dirigé spécifiquement contre cet haptène et qui est conjugué à un fluorochrome ou susceptible d'être rendu fluorescent par une réaction avec un contre-ligand conjugué à un fluorochrome, auquel cas la trousse contient, de plus, une quantité appropriée dudit contre-ligand.
21. Trousse selon l'une quelconque des revendications 18 à 20, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre :
- une quantité appropriée d'un ou plusieurs réactifs pour la fixation des cellules ; et ou
- une quantité appropriée d'un troisième fluorochrome propre à permettre une contre-coloration des noyaux cellulaires ; et/ou
- une quantité appropriée de réactifs (ARNase, pepsine, ...) et de solutions tampons (tampons d'hybridation, tampons de rinçage, ...) propres à permettre l'hybridation in situ du chromosome par les sondes.
22. Application d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux en interphase selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et/ou d'une trousse pour la mise en oeuvre d'un tel procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, à la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique.
23. Application d'un procédé de détection d'un déséquilibre intrachromosomique dans des noyaux en inteφhase selon l'une quelconque des revendications 1 à 17 et/ou d'une trousse pour la mise en oeuvre d'un tel procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 21, au diagnostic positif et/ou au diagnostic évolutif des pathologies cancéreuses chez l'homme.
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CN112698025B (zh) * 2020-12-14 2022-10-18 四川沃文特生物技术有限公司 抗原或抗体包被磁微粒的方法、应用及试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5756696A (en) * 1986-01-16 1998-05-26 Regents Of The University Of California Compositions for chromosome-specific staining
CA2060267A1 (fr) * 1991-02-22 1992-08-23 Joe W. Gray Coloration specifique des chromosomes pour deceler les rearrangements genetiques
EP0688366B1 (fr) * 1993-01-15 2002-05-22 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Titrages sensibles par hybridation en sandwich de l'acide nucleique et kits afferents
US5830645A (en) * 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays

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