FR2729760A1 - Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications - Google Patents
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Abstract
Conjugués immuno-enzymatique constitués d'enzymes de marquage glycosylés sous forme de copolymère et de substance à activité immunologique. Procédé de préparation des conjugués selon l'invention et utilisation desdits conjugués dans des kits de diagnostic.
Description
L'invention concerne un conjugué immuno-enzymatique constitué de substances à activité immunologique et d'enzymes de marquage glycosylés sous forme de copolymère.
L'invention concerne également le procédé de préparation du conjugué selon l'invention et l'utilisation dudit conjugué pour le diagnostic.
On connait de l'art antèrieur différents conjugués et procédés de préparation de conjugués immunoenzymatiques. Ces conjugués immunoenzymatiques sont constitués généralement d'une substance à activité immunologique et d'un enzyme de marquage qui peut être glycosylé. Les procédés de préparation de ces conjugués sont variés et il existe particulièrement des procédés tels que ceux utilisant des techniques de couplage au périodate, lesquelles ont donné lieu à des techniques plus perfectionnées utilisant des agents homo ou hétérobifonctionnels. Ces procédés ont pour but d'améliorer le couplage de l'enzyme à la substance à activité immunologique afin d'obtenir des conjugués qui permettent d'augmenter la spécificité et/ou la sensibilité des résultats de diagnostic.
De façon plus précise, le procédé de couplage de Nakane (The journal of Histochemistry and Cytochemistry, vol.22, No.12, pp.1064-1091, 1974) décrit, après l'oxydation des carbohydrates de l'enzyme au périodate, le couplage direct de la protéine par l'intermédiaire de ses fonctions amines libres.
De même, le brevet EP 209155 décrit un procédé permettant le couplage du réactif immunologique sur la partie protéique de l'enzyme. Ce couplage s'effectue avant ou apres la modification de la partie carbohydrate de la peroxydase par oxydo-réduction, ce qui permet d'obtenir un conjugué qui élimine les résultats faux positifs provenant de sérums dits "à problèmes".
De même, la demande de brevet EP 601318 décrit un procédé de couplage du réactif immunologique sur l'enzyme par l'intermédiaire d'une diamine puis d'un réactif hétérobifonctionnel, la diamine ayant au préalable réagi sur la partie oxydée du cabohydrate de l'enzyme. On obtient de la sorte un conjugué dont la liaison enzyme-réactif immunologique se trouve sur la partie carbohydrate de 1' enzyme, ce qui augmente le nombre de site accessible pour le couplage.
Plus récemment, la demande de brevet EP560912 a décrit un procédé de préparation d'immunoconjugués utilisant la partie carbohydrate des protéines (anticorps-phosphatase alcaline), ce qui permet de préserver le site de reconnaissance immunologiquede l'anticorps.
A I' heure actuelle, il est nécessaire pour certaines pathologies de détecter très précocement la présence d'un antigène spécifique. De plus, certains antigènes sont parfois masqués à la détection et seules quelques infimes quantités d'anticorps spécifiques de l'antigène apparaissent dans le sérum du patient atteint d'une telle infection.
Les conjugués connus de l'art antèrieur ne permettent pas une détection suffisamment sensible des antigènes ou anticorps présents dans le sérum de patients atteints d' infection qui n'induit pas de réaction immunologique importante.
La présente demande se propose d'apporter une solution à ce problème de manque de sensibilité par l'utilisation des conjugués immunoenzymatiques selon l'invention, lesquels conjugués sont constitués d' enzymes de marquage glycosylés sous forme de copolymère et de substances à activité immunologique.
L' invention conceme également le procédé de préparation du conjugué immuns enzymatique selon l'invention, ainsi que 1' utilisation dudit conjugué pour la détermination immunologique.
L'invention concerne encore des kits pour le diagnostic comprenant les conjugués selon l'invention.
Dans la présente invention, les termes "carbohydrate" ou "glycosylé" associés à 1' enzyme signifie que 1' enzyme possède une ou plusieurs molécules glucidique sur sa partie protéique.
Les conjugués selon 1' invention permettent d' obtenir des résultats beaucoup plus sensibles que ceux obtenus par les conjugués immunoenzymatiques déja connus de 1' art antèrieur.
L' invention apporte donc une amélioration significative dans le domaine du diagnostic, et spécialement pour le diagnostic des pathologies ayant une origine virale puisque ces dernières sont souvent de détection difficile au début de l'infection.
Plus particulièrement, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes est obtenu à partir d'enzymes de marquage et de diamines, ou d'enzymes de marquage et de réactifs hétérobifonctionnels différents liés entre eux.
Plus particulièrement encore, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes est obtenu à partir d'une diamine choisie panni une diamine à chaine linéaire, ramifiée ou aromatique comprenant de 2 à 12 atomes de carbone, et de préference encore le phényiène-l 4-diamine.
Plus particulièrement, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes contient deux réactifs hétérobifonctionnels différents liés entre eux qui sont respectivement choisis parmis la 2-mercaptoéthylamine ou le 342-pyridyl-dithio) propionyl hydrazide, et le 4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-l-carboxyl-hydrazide ou l'acide 4 ($N-maléimidb phényl) butyrique hydrazide.
Plus particulièrement, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes comprend des proportions d'enzymes et de diamines ou de réactifs hétérobifonctionnels respectivement de 1/1-10 équivalents molaires, et de préférence 1/s6 équivalents molaires.
De façon préferentielle, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes comprend n x enzymes, n étant un entier compris entre 3 et 20, de préference un entier de 5 à 15.
De façon préferentielle, I'invention concerne un conjugué dont l'enzyme copolymérisée est la peroxydase de Raiford ou la phosphatase alcaline.
Plus particulièrement, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzyme est couplé aux substances à activité immunologique par l'intermédiaire d'un réactif homo ou héterobifonctionnel.
Plus particulièrement encore, I'invention concerne un conjugué dont les proportions molaires respectives du copolymère d'enzymes et des substances à activité immunologique sont de 10/1 à 1/10 ( unité enzymatique / unité de substance à activité immunologique), de préference 3/1 à 1/3, et de préference encore 1/1.
De façon préferentielle, I'invention concerne un conjugué dont la substance à activité immunologique est un peptide VIH1, un peptide VIH2, un peptide VHC et un anticorps anti-VIHl .
L'invention concerne également un procédé de préparation de conjugué selon l'invention, caractérisé en ce que:
a on copolymérise les enzymes de marquage par l'intermédiaire de leurs
carbohydrates préalablement oxydés,
b. puis on effectue le couplage du copolymère d'enzymes avec les
substances à activité immunologique.
a on copolymérise les enzymes de marquage par l'intermédiaire de leurs
carbohydrates préalablement oxydés,
b. puis on effectue le couplage du copolymère d'enzymes avec les
substances à activité immunologique.
Dans un premier mode de réalisation, dans l'étape de copolymérisation du procédé de préparation de conjugués selon l'invention, on fait réagir les enzymes avec une diamine.
Dans un deuxième mode de réalisation, dans l'étape de copolymérisation du procédé de préparation de conjugués selon l'invention, on fait réagir séparément dans une première étape les enzymes avec deux réactifs hétérobifonctionnels différents, puis dans une deuxième étape on fait réagir entre eux les produits de réaction.
Plus particulièrement, I'invention concerne un procédé de préparation dont la copolymérisation, lorsqu'on utilise une diamine, est controlée puis arrêtée par l'ajout d'un agent réducteur choisi parmi le borohydrure de sodium et le cyanoborohydrure de sodium.
Plus particulièrement aussi, l'invention concerne un procédé de préparation dont la copolymérisation, lorsqu'on utilise des réactifs hétérobifonctionnels différents, est controlée puis arrêtée par l'ajout d'agents bloquants des fonctions libres des réactifs hétér bifonctionnels qui n'ont pas réagi. On peut soit utiliser les deux agents bloquants des fonctions libres des deux réactifs utilisés, soit utiliser un des deux agents bloquants des fonctions libres des réactifs employés.
Plus particulièrement encore, I'invention concerne un procédé de préparation pour lequel dans l'étape du couplage du copolymère d'enzymes avec les substances à activité immunologique, la concentration du réactif de couplage homo ou hétérobifonctionnel est en excès par rapport à la concentration du copolymère d'enzymes.
Les conjugués selon 1' invention sont constitués d' enzymes de marquage possédant une partie carbohydrate, par exemple des enzymes telles que la peroxydase de Raiford (POD), la phosphatase alcaline (PAL), la galactosidase, la glucoseKxydase et la fructose-oxydase.
On obtient ainsi des conjugués constitués de copolymères desdites enzymes citées, selon l'enzyme choisie.
Les substances à activité immunologique couplées aux copolymères d' enzymes peuvent être des protéines naturelles ou recombinantes, des anticorps mono ou polyclonaux, recombinants ou non, ou des peptides tels que des peptides H1V (1 ou 2), HCV et HBV, recombinants ou non.
Les réactifs de couplage homo ou hétérobifonctionnels utilisés dans l'étape de couplage du copolymère d'enzymes avec la substance à activité immunologique peuvent être par exemple le bis(sulfosuccinimidyl)suberate (bu3), le sulfosuccinimidyl+(N- maléimidométhyl) cyclo-hexane-lwarboxylate (sulfo-SMCC) et le N-succinimidyl-342- pyridildithio) propionate (SPDP).
Le procédé de préparation selon 1' invention est décrit de façon plus détaillé ci dessous pour une copolymérisation effectuée en une étape:
L' enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le périodate (plusieurs centaine de moles/ moles d'enzyme) à un PH compris entre 4 et 8. On élimine ensuite le périodate en excès par dialyse de la solution d' enzymes oxydées.
L' enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le périodate (plusieurs centaine de moles/ moles d'enzyme) à un PH compris entre 4 et 8. On élimine ensuite le périodate en excès par dialyse de la solution d' enzymes oxydées.
On ajoute alors une diamine telle que le phénylène-1,4-diamine ou une diamine linéaire, ramifiée ou aromatique comprenant de 2 à 12 atomes de carbone, à une concentration respective de 1/1-10 équivalents molaires (unité enzymatique/unité de diamine), de préference de 114b équivalents molaires, en milieu alcalin dont le pH est compris entre 7 et 9,5.
On controle la réaction de copolymérisation sur gel pour obtenir des copolymères d' enzymes qui comprennent n motifs d'enzymes, n étant un entier de 3 à 20, de préference un entier de 5 à 15.
On arrête alors la réaction de copolymérisation en ajoutant en excès un réducteur des carbohydrates oxydés qui n' ont pas réagi pendant la réaction de copolymérisation, tel que le borohydrure de sodium ou le cyanoborohydrure de sodium.
On purifie alors les copolymères d' enzymes par filtration sur gel.
On active ensuite les copolymères d' enzymes en ajoutant un réactif homo ou hétérobifonctionnel dans des proportions de 5-50 moles/ mole d'enzyme, à pH neutre compris entre 6,5 et 8. On purifie alors les copolymères d' enzymes activés par dessalage sur gel.
On effectue alors la conjuguaison du copolymère d' enzymes activé avec la substance à activité immunologique en utilisant des proportions molaires au environ de 10/1 à 1/10 (unité enzymatique/unité de substance à activité immunologique), de préference 3/là 1/3, et de préference encore 1/1, cette réaction s'effectuant à pH neutre.
Le procédé de préparation selon 1' invention est décrit de facon plus détaillé ci dessous pour une copolymérisation effectuée en deux étapes:
L' enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le périodate (plusieurs centaine de moles/ moles d'enzyme) à un PH compris entre 4 et 8. On élimine ensuite le périodate en excès par dialyse de la solution d' enzymes oxydées.
L' enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le périodate (plusieurs centaine de moles/ moles d'enzyme) à un PH compris entre 4 et 8. On élimine ensuite le périodate en excès par dialyse de la solution d' enzymes oxydées.
La solution des l'enzymes oxydés est alors divisée en deux parties égales.
On ajoute alors à la première partie un réactif tel que le 2-mercaptoéthylamine à une concentration respective de 1/1-10 équivalents molaires (unité enzymatique/unité de diamine), de préference de 1/4 6 équivalents molaires, en milieu alcalin dont le pRI est compris entre 7 et 9,5, une heure à température ambiante.
On ajoute à la deuxième partie un réactif tel que le $(N-maléimidométhyl)cyclohexane-l- carboxyl hydrazide à une concentration telle que définie précédemment une heure à température ambiante.
On réduit ensuite les fonctions carbohydrates oxydées n'ayant pas réagies par un réducteur tel que le borohydrure de sodium, et ceci pour les deux fractions des enzymes.
On purifie chacune des solutions d'enzymes par filtration sur gel, puis on mélange les deux fractions d'enzymes purifiés.
On controle la réaction de copolymérisation sur gel pour obtenir des copolymères d' enzymes qui comprennent n motifs d'enzymes, n étant un entier de 3 à 20, de préference un entier de 5 à 15.
On arrête alors la réaction de copolymérisation en ajoutant en excès et successivement deux agents bloquants tels que le 2-mercaptoéthanol et le Néthylmaléimide.
On purifie alors les copolymères d'enzymes par filtration sur gel.
On active ensuite les copolymères d' enzymes en ajoutant un réactif homo ou hétérobifonctionnel dans des proportions de 5-50 molesl mole d'enzyme, à pH neutre compris entre 6,5 et 8. On purifie alors les copolymères d' enzymes activés par dessalage sur gel.
On effectue alors la conjuguaison du copolymère d' enzymes activé avec la substance à activité immunologique en utilisant des proportions molaires au environ de 10/1 à 1/10 (unité enzymatique/unité de substance à activité immunologique), de préference 3/là 1/3, et de préference encore 1/1, cette réaction s'effectuant à pH neutre.
Selon le choix du conjugué que 1' on préferera obtenir, on bloquera ou non avant la réaction de copolymérisation les fonctions amines libres des enzymes.
Dans la mesure ou on ne bloque pas les fonctions amines libres des enzymes, on utilisera de préference au cours de la réaction de copolymérisation une diamine aromatique telle que par exemple le phénylène-l ,4-diamine ou des réactifs hétérobifonfonctionnels différents.
Dans la mesure ou on bloque les fonctions amines des enzymes avant la réaction de copolymérisation avec un agent de protection des fonctions aminées, la réaction de copolymérisation peut être effectuée avec une diamine linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 12 atomes de carbone ou des réactifs hétérobifonctionnels différents.
On peut alors entreprendre la réaction de copolymérisation, et selon 1' endroit ou 1' on veut que réagisse le couplage de la substance à activité immunologique par l'intermédiaire de réactif homo ou hétérobifonctionnel sur le copolymère d' enzymes, on éliminera ou non le groupement protecteur des fonctions aminées.
Le couplage du copolymère d' enzymes avec la substance à activité immunologique peut s' effectuer soit sur la partie protéique du copolymère d' enzymes, soit sur les diamines ou réactifs hétérobifonctionnels ayant réagi préalablement par 1' une de leurs extrémités sur les parties sucrées oxydées et n' ayant pas réagi par 1' autre extrémité, soit sur les deux à la fois.
n ressort de la description précédente que le procédé de préparation de conjugués selon l'invention comprenant une copolymérisation en une étape permet, en plus d'un gain considérable de sensibilité, des variantes interessantes de préparation. ll ressort également de la description précédente que l'avantage du procédé de préparation de conjugués selon l'invention comprenant une copolymérisation en deux étapes procure un éventail plus grand de choix des sites de couplage de la substance à activité immunologique.
On peut donc obtenir par le choix du procédé de préparation des conjugués selon l'invention, en fonction de 1' infection que 1' on veut diagnostiquer, des immunoconjugués appropriés constitués du copolymère d' enzymes choisi et de substances à activité immunologique spécifique de 1' infection. Les combinaisons du procédé de préparation des conjugués sont variées et permettent par un choix judicieux d'obtenir des conjugués qui procurent des résultats de détection spécifiques et ultra-sensibles.
Dans la description des exemples qui suivent, les colonnes du système de chromatographie( gel Superosed9 12 Prep Grad et colonnes HR 10x30 et XK 16x70, PHARMACIAQ) sont rincées et équilibrées avec le tampon PBS ( 50 mM / PH = 7,4 ) préalablement dégazé.
Exemple 1: CONJUGUE PEROXYDASE - PEKFDE VIHl a- copolemérisation de la peroxydase:
On prépare les tampons (Tpn) suivants:
-Tpn PBS (Na2PO4:50 mMNaCl:O,l5M / pH = 7.4) 2,01
-Tpn Hépès (0,36 M / pH = 5,4) 0,1 1
-Tpn Acétate de sodium (0,01 M / pH = 5,4) au moins 1000 fois le volume de peroxydase oxydée
-Tpn Carbonate de sodium (1 M / pH= 9,0) 15% du volume de
peroxydase
Pour les calculs de concentrations et quantités, les lectures de densité optique (D.O). sont
effectuées à 280 et 403 nm, les coefficients d' extinction massique sont:
280 0,7 ml.mg.cm 2 403 = 1,93 ml.mg.cm
Le poids moléculaire de la peroxydase est de 44000 Da.
On prépare les tampons (Tpn) suivants:
-Tpn PBS (Na2PO4:50 mMNaCl:O,l5M / pH = 7.4) 2,01
-Tpn Hépès (0,36 M / pH = 5,4) 0,1 1
-Tpn Acétate de sodium (0,01 M / pH = 5,4) au moins 1000 fois le volume de peroxydase oxydée
-Tpn Carbonate de sodium (1 M / pH= 9,0) 15% du volume de
peroxydase
Pour les calculs de concentrations et quantités, les lectures de densité optique (D.O). sont
effectuées à 280 et 403 nm, les coefficients d' extinction massique sont:
280 0,7 ml.mg.cm 2 403 = 1,93 ml.mg.cm
Le poids moléculaire de la peroxydase est de 44000 Da.
La peroxydase (100 mg) est préparée à une concentration théorique de 45 mg/ml en tampon
Hépès, puis controlée par une mesure de sa D.O. à 280 et 403 nm. La concentration doit
etre de 35 mg/ml à 15 % près). Elle est ensuite oxydée par addition de periodate (1,5 fois la
quantité de peroxydase à une concentration de 100 mg/ml en tampon Hépès. Cette
oxydation dure 45 minutes plus ou moins 10 minutes à environ 20 C et sous agitation
constante.
Hépès, puis controlée par une mesure de sa D.O. à 280 et 403 nm. La concentration doit
etre de 35 mg/ml à 15 % près). Elle est ensuite oxydée par addition de periodate (1,5 fois la
quantité de peroxydase à une concentration de 100 mg/ml en tampon Hépès. Cette
oxydation dure 45 minutes plus ou moins 10 minutes à environ 20 C et sous agitation
constante.
La dialyse est effectuée à 4" C en trois étapes correspondant à trois volumes de Tpn
Acétate de sodium largement supèrieur au volume de peroxydase oxydée.La durée totale de
la dialyse doit être de 24 heures environ.
Acétate de sodium largement supèrieur au volume de peroxydase oxydée.La durée totale de
la dialyse doit être de 24 heures environ.
La copolymérisation a lieu en milieu alcalin obtenu par addition de Tpn Carbonate et en
présence de 4 équivalents molaires de phénylène- 1 ,4-diamine à 2 mg/ml en Tpn Carbonate.
présence de 4 équivalents molaires de phénylène- 1 ,4-diamine à 2 mg/ml en Tpn Carbonate.
Cette étape se fait à 200 C, sous agitation, et durant à peu près 12 heures.
Les contrôles de la copolymérisation sont effectués par injection de 25 'LI de peroxydase
copolymérisée sur gel SuperosetD en colonne HR 10x30 analytique. Le profil doit etre
composé d' un pic majoritaire correspondant à des espèces moléculaires exclues du gel.
copolymérisée sur gel SuperosetD en colonne HR 10x30 analytique. Le profil doit etre
composé d' un pic majoritaire correspondant à des espèces moléculaires exclues du gel.
Deux ou trois autres pics peuvent être présents et correspondent aux différents états de
copolymérisation. On bloque alors la réaction.
copolymérisation. On bloque alors la réaction.
L'arrêt de la copolymérisation est réalisée par la réduction des fonctions oxydées des
peroxydases qui n' ont pas réagi pendant la copolymérisation. L'arrêt se fait par addition de
borohydrure de sodium ( 5 % du volume de peroxydase) à 5 mg/ml en solution dans l'eau.
peroxydases qui n' ont pas réagi pendant la copolymérisation. L'arrêt se fait par addition de
borohydrure de sodium ( 5 % du volume de peroxydase) à 5 mg/ml en solution dans l'eau.
Le mélange est maintenu sous agitation pendant 30 secondes , puis 15 à 20 minutes à
température ambiante sans agitation.
température ambiante sans agitation.
On répéte la même étape une seconde fois dans les mêmes conditions.
On purifie les copolymères sur gel Superose en colonne XK 16x70 préparative. La
quantité maximale injectable de peroxydase est de 400 mg, le volume maximal est de 10
ml. La colonne doit etre équilibrée en Tpn PBS. Le débit pour la purification est de 120
ml/heure
On collecte la fraction correspondant aux espèces moléculaires exclues ou peu retenues par
le gel.
quantité maximale injectable de peroxydase est de 400 mg, le volume maximal est de 10
ml. La colonne doit etre équilibrée en Tpn PBS. Le débit pour la purification est de 120
ml/heure
On collecte la fraction correspondant aux espèces moléculaires exclues ou peu retenues par
le gel.
Le coefficient d' absorption pour le copolymère de peroxydase est de 1,3 mg-'.ml.cm-l.
couplage
On prépare les tampons suivants:
-Tpn PBS (Na2PO4:50 mM,NaCl:0,15M / pH = 7,4) 21
-Tpn acide 2-( N-morpholino) éthanesulphonique (MES):SmMI
acide. borique:5mM/
urée (M.B.U.):2M
pu=7,0 21
Le peptide utilisé est le fragment (584-609) de la protéine gp 41 de l'isolat BRU VIH 1.
On prépare les tampons suivants:
-Tpn PBS (Na2PO4:50 mM,NaCl:0,15M / pH = 7,4) 21
-Tpn acide 2-( N-morpholino) éthanesulphonique (MES):SmMI
acide. borique:5mM/
urée (M.B.U.):2M
pu=7,0 21
Le peptide utilisé est le fragment (584-609) de la protéine gp 41 de l'isolat BRU VIH 1.
La quantité de copolymère à activer est fonction de la quantité de peptide à coupler: 10 à 20
mg de peroxydase pour 1 mg de peptide VIF' I.
mg de peroxydase pour 1 mg de peptide VIF' I.
La peroxydase est activée avec 35 équivalents molaires de BS3 à 30 mg/ml en Tpn PBS
pendant 45 minutes à 20 C sous agitation constante.
pendant 45 minutes à 20 C sous agitation constante.
Le dessalage du copolymère d'enzymes activé se fait sur gel Superpose ) équilibré en
M.B.U. et a pour rôle de séparer le copolymère de peroxydase activé du BS3 n' ayant pas
réagi.
M.B.U. et a pour rôle de séparer le copolymère de peroxydase activé du BS3 n' ayant pas
réagi.
Le copolymère de peroxydase est récupéré à la sortie de ce dessalage et ajusté à une
concentration de 6 mg/ml.
concentration de 6 mg/ml.
Pour la conjuguaison du copolymère de peroxydase activé et du peptide VIHI, le ratio
molaire (peptide / peroxydase) est de 1/1. Le peptide est en solution à 5 mg/ml. On
mélange les quantités correctes de copolymères de peroxydases activés et de peptides et on
laisse sous agitation constante pendant 2 heures à 20 C.
molaire (peptide / peroxydase) est de 1/1. Le peptide est en solution à 5 mg/ml. On
mélange les quantités correctes de copolymères de peroxydases activés et de peptides et on
laisse sous agitation constante pendant 2 heures à 20 C.
Après deux heures de conjuguaison, le mélange est purifié sur gel Superose < E9 équilibré en
Tpn PBS. Le mélange copolymère de peroxydase - peptide VIH1 est injecté sur la colonne
à un débit de 120 heure. 5mM / 2 M /
La fraction correspondant au conjugué est récupérée, la concentration est déterminée par
lecture de D.O. à 403 (ç1,3 ml.mg-'.cm-l).
Tpn PBS. Le mélange copolymère de peroxydase - peptide VIH1 est injecté sur la colonne
à un débit de 120 heure. 5mM / 2 M /
La fraction correspondant au conjugué est récupérée, la concentration est déterminée par
lecture de D.O. à 403 (ç1,3 ml.mg-'.cm-l).
Exemple 2:CONJUGUE PAL-PEPTIDE VIH1
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1,
mais on utilise la PAL purifiée à la place de la POD.
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1,
mais on utilise la PAL purifiée à la place de la POD.
Exemple 3:CONJUGUE POD-ANTICORPS MONOCLONAL VIH1
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1,
mais on utilise un anticorps monoclonal anti HIV 1 à la place du peptide HIV 1.
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1,
mais on utilise un anticorps monoclonal anti HIV 1 à la place du peptide HIV 1.
Exemple 4: IMMUNOENZYMOESSAI DU CONJUGUE POD-PEPTIDE VIHI
La détection des anticorps dirigés contre le virus VIH est basée dans notre exemple
sur le principe de la technique immunoenzymatique de type sandwich. Le test repose sur
l'utilisation d'une phase solide préparée avec des antigènes purifiés, dont la glycoprotéine
d'enveloppe du virus VIF' 1.
La détection des anticorps dirigés contre le virus VIH est basée dans notre exemple
sur le principe de la technique immunoenzymatique de type sandwich. Le test repose sur
l'utilisation d'une phase solide préparée avec des antigènes purifiés, dont la glycoprotéine
d'enveloppe du virus VIF' 1.
La mise en oeuvre du test repose sur les étapes réactionnelles suivantes.
Les sérums à étudier (0,1 ml d'échantillon dilué au 3/4) sont distribués dans les cupules de
la microplaque. Après incubation de 30 minutes, le conjugué (0,1 ml) marqué à la
peroxydase est ajouté après lavage. La présence de l'enzyme immobilisée sur les complexes est révélée par incubation en présence du substrat après élimination de la fraction de conjugué restée libre. Après arrêt de la réaction, la lecture s'effectue au spectrophotomètre à 450/620 nm. La présence ou l'absence des anticorps anti-VîH 1 est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance enregistrée à celle de la valeur seuil calculée (dans ce cas, moyenne des négatifs + 0,1).
la microplaque. Après incubation de 30 minutes, le conjugué (0,1 ml) marqué à la
peroxydase est ajouté après lavage. La présence de l'enzyme immobilisée sur les complexes est révélée par incubation en présence du substrat après élimination de la fraction de conjugué restée libre. Après arrêt de la réaction, la lecture s'effectue au spectrophotomètre à 450/620 nm. La présence ou l'absence des anticorps anti-VîH 1 est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance enregistrée à celle de la valeur seuil calculée (dans ce cas, moyenne des négatifs + 0,1).
Le tableau suivant montre les résultats comparatifs obtenus à l'aide de cinq conjugués fabriqués dans des conditions différentes (couplage d'un peptide mimant l'épitope immunodominant de la glycoprotéine d'enveloppe du virus VIHI/acides aminés 584-609, isolat BRU, à la peroxydase).
Les différents conjugués préparés sont décrits ci après:
-Conjugué A: La peroxydase est non traitée et le peptide est couplé à l'aide d'un réactif bifonctionnel (la méthode de couplage est détaillée plus haut dans l'exemple 1)
Conjugué B: Le peptide est couplé à la peroxydase suivant la méthode Nakane et al.(J.Histochem.Cytochem, 1974,22, 1084-1091) modifiée de la façon suivante: 28 mg de peroxydase sont oxydés avec 19,7 mg de periodate de sodium pendant 1 heure 30 minutes. I mg de peptide est mis en contact avec 4 mg de peroxydase oxydée pendant 3 heures.
-Conjugué A: La peroxydase est non traitée et le peptide est couplé à l'aide d'un réactif bifonctionnel (la méthode de couplage est détaillée plus haut dans l'exemple 1)
Conjugué B: Le peptide est couplé à la peroxydase suivant la méthode Nakane et al.(J.Histochem.Cytochem, 1974,22, 1084-1091) modifiée de la façon suivante: 28 mg de peroxydase sont oxydés avec 19,7 mg de periodate de sodium pendant 1 heure 30 minutes. I mg de peptide est mis en contact avec 4 mg de peroxydase oxydée pendant 3 heures.
-Conjugué C: La peroxydase est préparée suivant la méthode décrite dans la demande EP 601318 citée précédemment et couplée au peptide à l'aide d'un réactif bifonctionnel selon la méthode décrite dans le procédé exemplifié.
-Conjugué D: Le conjugué est préparé suivant la méthode décrite dans l'exemple 1, en utilisant comme réactif bifonctionnel l'hexanediamine- 1.6.
Conjugué E: Le conjugué est préparé suivant la méthode décrite dans l'exemple 1.
<tb>
<SEP> PanelK <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> K1 <SEP> 0,047 <SEP> 0,053 <SEP> 0,062 <SEP> 0,046 <SEP> 0,122
<tb> <SEP> K2 <SEP> 0,095 <SEP> 0,161 <SEP> 0,106 <SEP> 0,835 <SEP> 1,651
<tb> <SEP> K3 <SEP> 0,195 <SEP> 0,310 <SEP> 0,161 <SEP> 2,106
<tb> <SEP> K4 <SEP> 0,243 <SEP> 0,463 <SEP> 0,399 <SEP> 2,816 <SEP> 23 <SEP>
<tb> Panel <SEP> U <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> U1 <SEP> 0,045 <SEP> 0,112 <SEP> 0,298 <SEP> 2,407 <SEP> <SEP> #3
<tb> <SEP> U2 <SEP> 0,226 <SEP> 1,687 <SEP> #3 <SEP> <SEP> #3 <SEP> <SEP> #3
<tb> <SEP> Panel <SEP> Q <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> Q3 <SEP> 0,050 <SEP> 0,044 <SEP> 0,049 <SEP> 0,055 <SEP> 0,125
<tb> <SEP> Q4 <SEP> 0,066 <SEP> 0,368 <SEP> 1,052 <SEP> 2,816 <SEP> 23 <SEP>
<tb> <SEP> Q5 <SEP> 0,125 <SEP> 0,404 <SEP> 1,064 <SEP> 2,906 <SEP> > 3
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 0,116 <SEP> 0,382 <SEP> 1,009 <SEP> 2,836 <SEP> 23 <SEP>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/2 <SEP> 0,100 <SEP> 0,241 <SEP> 0,743 <SEP> 2,191 <SEP> 23 <SEP>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/4 <SEP> 0,073 <SEP> 0,208 <SEP> 0,569 <SEP> 2,133 <SEP> > 3
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/8 <SEP> 0,055 <SEP> 0,135 <SEP> 0,356 <SEP> 1,523 <SEP> 2,837 <SEP>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/16 <SEP> 0,047 <SEP> 0,092 <SEP> 0,218 <SEP> 0,965 <SEP> 1,945
<tb>
<tb> <SEP> K1 <SEP> 0,047 <SEP> 0,053 <SEP> 0,062 <SEP> 0,046 <SEP> 0,122
<tb> <SEP> K2 <SEP> 0,095 <SEP> 0,161 <SEP> 0,106 <SEP> 0,835 <SEP> 1,651
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<tb> Panel <SEP> U <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
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<tb> <SEP> Panel <SEP> Q <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
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<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/2 <SEP> 0,100 <SEP> 0,241 <SEP> 0,743 <SEP> 2,191 <SEP> 23 <SEP>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/4 <SEP> 0,073 <SEP> 0,208 <SEP> 0,569 <SEP> 2,133 <SEP> > 3
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/8 <SEP> 0,055 <SEP> 0,135 <SEP> 0,356 <SEP> 1,523 <SEP> 2,837 <SEP>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/16 <SEP> 0,047 <SEP> 0,092 <SEP> 0,218 <SEP> 0,965 <SEP> 1,945
<tb>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/32 <SEP> I <SEP> 0,047 <SEP> <SEP> < <SEP> 0,668 <SEP> L <SEP> 1,515 <SEP>
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/64 <SEP> 0,042 <SEP> 0,064 <SEP> 1 <SEP> <SEP> 0,430 <SEP> 0,772
<tb> <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> moyenne <SEP> 0,039 <SEP> 0,047 <SEP> 0,040 <SEP> 0,031 <SEP> 0,037
<tb> <SEP> (n=31) <SEP>
<tb> valeur <SEP> seuil <SEP> 0,139 <SEP> 0,147 <SEP> 0,140 <SEP> 0,131 <SEP> 0,137
<tb> <SEP> (vs)
<tb>
Les résultats des tests rassemblés dans le tableau montrent que seuls les conjugués D et E permettent de détecter la positivité à la fois des sérums K2 et Q6 dilués au 1/64.
<tb> <SEP> Q6 <SEP> 1/64 <SEP> 0,042 <SEP> 0,064 <SEP> 1 <SEP> <SEP> 0,430 <SEP> 0,772
<tb> <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> moyenne <SEP> 0,039 <SEP> 0,047 <SEP> 0,040 <SEP> 0,031 <SEP> 0,037
<tb> <SEP> (n=31) <SEP>
<tb> valeur <SEP> seuil <SEP> 0,139 <SEP> 0,147 <SEP> 0,140 <SEP> 0,131 <SEP> 0,137
<tb> <SEP> (vs)
<tb>
Les résultats des tests rassemblés dans le tableau montrent que seuls les conjugués D et E permettent de détecter la positivité à la fois des sérums K2 et Q6 dilués au 1/64.
n apparait donc que les conjugués de l'invention permettent de donner une marge de sécurité meilleure, ils sont donc plus performants.
Claims (1)
- 3 conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diamine est choisie parmi une diamine à chaine linéaire, ramifiée ou aromatique comprenant de 2 à 12 atomes de carbone.4Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diamine est le phénylène-1,4 diamine.5-Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que les réactifs hétérobifonctionnels différents sont deux réactifs hétérobifonctionnels respectivement choisis parmi la 2-mercapto-éthylamine ou le 3-( 2-pyridyldithio) propionyl hydrazide, et le 4 (N-maléimidométhyl) cyclohexane- I arboxyl hydrazide ou l'acide 4-(4-N- maléimidophényl) butyrique hydrazide.6Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que les proportions d'enzymes et de diamines ou de réactifs hétérobifonctionnels sont respectivement de 1/1-10 équivalents molaires, et de préférence 1/66 équivalents molaires.7Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le copolymère d'enzymes comprend n x enzymes, n étant un entier compris entre 3 et 20, de préference un entier de 5 à 15.SConjugué selon les revendications I à 7, caractérisé en ce que l'enzyme copolyntrisée est la peroxydase de Raiford ou la phosphatase alcaline.9Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le copolymère d'enzymes est couplé aux substances à activité immunologique par l'intermédiaire d'un réactif homo ou hétérobifonctionnel.10 Conjugué selon les revendications I et 9 , caractérisé en ce que les proportions molaires respectives du copolymère d'enzymes et des substances à activité immunologique sont de 10/1 à 1/10 ( unité enzymatique / unité de substance à activité immunologique), de préference 3/1 à 1/3, et de préference encore 1/1.llZonjugué selon les revendications 1, 9 et 10, caractérisé en ce que la substance à activité immunologique est un peptide VOMI, un peptide VIH2, un peptide VHC ou un anticorps monoclonal-anti-VM1 .12-Procédé de préparation de conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que:a on copolymérise les enzymes de marquage par l'intermédiaire de leurs carbohydrates préalablement oxydés,b. puis on effectue le couplage du copolymère d'enzymes avec les substances à activité immunologique.13-Procédé selon la revendication 12, caractérisée en ce que pour effectuer la copolymérisation on fait réagir les enzymes avec une diamine.14-Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que pour effectuer la copolymérisation, on fait réagir séparément dans une première étape les enzymes avec deux réactifs hétérobifonctionnels différents, puis dans une deuxième étape on fait réagir entre eux les produits de réaction.15-Procédé selon les revendications 12 et 13, caractérisé en ce que la copolymérisation est controlée puis arrêtée par l'ajout d'un agent réducteur choisi parmi le borohydrure de sodium et le cyanoborohydrure de sodium.1iProcédé selon la revendications 12 et 14, caractérisé en ce que la copolymérisation est controlée puis arrêtée par l'ajout d'agents bloquants des réactifs hétérobifonctionnels.17-Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que dans l'étape du couplage du copolymère d'enzymes avec les substances à activité immunologique, la concentration du réactif homo ou hétérobifonctionnel est en excès par rapport à la concentration du copolymère d'enzymes.18-Utilisation du conjugué selon la revendication l pour la détermination immune logique.19-Kit de diagnostic comprenant un réactif pour la détermination immunologique, caractérisé par une teneur en conjugué selon la revendication l.
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| CA002184636A CA2184636C (fr) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| AU46260/96A AU707172B2 (en) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatic conjugate, preparation method therefor and uses thereof |
| PT96901840T PT752102E (pt) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugado imunoenzimatico seu processo de preparacao e as suas aplicacoes |
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| DE69610948T DE69610948T2 (de) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatisches konjugat, herstellungsverfahren dafür und verwendungen |
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| AT96901840T ATE197645T1 (de) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatisches konjugat, herstellungsverfahren dafür und verwendungen |
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| ES96901840T ES2153090T3 (es) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugado inmunoenzimatico, su procedimiento de preparacion y sus aplicaciones. |
| DK96901840T DK0752102T3 (da) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatisk konjugat, fremgangsmåde til fremstilling af konjugatet og anvendelse af dette. |
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| US08/714,110 US6027874A (en) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatic conjugate, method for its productions, applications thereof |
| GR20010400042T GR3035226T3 (en) | 1995-01-23 | 2001-01-11 | Immunoenzymatic conjugate, preparation method therefor and uses thereof |
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| EP0175560A2 (fr) * | 1984-09-14 | 1986-03-26 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Essais immunologiques utilisant des conjugués covalents d'enzymes polymérisées et d'anticorps |
| EP0209155A1 (fr) * | 1985-07-19 | 1987-01-21 | Roche Diagnostics GmbH | Réactif conjugué pour un immuno-essai enzymatique |
| US4693969A (en) * | 1984-05-04 | 1987-09-15 | Cornell Research Foundation, Inc. | Reagent for use in a sandwich solid-phase enzyme-immunoassay and process for employing same |
| EP0430510A2 (fr) * | 1989-11-22 | 1991-06-05 | THE GENERAL ELECTRIC COMPANY, p.l.c. | Polymères |
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1995
- 1995-01-23 FR FR9500735A patent/FR2729760B1/fr not_active Expired - Fee Related
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1996
- 1996-01-23 ZA ZA96504A patent/ZA96504B/xx unknown
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| EP0601318A2 (fr) * | 1992-11-06 | 1994-06-15 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Procédé de préparation de conjugués d'un membre spécifique d'une réaction et d'une proteine glycosylée |
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| ZA96504B (en) | 1997-07-23 |
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