FR2726278A1 - Ovoglycoproteine et agents pour la separation chromatographique comprenant celle-ci - Google Patents
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Abstract
Ovoglycoprotéine et agent de résolution pour chromatographie comprenant ladite ovoglycoprotéine. Cette ovoglycoprotéine a un poids moléculaire de 30000, une séquence d'acides aminés de 15 résidus à partir de l'extrémité N-terminale représentée par T-E-S-PX-S-A-P-L-V-P-A-D-M-D (dans laquelle X représente un résidu cystéine ou un résidu d'acide aminé auquel est liée une chaîne glucidique) et une teneur en glucides d'environ 25 % et elle est dépourvue d'activité inhibitrice de la trypsine. Cet agent de résolution pour chromatographie comprend un support et l'ovoglycoprotéine décrite ci-dessus liée à ce support. Cet agent de résolution des isomères optiques est stable et très résistant à la détérioration par des solvants organiques. Il possède d'excellentes propriétés rhéologiques et permet une fréquence élevée de chargement d'échantillon et une résolution efficace des isomères optiques d'un composé chiral.
Description
La présente invention a pour objet une nouvelle ovoglycoprotéine et un
agent pour la séparation chromatographique et plus spécifiquement, une ovoglycoprotéine ayant une capacité de reconnaissance optique et un agent servant de phase stationnaire pour la séparation chromatographique comprenant un support et l'ovoglycoprotéine liée à
ce support.
Il existe une très forte demande pour le développement des techniques permettant la résolution des isomères optiques d'un composé chiral possédant un atome de carbone asymétrique, en particulier, dans le domaine des médicaments. Cela s'explique parce qu'il a été montré, comme principe général, que l'un des nombreux isomères optiques constituant un mélange racémique possède une efficacité médicale particulièrement remarquable, telle qu'une action pharmacologique significative et/ou une biodisponibilité marquée ou possède, au contraire, une toxicité élevée et il a souvent été observé qu'un tel médicament devrait raisonnablement être administré à des patients sous la forme d'un isomère optique, donc après résolution, plutôt que sous la forme d'un mélange racémique
de celui-ci et que cette administration a souvent un effet thérapeutique très important.
Dans la présente demande, l'expression "résolution" désigne la séparation
d'iomères optiques à partir d'un mélange de ceux-ci.
De nombreuses méthodes de laboratoire ont été conventionnellement décrites pour la résolution des isomères optiques, mais la plupart de ces méthodes ne peuvent être utilisées à l'échelle industrielle et on pense que la mise au point d'une telle méthode utilisable à l'échelle industrielle est un problème technique assez difficile à résoudre. Cependant, avec les progrès de la technique de la chromatographie sur colonne, un nombre croissant de méthodes permettant la résolution des isomères optiques sont progressivement apparues, en particulier, la chromatographie liquide et on trouvera des exemples de celles-ci dans la liste des articles 1) à 7) ci-après: 1) Joergen Hermnansson, Journal of Chromatography, 1985, 325, pp. 379-384; 2) S. Allenmark et al., Journal of Chromatography, 1983, 264, pp. 63-68; 3) S. Allenmark et al., Journal of Chromatography, 1982, 237, pp. 473-477; 4) Publication du brevet japonais non examiné, n Sho 6041619; ) T. Miwa et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1987, 35, pp. 682-686; 6) J. Haginaka et al. , Chromatographia, 1990, 29, pp. 587-592; et
7) Publication du brevet japonais non examiné n Sho 64-3129.
Parmi les articles ci-dessus, l'article 1) décrit une technique qui fait appel à une axl-glycoprotéine acide chirale. Les articles 2) et 3) décrivent des méthodes permettant la résolution d'isomères optiques qui font appel à des phases stationnaires comprenant de la sérumalbumine bovine liée à de la silice et de l'Agarose, respectivement. L'article 4) décrit une méthode de résolution d'isomères optiques utilisant un orosomucoïde ou un analogue fonctionnel de celui-ci. Les articles 5) et 6) décrivent des méthodes de résolution d'isomères optiques utilisant une phase stationnaire comprenant un support et un ovomucoide lié au support. L'article 7) décrit une méthode de résolution d'isomères optiques qui fait appel à une phase stationnaire comprenant un support et de l'avidine liée
au support.
Cependant, les substances utilisées dans les techniques décrites dans les articles 1) à 4) et 7) sont, en général, onéreuses. En outre, les méthodes de résolution décrites ici comprennent principalement des procédés de chromatographie liquide dans lesquels une grande quantité de solvant organique est utilisée et en conséquence, les substances à utiliser doivent être stables ou résistantes à la détérioration par les solvants
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organiques, mais les substances telles que l'albumine ou l'orosomucoïde ne remplissent pas ces conditions de manière satisfaisante. En outre, un agent de résolution d'isomères optiques qui comprend une protéine immobilisée permet uniquement une faible fréquence de chargement d'échantillon: Aussi, un objet de la présente invention est de fournir une nouvelle protéine
permettant la résolution efficace des isomères optiques d'un composé chiral.
Un autre objet de la présente invention est de fournir un agent pour la résolution chromatographique des isomères optiques d'un composé chiral, qui ne soit pas onéreux, et qui soit stable et très résistant à la détérioration par un solvant organique, présente une excellente capacité de reconnaissance optique et une fréquence élevée de
chargement d'échantillon et permet une résolution efficace de ces isomères optiques.
Les inventeurs de la présente invention ont effectué différentes études afin d'atteindre les objectifs décrits ci-dessus. Les inventeurs ont ainsi trouvé qu'une ovoglycoprotéine aisément disponible à partir du blanc d'oeuf est excellente en ce qui concerne la capacité de reconnaissance optique, présente une fréquence élevée de chargement d'échantillon et est stable et résistante à la détérioration par un solvant
organique.
Selon un des aspects de la présente invention, on fournit une ovoglycoprotéine qui a un poids moléculaire d'environ 30 000, déterminé à l'aide d'un spectromètre de masse de type "à temps de vol" à ionisation par désorption laser assistée par matrice, une séquence d'acides aminés de 15 résidus à partir de l'extrémité N-terminale représentée par T-E-S-P-X-S-A-P-L-V-P-A-D-M-D (dans laquelle X représente un résidu cystéine ou un résidu d'acide aminé auquel est liée une chaîne glucidique) et une teneur en
glucide d'environ 25 % en poids et qui n'a pas d'activité inhibitrice de la trypsine.
L'invention concerne en particulier une protéine telle que définie cidessus
sous forme purifiée.
Selon un autre aspect de la présente invention, on fournit un agent de résolution pour chromatographie qui comprend une phase stationnaire, comprenant un support et une ovoglycoprotéine telle que définie précédemment dont la structure
moléculaire peut être partiellement modifiée et qui est liée au support.
L'invention s'étend à l'utilisation d'une ovoglycoprotéine analogue dont la structure moléculaire est partiellement modifiée, mais ayant conservé les propriétés de
reconnaisance optique de la protéine non modifiée.
L'agent pour la résolution chromatographique des isomères optiques, comprend donc une phase stationnaire qui comporte un support et une ovoglycoprotéine liée au support; ou un support et une ovoglycoprotéine immobilisée sur le support et dont la structure moléculaire est partiellement modifiée; ou un support et une ovoglycoprotéine
dont la structure moléculaire est partiellement modifiée et qui est liée au support.
La Figurel montre un chromatogramme illustrant l'isolement de
l'ovoglycoprotéine à partir de poudre de blanc d'oeuf précipitée à l'acétone.
La Figure 2 montre des chromatogrammes des fractions SP-1, SP-2 et SP-3
séparées à partir de poudre de blanc d'oeuf précipitée à l'acétone.
La Figure 3 montre un diagramme d'enregistrement illustrant les résultats de l'analyse de poids moléculaire de l'ovoglycoprotéine réalisée à l'aide d'un spectromètre
de masse.
La Figure 4 montre un chromatrogramme illustrant le résultat obtenu par la résolution de l'énantiomère de benzoïne, en utilisant une colonne garnie avec de
l'ovoglycoprotéine immobilisée.
La Figure 5 montre un chromatogramme illustrant le résultat obtenu par la résolution de l'énantiomère du maléate de chlorphéniramine, en utilisant une colonne
garnie avec une ovoglycoprotéine immobilisée.
La Figure 6 montre un chromatogramme illustrant le résultat obtenu par la résolution de l'énantiomère du kétoprofène, en utilisant une colonne garnie avec une
ovoglycoprotéine immobilisée.
La Figure 7 montre un chromatogramme illustrant le résultat du test de fréquence de chargement d'échantillon observé lors de la résolution de l'énantiomère de benzoïne. La présente invention est décrite plus en détail ci-après, en se référant aux
modes de réalisation préférés.
L'ovoglycoprotéine de la présente invention peut être préparée par les
méthodes suivantes.
Préparation de l'ovoglycoprotéine 1) Séparation de la poudre de blanc d'oeuf précipitée à l'acétone On ajoute à 450 ml de blanc d'oeuf, 900 ml d'un mélange 1:2 (volume/volume) d'acide trichloroacétique 0,5 Mlacétone (pH 3,5) et on agite le mélange résultant à 4 C pendant 4 heures. On centrifuge le mélange à 4 C et à 5000 tpm pendant minutes afin d'éliminer les précipités. On ajoute deux volumes d'acétone froid au surnageant et on agite le mélange pendant 15 minutes, puis on centrifuge à 4 C et à 5000 tpm, pendant une heure, afin d'éliminer le surnageant résultant. On dissout les précipités résultants dans de l'eau désionisée et distillée, puis on dialyse pendant un jour et une nuit entiers et on lyophilise. La poudre précipitée à l'acétone résultante est utilisée comme telle
dans l'isolement suivant.
2) Isolement de l'ovoglycoprotéine à partir de la poudre précipitée à l'acétone On dissout la poudre précipitée à l'acétone (environ 3 g) dans CH3COONH4 mM (pH 4,6), puis on filtre la solution résultante. On fractionne le filtrat par
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chromatographie échangeuse d'ions et on obtient les fractions SP-I, SP-2 et SP-3. Les chromatogrammes des fractions résultantes sont présentés à la Figure 1. On dessale, puis on lyophilise chacune des fractions. Les conditions utilisées pour la chromatographie échangeuse d'ions sont les suivantes: Colonne: SP-Sépharose (longueur 6 cm; diamètre interne: 5 cm) Eluant: Eluant A 250 ml de CH3COONH4 10 mM (pH 4,6); Eluant B 250 ml de CH3COONH4 500 mM (pH 4,6); Eluant C 250 ml de CH3COONH4 700 mM (pH 4,6) (On élue la colonne avec les éluants A et B, en 5 heures, selon la technique de
l'élution sur gradient linéaire, puis on élue avec l'éluant C).
Débit: 100 ml/h
Détection: absorbance à 280 nm.
3) Chromatographie liquide en phase inverse de l'ovoglycoprotéine (Figure 2) Dans la Figure 2, A désigne la fraction SP-1, B la fraction SP-2 et C la fraction
SP-3.:
La fraction SP-1 contient l'ovomucoide et une substance non identifiée, la fraction SP-2 correspond à l'ovomucoïde et la fraction SP-3 s'avère être une
ovoglycoprotéine en fonction des résultats obtenus en 4) comme décrit en détail ci-après.
La chromatographie en phase inverse est réalisée selon les conditions suivantes: Colonne: Cosmosil 5C 18-AR (longueur: 250 mm; diamètre interne: 4,6 mm) Eluant: éluant A H20/CH3CN (80/20, volume/volume) (contenant de l'acide trifluoroacétique 0,1 %) Eluant B H20/CH3CN (20/80, volume/volume) (contenant de l'acide trifluoroacétique 0,1 %) (On élue la colonne avec les éluants en commençant avec 0 % d'éluant B au temps zéro et en atteignant 100 % d'éluant B après 90 minutes, selon la technique du
io gradient d'élution linéaire).
Débit: 1,0 ml/min Détection: absorbance à 280 nm 4) Propriétés caractéristiques de la fraction SP-3 (i) Poids moléculaire de la fraction SP-3 Le poids moléculaire de celle-ci est d'environ 30000 déterminé à l'aide d'un spectrométre de masse de type "à temps de vol" à ionisation par désorption laser assistée
par matrice (MALDI-TOF) (Voir Figure 3).
(ii) Teneur glucidique de la fraction SP-3 La fraction SP-3 comprend 15, 1 % de glucosamine, 7,3 % d'hexose et 2,8 %
d'acide sialique et a une teneur en glucides d'environ 25 %.
(iii) Activité inhibitrice de la fraction SP-3 sur une enzyme
La fraction SP-3 n'a pas d'activité inhibitrice sur la trypsine.
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(iv) Séquence en acides aminés N-terminale de la fraction SP-3
La séquence des 15 résidus d'acides aminés de la partie N-terminale est T-E-
S-P-X-S-A-P-L-V-P-A-D-M-D (dans laquelle X représente un résidu cystéine ou un résidu d'acide aminé auquel est liée une chaîne glucidique). La recherche des séquences d'acides aminés dans la banque de données NBRFPIR (National Biomedical Research Foundation Protein Information Resource) confirme que la séquence d'acides aminés ci-dessus diffère de la séquence des acides aminés dans la partie N-terminale de l'ovomucoide connu et on n'a trouvé aucune séquence d'acides aminés identique ou similaire à celle-ci. En
conséquence, on peut conclure que la fraction SP-3 est une nouvelle ovoglycoprotéine.
Le support utilisé dans la présente invention peut être une substance quelconque qui peut être liée à l'ovoglycoprotéine dont la structure moléculaire peut être partiellement modifiée pour former une phase stationnaire. L'agent de résolution des isomères optiques par chromatographie selon la présente invention est principalement utilisé en chromatographie liquide. Les exemples de supports utilisables comme agent en chromatographie liquide comprennent le gel de silice, les verres, la cellulose, les
matériaux carbonés et les polymères synthétiques.
L'ovoglycoprotéine peut être liée à de tels supports par des méthodes actuellement utilisées pour former des phases stationnaires, par exemple, par une méthode qui comprend la liaison de l'ovoglycoprotéine à un gel de silice aminopropyle ou un polymère synthétique ayant des groupes amino liés à celui-ci servant de support et en utilisant du carbonate de N,N'-disuccinimidyle comme agent de réticulation; une méthode comprenant la liaison de l'ovoglycoprotéine à une substance à un verre comme support, en utilisant le triméthoxysilane de 3-glycidoxypropyle comme agent de réticulation; ou une méthode comprenant l'activation de la cellulose utilisée comme support, avec du bromure
de cyanogène, en liant ensuite l'ovoglycoprotéine à celle-ci.
Les molécules de protéines sont en général modifiées par une méthode chimique, enzymatique ou physique. Plus spécifiquement, une molécule de protéine peut être modifiée chimiquement en faisant réagir le groupe amino, les groupes imidazolyle et/ou carboxyle de la molécule de protéine avec des aldéhydes, des anhydrides d'acide
et/ou des alcools pour former ainsi des bases de Schiff, des groupes imidazolyle N-
substitués et/ou des résidus d'ester. Les réactions telles que la modification de groupes fonctionnels de la protéine, l'oxydation et la réduction de la molécule de protéine et/ou l'élimination d'une partie de' la molécule peuvent également être utilisées dans des conditions douces, en utilisant diverses fonctions enzymatiques. Par exemple, on peut préparer l'ovoglycoprotéine partiellement modifiée
avec du glutaraldéhyde par la méthode suivante.
On introduit l'ovoglycoprotéine et le glutaraldéhyde dans un tampon phosphate (pH 6,8), puis on agite à 30 C pendant 15 heures et on purifie l'ovoglycoprotéine résultante (de type non réduit) ou, si on le désire, une ovoglycoprotéine (de type réduit), obtenue par réduction de l'ovoglycoprotéine modifiée avec le glutaraldéhyde résultante (de type non réduit) avec du borohydrure de sodium dans du
tampon phosphate (pH 6,8) en agitant à 4 C pendant 12 heures.
La méthode de purification de l'ovoglycoprotéine modifiée avec le glutaraldéhyde n'est pas limitée à une méthode spécifique et peut être réalisée par une méthode quelconque habituellement utilisée. Par exemple, l'ovoglycoprotéine modifiée avec le glutaraldéhyde peut être purifiée en éliminant le glutaraldéhyde qui n'a pas réagi et le borohydrure de sodium de la solution de la réaction précédente à l'aide d'une colonne de
chromatographie Sephadex G25.
En outre, on peut obtenir une ovoglycoprotéine qui est partiellement modifiée avec un diol par addition de l'ovoglycoprotéine et de 2,3époxypropanol à un tampon phosphate (pH 8,0), en agitant le mélange à température ambiante pendant 24
heures, puis en purifiant le produit de la réaction.
En outre, on peut obtenir une ovoglycoprotéine partiellement acylée en introduisant l'ovoglycoprotéine et un anhydride d'acide correspondant tel que de l'anhydride acétique dans un tampon borate (pH 8,5), en agitant le mélange à 25 C pendant
à 60 minutes, puis en purifiant l'ovoglycoprotéine acylée résultante.
On prépare une phase stationnaire comprenant un support et une ovoglycoprotéine dont la structure moléculaire est partiellement modifiée et liée au support, par exemple, par une méthode comprenant une étape consistant à lier par l'intermédiare de liaisons covalentes ou de liaisons ioniques une ovoglycoprotéine, dont la structure moléculaire a préalablement été partiellement modifiée, au support ou par une méthode comprenant les étapes consistant à lier l'ovoglycoprotéine au support, puis à
modifier l'ovoglycoprotéine liée au support par une méthode discutée cidessus.
On peut lier à un support une ovoglycoprotéine dont la molécule est partiellement modifiée, afin d'obtenir une phase stationnaire, par toute méthode actuellement utilisée pour former des phases stationnées. Plus spécifiquement, l'ovoglycoprotéine dont la molécule est partiellement modifiée, peut être liée à un support, par exemple, en préparant un gel de silice d'aminopropyle ou un polymère synthétique portant des groupes amino liés à celui-ci en tant que support et en liant l'ovoglycoprotéine au support en utilisant du glutaraldéhyde ou du carbonate de N,N'-disuccinimidyle comme agent de réticulation; en liant l'ovoglycoprotéine au gel de silice ou au verre ou au
matériau carboné utilisé comme support à l'aide de triméthoxysilane de 3-
glycidoxypropyle comme agent de réticulation; ou en activant avec du bromure de
cyanogène de la cellulose utilisée comme support, puis en liant l'ovoglycoprotéine à celle-
ci. L'ovoglycoprotéine modifiée avec du glutaraldéhyde peut être liée à un gel
de silice-aminopropyle utilisé comme support, par exemple, par la méthode suivante.
On dissout de l'ovoglycoprotéine modifiée avec le glutaraldéhyde dans un tampon hydrogénocarbonate de sodium (pH 6,8). On dissout, ou on met en suspension séparément un gel de silice-aminopropyle et du carbonate de N, N'-disuccinimidyle dans du tampon hydrogénocarbonate de sodium (pH 6,8), puis on agite le système réactionnel pendant une nuit et on effectue un lavage préparatif à l'eau afin d'obtenir une suspension de gel de silice-aminopropyle activé. On ajoute la solution d'ovoglycoprotéine modifiée par
du glutaraldéhyde préparée ci-dessus à la suspension résultante de gel de silice-
aminopropyle activé, puis on agite le mélange et on le lave à l'eau de façon à obtenir un agent de résolution des isomères optiques d'un composé chiral qui comprend l'ovoglycoprotéine modifiée par du glutaraldéhyde liée par l'intermédiaire d'un agent de
réticulation à un gel de silice.
L'ovoglycoprotéine préalablement liée au support peut être modifiée
chimiquement par la méthode suivante.
Par exemple, on dissout, ou on met en suspension, du carbonate de N,N'-
disuccinimidyle et un support comprenant un polymère synthétique hydrophile (tel qu'un copolymère d'alcool polyvinylique) dans lequel on a introduit une polyamine telle que la pentaéthylhexamine, dans du tampon hydrogénocarbonate de sodium ayant un pH 6,8, puis on agite le mélange pendant une nuit et on effectue un lavage préparatif à l'eau du même
produit afin d'obtenir une suspension de polymère synthétique activé.
On dissout séparément l'ovoglycoprotéine dans du tampon hydrogénocarbonate de sodium ayant un pH de 6,8, et on obtient une solution de celle-ci que l'on ajoute à la suspension de polymère synthétique activé afin de former un agent de
résolution constitué par le polymère auquel l'ovoglycoprotéine est liée.
On introduit l'agent de résolution et le glutaraldéhyde dans un tampon phosphate (pH 6,8), puis on agite le mélange à 30 C pendant 15 heures, en effectuant éventuellement ensuite une réduction de l'ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde résultante (de type non réduit), avec du borohydrure de sodium dans un tampon phosphate (pH 6,8) en agitant le système réactionnel à 4 C pendant 12 heures afin d'obtenir un agent pour la résolution d'isomères optiques comprenant de l'ovoglycoprotéine (de type non réduit) modifiée par le glutaraldéhyde ou de l'ovoglycoprotéine (de type réduit) modifiée par le glutaraldéhyde qui est liée au polymère synthétique par l'intermédiaire des liaisons amido et de l'agent de réticulation. Une telle modification chimique de l'ovoglycoprotéine permet une amélioration sensible de la durée de vie de la colonne (nombre d'injections d'échantillons), colonne utilisée pour la résolution des isomères optiques dans laquelle
l'ovoglycoprotéine est utilisée sous la forme d'une phase stationnaire.
1 2
12 2726278
Comme discuté ci-dessus en détail, la présente invention a pour objet l'ovoglycoprotéine ou l'ovoglycoprotéine dont la structure moléculaire est partiellement modifiée, utilisée pour la résolution des isomères optiques d'un composé chiral et l'invention n'est pas particulièrement limitée, par exemple, par les types de supports utilisés, les méthodes de liaison de l'ovoglycoprotéine au support et/ou les méthodes de modification de la structure moléculaire de celle-ci. L'agent de résolution de la présente invention comprend les phases stationnaires précédentes en tant que composant essentiel, mais peut comprendre simultanément des agents de résolution conventionnels choisis de façon appropriée tels que le gel de silice, les verres, la cellulose, les matériaux carbonés
et/ou les polymères, pour améliorer la capacité de résolution.
Le terme "isomères optiques" utilisé ici signifie les composés chiraux qui ont un carbone asymétrique dans la molécule et de nombreux médicaments appartiennent à une telle catégorie de composés chiraux. Des exemples de tels médicaments sont la chlorphéniramine, chlorprénaline, pindolol, vérapamil, propanolol, dimétindène, éthiazide, oxazepam et flurbiprofène. Ces composés comprennent chacun plusieurs isomères optiques qui forment un mélange racémique composé d'énantiomères. En particulier, l'agent de résolution de la présente invention peut effectivement être appliqué à ces mélanges racémiques afin de séparer chacun des mélanges racémiques en ses isomères
optiques constituants.
L'agent de résolution de la présente invention est principalement utilisé en chromatographie liquide. Aussi, l'agent de résolution peut être utilisé selon les opérations habituelles de chromatographie liquide. Par exemple, on garnit la colonne avec l'agent de résolution, on y dépose un mélange racémique formé des isomères optiques correspondants, puis on élue la colonne avec une phase mobile comprenant une solution tampon telle qu'un tampon phosphate ou un tampon comprenant, par exemple, de l'éthanol ou de l'isopropanol, afin d'obtenir la résolution des isomères optiques désirés, en se basant
sur la différence des temps de rétention entre les différents isomères optiques.
La présente invention est décrite plus en détail ci-après en se référant aux Exemples d'utilisation non limitatifs suivants. Les effets pratiques obtenus avec la présente
invention sont également discutés en détail en se référant aux Exemples de Tests ci-après.
"3 2726278
Exemple Comparatif 1 A 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0, 1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave avec de l'eau afin d'obtenir une suspension de gel de silice-aminopropyle activé. Séparément, on dissout 2 g de la fraction SP-1 dans 30 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH
6,8) afin d'obtenir une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-
dessus afin d'obtenir un agent de résolution portant SP-1 immobilisé, constitué par du SP-1 lié au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques. Exemple Comparatif 2 A 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0, 1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave avec de l'eau afin d'obtenir une suspension de gel de silice-aminopropyle activé. Séparément, on dissout 2 g de la fraction SP-2 dans 30 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH
6,8) afin d'obtenir une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-
dessus afin d'obtenir un agent de résolution portant SP-2 immobilisé, constitué par du SP-2 lié au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques. Exemple Comparatif 3 A 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave avec de l'eau afin d'obtenir une suspension de gel de silice- aminopropyle activé. Séparément, on dissout de sodium 0,1 M (pH 6,8) afin d'obtenir une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-dessus et on obtient donc un agent de résolution portant l'ovomucoide immobilisé constitué par l'ovomucoïde lié au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques.
Exemple 1
A 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave avec de l'eau afin d'obtenir une suspension de gel de silice-aminopropyle activé. Séparément, on dissout 2 g d'ovoglycoprotéine (la fraction SP-3) dans 30 ml de tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8) afin d'obtenir une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-dessus afin d'obtenir un agent de résolution portant l'ovoglycoprotéine immobilisée de la présente invention, constituée par de l'ovoglycoprotéine liée au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la
résolution d'isomères optiques.
Exemple 2
A du tampon phosphate 0,06 M (pH 6,8), on ajoute 0,1 g de glutaraldéhyde et 2 g de l'ovoglycoprotéine, puis on agite le mélange à 30 C pendant 15 heures et on obtient une ovoglycoprotéine modifiée avec du glutaraldéhyde. Ensuite, on isole l'ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde (de type non réduit) en soumettant le
système réactionnel à une chromatographie sur colonne de Sephadex G25.
L'ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde(de type non réduit) peut ensuite être réduite avec du borohydrure de sodium à 4 C pendant 12 heures dans un tampon phosphate (pH 6,8), afin d'obtenir une ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde,
(de type réduit), qui est ensuite purifiée.
1 5
2726278 -- A 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on
ajoute ensuite 2 g d'agent de résolution utilisable dans des colonnes (tel que Asahi Pack NH2P) dans lesquelles on a introduit une polyamine (telle que la pentaéthylhexamine) dans un gel de polymère hydrophile (copolymère d'alcool polyvinylique) et 2 g de carbonate de N,N'- disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave à l'eau, et on obtient une suspension du gel de polymère synthétique activé. Séparément, on dissout 2 g d'ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde (de type réduit ou de type non réduit) dans 30 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8) et on obtient une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-dessus, on agite le mélange à 30 C pendant 15 heures, on filtre sur filtre de verre et on lave à l'eau et on obtient ainsi l'agent de résolution de la présente invention constitué par une ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde lié à un gel de polymère hydrophile. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution
d'isomères optiques.
Exemple 3
A 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave à l'eau et on obtient une suspension de gel de silice-aminopropyle activé. Séparément, on dissout 2 g de l'ovoglycoprotéine dans 30 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0, 1 M (pH 6,8) et on obtient une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-dessus et
on obtient ainsi un agent de résolution constitué par l'ovoglycoprotéine liée au gel de silice.
Ensuite, à 30 ml de tampon phosphate 0,06 M (pH 6,8), on ajoute 2 g de l'agent de résolution et 0,1 g de glutaraldéhyde, puis on agite le mélange à 30 C pendant 15 heures et on obtient l'agent de résolution (de type non réduit) de la présente invention. Ensuite, on réduit l'agent de résolution ainsi préparé par addition de 0,2 g de borohydrure de sodium et on agite à 4 C pendant 12 heures afin d'obtenir un agent de résolution de la présente invention comprenant une ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde (de type réduit) liée à un gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une
16 2726278 -
colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution
d'isomères optiques.
Exemple 4
A 100 ml de tampon phosphate 0,06 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 0,1 g de glutaraldéhyde, puis on agite le mélange à 30 C pendant 15 heures, on filtre sur filtre de verre, on lave à l'eau et on obtient le gel de silice modifié par le glutaraldéhyde. A 30 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on ajoute le gel de silice modifié par le glutaraldéhyde ainsi préparé et 2 g de l'ovoglycoprotéine pour dissoudre l'ovoglycoprotéine qui y est contenue et la faire réagir avec la substance précédente et pour modifier simultanément l'ovoglycoprotéine avec du glutaraldéhyde afin d'obtenir finalement un agent de résolution de la présente invention
comprenant une ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde liée au gel de silice.
L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acierpour préparer une
colonne en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques.
Exemple 5A
On répète les procédés utilisés dans l'Exemple I en utilisant du gel de silice-
aminopropyle pour obtenir un agent de résolution comprenant une ovoglycoprotéine modifiée par le glutaraldéhyde liée au gel de silice. On sèche l'agent de résolution dans un dessicateur contenant du pentoxyde de phosphore, puis on le met en suspension dans un tampon phosphate 0,06 M (pH 8,0), puis on ajoute 0,5 ml de 2,3-époxypropanol et en agite à température ambiante pendant 24 heures afin d'obtenir un agent de résolution de la présente invention comprenant de l'ovoglycoprotéine modifiée par le diol et liée au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour
préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques.
Exemple 5B
On met en suspension l'ovoglycoprotéine (2 g) dans du tampon phosphate 0,06 M, puis on ajoute 0,5 ml de 2,3-époxypropanol et on agite le mélange à température ambiante pendant 24 heures et on obtient l'ovoglycoprotéine modifiée par le diol. Ensuite, à 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur un filtre de verre et on lave à l'eau et on obtient une suspension de gel de silice- aminopropyle activé. Séparément, on dissout 2 g de l'ovoglycoprotéine modifiée par le diol, préparée ci-dessus, dans 30 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8) afin d'obtenir une solution, on ajoute la solution à la suspension préparée ci-dessus, on agite le mélange à 30 C pendant 15 heures, on filtre sur filtre de verre, on lave à l'eau et on obtient un agent de résolution de la présente invention constitué par l'ovoglycoprotéine modifiée par le diol liée au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour
préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques.
Exemple 6A
On répète les mêmes procédés que ceux de l'Exemple 1 en utilisant du gel de silice-aminopropyle afin d'obtenir un agent de résolution comprenant de l'ovoglycoprotéine liée au gel de silice. A 50 ml de tampon borate 0, 1 M (pH 8,5), on ajoute 1,8 g de l'agent de résolution résultant et une solution d'anhydride acétique (0,225 ml) dans du dioxane (1 ml), puis on agite le mélange à 25 C pendant 30 minutes, on filtre sur filtre de verre, on lave à l'eau et on obtient ainsi l'agent de résolution de la présente invention constitué par de l'ovoglycoprotéine acétylée liée au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne
en vue d'être utilisée pour la résolution d'isomères optiques.
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Exemple 6B
A un tampon borate 0,1 M (pH 8,5), on ajoute 2 g de l'ovoglycoprotéine et une solution d'anhydride acétique (0,225 ml) dans du dioxane (1 ml), puis on agite le mélange à 25 C pendant 30 minutes et on obtient une ovoglycoprotéine acétylée. Ensuite, à 100 ml d'un tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8), on ajoute 3 g de gel de silice-aminopropyle et 2 g de carbonate de N,N'-disuccinimidyle, puis on agite le mélange pendant une nuit, on filtre sur filtre de verre, on lave à l'eau et on obtient une suspension de gel de silice- aminopropyle activé. Séparément, on dissout l'ovoglycoprotéine acétylée (2 g) dans 30 ml de tampon hydrogénocarbonate de sodium 0,1 M (pH 6,8) et on obtient une solution, puis on ajoute la solution à la suspension préparée ci-dessus afin d'obtenir un agent de résolution de la présente invention comprenant l'ovoglycoprotéine acétylée liée au gel de silice. L'agent de résolution résultant est utilisé pour garnir une colonne en acier pour préparer une colonne en vue d'être utilisée pour la
résolution d'isomères optiques.
Les effets pratiques obtenus par la présente invention sont discutés ciaprès
en détail en référence aux Exemples de Tests ci-après.
Exemple de Test 1 La résolution des isomères de benzoïne, maléate de chlorphéniramine ou de kétoprofène est effectuée en utilisant les colonnes pour la résolution des isomères optiques préparées dans les Exemples Comparatifs I et 2 et dans l'Exemple 1. Comme résultat, on observe que la colonne garnie avec l'ovoglycoprotéine immobilisée (SP-3) présente une excellente capacité de résolution (voir Figures 4, 5 et 6) et que les colonnes garnies avec les fractions immobilisées SP-1 et SP-2 ne permettent pas de distinguer les formes optiques. A cet effet, IHPLC est réalisée dans les conditions suivantes: la colonne utilisée a un diamètre interne de 2,0 mm et une longueur de 100 mm; phase mobile:
19 2726278
tampon phosphate 20 mM (pH 5,1)/éthanol = 90/10 (volume/volume); température de la
colonne: 25 C; débit: 0,2 ml/min; et détection: 220 nm.
Exemple de Test 2 Dans cet Exemple de Test, on étudie la fréquence de chargement d'échantillon lors de la résolution de l'énantiomere de benzoïne de la même manière que celle utilisée dans lExemple de Test 1. Les résultats obtenus sont présentés graphiquement à la Figure 7. A la Figure 7, les colonnes utilisées sont garnies avec un ovomucoide immobilisé, disponible dans le commerce dans le cas du spectre A (Figure 7A) et avec l'ovoglycoprotéine immobilisée de la présente invention dans le cas du spectre B (Figure
7B), respectivement.
A cet effet, -IPLC est effectuée dans les conditions suivantes: la colonne utilisée a un diamètre interne de 2,0 mm et longueur de 100 mm; phase mobile: tampon phosphate 20 mM (pH 5,1)/éthanol = 90/10 (volume/volume); température de la colonne: C; débit: 0,2 ml/min; et détection: 254 nm. La quantité d'échantillon injecté est de
2,5 nMpour A et20nMpourB.
Les résultats présentés à la Figure 7 montrent que l'ovoglycoprotéine immobilisée, utilisée comme agent de résolution (B) de la présente invention (Figure 7B), permet une fréquence de chargement d'échantillon 8 fois supérieure à celle observée avec
l'ovomucoïde immobilisé, c'est-à-dire l'agent de résolution A (Figure 7A).
Comme discuté ci-dessus en détail, l'agent de résolution des isomères optiques de la présente invention n'est pas onéreux, il est stable et très résistant à la détérioration par les solvants organiques, présente des propriétés rhéologiques excellentes, et permet une fréquence de chargement d'échantillon élevée et une résolution efficace
d'isomères optiques.
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Claims (6)
1. Ovoglycoprotéine ayant un poids moléculaire d'environ 30000, déterminé à l'aide d'un spectromètre de masse de type "à temps de vol" à ionisation par désorption laser assistée par matrice, une séquence d'acides aminés de 15 résidus à partir de l'extrémité N-terminale, représentée par T-E-S-P-X-S-A-P-L-V-P-A-D-M-D (dans laquelle X représente un résidu cystéine ou un résidu d'acide aminé auquel est lié une chaîne glucidique) et une teneur en glucides d'environ 25 % en poids et est dépourvue d'activité inhibitrice de la trypsine; ou ovoglycoprotéine analogue dont la structure moléculaire est
partiellement modifiée.
2. Agent de résolution pour chromatographie comprenant une phase stationnaire caractérisée en ce qu'elle comprend un support et une ovoglycoprotéine telle
que définie dans la revendication 1 liée au support.
3. Agent de résolution selon la revendication 2 caractérisé en ce que la
structure moléculaire de ladite ovoglycoprotéine est partiellement modifiée.
4. Agent de résolution pour chromatographie selon la revendication 3 caractérisé en ce que ladite ovoglycoprotéine est choisie dans le groupe constitué par les ovoglycoprotéines modifiées avec le glutaraldéhyde de type non réduit, les ovoglycoprotéines modifiées par le glutaraldéhyde de type réduit, les ovoglycoprotéines
modifiées par un diol et les ovoglycoprotéines acylées.
5. Agent de résolution pour chromatographie selon l'une quelconque des
revendications 2 à 4 caractérisé en ce que le support est choisi dans le groupe constitué par
le gel de silice, les verres, la cellulose, les matériaux carbonés et les polymères synthétiques.
6. Utilisation d'un agent de résolution tel que défini dans l'une quelconque
des revendications 2 à 5 pour la résolution d'isomères optiques d'un composé chiral.
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