FR2664286A1 - Nouvelle souche d'aspergillus flavus et son utilisation pour la production d'urate-oxydase. - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne les souches d'Aspergillus flavus ayant les caractéristiques de la souche déposée le 25 juin 1990 auprés de la C.N.C.M. qui lui a attribué la référence I-958. La souche C.N.C.M. I-958 a été obtenue en soumettant à une irradiation par exposition à un rayonnement ultra-violet la souche ATCC 20047. L'invention concerne également l'utilisation de ces souches pour la production d'urate-oxydase.
Description
Nouvelle souche d'Aspergillus flavus et son utilisation pour la production d'urate-oxydase.
La présente invention a pour objet une nouvelle souche de champignon filamenteux appartenant à l'espèce Aspergillus flavus et son utilisation pour l'obtention d'urate-oxydase.
L'urate-oxydase ou uricase est une enzyme (répertoriée par l'Union Internationale de Biochimie sous la référence E.C.17.3.3) impliquée dans la voie de dégradation des purines : elle catalyse l'oxydation de l'acide urique en allantoine.
Elle s'est avérée pouvoir constituer le principe actif de médicaments destinés au traitement des états d'hyperuricémie.
L'urate-oxydase entra1ne la dégradation de l'acide urique en allantoine qui, dix fois plus soluble que l'acide urique, est alors facilement éliminée par voie rénale.
L'urate-oxydase est également utilisée à des fins de diagnostic pour la détermination notamment de l'uricémie
Au côté des méthodes d'extraction à partir d'organes d'animaux, notamment à partir de foie de porc ou de rein de boeuf, d'abord utilisées en vue de l'obtention d'urate-oxydase, ont été introduites des méthodes mettant en jeu des micro-organismes qui, soumis à une fermentation, produisent de l'urate-oxydase.
Au côté des méthodes d'extraction à partir d'organes d'animaux, notamment à partir de foie de porc ou de rein de boeuf, d'abord utilisées en vue de l'obtention d'urate-oxydase, ont été introduites des méthodes mettant en jeu des micro-organismes qui, soumis à une fermentation, produisent de l'urate-oxydase.
L'utilisation d'un certain nombre de micro-organismes a été envisagée ; parmi ceux-ci on peut citer certaines souches des espèces bactériennes Bacillus fastidiosus (voir US 3 669 843),
Corynebacterium uratoxidans (voir US 3 767 533), Micrococcus luteus (voir US 4 062 731), Micrococcus roseus (voir US 4 389 485) ou encore Streptomyces gannmycicus (voir EP 0 012 446), certaines souches d'espèces de levures Candida utilis (voir US 3 475 276) et certaines souches de champignons filamenteux CAspergillus flavus (voir US 3 475 276)z.
Corynebacterium uratoxidans (voir US 3 767 533), Micrococcus luteus (voir US 4 062 731), Micrococcus roseus (voir US 4 389 485) ou encore Streptomyces gannmycicus (voir EP 0 012 446), certaines souches d'espèces de levures Candida utilis (voir US 3 475 276) et certaines souches de champignons filamenteux CAspergillus flavus (voir US 3 475 276)z.
Une souche d'Aspergillus flavus (déposée auprès de la collection ATCC sous le numéro 20047) s'est avérée convenir tout particulièrement à l'obtention à l'échelle industrielle d'urateoxydase Cvoir US 3 475 276 et article de P. Laboureur et
C. Langlois paru dans le Bulletin de la Société de Chimie
Biologique en 1968 (50, 4, pages 811-825)7.
C. Langlois paru dans le Bulletin de la Société de Chimie
Biologique en 1968 (50, 4, pages 811-825)7.
La perspective d'une demande en urate-oxydase plus importante du fait de nouvelles indications thérapeutiques, telles que le traitement de leucemie aiguës ou une thérapie d'accompagnement de l'allogreffe de moelle, a incité la demanderesse à envisager la recherche de moyens de production plus performants.
La souche d'Aspergillus flavus ATCC 20047 étant actuellement utilisée pour l'obtention d'urate-oxydase en vue de la préparation d'un médicament et présentant à cet égard les qualités requises par les réglementations en vigueur relatives à la santé publique, il est apparu qu'elle constituait un matériel de départ approprié.
La demanderesse a obtenu un sous-clone mutant plus performant en soumettant cette souche à un rayonnement ultraviolet.
Ce sous-clone obtenu à l'état de culture pure a fait l'objet d'un dépôt le 25 juin 1990 auprès de la Collection
Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.) qui lui a attribué la référence I-958.
Nationale de Cultures de Micro-organismes (C.N.C.M.) qui lui a attribué la référence I-958.
Selon un premier aspect, la présente invention concerne précisément une souche de champignon filamenteux de l'espèce
Aspergillus flavus obtenue à l'état de culture pure et ayant tes caractéristiques de la souche correspondant à ce sous-clone.
Aspergillus flavus obtenue à l'état de culture pure et ayant tes caractéristiques de la souche correspondant à ce sous-clone.
L'invention concerne la souche C.N.C.M. I-958 et les souches qui en seraient dérivées et présenteraient encore les caractéristiques essentielles de celle-ci.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation de la souche C.N.C.M. I-958 ou de souches qui en seraient dérivées en vue de l'obtention d'urate-oxydase.
Cette utilisation se caractérise par la mise en oeuvre d'un échantillon d'une culture pure de ladite souche en la soumettant à une fermentation dans des conditions de culture permettant l'expression du gène codant pour l'urate-oxydase.
Les conditions de culture sont celles bien connues de l'homme de l'art dès lors qu'il s'agit de cultiver à grande échelle des souches d'Aspergillus ; ces conditions sont notamment décrites dans l'ouvrage de B. BOTTON et al (Moisissures utiles et nuisibles, importance industrielle, Editions MASSON, Paris, 1985, pages 17 à 29).
Les milieux de culture doivent contenir, outre notamment une source de carbone et une source d'azote, un inducteur de l'une des enzymes placées sous le controle du gène de régulation positive uaY (cf article de C. SCAZZOCCHIO et al, Genetics 100 : 185-208, 1982).
Il s'est avéré que la production d'urate-oxydase par la souche selon l'invention était optimisée lorsque le milieu utilisé contenait notamment comme inducteur de la 2-thioxanthine.
L'invention concerne précisément selon un autre aspect des souches selon L'invention caractérisées en ce que le milieu de culture contient en tant qu'inducteur de la 2-thioxanthine.
Une quantité de 2-thioxanthine comprise entre 10 et 50 mg/ml suffit à obtenir t'effet d'induction. Pour des raisons de facilité de mise en oeuvre, on peut en utiliser une quantité plus importante sans inconvénient.
L'invention va maintenant être décrite plus en détail par
Les essais ci-après. Ces essais rendent compte en premier lieu de l'obtention de la souche C.N.C.M. I-958. Ils présentent ensuite son aptitude à produire de I'urate-oxydase en quantité plus importante que ne peut le faire la souche ATCC 20047.
Les essais ci-après. Ces essais rendent compte en premier lieu de l'obtention de la souche C.N.C.M. I-958. Ils présentent ensuite son aptitude à produire de I'urate-oxydase en quantité plus importante que ne peut le faire la souche ATCC 20047.
I. Obtention et mise en évidence de La souche C.N.C.M. I-958 1. Conidies mises en oeuvre
Les essais ont été réalisés sur des conidies de la souche
ATCC 20047 fraichement récoltées, en suspension, à raison de 2 à 7.107 conidies par ml, dans une solution dans l'eau distillée de chlorure de sodium (9 g/l).
Les essais ont été réalisés sur des conidies de la souche
ATCC 20047 fraichement récoltées, en suspension, à raison de 2 à 7.107 conidies par ml, dans une solution dans l'eau distillée de chlorure de sodium (9 g/l).
2. Préparation des conidies en vue de Leur irradiation
Chaque essai d'irradiation a été conduit sur des conidies préparées comme indiqué ci-après.
Chaque essai d'irradiation a été conduit sur des conidies préparées comme indiqué ci-après.
25 ml de la suspension décrite au paragraphe 1 sont centrifugés de manière à obtenir un culot de conidies. Le culot est repris dans une solution dans L'eau distillée de 9 g/l de chlorure de sodium, contenant 1 ml/l de polyéthylèneglycol p-isooctyléther 100 (dénomination commerciale : Triton X-100).
La suspension obtenue est à nouveau centrifugée et le culot de conidies est repris dans une solution dans l'eau distillée de chlorure de sodium (9 q/l)
Ce cycle de 2 centrifugations est ensuite repété deux fois.
Ce cycle de 2 centrifugations est ensuite repété deux fois.
On obtient finalement une suspension de 2 à 7 107 conidies par ml dans une solution dans l'eau distillée de 9g/l de chlorure de sodium.
3. Irradiation
L'irradiation a consisté à exposer les conidies 2 min au rayonnement d'une lampe UV ayant une puissance de 30 W et émettant à 254 nm.
L'irradiation a consisté à exposer les conidies 2 min au rayonnement d'une lampe UV ayant une puissance de 30 W et émettant à 254 nm.
Pour chaque essai d'irradiation il a été procédé comme indiqué ci-après.
5 ml de la suspension de conidies décrite au paragraphe 2 sont introduits dans une boîte de Petri en verre.
La boîte est placée sous agitation à 20 cm de la lampe pendant 2 min.
La suspension qui ne contient plus alors après irradiation qu'environ 1 % de conidies survivantes est diluée dans du glycérol, mise immédiatement à l'obscurité et congelée à -800C.
4. Mise-en-évidence de conidiesmutantes-a priori intéressantes
On a procédé d'une part à une mise en évidence indirecte en présélectionnant des conidies au moyen d'un inhibiteur enzymatique et d'autre part à une mise en évidence directe.
On a procédé d'une part à une mise en évidence indirecte en présélectionnant des conidies au moyen d'un inhibiteur enzymatique et d'autre part à une mise en évidence directe.
41. Mise en évidence indirecte a;-Protocole
Des tests de présélection ont été réalisés à l'aide, pour les uns d'un inhibiteur de l'urate-oxydase (la 8-azaxanthine et la 8- azauanine ont été-utilisées), et pour les autres d'un inhibiteur de la xanthine déshydrogénase, en l'occurrence l'allopurinol.
Des tests de présélection ont été réalisés à l'aide, pour les uns d'un inhibiteur de l'urate-oxydase (la 8-azaxanthine et la 8- azauanine ont été-utilisées), et pour les autres d'un inhibiteur de la xanthine déshydrogénase, en l'occurrence l'allopurinol.
il a été procédé comme indiqué ci-après.
Une partie aliquote de la suspension irradiée décongelée est répartie à la surface d'un milieu solide contenant l'inhibiteur. Après un temps d'incubation à 30 C d'une durée adaptée au milieu, on vérifie les caractéristiques morphologiques des colonies qui se sont développées. Ces colonies, si l'inhibiteur a manifestement retardé le développement et la croissance de colonies à partir des conidies, sont réputées pouvoir présenter une mutation intéressante.
Les milieux utilisés sont les suivants :
- pour les essais avec un inhibiteur de l'urate-oxydase on a mis en oeuvre le milieu dont la composition et la préparation sont explicitées ci-après.
- pour les essais avec un inhibiteur de l'urate-oxydase on a mis en oeuvre le milieu dont la composition et la préparation sont explicitées ci-après.
On prépare en premier lieu un milieu de base ayant la composition suivante * glucose (g/l) 2 * acide urique (mg/l) 100 * MgSO4,7H20 (g/l) 1 * K2HPO4 (g/l) 0,75.
Après avoir ajusté le pH du milieu ainsi constitué à 7,0 on ajoute : * CuSO4,5H20 (g/l) 1 * ZnSO4,7H20 (g/l) 3 * MnSO4,H20 (g/l) 1 puis * agar (g/l) 15 * polyéthyléneglycol p-isooctyléther 100 (ml/l) 2.
On ajoute enfin l'inhibiteur en poudre, avant ou après autoclavage (à 1150C pendant 20 min) * 8-azaguanine : 25 mg/l ou 8-azaxanthine : 500 mg/l.
- Pour les esais avec de l'allopurinol on a mis en oeuvre le milieu dont la composition et la préparation sont explicitées ci-après.
On prépare en premier lieu un milieu de base ayant la composition suivante * glucose (g/l) 10 * hypoxanthine (mg/l) 100 * solution-mère d'allopurinol (ml/l) 8,4 * solution de sels (ml/l) 20 * eau distillée qsp 1 l.
La solution-mere d'allopurinol mise en oeuvre est préparée en dissolvant 18 mg d'allopurinol dans 60 ml d'eau distillée.
La solution de sels mise en oeuvre a la composition suivante * KCl (g/l) 26 * MgS04,7H20 (g/l) 26 * KH2PO4 (g/l) 76 * solution d'oligoéléments (ml/l) 50 * eau distillée qsp 1 l.
La solution d'oligoéléments mise en oeuvre a la composition suivante : * Na2B407,10H20 (mg/l) 40 * CuSO4,5H2O (mg/l) 400 * Fe4(P2O7)3 (mg/l) 800
4 207)3 (mg/I) * MnS04,H20 (mg/l) 800 * MoNa2O4,2H20 (mg/l) 800 * ZnS04,7H20 ( g/l) 8 * eau distillée qsp 1 l.
4 207)3 (mg/I) * MnS04,H20 (mg/l) 800 * MoNa2O4,2H20 (mg/l) 800 * ZnS04,7H20 ( g/l) 8 * eau distillée qsp 1 l.
Après avoir ajusté le pH du milieu ainsi constitué à 7,00 on ajoute : * agar (g/l) 15 * polyéthyléneglycol p-isooctyléther(100 ml/l) 2.
Le milieu ainsi complété est soumis à un traitement thermique à 115 C pendant 20 min.
b. Observations
La 8-azaxanthine ne s'est pas révélée être un agent de présélection efficace.
La 8-azaxanthine ne s'est pas révélée être un agent de présélection efficace.
La 8-azaguanine par contre a permis de présélectionner des colonies parmi lesquelles 114 ont été retenues. Celles-ci présentaient après 3 jours d'incubation à 300C, par comparaison avec les colonies observées à la surface du même milieu ne contenant pas t'inhibiteur, une inhibition de croissance significative appréciée en mesurant le diamètre des colonies dont rend compte le tableau 1 ci-après.
Tableau 1
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> O <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 25 <SEP> 50 <SEP> 150 <SEP> 200 <SEP> 500 <SEP> 100C
<tb> 8-azaguanine <SEP> (mg/l)
<tb> Diamètre <SEP> des
<tb> colonies <SEP> (mm) <SEP> 5 <SEP> Il <SEP> 1 <SEP> < 1 <SEP> < 1 <SEP> < 1 <SEP> < 1 <SEP> - <SEP>
<tb>
L'allopurinol s'est avéré être un puissant inhibiteur de la croissance des colonies issues du développement des conidies irradiées apprécié ici par un examen du mycélium aérien après 9 jours d'incubation. Le tableau 2 ci-après rend compte de cet effet.
<tb> 8-azaguanine <SEP> (mg/l)
<tb> Diamètre <SEP> des
<tb> colonies <SEP> (mm) <SEP> 5 <SEP> Il <SEP> 1 <SEP> < 1 <SEP> < 1 <SEP> < 1 <SEP> < 1 <SEP> - <SEP>
<tb>
L'allopurinol s'est avéré être un puissant inhibiteur de la croissance des colonies issues du développement des conidies irradiées apprécié ici par un examen du mycélium aérien après 9 jours d'incubation. Le tableau 2 ci-après rend compte de cet effet.
Tableau 2
<tb> Concentration <SEP> en <SEP> allopurinol <SEP> O <SEP> 0,25 <SEP> 0,5 <SEP> 2,5 <SEP> 5 <SEP> 10
<tb> <SEP> (mg/l) <SEP>
<tb> Développement <SEP> d'un <SEP> mycélium
<tb> aerien <SEP> ++t <SEP> ~ <SEP>
<tb>
37 des colonies ayant développé un mycélium aérien malgré la présence d'allopurinol ont été retenues.
<tb> <SEP> (mg/l) <SEP>
<tb> Développement <SEP> d'un <SEP> mycélium
<tb> aerien <SEP> ++t <SEP> ~ <SEP>
<tb>
37 des colonies ayant développé un mycélium aérien malgré la présence d'allopurinol ont été retenues.
42. Mise en évidence directe
10 000 conidies irradiées ainsi que des conidies obtenues à partir de colonies . prélevées au hasard parmi celles s'étant développées sur le milieu additionné de 8-azaxanthine, ont été soumises au test - par la suite appelé test à l'acide urique précipité - dont la réalisation est ci-après explicitée.
10 000 conidies irradiées ainsi que des conidies obtenues à partir de colonies . prélevées au hasard parmi celles s'étant développées sur le milieu additionné de 8-azaxanthine, ont été soumises au test - par la suite appelé test à l'acide urique précipité - dont la réalisation est ci-après explicitée.
Ce test consiste à mesurer l'activité urate-oxydase développée par une colonie issue d'une conidie portée à la surface d'un milieu solide contenant de l'acide urique précipité.
Le milieu utilisé est coulé en boîtes de Petri en deux couches.
S'agissant de la première couche (fond) on prépare en premier lieu un milieu de base ayant la composition suivante * qlucose (9/1) 0,5 * MgS04,7H02 (g/l) 1 * K2HP04 (g/l) 0,75 * solution d'olioéléments (ml/l) 1 * solution de FeS04,7H20 à
1 g/lûO mi dans l'eau distillée (ml/l) 1 * eau distillée qsp 1 l.
1 g/lûO mi dans l'eau distillée (ml/l) 1 * eau distillée qsp 1 l.
La solution d'oligoéléments comprend en solution dans de l'eau distillée : * CuS04,5H20 (g/l) 1 * ZnS04,7H20 (g/l) 3 * MnS04,H20 (q/l) 1.
Après avoir ajusté le pH du milieu ainsi constitué, on ajoute * agar (g/l) 15 * polyéthylèneglycol p-isooctyléther 100 (ml/l) 2.
La deuxième couche (surface) a la composition de la première complétée par * acide urique (g/l) 1,5 * KOH (g/l) 0,5.
Le pH est ajusté au moment indiqué ci-dessus pour la couche de fond à 6,5 et pour la couche de surface à 5,70.
Les milieux ainsi préparés pour l'une et l'autre couches sont ensuite soumis à un traitement thermique à 1100C pendant 20 min.
Le test est positif et la colonie est sélectionnée, lorsque l'auréole translucide Edont la formation correspond à l'utilisation de l'acide urique par la colonie] apparaissant à son pourtour a une surface significativement plus grande que la moyenne des surfaces de l'ensemble des auréoles.
17 colonies dont 5 ayant pour origine des conidies issues des colonies prélevées sur le milieu à la 8-axazanthine ont été retenues.
5 Mise en évidence de La souche C.N.C.M. I-958
On a vérifié si les clones constitués à partir de chacune des colonies retenues comme indiqué au paragraphe 4 étaient purs et s'ils conduisaient bien effectivement à une production d'urateoxydase accrue.
On a vérifié si les clones constitués à partir de chacune des colonies retenues comme indiqué au paragraphe 4 étaient purs et s'ils conduisaient bien effectivement à une production d'urateoxydase accrue.
A cet effet, les clones purs ont été soumis à une fermentation à l'échelle du laboratoire en erlenmeyer de 5 l contenant 1,5 l d'un milieu dit standard dont la composition et la préparation sont explicitées ci-après : * on prépare un milieu de base ayant les composants suivants : . glucose (g/l) 15 .MgS04,7H20 (g/l) 1 K2HP04 (g/l) 0,75 . acide urique (g/l) 1,2 . KOH (g/l) 0,4 - solution de FeS04,7H20 à 1 g/100 ml (ml/l) 1 . solution de CuSO4,5H2O à 0,1 g/100 ml (ml/l) 1 - solution de ZnS04,7H20 à 0,3 9/100 ml (ml/l) 1 - solution de MnS04,H20 à 0,1 9/100 ml (ml/l) 1 . eau distillée qsp 1 I * on chauffe le milieu ainsi préparé, sous agitation, jusqu'à dissolution de l'acide urique. On refroidit à 20 C et on ajuste le pH à 7,00 +/- 0,05.
* On ajoute ensuite : - CaC03 (g/l) 1,2 - huile de soja (ml/l) 0,66 * on stérilise le milieu ainsi complété par un traitement thermique de 30 min à 1200C.
Les fermentations ont été conduites sous agitation à 300C.
L'acide urique du milieu de fermentation a été dosé selon le mode opératoire ci-après décrit.
2 ml de moût sont complétés à 20 ml avec un tampon TEA dont le pH est de 8,9 et qui est constitué de triéthanolamine et d'acide éthylènediamide-tétraacétique, en solution dans de l'eau distillée à raison le premier de 7,5 g/l et le second de 0,372 g/l.
Après dissolution complète de l'acide urique, la solution obtenue est filtrée à l'aide d'un papier du type Whatman H 113V.
Elle est ensuite éventuellement rediluée au 1/10ème à l'aide d'un tampon TEA.
La concentration en acide urique est déterminée par une lecture spectrophotométrique à 292 nm et après comparaison avec une gamme étalon.
L'activité urate-oxydase a été déterminée selon le mode opératoire ci-après décrit.
L'urate-oxydase étant une enzyme intracellulaire doit être extraite du mycélium.
Après filtration de 50 ml de moût sur verre fritté n 1, les matières solides retenues sont broyées au mortier dans de l'azote liquide.
La poudre ainsi obtenue est mise en suspension dans du tampon TEA. Enfin, après filtration sur un papier de type Whatman
H 113V, L'activité est dosée sur le filtrat.
H 113V, L'activité est dosée sur le filtrat.
Le dosage consiste à mesurer la vitesse de disparition de l'acide urique d'une solution standard (par lecture de la densité optique à 292 nm) en présence de l'extrait enzymatique contenu dans le filtrat.
L'activité urate-oxydase est exprimée conformément aux recommandations du Groupement International pour la Définition d'une Unité Enzymatique (GIPEP) en unités par litre de milieu, une unité étant l'activité enzymatique qui permet la transformation d'une micromole d'acide urique en allantoine par minute à pH 8,9 et à 300C.
Les protéines ont été dosées selon le mode opératoire décrit par M. M. Bradford en 1976 (voir Anal. Biochem., 72, 248254).
En définitive seuls 5 clones ont présenté des qualités de production satisfaisantes ainsi que d'autres propriétés de croissance intéressantes. Seul parmi ces clones, le clone APII4 a présenté une activité spécifique plus élevée que la souche
ATCC 20047. Le tableau 3 suivant en rend compte.
ATCC 20047. Le tableau 3 suivant en rend compte.
Tableau 3
<tb> Micro-organisme
<tb> <SEP> zesté <SEP> Souche <SEP> CLone <SEP> CLone <SEP> CLone <SEP> CLone <SEP> CLone
<tb> <SEP> ATCC <SEP> 20047 <SEP> APII4 <SEP> APII11 <SEP> APII19 <SEP> AXII3 <SEP> ,,~-,,,, <SEP> ,,,,,,,,,,,,,,, <SEP> AUIII2
<tb> <SEP> Poids <SEP> sec <SEP> 3,24 <SEP> 3,82 <SEP> 3,84 <SEP> 4,30 <SEP> 3,36 <SEP> 3,56
<tb> <SEP> (g/l)
<tb> <SEP> Protéine <SEP> 0,49 <SEP> 0,63 <SEP> 0,50 <SEP> 0,44 <SEP> 0,51 <SEP> 0,40
<tb> <SEP> (s/l)
<tb> <SEP> Activité <SEP> (U/l) <SEP> 8800 <SEP> 124,00 <SEP> 9300 <SEP> 8200 <SEP> 8750 <SEP> i <SEP> 8350
<tb> <SEP> Urate
<tb> <SEP> oxydase <SEP> (U/g) <SEP> 2710 <SEP> 3246 <SEP> 2422 <SEP> 1907 <SEP> , <SEP> 2604 <SEP> 2345
<tb> <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~~ <SEP> ,~~~~~~~.<SEP> ~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~ <SEP> ,~~~~~~
<tb> <SEP> Acide <SEP> urique <SEP> 0,23 <SEP> 0,30 <SEP> 0,21 <SEP> 0,19 <SEP> 0,17 <SEP> 0,20
<tb> <SEP> dissous <SEP> (g/L)
<tb>
Note * les clones marqués APII ont été initialement présélectionnés sur le milieu additionné d'allopurinol, * le clone AXII3 est issu de l'une des colonies prévelées après culture sur le milieu additionné de 8-azaxanthine, * le clone AUIII2 est issu d'une colonie développée à partir d'une conidie irradiée soumise directement au test à l'acide urique précipité.
<tb> <SEP> zesté <SEP> Souche <SEP> CLone <SEP> CLone <SEP> CLone <SEP> CLone <SEP> CLone
<tb> <SEP> ATCC <SEP> 20047 <SEP> APII4 <SEP> APII11 <SEP> APII19 <SEP> AXII3 <SEP> ,,~-,,,, <SEP> ,,,,,,,,,,,,,,, <SEP> AUIII2
<tb> <SEP> Poids <SEP> sec <SEP> 3,24 <SEP> 3,82 <SEP> 3,84 <SEP> 4,30 <SEP> 3,36 <SEP> 3,56
<tb> <SEP> (g/l)
<tb> <SEP> Protéine <SEP> 0,49 <SEP> 0,63 <SEP> 0,50 <SEP> 0,44 <SEP> 0,51 <SEP> 0,40
<tb> <SEP> (s/l)
<tb> <SEP> Activité <SEP> (U/l) <SEP> 8800 <SEP> 124,00 <SEP> 9300 <SEP> 8200 <SEP> 8750 <SEP> i <SEP> 8350
<tb> <SEP> Urate
<tb> <SEP> oxydase <SEP> (U/g) <SEP> 2710 <SEP> 3246 <SEP> 2422 <SEP> 1907 <SEP> , <SEP> 2604 <SEP> 2345
<tb> <SEP> ~~~~~~~~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~~ <SEP> ,~~~~~~~.<SEP> ~~~~~~~ <SEP> ~~~~~~ <SEP> ,~~~~~~
<tb> <SEP> Acide <SEP> urique <SEP> 0,23 <SEP> 0,30 <SEP> 0,21 <SEP> 0,19 <SEP> 0,17 <SEP> 0,20
<tb> <SEP> dissous <SEP> (g/L)
<tb>
Note * les clones marqués APII ont été initialement présélectionnés sur le milieu additionné d'allopurinol, * le clone AXII3 est issu de l'une des colonies prévelées après culture sur le milieu additionné de 8-azaxanthine, * le clone AUIII2 est issu d'une colonie développée à partir d'une conidie irradiée soumise directement au test à l'acide urique précipité.
Le clone APII4 présentant les résultats les plus intéressants a donné lieu à un examen plus approfondi. Il a été notamment soumis à nouveau au test à l'acide urique précipité. Après 72 h d'incubation les colonies obtenues se sont avérées présenter une auréole dont la surface était significativement plus importante que celle des auréoles se formant autour des colonies de la souche
ATCC 20047, ainsi qu'en rend compte le tableau 4 ci-après.
ATCC 20047, ainsi qu'en rend compte le tableau 4 ci-après.
Tableau 4
<tb> <SEP> Diamètre <SEP> de <SEP> Ecart- <SEP> Nombre <SEP> de
<tb> <SEP> l'auréole <SEP> (mm) <SEP> type <SEP> mesures
<tb> Souche <SEP> ATCC <SEP> 20047 <SEP> 5,66 <SEP> 0,59 <SEP> 50
<tb> Clone <SEP> APII4 <SEP> 6,32 <SEP> 0,84 <SEP> 18
<tb>
Seules les 5 colonies formant les plus grandes auréoles ont été retenues et les sous-clones correspondants ont été dénommés ALPR04 A, ALPR04 B, ALPR04 C, ALPR04 D et ALPR04 E.
<tb> <SEP> l'auréole <SEP> (mm) <SEP> type <SEP> mesures
<tb> Souche <SEP> ATCC <SEP> 20047 <SEP> 5,66 <SEP> 0,59 <SEP> 50
<tb> Clone <SEP> APII4 <SEP> 6,32 <SEP> 0,84 <SEP> 18
<tb>
Seules les 5 colonies formant les plus grandes auréoles ont été retenues et les sous-clones correspondants ont été dénommés ALPR04 A, ALPR04 B, ALPR04 C, ALPR04 D et ALPR04 E.
Chacun de ces sous-clones a été soumis à une fermentation à l'échelle du laboratoire selon le protocole décrit plus haut. On a constaté qu'ils exprimaient après 64 h une activité urate-oxydase plus importante que la souche ATCC 20047 ce dont rend compte le tableau 5 ci-après.
Tableau 5
<tb> <SEP> à <SEP> t <SEP> = <SEP> 48 <SEP> h <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> à <SEP> t <SEP> = <SEP> 64 <SEP> h <SEP> de <SEP> fermentation
<tb> <SEP> Biomasse <SEP> Act. <SEP> urate-oxydase <SEP> Biomase <SEP> Act. <SEP> urate-oxydase
<tb> <SEP> g/l <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g <SEP> g/l <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g
<tb> <SEP> (poids <SEP> sec) <SEP> (poids <SEP> sec)
<tb> clones <SEP> 4,35 <SEP> 200 <SEP> 46 <SEP> 5,03 <SEP> 351 <SEP> 69,8
<tb> A, <SEP> B, <SEP> C, <SEP> D
<tb> t <SEP> E <SEP> ~ <SEP> (*) <SEP>
<tb> Souche <SEP> 3,79 <SEP> 155 <SEP> 40,8 <SEP> 4,14 <SEP> 190 <SEP> 45,8
<tb> TCC <SEP> 20047 <SEP>
<tb> (*) Les résultats sont une moyenne des valeurs obtenues avec chacun des 5 sous-clones.
<tb> <SEP> Biomasse <SEP> Act. <SEP> urate-oxydase <SEP> Biomase <SEP> Act. <SEP> urate-oxydase
<tb> <SEP> g/l <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g <SEP> g/l <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g
<tb> <SEP> (poids <SEP> sec) <SEP> (poids <SEP> sec)
<tb> clones <SEP> 4,35 <SEP> 200 <SEP> 46 <SEP> 5,03 <SEP> 351 <SEP> 69,8
<tb> A, <SEP> B, <SEP> C, <SEP> D
<tb> t <SEP> E <SEP> ~ <SEP> (*) <SEP>
<tb> Souche <SEP> 3,79 <SEP> 155 <SEP> 40,8 <SEP> 4,14 <SEP> 190 <SEP> 45,8
<tb> TCC <SEP> 20047 <SEP>
<tb> (*) Les résultats sont une moyenne des valeurs obtenues avec chacun des 5 sous-clones.
C'est en définitive le sous-clone ALPRO4 D qui a été seul retenu. C'est un échantillon d'une culture de ce sous-clone qui a été déposée auprès de la CNCM I-958 qui lui a attribué la référence I-958.
II. Caractéristiques de production d'urate-oxydase de La souche
CNCM I-958.
CNCM I-958.
Tableau 6
<tb> <SEP> à <SEP> t <SEP> = <SEP> 48 <SEP> h <SEP> de <SEP> fermentation <SEP> à <SEP> t <SEP> = <SEP> 64 <SEP> h <SEP> de <SEP> fermentation
<tb> <SEP> Biomasse <SEP> Activite <SEP> urate-oxydase <SEP> Biomase <SEP> Activité <SEP> urate-oxydas <SEP>
<tb> <SEP> g/l <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g <SEP> g/l <SEP> Uhités/l <SEP> Unités/g
<tb> <SEP> (poids <SEP> sec) <SEP> (poids <SEP> sec)
<tb> Souche <SEP> 4,06 <SEP> 236 <SEP> 58 <SEP> 4,68 <SEP> 351 <SEP> 75
<tb> ATCC <SEP> 20047 <SEP>
<tb> CNCM <SEP> 4,68 <SEP> 281 <SEP> 60 <SEP> 5,84 <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 102 <SEP>
<tb> I.958 <SEP> w <SEP>
<tb> <SEP> F <SEP> I <SEP> I <SEP> i <SEP>
<tb>
Le tableau 6 ci-dessus rend compte des propriétés surproductrices de la souche C.N.C.M. I-958 par rapport à la souche
ATCC 20047 exprimées lors d'une fermentation à l'échelle du laboratoire selon le mode opératoire décrit plus haut, mais avec un milieu se différenciant principalement du milieu standard par la substitution de l'acide urique jouant le role d'inducteur de
I'urate-oxydase et de source d'azote par de la 2-thioxanthine qui est un inducteur gratuit, c'est-à-dire qui n'est pas tranformé par le micro-organisme et un extrait de levures.La composition de ce milieu et sa préparation sont explicitées ci-après : * on prépare un milieu de base ayant Les composants suivants : - glucose (g/l) 15 - MgSO4,7H2O (g/l) 1 - K2HPO4 (g/l) & ommat; 0,75 - extrait de levures (Biokar #
référence 1-120 02) en g/l 5 - solution de FeS04,7H20 à 1 9/100 ml (ml/l) 1 - solution de CuSO4,5H20 à 0,1 9/100 ml (ml/l) 1 . solution de ZnS04,7H20 à 0,3 g/100 ml (ml/l) 1 - solution de MnS04,H20 à 1 g/100 ml (ml/l) 1 - eau distillée qsp 1 I * on ajuste te pH à 7,00 +/- 0,05.
<tb> <SEP> Biomasse <SEP> Activite <SEP> urate-oxydase <SEP> Biomase <SEP> Activité <SEP> urate-oxydas <SEP>
<tb> <SEP> g/l <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g <SEP> g/l <SEP> Uhités/l <SEP> Unités/g
<tb> <SEP> (poids <SEP> sec) <SEP> (poids <SEP> sec)
<tb> Souche <SEP> 4,06 <SEP> 236 <SEP> 58 <SEP> 4,68 <SEP> 351 <SEP> 75
<tb> ATCC <SEP> 20047 <SEP>
<tb> CNCM <SEP> 4,68 <SEP> 281 <SEP> 60 <SEP> 5,84 <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 102 <SEP>
<tb> I.958 <SEP> w <SEP>
<tb> <SEP> F <SEP> I <SEP> I <SEP> i <SEP>
<tb>
Le tableau 6 ci-dessus rend compte des propriétés surproductrices de la souche C.N.C.M. I-958 par rapport à la souche
ATCC 20047 exprimées lors d'une fermentation à l'échelle du laboratoire selon le mode opératoire décrit plus haut, mais avec un milieu se différenciant principalement du milieu standard par la substitution de l'acide urique jouant le role d'inducteur de
I'urate-oxydase et de source d'azote par de la 2-thioxanthine qui est un inducteur gratuit, c'est-à-dire qui n'est pas tranformé par le micro-organisme et un extrait de levures.La composition de ce milieu et sa préparation sont explicitées ci-après : * on prépare un milieu de base ayant Les composants suivants : - glucose (g/l) 15 - MgSO4,7H2O (g/l) 1 - K2HPO4 (g/l) & ommat; 0,75 - extrait de levures (Biokar #
référence 1-120 02) en g/l 5 - solution de FeS04,7H20 à 1 9/100 ml (ml/l) 1 - solution de CuSO4,5H20 à 0,1 9/100 ml (ml/l) 1 . solution de ZnS04,7H20 à 0,3 g/100 ml (ml/l) 1 - solution de MnS04,H20 à 1 g/100 ml (ml/l) 1 - eau distillée qsp 1 I * on ajuste te pH à 7,00 +/- 0,05.
* sont ensuite ajoutés :
* CaC03 (g/l) 1,2
* huile de soja (ml/l) 0,66 * le milieu complet est stérilisé par un traitement thermique de 30 min à 1200C, * on ajoute enfin une solution concentrée de 2-thioxanthine (240 mg/lO ml de KOH 0,5N) filtrée sur membrane de porosité 0,22 ,um) de manière telle que la concentration finale de cet inducteur atteigne 40 mg/l.
* CaC03 (g/l) 1,2
* huile de soja (ml/l) 0,66 * le milieu complet est stérilisé par un traitement thermique de 30 min à 1200C, * on ajoute enfin une solution concentrée de 2-thioxanthine (240 mg/lO ml de KOH 0,5N) filtrée sur membrane de porosité 0,22 ,um) de manière telle que la concentration finale de cet inducteur atteigne 40 mg/l.
La souche CNCM I-958 présente notamment par rapport à la souche ATCC 20047 une activité spécifique en urate-oxydase (activité mesurée rapportée à l'uni té de biomasse exprimée en poids sec) d'environ 30 % supérieure.
Les mêmes propriétés s'expriment lors de fermentations à l'échelle industrielle. Les figures 1 et 2 en rendent compte.
Ces figures ont été établies lors d'un essai de fermentation réalisé dans un fermenteur de 2800 l contenant 1800 l de milieu standard.
La figure 1 traduit l'évolution de la productivité de la souche ATCC 20047 et de la souche C.N.C.M. I-958 au cours de la fermentation. La productivité est ici déterminée en mesurant au cours de la fermentation l'activité urate-oxydase en unités par litre de milieu. On constate que dans cet essai la souche
ATCC 20047 a cessé de produire de I'urate-oxydase après environ 53 h de fermentation.
ATCC 20047 a cessé de produire de I'urate-oxydase après environ 53 h de fermentation.
La figure 2 vient corréler la figure 1 ; elle montre que la croissance de la souche ATCC 20047 exprimée par une mesure de la biomasse exprimée en g de poids sec par litre de milieu de culture a cessé après 53 h de fermentation.
Ces résultats mettent bien en évidence que la souche
C.N.C.M. I-958 est capable d'une activité spécifique d'urateoxydase significativement plus élevée que celle que permet d'atteindre la souche ATCC 20047. Ils traduisent une meilleure utilisation des agents nutritifs permettant une croissance plus longue de la souche C.N.C.M. I-958 conduisant elle-même à l'obtention d'une biomasse plus importante.
C.N.C.M. I-958 est capable d'une activité spécifique d'urateoxydase significativement plus élevée que celle que permet d'atteindre la souche ATCC 20047. Ils traduisent une meilleure utilisation des agents nutritifs permettant une croissance plus longue de la souche C.N.C.M. I-958 conduisant elle-même à l'obtention d'une biomasse plus importante.
III - Autres caractéristiques de la souche C.N.C.M. I-958
La souche C.N.C.M. I-958 présente les caractéristiques générales de culture de la souche ATCC 20047. Cependant, elle diffère notamment de cette souche par son niveau d'activité spécifique pour la xanthine déshydrogénase plus important ainsi qu'en témoigne le tableau 7 :
Activité xanthine déshydrogénase
La souche C.N.C.M. I-958 présente les caractéristiques générales de culture de la souche ATCC 20047. Cependant, elle diffère notamment de cette souche par son niveau d'activité spécifique pour la xanthine déshydrogénase plus important ainsi qu'en témoigne le tableau 7 :
Activité xanthine déshydrogénase
<tb> <SEP> Après <SEP> 48 <SEP> h <SEP> de <SEP> Après <SEP> 64 <SEP> h <SEP> de
<tb> <SEP> fermentation <SEP> fermentation
<tb> <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g <SEP> Unités/l <SEP> Unités/
<tb> Souche <SEP> ATCC <SEP> 20047 <SEP> 149 <SEP> 39 <SEP> 233 <SEP> 52
<tb> Souche <SEP> CNCM <SEP> I-958 <SEP> 161 <SEP> 67 <SEP> 761 <SEP> 170
<tb>
<tb> <SEP> fermentation <SEP> fermentation
<tb> <SEP> Unités/l <SEP> Unités/g <SEP> Unités/l <SEP> Unités/
<tb> Souche <SEP> ATCC <SEP> 20047 <SEP> 149 <SEP> 39 <SEP> 233 <SEP> 52
<tb> Souche <SEP> CNCM <SEP> I-958 <SEP> 161 <SEP> 67 <SEP> 761 <SEP> 170
<tb>
Claims (4)
- REVENDICATIONS 1. Souche d'Aspergillus flavus obtenue en culture pure ayant les caractéristiques de la souche déposée le 25 juin 1990 auprès de la C.N.C.M. qui lui a attribué la référence I-958.
- 2. Souche d'Aspergillus flavus C.N.C.M. I-958 obtenue en culture pure.
- 3. Utilisation d'une culture pure d'une souche selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2 pour la production par fermentation d'urate-oxydase.
- 4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que le milieu de fermentation contient en tant qu'inducteur de la 2-thioxanthine.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR909008562A FR2664286B1 (fr) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | Nouvelle souche d'aspergillus flavus et son utilisation pour la production d'urate-oxydase. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR909008562A FR2664286B1 (fr) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | Nouvelle souche d'aspergillus flavus et son utilisation pour la production d'urate-oxydase. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2664286A1 true FR2664286A1 (fr) | 1992-01-10 |
| FR2664286B1 FR2664286B1 (fr) | 1994-09-02 |
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ID=9398407
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR909008562A Expired - Fee Related FR2664286B1 (fr) | 1990-07-05 | 1990-07-05 | Nouvelle souche d'aspergillus flavus et son utilisation pour la production d'urate-oxydase. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2664286B1 (fr) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3620923A (en) * | 1967-03-29 | 1971-11-16 | Applic Boichimiques Jouj En Jo | Urate oxidase and process for the production thereof |
| EP0082395A2 (fr) * | 1981-12-14 | 1983-06-29 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Procédé de préparation de protéase acide et les mutants de moisissures du type Aspergillus la produisant |
-
1990
- 1990-07-05 FR FR909008562A patent/FR2664286B1/fr not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3620923A (en) * | 1967-03-29 | 1971-11-16 | Applic Boichimiques Jouj En Jo | Urate oxidase and process for the production thereof |
| EP0082395A2 (fr) * | 1981-12-14 | 1983-06-29 | Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien | Procédé de préparation de protéase acide et les mutants de moisissures du type Aspergillus la produisant |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BULLETIN DE LA SOCIETE DE CHIMIE BIOLOGIQUE vol. 50, no. 4, 1968, PARIS FR pages 811 - 825; P.LABOUREUR ET AL.: "URATE OXYDASE D'ASPERGILLUS FLAVUS 1.OBTENTION,PURIFICATION,PROPRIETES" * |
| GENETICS vol. 100, no. 2, février 1982, AUSTIN US pages 185 - 208; C.SCAZZOCCHIO ET AL.: "POSITIVE REGULATION IN A EUKARYOTE,A STUDY OF THE uaY GENE OF ASPERGILLUS NIDULANS:1. CHARACTERIZATION OF ALLELES,DOMINANCE AND COMPLE MENTATION STUDIES, AND A FINE STRUCTURE MAP OF THE uaY-oxpA CLUSTER" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2664286B1 (fr) | 1994-09-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| ST | Notification of lapse |