JP7324711B2 - 一標的細胞の染色体複数異常を同時検出する方法 - Google Patents
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Description
(1)識別可能な3以上の標識を用いて、一標的細胞中の2以上の染色体異常を同時検出するFISH(fluorescense in situ hybridization)解析法。
(2)画像解析ソフトによって蛍光を分離して解析する(1)記載のFISH解析法。
(3)ホルムアルデヒド固定、メタノール/酢酸後固定、酢酸処理を行い細胞を固定する(1)又は(2)記載のFISH解析法。
(4)細胞表面抗原を染色することにより腫瘍細胞を識別し、染色体異常を検出する(1)~(3)いずれか1つ記載のFISH解析法。
(5)PF-405、PF-380-LSS、PF-395-LSS、SpectrumGreen、PF-510-LSS、SpectrumOrange、ATTO Rho12、Red5-ROX、ATTO 620、PB495、AF594から選択される複数の蛍光色素によってFISHプローブを標識する(1)~(4)いずれか1つ記載のFISH解析法。
(6)表8のいずれか1つの疾患を検出するために用いる(1)~(5)いずれか1つ記載のFISH解析法。
(7)多発性骨髄腫を原因とする染色体異常を検出する(6)記載のFISH解析法。
(8)表8に記載のプローブを用いて、del13q34、del17p13、t(11;14)(q13;q32)、t(4;14)(p16;q32)、t(14;16)(q32;q23)、t(6;14)(p25;q32)、t(6;14)(p21;q32)、t(8;14)(q24;q32)、t(14;20)(q32;q11)、1q21増幅、del1p32.3、CEP7、CEP9のうちのいずれか2つ以上の染色体異常を同時に検出する(7)記載のFISH解析法。
(9)さらに、CD138、及び/又は核を染色する(7)、又は(8)記載のFISH解析法。
(10)多発性骨髄腫の治療薬を選択するために用いる(7)~(9)いずれか1つ記載のFISH解析法。
(11)(1)~(10)いずれか1つ記載の血液腫瘍の解析法に用いる検査キットであって、表8に記載のプローブとFISHに必要な試薬を含むことを特徴とする検査キット。
(12)前記プローブが蛍光標識されたものである(11)記載の検査キット。
(13)(1)~(10)いずれか1つ記載のFISH解析法で得られた患者の染色体異常パターンと、患者の治療成績を蓄積し、AIを用いて解析することによって染色体異常パターンごとの最適な治療法を選択する方法。
(14)一標的細胞の染色体複数異常を同時検出する方法(Simultaneous Chromosomal Abnormalities in a Target cell Fluorescence in situ hybridization:SCAT FISH)によって、識別可能な3以上の標識を用いて、画像解析ソフトによって蛍光を分離して検出し、1細胞中の2以上の染色体異常を同時に検出し、染色体異常パターンによって疾患の病型を分類することを特徴とする診断方法。
(15)SCAT FISH解析法によって、識別可能な3以上の標識を用いて、画像解析ソフトによって蛍光を分離して検出し、1細胞中の2以上の染色体異常を同時に検出し、染色体異常パターンによって治療薬を選択することを特徴とする治療方法。
(1)方法
試料としては、染色体異常が存在する可能性のある細胞であれば、どのような試料を用いてもよい。血液腫瘍であれば、骨髄穿刺によって得られた骨髄液、あるいは末梢血を試料として用いることができる。試料は患者から採取後すぐに、あるいは凍結保存したものを37℃で速やかに解凍して使用する。骨髄液には、骨髄芽球などの白血球系の細胞、赤芽球系の細胞、骨髄巨核球、形質細胞が含まれる。そこで、腫瘍細胞において発現している表面抗原に対する抗体を用いて陽性細胞を分離し、さらに、腫瘍細胞の表面抗原を染色することによって腫瘍細胞を選択的に検出することができる。
本方法では、複数の蛍光色素で標識されたプローブを用いてFISHを行うので、各スペクトルに重複する波長領域が生じる。そこで、ラムダスキャン(Lambda scan、Leica Microsystems社)によって画像を取得し、蛍光スペクトルを分離し解析を行う。種々の蛍光色素を検討した結果、現在ラムダスキャンによって画像取得後に蛍光スペクトルを分離し、最も明瞭に解析を行うことができるのは、以下の10の蛍光色素であった(表1)。なお、DRAQ5はDNAに結合する試薬であり、核染色に用いている。
<表面抗原染色>
多発性骨髄腫患者の骨髄液を採取し、2mM EDTAを含むPBSを加え1500rpm5分間の遠心処理を行った後、沈殿を最初の試料の量と同じ量になるようにMACS(登録商標)バッファー(Miltenyi Biotec社製)で懸濁した。次に、抗CD138抗体が結合した磁気ビーズ(Miltenyi Biotec社製)を試料の1/20量加え、4℃で15分間反応させた後、AutoMACS(Miltenyi Biotec社製)によりCD138陽性細胞を分離した。2000rpm3分間の遠心により上清を除き、10μlの細胞懸濁液とした。ビオチン標識抗CD138抗体(Acris社製)を10μl添加し、4℃で10分インキュベートした。次に、1.2ml MACSバッファーを加え、2000rpm3分間の遠心後、上清を除き、10μlの細胞懸濁液とした。10倍希釈したATTO 620-ストレプトアビジン(ATTOTECH社製)を1μl加え、4℃で15分間反応させた。次に、1.2ml MACSバッファーを加え、2000rpm3分の遠心を2回繰り返し洗浄後、MACSバッファーで50μlの細胞懸濁液とした。
スライドガラス上の細胞をスポットした箇所に、ハイブリバッファー(Lica Biotechnology社製)3μlを載置し、カバーガラスを載せ、ペーパーボンド(KOKUYO社製)によって封入した。80℃のホットプレート(StatSpin ThermoBrite、ABBOTT社製)上で60分間、抗原賦活化処理を行った。スライドガラスは、室温の2×SSC中でカバーガラスをはずし、70%、85%、100%エタノールに各1分ずつ浸漬し、風乾後45℃に保温した。
(1)50% ホルムアミド/2×SSC、45℃、10分、3回
(2)2×SSC 45℃、10分
(3)0.1%NP40/2×SSC、45℃、5分
(4)2×SSC すすぎ
次に、従来法である1つの染色体の異常をそれぞれ検出するFISHと、SCAT FISHによる結果比較を示す(表3)。検査会社に、10名の多発性骨髄腫患者(検体P1~P10)の骨髄液の検査を依頼し、FACSによるCD138陽性細胞の全細胞に対する割合(検査会社のFACS結果)、DLEU1(RB1)欠損、P53欠損、BCL1転座、FGFR3転座、MAF転座のFISHによる検査を依頼した。同じ試料をSCAT FISHによって、実施例1と同様の方法を用いてFISHを行い、染色体異常が検出された割合をまとめた。
SCAT FISHにより一細胞中の染色体異常を複数検出し、解析した例を次に示す。2例の多発性骨髄腫再発例において、実施例1と同様にSCAT FISHを行い、一細胞中でどのような染色体異常が複合して生じているか、解析を行った(表4~表7)。
[実施例4]
Claims (10)
- 細胞をホルムアルデヒド固定し、
次にメタノール/酢酸後固定を行い、
次に酢酸処理を行い、
識別可能な3以上の標識を用いて、
一標的細胞中の2以上の染色体異常を同時検出するFISH(fluorescense in situ hybridization)解析法。 - 画像解析ソフトによって蛍光を分離して解析する請求項1記載のFISH解析法。
- 細胞表面抗原を染色することにより腫瘍細胞を識別し、
染色体異常を検出する請求項1又は2記載のFISH解析法。 - PF-405、PF-380-LSS、PF-395-LSS、SpectrumGreen、PF-510-LSS、SpectrumOrange、ATTO Rho12、Red5-ROX、ATTO 620、PB495、AF594から選択される複数の蛍光色素によってFISHプローブを標識する請求項1~3いずれか1項記載のFISH解析法。
- 濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、MALTリンパ腫、バーキットリンパ腫、ALK-positive large B-cell Llymphoma、ALK-positive Anaplastic large cell lymphoma、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、MDS、MPN/MDS、MPNのいずれか1つの疾患の検出を支援するために用いる請求項1~4いずれか1項記載のFISH解析法。
- 多発性骨髄腫を原因とする染色体異常を検出する請求項5記載のFISH解析法。
- 13q14 RB1及び13q34、17p13 TP53及びCEP17、14q32 IgH及び11q13 CCND/BCL1、14q32 IgH及び4p16 FGFR3、14q32 IgH及び16q23 MAF、14q32 IgH及び6p25 IRF4、14q32 IgH及び6p21 CCND3、14q32 IgH及び8q24 MYC、14q32 IgH及び20q11 MAFB、1q21 CKS1B及び1pter、1p32 CDKN2C及び1qter、CEP7、CEP9のうちのいずれか2組以上のプローブを用いて、
del13q34、del17p13、t(11;14)(q13;q32)、t(4;14)(p16;q32)、t(14;16)(q32;q23)、t(6;14)(p25;q32)、t(6;14)(p21;q32)、t(8;14)(q24;q32)、t(14;20)(q32;q11)、1q21増幅、del1p32.3、CEP7、CEP9のうちのいずれか2つ以上の染色体異常を同時に検出する請求項6記載のFISH解析法。 - さらに、CD138、及び/又は核を染色する請求項6、又は7記載のFISH解析法。
- 多発性骨髄腫の治療薬の選択を支援するために用いる請求項6~8いずれか1項記載のFISH解析法。
- 請求項1~9いずれか1項記載のFISH解析法で得られた患者の染色体異常パターンと、患者の治療成績を蓄積し、
AIを用いて解析することによって染色体異常パターンごとの最適な治療法の選択を支援する方法。
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WO2016106298A1 (en) | 2014-12-22 | 2016-06-30 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Visualizing modified nucleotides and nucleic acid interactions in single cells |
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Title |
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'Atto Dyes for Superior Fluorescent Imaging', [online], 2017.9.24 公開, SIGMA-ALDRICH, [2019.1.11 検索], インターネット<URL: https://web.archive.org/web/20170924053652/https://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/detection/learning-center/atto.html> |
Blood,2007年,Vol.109,pp.2089-2099 |
Haematologica,2012年,Vol.97, No.8,pp.1272-1277 |
Leukemia,2016年,Vol.30,pp.1197-1201 |
Oncol. Rep.,2007年,Vol.18,pp.1099-1106 |
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WO2019082871A1 (ja) | 2019-05-02 |
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