FR2734365A1 - Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications - Google Patents
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Abstract
Conjugué immunoenzymatique constitué d'enzymes de marquage glycosylées sous forme de copolymère et de substances à activité immunologique. Procédé de préparation des conjugués selon l'invention et utilisation desdits conjugués dans des trousses de diagnostic.
Description
La présente invention concerne un conjugué immuno-enzymatique constitué de substances à activité immunologique et d'enzymes de marquage glycosylées sous forme de copolymère. L'invention concerne également le procédé de préparation du conjugué selon l'invention et l'utilisation dudit conjugué pour le diagnostic.
On connaît de l'art antèrieur différents conjugués et procédés de préparation de conjugués immuno-enzymatiques. Ces conjugués immuno-enzymatiques sont constitués généralement d'une substance à activité immunologique et d'une enzyme de marquage qui peut être glycosylée. Les procédés de préparation de ces conjugués sont variés et il existe particulièrement des procédés tels que ceux utilisant des techniques de couplage au périodate, lesquelles ont donné lieu à des techniques plus perfectionnées utilisant des agents homo ou hétérobifonctionnels. Ces procédés ont pour but d'améliorer le couplage de l'enzyme à la substance à activité immunologique afin d'obtenir des conjugués qui permettent d'augmenter la spécificité et/ou la sensibilité des résultats de diagnostic.
De façon plus précise, le procédé de couplage de Nakane (The joumal of
Histochemistry and Cytochemistry, vol.22, No.12, pp.l064-1091, 1974) décrit, après l'oxydation des carbohydrates de l'enzyme au périodate, le couplage direct de la protéine par l'intermédiaire de ses fonctions amines libres.
Histochemistry and Cytochemistry, vol.22, No.12, pp.l064-1091, 1974) décrit, après l'oxydation des carbohydrates de l'enzyme au périodate, le couplage direct de la protéine par l'intermédiaire de ses fonctions amines libres.
De même, le brevet EP 209155 décrit un procédé permettant le couplage du réactif immunologique sur la partie protéique de l'enzyme. Ce couplage s'effectue avant ou après la modification de la partie carbohydrate de la peroxydase par oxydo-réduction, ce qui permet d'obtenir un conjugué qui élimine les résultats faux positifs provenant de sérums dits "à problèmes".
De même, la demande de brevet EP 601318 décrit un procédé de couplage du réactif immunologique sur l'enzyme par l'intermédiaire d'une diamine puis d'un réactif hétérobifonctionnel, la diamine ayant au préalable réagi sur la partie oxydée du cabohydrate de l'enzyme. On obtient de la sorte un conjugué dont la liaison enzyme-réactif immunologique se trouve sur la partie carbohydrate de 1' enzyme, ce qui augmente le nombre de site accessible pour le couplage.
Plus récemment, la demande de brevet EP560912 a décrit un procédé de préparation d'immunoconjugués utilisant la partie carbohydrate des protéines (anticorps-phosphatase alcaline), ce qui permet de préserver le site de reconnaissance immunologique de l'anticorps.
A I' heure actuelle, il est nécessaire pour certaines pathologies de détecter très précocement la présence d'un antigène spécifique. De plus, certains antigènes sont parfois masqués à la détection et seules quelques infimes quantités d'anticorps spécifiques de l'antigène apparaissent dans le sérum du patient atteint d'une telle infection.
Les conjugués connus de l'art antèrieur ne permettent pas une détection suffisamment sensible des antigènes ou anticorps présents dans le sérum de patients atteints d'infection qui n'induit pas de réaction imrnunologique importante.
La présente demande se propose d'apporter une solution à ce problème de manque de sensibilité par l'utilisation des conjugués immunoenzymatiques selon l'invention.
L'invention a pour objet des conjugués immunoenzymatiques, lesquels conjugués sont constitués d' enzymes de marquage glycosylées sous forme de copolymère et de substances à activité immunologique.
L' invention concerne également le procédé de préparation du conjugué immunoenzymatique selon l'invention, ainsi que 1' utilisation dudit conjugué pour la détermination immunologique.
L'invention concerne encore des kits pour le diagnostic comprenant les conjugués selon l'invention.
Dans la présente invention, les termes "carbohydrate" ou "glycosylée" associés à 1' enzyme signifient que 1' enzyme possède une ou plusieurs molécules glucidique sur sa partie protéique.
Les conjugués selon 1' invention permettent d' obtenir des résultats beaucoup plus sensibles que ceux obtenus par les conjugués immunoenzymatiques déja connus de 1' art antèrieur. L' invention apporte donc une amélioration significative dans le domaine du diagnostic, et spécialement pour le diagnostic des pathologies ayant une origine virale puisque ces dernières sont souvent de détection difficile au début de l'infection.
Plus particulièrement, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes est obtenu à partir d'enzymes de marquage et de diamines, ou d'enzymes de marquage et de réactifs hétérobifonctionnels différents liés entre eux.
Selon une variante avantageuse, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes est obtenu à partir d'une diamine choisie parmi une diamine à chaine linéaire, ramifiée ou aromatique comprenant de 2 à 12 atomes de carbone, et de préference encore le phénylène- I ,4-diamine.
Selon une autre variante avantageuse, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes contient deux réactifs hétérobifonctionnels différents liés entre eux qui sont respectivement choisis parmis la 2-mercaptoéthylamine ou la 3-(2-pyridyl-dithio) propionyl hydrazide, et le 4-(N-maléinudométhyl) cyclohexane-l-carboxyl-hydrazide ou le 4-(4-N-maléimido-phényl) butyryl hydrazide.
Plus particulièrement, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes comprend des proportions d'enzymes et de diamines ou de réactifs hétérobifonctionnels respectivement de 1/1-10 équivalents molaires, et de préférence 1/4-6 équivalents molaires.
De façon préferentielle encore, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzymes comprend n x enzymes, n étant un entier compris entre 3 et 20, de préference un entier compris entre 5 et 15.
Selon une variante avantageuse, I'invention concerne un conjugué dont l'enzyme copolymérisée est la peroxydase de raiford ou la phosphatase alcaline.
Selon une autre variante avantageuse, I'invention concerne un conjugué dont le copolymère d'enzyme est couplé aux substances à activité immunologique par l'intermédiaire d'un réactif homo ou héterobifonctionnel.
Plus particulièrement encore, l'invention concerne un conjugué dont les proportions molaires respectives du copolymère d'enzymes et des substances à activité immunologique sont de 10/1 à 1/10 ( unité enzymatique / unité de substance à activité immunologique), de préférence 3/1 à 1/3, et de préference encore 1/1.
Selon une variante préférée, I'invention concerne un conjugué dont la substance à activité immunologique est un peptide VIH1, un peptide VIH2, un peptide VHC, une protéine recombinante VHC et un anticorps-anti-VIH1 .
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de conjugué selon l'invention, caractérisé en ce que
a. on copolymérise les enzymes de marquage par l'intermédiaire de leurs
carbohydrates préalablement oxydés,
b. puis on effectue le couplage du copolymère d'enzymes avec les
substances à activité immunologique.
a. on copolymérise les enzymes de marquage par l'intermédiaire de leurs
carbohydrates préalablement oxydés,
b. puis on effectue le couplage du copolymère d'enzymes avec les
substances à activité immunologique.
Dans un premier mode de réalisation, dans l'étape de copolymérisation du procédé de préparation de conjugués selon l'invention, on fait réagir les enzymes avec une diamine.
Dans un deuxième mode de réalisation, dans l'étape de copolymérisation du procédé de préparation de conjugués selon l'invention, on fait réagir séparément dans une première étape les enzymes avec deux réactifs hétérobifonctionnels différents, puis dans une deuxième étape on fait réagir entre eux les produits de la réaction.
Selon une variante avantageuse, I'invention concerne un procédé de préparation dont la copolymérisation, lorsqu'on utilise une diamine, est controlée puis arrêtée par l'ajout d'un agent réducteur choisi parmi le borohydrure de sodium et le cyanoborohydrure de sodium.
Selon une autre variante avantageuse, I'invention concerne un procédé de préparation dont la copolymérisation, lorsqu'on utilise des réactifs hétérobifonctionnels différents, est controlée puis arrêtée par l'ajout d'agents bloquants des fonctions libres des réactifs hétéro-bifonctionnels qui n'ont pas réagi. On peut, selon le cas, soit utiliser les deux agents bloquants des fonctions libres des deux réactifs utilisés, soit utiliser un des deux agents bloquants des fonctions libres des réactifs employés.
De façon préferentielle, l'invention concerne un procédé de préparation pour lequel dans l'étape du couplage du copolymère d'enzymes avec les substances à activité immunologique, la concentration du réactif de couplage homo ou hétérobifonctionnel est en excès par rapport à la concentration du copolymère d'enzymes.
Les conjugués selon l'invention sont constitués d' enzymes de marquage, possédant une partie carbohydrate, telles que la peroxydase de raiford (POD), la phosphatase alkaline (PAL), la galactosidase, la glucose-oxydase et la fructose-oxydase. On obtient ainsi, par le procédé selon l'invention, des conjugués constitués de copolymères constitués desdites enzymes citées, copolymères selon l'enzyme choisie.
Les substances à activité immunologique couplées aux copolymères d' enzymes peuvent être des protéines naturelles ou recombinantes, des anticorps mono ou polyclonaux, recombinants ou non, ou des peptides tels que des peptides VIR (1 ou 2), VllC et VHB, recombinants ou non.
Les réactifs de couplage homo ou hétérobifonctionnels utilisés dans l'étape de couplage du copolymère d'enzymes avec la substance à activité immunologique peuvent être par exemple le bis(sulfosuccinimidyl)suberate (BS3), le sulfosuccinimidyl-4-(Nmaléimidométhyl) cyclo-hexane-l-carboxylate (sulfo-SMCC) et le N-succinimidyl-3-(2pyridyldithio) propionate (SPDP).
Le procédé de préparation selon I' invention est décrit de facon plus détaillé cidessous pour une copolymérisation effectuée en une étape:
L' enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le périodate (plusieurs centaine de moles/ moles d'enzyme) à un pH compris entre 4 et S. On élimine ensuite le périodate en excès par dialyse de la solution d' enzymes oxydées.
L' enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le périodate (plusieurs centaine de moles/ moles d'enzyme) à un pH compris entre 4 et S. On élimine ensuite le périodate en excès par dialyse de la solution d' enzymes oxydées.
On ajoute alors une diamine telle que le phénylène-l,4-diamine ou une diamine linéaire, ramifiée ou aromatique comprenant de 2 à 12 atomes de carbone, à une concentration respective de 1/1-10 équivalents molaires (unité enzymatique/unité de diamine), de préférence de 1/4-6 équivalents molaires, en un milieu dont le pH est compris entre 7 et 9,5.
On contrôle la réaction de copolymérisation par analyse chromatographique de filtration sur gel pour obtenir des copolymères d' enzymes qui comprennent n motifs d'enzymes, n étant un entier de 3 à 20, de préference un entier de 5 à 15.
On arrête alors la réaction de copolymérisation en ajoutant en excès un réducteur des carbohydrates oxydés qui n' ont pas réagi pendant la réaction de copolymérisation, tel que le borohydrure de sodium ou le cyanoborohydrure de sodium.
On purifie alors les copolymères d' enzymes par filtration sur gel.
On active ensuite les copolymères d' enzymes en ajoutant un réactif homo ou hétérobifonctionnel dans des proportions de 5-50 moles/ mole d'enzyme, à pH compris entre 6,5 et 8. On purifie alors les copolymères d' enzymes activés par dessalage sur gel
On effectue alors la conjuguaison du copolymère d' enzymes activé avec la substance à activité immunologique en utilisant des proportions molaires aux environs de 10/1 à 1/10 (unité enzymatique/unité de substance à activité immunologique), de préference 3/là 1/3, et de préference encore 1/1, cette réaction s'effectuant à pH neutre.
On effectue alors la conjuguaison du copolymère d' enzymes activé avec la substance à activité immunologique en utilisant des proportions molaires aux environs de 10/1 à 1/10 (unité enzymatique/unité de substance à activité immunologique), de préference 3/là 1/3, et de préference encore 1/1, cette réaction s'effectuant à pH neutre.
Le procédé de préparation selon 1' invention est décrit de facon plus détaillé cidessous pour une copolvmérisation effectuée en deux étapes:
L'enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le periodate (plusieurs centaines de moles / mole d'enzyme) à un pH compris entre 4 et 8.
L'enzyme choisie pour effectuer la préparation du conjugué est, préalablement à la réaction de copolymérisation, traitée avec un réactif oxydatif des fonctions carbohydrates, tel que le periodate (plusieurs centaines de moles / mole d'enzyme) à un pH compris entre 4 et 8.
On élimine ensuite le periodate en excès par dialyse de la solution d'enzymes oxydées.
La solution d'enzymes oxydées est ajustée à 5-10 mg/ml et divisée en 2 parties égales.
On ajoute alors à la première partie un réactif tel que le 2-mercaptoéthylamine à une concentration respective de 1/1-10 équivalents molaires (unité enzymatique/unité de diamine), de préférence de 1/4-6 équivalents molaires, en milieu alcalin dont le pH est compris entre 7 et 9,5, une heure à température ambiante.
On ajoute à la deuxième partie un réactif tel que le 4-(Nmaléimidométhyl)cyclohexane- I-carboxyl hydrazide à une concentration telle que définie précédemment une heure à température ambiante.
Selon une variante préférée, on effectue le protocole suivant:
-On ajoute à la première partie un réactif tel que le 3-(2-pyridyl-dithio) propionyl hydrazide (PDPH) à une concentration finale de 5 mM environ, à pH 5-7. On laisse réagir les réactifs une heure environ à 200C.
-On ajoute à la première partie un réactif tel que le 3-(2-pyridyl-dithio) propionyl hydrazide (PDPH) à une concentration finale de 5 mM environ, à pH 5-7. On laisse réagir les réactifs une heure environ à 200C.
-On ajoute à la deuxième partie un réactif tel que le 4-(4-N-maléimido-phényl) butyryl hydrazide (MPBH) à une concentration finale de I mM environ. à pH 5-7. On laisse réagir les réactifs pendant I heure environ à 20"C.
Chacune des solutions d'enzymes est filtrée et purifiée par filtration sur gel.
La fraction activée par la PDPH est réduite par du dithiothréitol (concentration finale 10 mM) pendant 10 minutes environ, puis purifiée à nouveau par filtration sur gel.
La fraction d'enzymes activées par la PDPH après réduction est mélangée à la fraction d'enzymes activées à la MPBH. La réaction de copolymérisation des 2 espèces est effectuée à 20"C à un pH compris entre 6 et 8.
Le contrôle de la copolymérisation est effectué par filtration sur gel sur une colonne analytique remplie par exemple de gel PharmaciaB SuperoseB 6 Prep Grad pour la phosphatase alcaline (PM = 140000) ou de SuperoseB 12 Prep Grad pour la peroxydase de raiford (PM = 44000).
Le blocage des réactions est réalisé par additions successives de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 1 mM) et de N-éthylmaléimide (concentration finale 2 mM), une réduction au borohydrure de sodium ou au cyanoborohydrure de sodium peut être effectuée pour réduire les fonctions carbonyles qui n'ont éventuellement pas réagi et pour stabiliser les fonctions hydrazones créées par la réaction des fonctions carbonyles sur les hydrazides.
La solution d'enzymes polymérisées est purifiée par gel filtration sur colonne préparative dans des conditions similaires au contrôle analytique précédent. La fraction correspondant aux espèces exclues du gel est récupérée et constitue la solution d'enzymes polymérisées. La concentration en protéine est déterminée par dosage BCA (Pierce).
On active ensuite les copolymères d' enzymes en ajoutant un réactif homo ou hétérobifonctionnel dans des proportions de 5-50 moles/ mole d'enzyme, à-pH compris entre 6,5 et 8. On purifie alors les copolymères d' enzymes activés par dessalage sur gel
On effectue alors la conjuguaison du copolymère d' enzymes activé avec la substance à activité immunologique en utilisant des proportions molaires aux environs de 10/1 à 1/10 (unité enzymatique/unité de substance à activité immunologique), de préference 3/là 1/3, et de préference encore 1/1, cette réaction s'effectuant àpH neutre.
On effectue alors la conjuguaison du copolymère d' enzymes activé avec la substance à activité immunologique en utilisant des proportions molaires aux environs de 10/1 à 1/10 (unité enzymatique/unité de substance à activité immunologique), de préference 3/là 1/3, et de préference encore 1/1, cette réaction s'effectuant àpH neutre.
Selon le choix du conjugué que I' on préfèrera obtenir, on bloquera ou non avant la réaction de copolymérisation les fonctions amines libres des enzymes.
Dans la mesure ou on ne bloque pas les fonctions amines libres des enzymes, on utilisera de préference au cours de la réaction de copolymérisation une diamine aromatique telle que par exemple le phénylène-l,4-diamine ou des réactifs hétérobifonfonctionnels différents.
Dans la mesure ou on bloque les fonctions amines des enzymes avant la réaction de copolymérisation avec un agent de protection des fonctions aminées, la réaction de copolymérisation peut être effectuée avec une diamine linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 12 atomes de carbone ou des réactifs hétérobifonctionnels différents.
On peut alors entreprendre la réaction de copolymérisation, et selon 1' endroit ou 1' on veut que réagisse le couplage de la substance à activité immunologique par l'intermédiaire de réactif homo ou hétérobifonctionnel sur le copolymère d' enzymes, on éliminera ou non le groupement protecteur des fonctions aminées.
Le couplage du copolymère d' enzymes avec la substance à activité immunologique peut s' effectuer soit sur la partie protéique du copolymère d' enzymes, soit sur les diamines ou réactifs hétérobifonctionnels ayant réagi préalablement par l' une de leurs extrémités sur les parties sucrées oxydées et n' ayant pas réagi par 1' autre extrémité, soit sur les deux à la fois.
fl ressort de la description précédente que le procédé de préparation de conjugués selon l'invention, comprenant une copolymérisation en une étape, permet, en plus de l'obtention de conjugués présentant un gain considérable de sensibilité dans des tests immunoenzymatiques, des variantes intéressantes de préparation.
H ressort également de la description précédente que l'avantage du procédé de préparation de conjugués selon l'invention comprenant une copolymérisation en deux étapes, est un éventail plus élevé du choix des sites de couplage de la substance à activité immunologique.
On peut donc obtenir par le choix du procédé de préparation des conjugués selon l'invention, en fonction de 1' infection que I' on veut diagnostiquer, des immunoconjugués appropriés constitués du copolymère d' enzymes choisi et de substances à activité immunologique spécifique de 1' infection. Les combinaisons possibles du procédé de préparation des conjugués selon l'invention (que ce soit l'étape de copolymérisation ou l'étape de couplage) sont variées et permettent par un choix judicieux d'obtenir des conjugués qui procurent des résultats de détection spécifiques et ultra-sensibles.
Dans la description des exemples qui suivent, les colonnes du système de chromatographie (gel Superose(D 12 Prep Grad et colonnes HR 10x30 et XK 16x70, PHARMACIA(!)) sont rincées et équilibrées avec le tampon PBS ( 50 mM / PH = 7,4 ) préalablement dégazé.
Exemple 1: CONJUGUE DE PEROXYDASE -PEPTIDE VIHI a- copolvmérisation de la peroxydase en une étape:
On prépare les tampons (Tpn) suivants
-Tpn PBS (phosphate de sodium 50 mM,NaCI:0,15 M / pH = 7,4) 2,0 1
-Tpn Hépès (0,36 M / pH = 5,4) 0,11
-Tpn Acétate de sodium (0,01 M / pH = 5,4) au moins 1000 fois le
volume de peroxydase oxydée
-Tpn Carbonate de sodium (1 M / pH= 9,0) 15% du volume de
peroxydase
Pour les calculs de concentrations et quantités, les lectures de densité optique (D.O). sont effectuées à 280 et 403 nm, les coefficients d' extinction massique sont::
280 = 0,7 ml.mg~T.cm~0
403 = 1,93 ml.mg'.cm'
Le poids moléculaire de la peroxydase est de 44 000 Da.
On prépare les tampons (Tpn) suivants
-Tpn PBS (phosphate de sodium 50 mM,NaCI:0,15 M / pH = 7,4) 2,0 1
-Tpn Hépès (0,36 M / pH = 5,4) 0,11
-Tpn Acétate de sodium (0,01 M / pH = 5,4) au moins 1000 fois le
volume de peroxydase oxydée
-Tpn Carbonate de sodium (1 M / pH= 9,0) 15% du volume de
peroxydase
Pour les calculs de concentrations et quantités, les lectures de densité optique (D.O). sont effectuées à 280 et 403 nm, les coefficients d' extinction massique sont::
280 = 0,7 ml.mg~T.cm~0
403 = 1,93 ml.mg'.cm'
Le poids moléculaire de la peroxydase est de 44 000 Da.
La peroxydase (100 mg) est préparée à une concentration théorique de 45 mg/ml en tampon Hépès, puis controlée par une mesure de sa D.O. à 280 et 403 nm. La concentration doit être de 35 mg/ml à 15 % près). Elle est ensuite oxydée par addition de periodate (1,5 fois la quantité de peroxydase à une concentration de 100 mg/ml en tampon Hépès). Cette oxydation dure 45 minutes plus ou moins 10 minutes à environ 20 C et sous agitation constante.
La dialyse est effectuée à 4" C en trois étapes correspondant à trois volumes de Tpn
Acétate de sodium largement supérieur au volume de peroxydase oxydée. La durée totale de la dialyse doit être de 24 heures environ.
Acétate de sodium largement supérieur au volume de peroxydase oxydée. La durée totale de la dialyse doit être de 24 heures environ.
La copolymérisation a lieu en milieu alcalin obtenu par addition de Tpn Carbonate et en présence de 4 équivalents molaires de phénylène-l ,4-diamine à 2 mg/ml en Tpn
Carbonate. Cette étape se fait à 200 C, sous agitation, et durant à peu près 12 heures.
Carbonate. Cette étape se fait à 200 C, sous agitation, et durant à peu près 12 heures.
Les contrôles de la copolymérisation sont effectués par injection de 25 lii de peroxydase copolymérisée sur gel SuperoseB en colonne HR 10x30 analytique. Le profil doit être composé d' un pic majoritaire correspondant à des espèces moléculaires exclues du gel. Deux ou trois autres pics peuvent être présents et correspondent aux différents états de copolymérisation. On bloque alors la réaction.
L'arrêt de la copolymérisation est réalisée par la réduction des fonctions oxydées des peroxydases qui n' ont pas réagi pendant la copolymérisation. L'arrêt se fait par addition de borohydrure de sodium ( 5 io du volume de peroxydase) à 5 mg/ml en solution dans l'eau. Le mélange est maintenu sous agitation pendant 30 secondes , puis 15 à 20 minutes à température ambiante sans agitation.
On répéte la même étape une seconde fois dans les mêmes conditions.
On purifie les copolymères sur gel SuperoseB en colonne XK 16x70 préparative.
La quantité maximale injectable de peroxydase est de 200 mg, le volume maximal est de 10 ml. La colonne doit être équilibrée en Tpn PBS. Le débit pour la purification est de 120 ml/heure
On collecte la fraction correspondant aux espèces moléculaires exclues ou peu retenues par le gel.
On collecte la fraction correspondant aux espèces moléculaires exclues ou peu retenues par le gel.
Le coefficient d' absorption pour le copolymère de peroxydase est de 1,3 mg-'.ml.cm-l à 403 nm.
b-couplaae:
On prépare les tampons suivants
-Tpn PBS (phosphate de sodium 50 mM NaCl:0, 15 M / pH = 7,4) 2 1
-Tpn M.B.U.:-acide 2-(N-morpholino) éthanesulphonique (MES):5mM/
-acide. horique:5rnNlI
-urée 2M
pH= 7,0 21
Le peptide utilisé est le fragment (584-609) de la protéine gp 41 de l'isolat BRU VlH 1. Ce peptide correspond au peptide 39 divulgué dans le brevet européen de Genetic
Systems Corporation, dont le numéro de publication est EP-220 273.
On prépare les tampons suivants
-Tpn PBS (phosphate de sodium 50 mM NaCl:0, 15 M / pH = 7,4) 2 1
-Tpn M.B.U.:-acide 2-(N-morpholino) éthanesulphonique (MES):5mM/
-acide. horique:5rnNlI
-urée 2M
pH= 7,0 21
Le peptide utilisé est le fragment (584-609) de la protéine gp 41 de l'isolat BRU VlH 1. Ce peptide correspond au peptide 39 divulgué dans le brevet européen de Genetic
Systems Corporation, dont le numéro de publication est EP-220 273.
La quantité de copolymère à activer est fonction de la quantité de peptide à coupler: 10 à 20 mg de peroxydase pour I mg de peptide VIHI.
La peroxydase est activée avec 35 équivalents molaires de BS3 à 30 mg/ml en Tpn
PBS pendant 45 minutes à 20 C sous agitation constante.
PBS pendant 45 minutes à 20 C sous agitation constante.
Le dessalage du copolymère d'enzymes activé se fait sur gel SuperoseB équilibré en
M.B.U. et a pour rôle de séparer le copolymère de peroxydase activé du BS3 n' ayant pas réagi.
M.B.U. et a pour rôle de séparer le copolymère de peroxydase activé du BS3 n' ayant pas réagi.
Le copolymère de peroxydase est récupéré à la sortie de ce dessalage et ajusté à une concentration de 6 mg/mi.
Pour la conjugaison du copolymère de peroxydase activé et du peptide VIH1, le ratio molaire (peptide / peroxydase) est de 1/1. Le peptide est en solution à 5 mg/ml. On mélange les quantités correctes de copolymères de peroxydases activés et de peptides et on laisse sous agitation constante pendant 2 heures à 20 C.
Après deux heures de conjugaison, le mélange est purifié sur gel Superose(E) équilibré en Tpn PBS. Le mélange copolymère de peroxydase - peptide VIH1 est injecté sur la colonne à un débit de 120 ml/heure.
La fraction correspondant au conjugué est récupérée, la concentration est déterminée par lecture de D.O. à 403 nm (91,3 ml.mg-l.cm-l).
Exemple 2:CONJUGUE DE PHOSPHATASE ALCALINE-PEPTIDE VIH1
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1, mais on utilise la phosphatase alcaline purifiée à la place de la peroxydase.
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1, mais on utilise la phosphatase alcaline purifiée à la place de la peroxydase.
Exemple 3:CONJUGUE DE PEROXYDASE-ANTICORPS MONOCLONAL VIHI
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1, mais on utilise un anticorps monoclonal anti HIV 1 (divulgué dans le brevet de Genetic
Systems Corporation, clone déposé VIH-p25-6) à la place du peptide HIV 1.
On effectue le même protocole de préparation que celui décrit dans l'exemple 1, mais on utilise un anticorps monoclonal anti HIV 1 (divulgué dans le brevet de Genetic
Systems Corporation, clone déposé VIH-p25-6) à la place du peptide HIV 1.
Exemple 4: CONJUGUE DE PHOSPHATASE ALCALINE-PEPTIDE VIHl a-copolvmérisation de la phosphatase alcaline en deux étapes:
La phosphatase alcaline à 10-20 mg/ml en tampon triéthanolamine 30 mM, pH 7,6 contenant du chlorure de sodium 3 M, du chlorure de magnésium 1 mM et du chlorure de zinc 0,1 mM, est oxydée par le périodate de sodium (300 moles / mole d'enzyme) pendant 45
minutes à 20"C.
La phosphatase alcaline à 10-20 mg/ml en tampon triéthanolamine 30 mM, pH 7,6 contenant du chlorure de sodium 3 M, du chlorure de magnésium 1 mM et du chlorure de zinc 0,1 mM, est oxydée par le périodate de sodium (300 moles / mole d'enzyme) pendant 45
minutes à 20"C.
On élimine ensuite le periodate en excès par dialyse de la solution d'enzymes oxydées
contre du tampon acétate 10mM pH 5,5 contenant ImM de chlorure de magnésium.
contre du tampon acétate 10mM pH 5,5 contenant ImM de chlorure de magnésium.
Après dialyse, la solution d'enzymes oxydées est divisée en 2 parties égales.
On ajoute à la première partie la PDPH à une concentration finale de 4 mM, la concentration de la phosphatase alcaline étant ajustée à 10 mg/ml. La réaction dure 1 heure sous agitation à 20"C.
On ajoute à la deuxième partie la;MPBH à une concentration finale de 1 mM, la concentration de la phosphatase alcaline étant ajustée à 5 mg/ml. La réaction dure I heure sous agitation à 20"C.
Chacune des solutions d'enzymes est filtrée et purifiée par filtration sur gel en tampon phosphate de sodium 50 mM. pH 7,4. contenant 150 mM de chlorure de sodium.
La fraction activée par la PDPH est réduite par du dithiothréitol (concentration finale 10 mM) pendant 10 minutes puis purifiée à nouveau par filtration sur gel.
La fraction d'enzymes activées par la PDPH après réduction est mélangée à la fraction d'enzymes activées à la MPBH. La réaction de copolymérisation des deux espèces est effectuée à 200C sous agitation pendant 2 à 15 heures selon la taille des copolymères que l'on désire obtenir.
Le contrôle de la copolymérisation est effectué par filtration sur gel sur une colonne analytique remplie de gel PharmaciaB SuperoseB 6 Prep Grad.
Le blocage des réactions est réalisé par additions successives de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 1 niai) et de N-éthylmaléimide (concentration finale 2 mM). Une réduction au borohydrure de sodium ou au cyanoborohydrure de sodium peut être effectuée pour réduire les fonctions carbonyles qui n'ont éventuellement pas réagi et pour stabiliser les fonctions hydrazones créées par la réaction des fonctions carbonyles sur les hydrazides.
La solution d'enzymes polymérisées est purifiée par gel filtration sur colonne préparative dans des conditions similaires au contrôle analytique précédent. La fraction correspondant aux espèces exclues du gel est récupérée et constitue la solution d'enzymes polymérisées. La concentration en protéine est déterminée par dosage BCA (Pierce).
b-couplae:
On effectue le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1.
On effectue le même protocole que celui décrit dans l'exemple 1.
Exemple 5: IMMUNOENZYMOESSAI DU CONJUGUE POD-PEPTIDE VIH1
La détection des anticorps dirigés contre le virus VIR est basée dans notre exemple
sur le principe de la technique immunoenzymatique de type sandwich. Le test repose sur
l'utilisation d'une phase solide préparée avec des antigènes purifiés, dont la glycoprotéine
d'enveloppe du virus VIT 1.
La détection des anticorps dirigés contre le virus VIR est basée dans notre exemple
sur le principe de la technique immunoenzymatique de type sandwich. Le test repose sur
l'utilisation d'une phase solide préparée avec des antigènes purifiés, dont la glycoprotéine
d'enveloppe du virus VIT 1.
Les sérums à étudier (0.1 ml d'échantillon dilué au 3/4) sont distribués dans les cupules de la microplaque. Après incubation de 30 minutes, le conjugué marqué à la peroxydase est ajouté après lavage. La présence de l'enzyme immobilisée sur les complexes est révélée par incubation en présence du substrat après élimination de la fraction de conjugué restée libre. Après arrêt de la réaction, la lecture s'effectue au spectrophotomètre à 450/620 nm. La présence ou l'absence des anticorps anti-VIH1 est déterminée en comparant pour chaque échantillon l'absorbance enregistrée à celle de la valeur seuil calculée (dans ce cas, moyenne des négatifs + 0,1).
Le tableau suivant montre les résultats comparatifs obtenus à l'aide de cinq conjugués fabriqués dans des conditions différentes (couplage d'un peptide mimant l'épitope immunodominant de la glycoprotéine d'enveloppe du virus VIHI/acides aminés 584-609, isolat BRU, à la peroxydase).
Les différents conjugués préparés sont décrits ci après:
-Conjutué A: La peroxydase est non traitée et le peptide est couplé à l'aide d'un réactif bifonctionnel (la méthode de couplage est celle de l'exemple 1).
-Conjutué A: La peroxydase est non traitée et le peptide est couplé à l'aide d'un réactif bifonctionnel (la méthode de couplage est celle de l'exemple 1).
-ConiuRué B: Le peptide est couplé à la peroxydase suivant la méthode Nakane et al (J.Histochem.Cytochem, 197492,1084-1091) modifiée de la raçon suivante: 28 mg de peroxydase sont oxydés avec 19,7 mg de periodate de sodium pendant 1 heure 30 minutes. 1 mg de peptide est mis en contact avec 4 mg de peroxydase oxydée pendant 3 heures. Ce protocole ne modifie pas le couplage en tant que tel selon la méthode Nakane.
-Coniunué C: La peroxydase est préparée suivant la méthode décrite dans la demande de brevet publiée sous le numéro EP 601318, et couplée au peptide à l'aide d'un réactif bifonctionnel selon la méthode décrite dans le procédé de ladite demande.
-Coniunué D: Le conjugué est préparé suivant la méthode décrite dans l'exemple 1, en utilisant comme réactif bifonctionnel l'hexanediamine- 1,6.
Conjugué E: Le conjugué est préparé suivant la méthode décrite dans l'exemple 1.
Dans les tableaux qui suivent, les résultats donnés sont des valeurs de densité optique lues en effectuant des essais immunoenzymatiques suivant le protocole décrit et en utilisant les conjugués A,B,C,D et E décrits.
Les sérums utilisés sont des échantillons des panels K, U et Q fournis par Boston
Biomedica Inc.. et sont également 31 sérums de patient normaux et négatifs pour la détection du VIH.
Biomedica Inc.. et sont également 31 sérums de patient normaux et négatifs pour la détection du VIH.
<tb> <SEP> Panel <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> K1 <SEP> 0,047 <SEP> 0.053 <SEP> 0,062 <SEP> 0.046 <SEP> 0,122
<tb> <SEP> K2 <SEP> 0.095 <SEP> 0.161 <SEP> 0,106 <SEP> 0,835 <SEP> 1,651
<tb> <SEP> K3 <SEP> 0,195 <SEP> 0.310 <SEP> 0,161 <SEP> 2,106 <SEP>
<tb> <SEP> K4 <SEP> 0,243 <SEP> 0,463 <SEP> 0,399 <SEP> 2,816 <SEP> > 3
<tb> Panel <SEP> U <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> U1 <SEP> 0,045 <SEP> 0,112 <SEP> 0,298 <SEP> 2,407 <SEP> > 3
<tb> U2 <SEP> 0,226 <SEP> 1,687 <SEP> > 3 <SEP> > 3 <SEP> > 3
<tb> Panel <SEP> Q <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> Q3 <SEP> 0,050 <SEP> 0,044 <SEP> 0,049 <SEP> 0,055 <SEP> 0,125
<tb> Q4 <SEP> 0,066 <SEP> 0,368 <SEP> 1,052 <SEP> 2,816 <SEP> > 3
<tb> Q5 <SEP> 0,125 <SEP> 0,404 <SEP> 1,064 <SEP> 2,906 <SEP> > 3
<tb> Q6 <SEP> 0,116 <SEP> 0,382 <SEP> 1,009 <SEP> 2,836 <SEP> > 3
<tb> 6 <SEP> 1/2 <SEP> 0,100 <SEP> 0,241 <SEP> 0,743 <SEP> 2,191 <SEP> > 3
<tb> 6 <SEP> 1/4 <SEP> 0,073 <SEP> 0,208 <SEP> 0,569 <SEP> 2,133
<tb> Q6 <SEP> 1/8 <SEP> 0,055 <SEP> 0,135 <SEP> 0,356 <SEP> 1,523 <SEP> 2,837
<tb> Q6 <SEP> 1/16 <SEP> 0,047 <SEP> 0,092 <SEP> 0,218 <SEP> 0,965 <SEP> 1,945
<tb> Q6 <SEP> 1/32 <SEP> 0,047 <SEP> 0,081 <SEP> 0,163 <SEP> 0,668 <SEP> 1,515
<tb> Q6 <SEP> l/64 <SEP> 0,042 <SEP> 0.064 <SEP> 0,118 <SEP> 0,430 <SEP> 0,772
<tb> <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> moyenne <SEP> 0,039 <SEP> 0,047 <SEP> 0,040 <SEP> 0,031 <SEP> 0,037
<tb> <SEP> (n=31)
<tb> <SEP> valeur <SEP> seuil <SEP> 0,139 <SEP> 0,147 <SEP> 0,140 <SEP> 0,131 <SEP> 0,137
<tb> <SEP> (vs)
<tb>
<tb> <SEP> K1 <SEP> 0,047 <SEP> 0.053 <SEP> 0,062 <SEP> 0.046 <SEP> 0,122
<tb> <SEP> K2 <SEP> 0.095 <SEP> 0.161 <SEP> 0,106 <SEP> 0,835 <SEP> 1,651
<tb> <SEP> K3 <SEP> 0,195 <SEP> 0.310 <SEP> 0,161 <SEP> 2,106 <SEP>
<tb> <SEP> K4 <SEP> 0,243 <SEP> 0,463 <SEP> 0,399 <SEP> 2,816 <SEP> > 3
<tb> Panel <SEP> U <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
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<tb> U2 <SEP> 0,226 <SEP> 1,687 <SEP> > 3 <SEP> > 3 <SEP> > 3
<tb> Panel <SEP> Q <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> Q3 <SEP> 0,050 <SEP> 0,044 <SEP> 0,049 <SEP> 0,055 <SEP> 0,125
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<tb> Q6 <SEP> 1/32 <SEP> 0,047 <SEP> 0,081 <SEP> 0,163 <SEP> 0,668 <SEP> 1,515
<tb> Q6 <SEP> l/64 <SEP> 0,042 <SEP> 0.064 <SEP> 0,118 <SEP> 0,430 <SEP> 0,772
<tb> <SEP> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E
<tb> <SEP> moyenne <SEP> 0,039 <SEP> 0,047 <SEP> 0,040 <SEP> 0,031 <SEP> 0,037
<tb> <SEP> (n=31)
<tb> <SEP> valeur <SEP> seuil <SEP> 0,139 <SEP> 0,147 <SEP> 0,140 <SEP> 0,131 <SEP> 0,137
<tb> <SEP> (vs)
<tb>
Les résultats des tests rassemblés dans les tableaux montrent que seuls les conjugués D et E permettent de détecter la positivité à la fois des sérums K2 et Q6 dilués au 1/64.
Il apparait donc que les conjugués selon l'invention permettent de donner une sensibilité de détection meilleure que ceux connus de l'art antérieur.
Claims (13)
- 2-Conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que le copolymère d'enzymes est obtenu à partir d'enzymes de marquage et de diamines, ou d'enzymes de marquage et de réactifs hétérobifonctionnels différents liés entre eux.
- 3 -Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diamine est choisie parmi une diamine à chaine linéaire, ramifiée ou aromatique comprenant de 2 à 12 atomes de carbone.l-Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diamine est le phénylêne-1,4-diamine.
- 5-Conjugué selon la revendication 2, caractérisé en ce que les réactifs hétérobifonctionnels différents sont deux réactifs hétérobifonctionnels respectivement choisis parmi la 2-mercapto-éthylamine ou le 3-( 2-pyridyldithio) propionyl hydrazide, et le 4-(N-maléimidométhyl) cyclohexane-l-carboxyl hydrazide ou le 4-(4-Nmaléimidophényl) butyryl hydrazide.
- 6-Conjugué selon la revendication 2. caractérisé en ce que les proportions d'enzymes et de diamines ou de réactifs hétérobifonctionnels sont respectivement de 1/1-10 équivalents molaires, et de préférence 1/4-6 équivalents molaires.
- 7-Conjugué selon la revendication 1 caractérisé en ce que le copolymère d enzymes comprend n x enzymes, n étant un entier compris entre 3 et 20. de préférence un entier de 5 à 15.
- 8-Conjugué selon l une quelconque des revendications précédentes. caractérisé en ce que enzyme copolymérisée est la peroxydase de raiford ou la phosphatase alcaline9-Conjugué selon la reendicatin i . caractérisé en ce que le copolymère d'enzymes cst couplé aux substances d activité immunologique par l'intermédiaire d'un réactif homo LI hetérobifonctionnel.I ?-( on ugué selon la revenJicatioi I ou () . caractérise cu cc que les proportions molaires respectives du copolymère J'c', rnes et des substances à activité immunologique sont de 10/1 à 1/10 ( unité enzymatique ' unité de substance à activité immunologique), de préference 3/1 à 1/3. et de préference encore 1/1.ll-Conjugué selon lune quelconque des revendications 1, 9 et 10, caractérisé en ce que la substance à activité immunologique est un peptide VIHI. un peptide VIH2. un peptide VHC ou un anticorps monoclonal-anti-VIHî.
- 12-Procédé de préparation de conjugué selon la revendication 1, caractérisé en ce que:a. on copolyménse les enzymes de marquage par l'intermédiaire de leurs carbohydrates préalablement oxydés,b. puis on effectue le couplage du copolymère d'enzymes avec les substances à activité immunologique
- 13-Procédé selon la revendication 12, caractérisée en ce que pour effectuer la copolymérisation on fait réagir les enzymes avec une diamine.
- 14-Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que pour effectuer la copolymérisation on fait réagir séparément dans une première étape les enzymes avec deux réactifs hétérobifonctionnels différents, puis dans une deuxième étape on fait réagir entre eux les produits de réaction.
- 15-Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que la copolymérisation est controlée puis arrêtée par l'ajout d'un agent réducteur choisi parmi le borohydrure de sodium et le cyanoborohydrure de sodium.
- 16-Procédé selon la revendication 12 ou 14. caractérisé en ce que la copolymérisation est controlée puis arrêtée par l'ajout d'agents bloquants des réactifs hétérobitonctionnels.
- 17-Procédé selon la revendication 12. caractérisé en ce que dans l'étape du couplage du copolymère d'enzymes avec les substances à activité immunologique. la concentration du réactif homo ou héterobifonctionnel est en exclues par rapport à ta concentration du copolynère d'enzymes.IS-[Itihsatioll du con. fugue selon la revendication I pour la détermination immunr,- lot'q"C.
- 19-Kit de diagnostic pour la détermination immunologique. caractérisé en ce qu'il comprend un conjugué immunoenzymatique selon la revendication 1.
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|---|---|---|---|
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| PT96901840T PT752102E (pt) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugado imunoenzimatico seu processo de preparacao e as suas aplicacoes |
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| DE69610948T DE69610948T2 (de) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatisches konjugat, herstellungsverfahren dafür und verwendungen |
| AT96901840T ATE197645T1 (de) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatisches konjugat, herstellungsverfahren dafür und verwendungen |
| CA002184636A CA2184636C (fr) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| ES96901840T ES2153090T3 (es) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugado inmunoenzimatico, su procedimiento de preparacion y sus aplicaciones. |
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| DK96901840T DK0752102T3 (da) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatisk konjugat, fremgangsmåde til fremstilling af konjugatet og anvendelse af dette. |
| EP96901840A EP0752102B1 (fr) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Conjugue immunoenzymatique, son procede de preparation et ses applications |
| IL11686396A IL116863A (en) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatic conjugate its preparation and use |
| US08/714,110 US6027874A (en) | 1995-01-23 | 1996-01-23 | Immunoenzymatic conjugate, method for its productions, applications thereof |
| GR20010400042T GR3035226T3 (en) | 1995-01-23 | 2001-01-11 | Immunoenzymatic conjugate, preparation method therefor and uses thereof |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
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Publications (2)
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| FR2734365A1 true FR2734365A1 (fr) | 1996-11-22 |
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