FR2645967A1 - Procede d'adsorption d'un materiel immunologique, utilisation dans le domaine des reactions antigene/anticorps - Google Patents

Procede d'adsorption d'un materiel immunologique, utilisation dans le domaine des reactions antigene/anticorps Download PDF

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'adsorption d'un matériel immunologique, choisi parmi les antigènes et les anticorps, sur des microparticules, ledit procédé étant caractérisé en ce que successivement : a) l'on met en contact les microparticules avec un matériel immunologique, dans un milieu liquide approprié, à un pH compris entre environ 4 et environ 10, pendant au moins 1 heure, à une température de 0 à 60 degre(s)C, b) l'on met en contact les microparticules revêtues dudit matériel immunologique adsorbé ainsi obtenues avec un matériau stabilisant choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, afin de bloquer les sites d'adsorption actifs desdites particules non liés audit matériel immunologique. L'invention concerne également l'utilisation desdites microparticules revêtues par adsorption d'un matériel immunologique dans le domaine des dosages immunologiques, lesdites microparticules étant " invisibles " quand elles sont exposées à un rayonnement de longueur d'onde supérieure à leur diamètre moyen et devenant " visibles " sous le même rayonnement après agglutination.

Description

PROCEDE DADSORPTION D'UN MATERIEL IMMUNOCLOGIQUE, UTILISATION DANS
LE DOMAINE DES REACTIONS ANTIGENE/ANTICORPS
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention a trait h la fixation par adsorption d'un matériel immunologique antigène ou anticorps et à l1uti- lisation dudit matériel adsorbé dans le domaine des réactions immunologiques du type antigène/anticorps.
Elle concerne plus précisément un procédé d'adsorption d'un matériel immunologique sur des particules submicroniques, dans lequel on stabilise la fixation par adsorption au moyen d'un matériau stabilisant choisi parmi 1'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges.
Elle concerne en tant que produit industriel nouveau le réactif immunologique obtenu selon ce procédé et dans lequel les sites actifs desdites particules non occupés par ledit matériel inmunologique sont bloqués par ledit matériau stabilisant.
Elle concerne également l'utilisation de ce réactif im munologique dans le domaine des dosages impliquant des réactions du type antigène/anticorps, en faisant appel à des particules qui sont "invisibles" ou "transparentes't quand elles sont exposées à un rayonnement électromagnétique, tel que la lumière visible et les UV, et deviennent "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec un anticorps ou respectivement un antigène.
ART ANTERIEUR
On sait que l'on a déjà décrit dans le passé des techniques d'adsorption d'une substance immrnologique ou d'un matériel itirnunologique antigène ou anticorps sur des particules microniques ou submicroniques de latex en vue de réaliser notamnent des dosages turbidimétriques ou néphélométriques. Voir notamment à cet effet l'article de Y. NAYNARD et al., Clin. Hem., 32 (No 5), pages 752-757, (1986), qui a trait à l'utilisation d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-IgG adsorbés sur des microsphères de latex pour le dosage, dans des microcuvettes, dtimmunoglobulines sériques.
I1 se trouve que ces techniques connues d'adsorption sont limitées par plusieurs inconvénients à savoir - difficultés à réaliser des suspensions stables et standardi
sées, - autoagglutination spontanée des latex sensibilisés par un anti
corps ou un antigène, - faible plage de mesure de la courbe d'étalonnage [variation de
la densité optique (DO) n'excédant pas 0.3 à 0.4], - manque de sensibilité et de reproductibilité, - traitement du réactif particulaire avant emploi, dans certains
cas (pour désaggrégation), et mauvaise stabilité du réactif, - mise en oeuvre délicate et détection parfois complexe.
Ces inconvénients ont fait que ces méthodes n'ont pas été exploitées malgré leur intérêt pratique.
En particulier l'article de J. GRANGE et al., Journal of
Immunological Methods 18, pages 365-375, (1977) [qui préconise l'utilisation de billes suhnicroniques de latex de polystyrène carboxylé (diamètre moyen 0,3 micromètre) pour fixer un anticorps (dans le cas d'espèce un anticorps anti-IgG de lapin)] signale que "la préparation de sphères de latex contenant des antigènes ou des - anticorps adsorbés est difficile à standardiser en raison de leur tendance à stautoagglutiner lorsque le pH et la force ionique du milieu de dosage changent".
On connaît par ailleurs de l'article de J. WINKIES et al., "Enhanced-Latex-Agglutination Assay for C-Reactive Protein in Sertit, with Use of a Centrifugal Analyzer", Clin. Chem., 33 (No 5), pages 685-689, (1987), l'utilisation de particules sphériques subuicroniques de latex de polystyrène (diamètre moyen : 0,057 micromètre) sur lesquelles a été adsorbé un anticorps, dans le cas d'espèce un anticorps anti-Protéine C réactive, pour apprécier par comptage de particules (de préférence), turbidimétrie ou néphélométrie l'agglutination résultant de la mise en contact du complexe sphères de latex/anti-Protéine C réactive avec la
Protéine C réactive (en abrégé : CRP). La technique décrite par J.
WINKIES et al. implique un traitement par ultrasons (en anglais "sonication") jugé essentiel pour disperser et stabiliser les particules de latex (pour empêcher leur autoagglutination) et donc de permettre l'utilisation de ces particules pour adsorber le matériel immunologique (dans le cas d'espèce dudit article) l'anticorps antiRP. Le traitement par ultrasons, qui doit intervenir à nouveau avant toute utilisation du réactif immunologique constitué par le matériel immunologique adsorbé sur lesdites particules de latex, exige l'utilisation d'un matériel onéreux (à savoir le générateur d'ultrasons et son enceinte) et la mise en oeuvre de modalités opératoires compliquées perturbant ou limitant les possibilités de reproduction de ladite technique.
Voir à cet effet les indications données dans ledit article page 686, colonne de gauche, lignes 37-58, et, page 688, colonne de droite, lignes 54-62.
En bref, la technique de J. WINXIES et al., pour les dosages immunologiques du type antigène/anticorps exige des traitements et conservations à une température se situant entre -20 et + 40C et la mise en oeuvre d'un champ d'ultrasons pendant une durée de 60 s; si cette durée est supérieure à 60 s, elle entrasse une surchauffe détruisant le complexe sphères de latex/anticorps, et si le traitement par ultrasons est incomplet, la sensibilité du dosage avec le complexe sphères de latex anticorps résultant diminue considérablement et on est conduit à des résultats de dosage aberrants.
Plus récemnent, pour pallier les inconvénients des méthodes d'adsorption de la substance imunologique ou du matériel immunologique, la Demanderesse a proposé dans sa demande de brevet français No 89 00 660 déposée le 20 janvier 1989 [incorporée ici à titre de référence et dans laquelle figure une description détaillée de l'art antérieur], une solution technique faisant appel à la fixation par covalence d'un antigène ou d'un anticorps sur des particules submicroniques.Cette solution technique repose sur l'utilisation de particules de latex submicroniques (c'est-àdire ayant des dimensions ou diamètres moyens inférieurs à 1 micromètre), sensiblement sphériques, revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes et respectivement les anticorps, et telles que
(a) le diamètre moyen (d) desdites particules est inférieur à 200 nm et est avantageusement situé dans la gamne allant de 5 à 100 nm,
(b) le latex desdites particules comporte une fonctionnalité réactive assurant la fixation par covalence de ladite substance immunologique,
(c) lesdites particules revetues de ladite substance immunologique en suspension dans un milieu liquide aqueux étant "invisibles" ou "transparentes" quand elles sont exposées à un rayonnement ayant une longueur d'onde (po nettement supérieure au diamètre moyen (d) desdites particules, et
(d) lesdites particules rave tues de ladite substance inznunologique en suspension dans un milieu liquide aqueux devenant "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec une substance choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes correspondant à ladite substance imunnologique fixée sur lesdites particules.
BUT DE L'INVENTI
Il existe un besoin d'une technique de dosage immunologique mettant en oeuvre des antigènes ou anticorps adsorbés, relativement simple, différente des techniques EIA et
RIA, permettant de pallier les inconvénients précités de l'art antérieur, assurant une détermination rapide facilement automatisable et accessible à tout laboratoire d'analyse ou de recherche avec un vaste champ d'application, permettant d'atteindre un seuil de sensibilité d'au moins 100 ngtml, et donnant des résultats de dosages immunologiques équivalents ou similaires à ceux obtenus selon ladite demande de- brevet antérieure de la Demanderesse.
OBJET DE L'INV8NTION
Selon l'invention on préconise une nouvelle solution technique pour les dosages immunologiques du type antigène/anticorps par agglutination de particules de latex revêtues par adsorption d'un antigène (ou d'un anticorps) lorsque lesdites particules sont mises en contact avec l'anticorps (ou respectivement I 'antigène) correspondant.
Cette nouvelle solution technique comprend le blocage ou l'occupation des sites actifs des particules, qui ne sont pas occupés par le matériel imnunologique antigène ou anticorps, par un matériau stabilisant choisi parmi ltensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges.
Suivant un premier aspect de l'invention on préconise un procédé d'adsorption d'un matériel immunologique choisi parmi les antigènes et les anticorps sur des microparticules, caractérisé en ce que successivement (a) plion met en contact les microparticules avec un matériel immunologique, dans un milieu liquide approprié, à un pH compris antre environ 4 et environ 10, pendant au moins 1 h, à une température de O à 600C, (b) l'on met en contact les microparticules revêtues dudit matériel irimunologique adsorbé ainsi obtenues avec un matériau stabilisant choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, afin de bloquer les sites d'adsorption actifs desdites particules non liés audit matériel immunologique.
Suivant un second aspect de l'invention, on préconise en tant que produit industriel nouveau le réactif jiiimmologique constitué par lesdites particules revêtues par ledit matériel immunologique adsorbé et ledit matériau stabilisant.
Suivant un troisième aspect de l'invention, on préconise l'utilisation de ce réactif immunologique dans le domaine des dosages Limunologiques du type antigène/anticorps.
Les procédés de dosage suivant l'invention comprennent - la détermination directe d'un anticorps par agglutination après mise en contact dudit anticorps avec un réactif constitué par des particules de latex liées chacune par adsorption à un antigène; - la détermination directe d'un antigène par agglutination après mise en contact dudit antigène avec un réactif constitué par des particules de latex liées chacune par adsorption à un anticorps; et, - I1irhibition de l'agglutination du réactif latex/antigène en présence de l'anticorps correspondant et dosage indirect de l'antigène libre (notamment par compétition) ouvice-versa.
Ces procédés de dosage sont insensibles à la température dans les conditions usuelles d'utilisation et peuvent être mis en oeuvre à une température de O à 600C, en particulier de 4 à 609C et notamment à une température usuelle dans le domaine imrmniologique située dans la gamme de 15 à 370C.
La technique de dosage suivant l'invention, qui repose avantageusement sur le changement invisibilité/visibilité de particules subuicroniques, par agglutination se distingue de l'enseignement des solutions techniques de l'art antérieur susvisé.
Elle se différencie en particulier de la solution technique de l'article de J. WlNKlES et al. précité, qui prévoit l'utilisation de particules de latex ayant un diamètre moyen de 57 nm, en ce sens que, suivant l'invention, on supprime le traitement aux ultrasons particulièrement compliqué. Elle se différencie en outre par le fait que le réactif imnunologique est stable pendant de longues périodes (notamment supérieures à 1 an) et peut être utilisé directement sans traitement préalable quelle qu'en soit la nature.
Elle se différencie également de la solution technique décrite par Y. MAYNARD et al. précité par le mode d'adsorption du matériel immunologique. Selon l'article de Y. MAYNARD on n'utilise pas un matériau stabilisant pour bloquer, après adsorption de la substance immunologique, les sites actifs d'adsorption encore libres sur les microparticules, on prévoit uniquement la stabilisation des complexes anticorps adsorbé-antigène, qui ont été formés à partir de l'anticorps adsorbé, au moyen d 'un tampon contenant un polyol (dans le cas d'espèce un polyéthylèneglycol).
La technique de la présente invention se distingue enfin de celle de la demande antérieure de la Demanderesse par le mode de fixation (par covalence et non, comne cela est le cas ici, par adsorption) du matériel inmunologique, même si elle fait appel aux mêmes particules submicroniques et conduits à des résultats de dosages identiques ou similaires.
DESCRIPTION DETAIIILEE DE L'INVENTION
Suivant l'invention par les expressions "particules invisibles" et "particules visibles" on entend le fait que, d'une part, les particules dites invisibles ou transparentes n'absorbent ni ne diffusent le rayonnement électromagnétique, tel que la lumière, traversant le milieu contenant lesdites particules sans déviation substantielle dudit rayonnement, et d'autre part, les particules dites visibles absorbent et/au diffusent ledit rayonnement électromagnétique.
Par l'expression "substance immunologique" ou "matériel innmrnologique" on entend toute substance choisie parmi 1 'ensemble constitué par les antigènes et les anticorps et devant être adsorbée sur les microparticules.
Par le terme "ligand" on entend ici l'antigène ou l'anticorps lié par adsorption à chaque particule de latex.
Par l'expression "réactif immunologique" On entend l'ensemble constitué par les particules de latent la substance imnunologique choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes qui est liée par adsorption à chacune desdites particules.
Par les termes "substance" ou "compose correspondant" (homologue, complémentaire et/ou conjugué) d'un anticorps (ou d'un antigène), on entend l'antigène, ou respectivement l'anticorps, qui réagi t avec l'anticorps, ou respectivement l'antigène, du réactif imnunologique.
Le terme "antigène" désigne ici tout antigène proprement dit mais également toute substance à partir de laquelle on est susceptible de générer un anticorps; parmi les substances pouvant générer des anticorps on peut notamment citer les haptènes, les peptides, les médicaments comportant au moins un fragment peptidique, les alcaloïdes et d'une manière générale toute substance présentant une structure immunologique.
L'adsorption du stade (a) est réalisée dans un milieu liquide approprié à une température de O à 600C (notamment à une température de 4-600C, par exemple 15-370C ou mieux à 560C) pendant au moins 1 h, en particulier pendant une durée de I à 48 h. En pratique cette adsorption est mise en oeuvre à un pH de 4-10, avantageusement à un pH de 6-9, de préférence à un pu =de 8,2-8,5 et mieux à un pH de 8,35. De façon avantageuse, on mettra en contact dans ledit milieu liquide 100 parties en poids de microparticules avec 1 à 50 parties en poids de matériel immunologique à adsorber [par exemple I ml de microparticules (à la concentration de 10 % p/v, soit 100 mg) pour 1 à 50 mg de matériel immunologique].
De façon avantageuse, ledit milieu liquide aura une force ionique comprise entre environ 0,01 et environ 0,5 et sera de préférence constitué par un tampon glycine.
Il est important que le matériel immwnologique utilisé au stade (a) soit une substance hautement purifiée afin (i) d'éviter ultérieurement des réactions parasites ou des phénomènes d'autoagglutination qui empêchent la standardisation et diminuent la sensibilité des dosages, et (ii) de permettre ainsi une réactivité suffisante.
De façon également avantageuse on fera appel à des microparticules de latex dont le diamètre moyen (d) est inférieur ou égal à 300 nm, de préférence inférieur ou égal à 200 nm et mieux situé dans la gamne allant de 65 à 100 nm.
Le stade (b) a pour objet de bloquer la totalité ou à la rigueur la majeure partie des sites actifs d'adsorption des microparticules non liés au matériel immunologique adsorbé. Le matériau stabilisant utilisé à cet effet est choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques (telles que I'albanine et la caséine), les substances peptidiques, les substances polyosiques contenant un ou plusieurs groupes acide carboxylique ou carboxylate (telles que notarrment l'acide alginique, les alginates et les carragheenates), leurs analogues et leurs mélanges.Le matériau stabilisant préféré selon 1 'invention est une substance polyhydroxylée, c'est-à-dire une substance comportant au moins deux groupes OH dans sa molécule, 1'albumine et les mélanges d'une telle substance polyhydroxylée avec une protéine Conviennent à cet effet l'éthylèneglycol, le propylèneglycol, les polymères polyhydroxylés (tels que les polyéthylèneglycols, en abrégé PDG, et polypropylèneglycols, en abrégé PPG), 1'albumine, et mieux les glycérol, éthylèneglycol, PDG et mélanges glycérol-protéine et PEG-protéine.
Le stade (b) sera avantageusement mis en oeuvre suivant des conditions opératoires analogues à celle du stade (a), à savoir à un pH de 4-10, avantageusement de 6-9, de préférence 8,28,5 et mieux de 8,35, à une température de 0-609C (par exemple de 15-370C, de préférence à 560C) pendant au moins 1 h, en particulier pendant une durée de 1-48 h. Le milieu liquide approprié pour la mise en oeuvre du stade (b) aura de préférence une force ionique de 0,01 environ à 0,5 environ, et sera avantageusement constitué par un tampon glycine.
De fanon pratique, le matériau stabilisant sera utilisé en excès par rapport au nombre de sites actifs d'adsorption encore présent sur les microparticules après l'adsorption du stade (a).
De façon avantageuse on utilisera 10 à 100 parties (de préférence 20-40 parties) en poids de matériau stabilisant pour 100 parties en poids de microparticules et 1 à 50 parties en poids de matériel immunologique utilisés au stade (a).
Le cas échéant, le stade (b) pourra être suivi d'une opération comprenant
(c) l'addition d'un ballast, notamment protéique ou hydroxvlé pour conservation, notamment par lyophilisation.
Le ballast qui intervient au stade (c) est avantageusement une substance protéinique ou une substance hydroxylée comportant au moins un groupe OH par molécule et de préférence au moins 2 groupes OH par molécules. En particulier, ledit ballast peut être constitué par les protéines et les composés polyhydroxylés utilisés au stade (b).
Le meilleur mode de mise en oeuvre du procédé d'adsorption suivant l'invention consiste - au stade (a), à mettre en contact 100 parties en poids de particules submicroniques de latex ayant un diamètre moyen inférieur ou égal à 300 nm, avec 2 à 20 parties en poids de matériel immunologique, dans un tampon glycine, à pH 8,2-8,5 et mieux à un pH de 8,35, pendant 1-2'l h, à une température de 560C, la force ionique du milieu aqueux de mise en contact étant comprise entre environ 0,01 et environ 0,5 - au stade (b) à mettre en contact, après les avoir rincées, lesdites particules de latex sur lesquelles ledit matériel inimmologique a été adsorbé avec un matériau stabilisant en excès par rapport aux sites actifs d'adsorption encore libres sur lesdites particules, ledit matériau stabilisant étant.choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes
OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/au carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, de préférence à raison de 10 à 100 parties en poids dudit matériau stabilisant pour 100 parties en poids de particules de latex utilisées au stade (a), dans un tampon glycine, à pH 8,2-8,5 et mieux à un pH de 8,35, pendant 1-24 h, à une température de 560C, la force ionique du milieu aqueux de mise en contact étant comprise entre environ 0,01 et environ 0,5; puis, - le cas échéant, au stade (c) à ajouter ledit ballast précité pour conservation.
Suivant le meilleur mode de mise en oeuvre d'adsorption selon l'invention, le matériau stabilisant est avantageusement choisi parmi les glycérol, éthylèneglycol, PEG et les mélanges glycérol-protéine et PDG-protéine.
Selon un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de l'invention les particules servant à l'adsorption du matériel immunologique seront des particules submicroniques c'est-à-dire des particules ayant des dimensions ou diamètres moyens inférieurs à 1 micromètre, et mieux, des particules qui sont "invisibles" sous un rayonnement électromagnétique tel que la lumière et qui deviennent "visibles" après agglutination sous ledit rayonnement comme prévu dans la demande antérieure précitée de la Demanderesse.
Ainsi selon l'invention on préconise des particules de latex submi croniques, revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes et respectivement les anticorps, lesdites particules, qui sont utiles dans les dosages immunologiques du type antigène/anticorps, étant caractérisées en ce que
(1) leur diamètre moyen (d) est inférieur à 300 nm, de préférence inférieur ou égal à 200 nm et mieux situé dans la gambe allant de 5 à 100 nm,
(2) le latex desdites particules assure la fixation par adsorption de ladite substance immunologique, les sites actifs desdites particules non liés à ladite substance immunologique étant essentiellement bloqués par un matériau stabilisant choisi parmi 1' ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges.
(3) lesdites particules revêtues de ladite substance immunologique et dudit matériau stabilisant mises en suspension dans un milieu liquide aqueux sont invisibles quand elles sont exposées à un rayonnement ayant une longueur d'onde cas supérieure au diamètre moyen (d) desdites particules, et
(4) lesdites particules revêtues de ladite substance imnunologique et dudit matériau stabilisant mises en suspension dans ledit milieu liquide aqueux deviennent "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec une substance choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes et qui correspond à ladite substance immunologique fixée sur lesdites particules.
Comne indiqué ci-dessus, on préfère que les particules de latex utiles selon l'invention aient un diamètre moyen (d) inférieur à 200 nm, de préférence inférieur ou égal à 100 nm, et mieux situé dans la gamine allant de 5 à 100 Tin.
Le rayonnement électromagnétique utilisé selon l'invention pour apprécier la variation de l'agglutination lors de la réaction du réactif immunolQgique avec son conjugué doit alors avoir une longueur d'onde () nettement supérieure au diamètre moyen (d) des particules de latex. De façon avantageuse ladite longueur d'onde sera située dans la gamne allant de 300 à 1000 nm.
De préférence on fera appel à un rapport A /d supérieur ou égal à 5.
Le latex utilisé selon l'invention pour adsorber le matériel ininunologique peut comporter une fonctionnalité réactive.
Conviennent à cet effet les latex comprenant des fonctions acide carboxylique (COOH), des fonctions hydroxyle (OH), des fonctions amine primaire (NH2), des fonctions amine secondaire (NHR), des fonctions thiol (SH), des fonctions carboxamide (CONS2 ou CONHR'), ou des fonctions carboxylate (COOR"), Où R, R' et R" sont des groupes de blocage usuels dans le domaine immunologique. R peut notamment représenter un reste hydrocarboné notamment un radical alkyle en C1-C4; R' peut notarrment représenter un reste hydrocarboné notamment un groupe alkyle en C1-C4, phényle ou benzyle;R" peut notamment représenter un reste hydrocarboné notamment un radical alkyle en C1-C4 tel que méthyle, éthyle, isopropyle, t-butyle ou s-butyle.
En pratique les groupes de la fonctionnalité réactive représenteront approximativement 100 à 450 micro-équivalents par gramne de latex.
Parmi les latex qui conviennent on peut notamnent mentionner les latex polyacryliques, polyméthacryliques, polyacrylates et polyméthacrylates, en particulier les latex de poly(méthacrylate d'alkyle en c'-C4), par exemple le poly (méthacrylate de butyle) et le poly(méthacrylate de méthyle) comportant, selon le pH du milieu des groupes CH et/ou COOR" (dans lesquels le nombre total de groupes COOH et COOR" présents représente 250 à 300 micro-équivalents par gramme de latex).
Conviennent également les homopolymères ou copolymères tels que les polystyrènes et polyvinyltoluènes, et les copolymères de styrène/divinylbenzène et de styrène/butadiène, qui comportent chacun une fonctionnalité réactive telle que visée ci-dessus.
De façon avantageuse les particules de latex utilisées selon l'invention présenteront une granulométrie sensiblement uniforme, d étant inférieur à 200 nm, de préférence inférieur à égal à 100 nm et mieux situé dans la gamne allant de 5 à 100 nm.
La particularité majeure des latex est leur faculté à former des suspensions stables pouvant être déstabilisées de façon spécifique dans des conditions définies, dans le cas d'espèce la réaction antigène/anticorps. Suivant l'invention, les particules sensibilisées par un antigène ou un anticorps, par exemple un haptène, conservent les propriétés inhérentes au latex et celle de la substance inmunologique couplée. Lesdites particules restent monodispersées durant le stockage et s 'agrègent uniquement en présence de ltélément complémentaire du système ligand/antiligand.
Dans le mode de sensibilisation des particules de latex et de fixation du ligand par adsorption, les conditions expérimentales, à savoir le pH, la force ironique, le volume, la température, la durée et la concentration du ligand sont ajustées en fonction de la nature du produit à doser de façon à assurer
une parfaite stabilité du réactif inounologique
particulaire dans un milieu biologique approprié,
-une réactivité maximale et une reproductibilité
efficace, et
-une excellente conservation du réactif imnunologique au
stockage (on n'a observé à la fin d'une durée de
conservation de 12-18 mois à + 40C aucune dégradation
ou inactivation substantielle dudit réactif).
D'un point de vue pratique, on constate que, quel que soit le tampon, l'augmentation du pH et de la force ionique entraine une stabilisation du réactif immunologique, d'une part, et provoque une diminution proportionnelle de la réactivité, d'autre part.
C'est pourquoi on préconise pour la préparation du réactif inimmologique un ajustement global, qui permet de pallier l'aspect antinomique susvisé, et qui fait appel à un milieu aqueux liquide comprenant de lteau et un moyen tampon, ayant un pH dans la gamne allant de 4 à 10, (avantageusement 6-9 et mieux 8,28,5), ayant une force ionique située dans la gamne de 0,01 à 0,5, et contenant, le cas échéant, pour stabiliser les particules de latex, un ballast inerte protéinique ou polyhydroxylé incorporé au stade (c).
De façon pratique, la réaction du réactif immunologique avec la substance complémentaire ou conjuguée sera effectuée dans un milieu liquide aqueux ayant un pH de 5-9, une force ionique de 0,01-0,5 et contenant le cas échéant un alcool polymère et/ou une substance choisie parmi les protéines et les aminoacides inertes.
Le procédé de dosage que 1 'on préconise suivant 1 'inven- tison, qui met en oeuvre une réaction du type antigène/anticorps est caractérisé en ce qu'il consiste (A) à mettre en contact, dans un milieu liquide aqueux ayant un pH situé dans la gamme de 5 à 10 et une force ionique située dans la gamne de 0,01 à 0,5, (i) des particules ayant un diamètre moyen (d) inférieur à 300 nm et revêtues d'une substance imunologique choisie parmi les antigènes et les anticorps et liée par adsorption à chacune desdites particules, les sites actifs de chacune desdites particules non liés à ladite substance immunologique étant essentiellement bloqués par un matériau stabilisant choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, avec (ii) une substance complémentaire au conjuguée de ladite substance immunologique, et (B) à apprécier l'évolution de l'agglutination par exposition à un rayonnement ayant une longueur d'onde (A) située dans la gamne de 300 à 1000 nm, telle que le rapport A /d soit supérieur ou égal à 5.
Dans ce procédé, on apprécie soit l'agglutination propement dite soit l'inhibition de l'agglutination.
La température que lton préconise pour la mise en oeuvre de ce procédé est située dans la gamme de 4 à 600C et mieux de 15 à 370C.
De préférence, le dosage sera réalisé par turbidimétrie.
Le dosage par turbidimétrie offre l'avantage de permettre une utilisation aisée par tout laboratoire équipé uniquement d'un photomètre ou d'un spectrophotomètre (travaillant à une longueur d'onde comprise entre 300 et 1000 nm) ou équipé d'un appareillage automatique et sophistiqué (type analyseur centrifuge tel que l'analyseur "Cobas Bio").
Le dosage peut également être réalisé par néphélométrie ou par comptage de particules avec, en contre-partie, une utilisation plus restrictive, compte tenu du cotit de 1' appareillage.
La sensibilité du dosage suivant l'invention est d'une manière générale dtau moins 100 ng/ml. Dans certains cas, le seuil de sensibilité, notamment par néphélométrie, pourra être inférieur, et égal à au moins 10 ng/ml.
La durée du dosage est comprise entre 30 et 600 s.
Un tel dosage est applicable à la détermination quantitative d'antigènes et d'anticorps d'une part, de toutes substances susceptibles de générer des anticorps telles que les haptènes, les peptides, les médicaments comportant au moins un fragment peptide, et les alcaloides, d'autre part, dans divers milieux biologiques, tels que plasma, sérum, urine, liquide céphalorachidien, et extraits biologiques, pour divers secteurs de la technique tels que la santé animale, la santé humaine, le domaine agro-alimentaire, 1 'environnement et analogues.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention seront mieux compris à la lecture qui va suivre d'exemples de réalisation nullement limitatifs mais donnés à titre d'illus- tration.
EXEMPLE 1
Préparation du réactif immunologique
On fait appel à un latex de poly(méthacrylate de butyle) carboxylé sous la forme de billes ayant un diamètre de 67 nm fabriqué par la société dite RHONE POULC, la fonctionnalité réactive de ce latex représentant une quantité de 250 à 300 microéquivalents de groupes carboxylés par gramme de latex.
La fixation par adsorption de la substance immunologique (i.e. l'antigène ou l'anticorps est effectuée à la surface du matériau polymère des particules). On met en contact dans un tampon glycine à pH 8,35 100 mg (1 ml à la concentration de 10 X p/v) de particules subuicroniques de latex avec 1 à 50 mg (de préférence 2 à 20 mg) d'anticorps (ou d'antigene) de haute pureté.
On incube à 560C pendant 1-24 h.
On rince les particules subuicroniques sur lesquelles a été fixée la substance immunologique, puis après mise en suspension dans le même tampon glycine à pH 8,35, on ajoute 20 à 40 mg de matériau polyhydroxylé, de préférence ici le diéthylèneglycol, le glycérol ou le PEG; on incube ensuite à 560C pendant 124 h.
On dilue ensuite la suspension résultante à la dilution d'utilisation (ici 0,075 % p/v) au moyen du tampon glycine de stabilisation contenant ledit matériau polyhydroxylé (ici ltéthylèneglycol, le glycérol ou le PEG) et de l'albumine.
EXEMPLE 2
Dosage des PDF sur sérum
Dans la cuve de mesure sont introduits successivement 15 g de standard ou d'échantillon à doser et 500 oul (en spectrophotométrie) ou 200 Ail (sur Cobas Bio) de billes de latex revêtues d'un anticorps et diluées en tampon de réaction (concentration finale 0,075 %) [préparées selon l'exemple 1 à partir d'un anticorps anti-PDF, généré selon une méthode connue en soi à partir d'un ou plusieurs PDF (produit de dégradation du fibrinogène)]. La lecture est effectuée à 600 nm au bout de 60 à 600 s de réaction en lecture manuelle sur spectrophotomètre ou 30 à 180 s en lecture automatique sur "Cobas Bio" ou tout autre mesure cinétique.La rapidité de la réaction permet également une lecture en cinétique entre 60 s et 600 s manuellement (figure 1), au entre 30 s et 600 s sur analyseur "Cobas Bio" (figures 2a et 2b). L'effet de zone est observé pour des concentrations supérieures à 500 ,ug/mi dans l'échantillon. Une prédilution supplémentaire permet d'éliminer tout risque d'erreur par excès d'antigène. Le seuil de détection dans le milieu réactionnel se situe à 100 ng/ml.
La figure 1 donne les courbes d'étalonnage lA, 1B et 1C pour des durées de réaction de 2,5 et respectivement de 10 minutes dans le système absorbance A (en ordonnées) / concentration finale en PDF exprimée en sslg/ml (en abscisses), sous une exposition à un rayonnement de 600 nm.
La figure' 2a donne les courbes des cinétiques obtenues lors du dosage des PDF dans le système densité optique D (en ordonnées) / durée de réaction T exprimée en secondes (en abscisses) pour des concentrations finales de PDF de O (courbe 2A); 0,75 (courbe 2B); 1,5 (courbe 2C); 3 (courbe 2D); 4,5 (courbe 2E) et 7,5 jigîmi (courbe 2F), sous une exposition à un rayonnement de 600 nm, au moyen d'un analyseur "Cobas Bio".
De même la figure 2b donne les courbes des cinétiques obtenues lors du dosage des PDF dans le système densité optique D (en ordonnées) / durée de réaction T exprimée en minutes (en abscisses) pour des concentrations finales en PDF de O (courbe 2'A); 0,4 (courbe 2'B); 0,9 (courbe 2'C); 1,8 (courbe 2'D); 3,75 (courbe 2'E) et 7,5 Dgfiml (courbe 2'F) sous une exposition à un rayonnement de 600 rm, au moyen d'un analyseur "Cobas Bio".
EXUMPLE 3
Dosage direct de l'Antithrombine III (AT III)
50 l de standard ou d'échantillon prédilué 80 fois sont mélangés aux latex-anticorps [préparés selon l'exemple 1 à partir d'anti-AT III J dilués sous un volume de 500ssug dans le tampon de réaction (0,075 Z p/v final).
La lecture est effectuée à 600 T'a après 2 à 10 minutes de réaction. La gamme d'étalonnage est comprise entre O et 200 % d'AT III plasmatique, ce qui correspond à des valeurs comprises entre O et 3,7 pglml dans le milieu réactionnel (figure 3).
La figure 3 donne la courbe d'étalonnage à 600 rin de 1'AT III plasmatique (en abscisses : concentrations finales en AT
III en g/ml et en AT III plasmatique correspondante exprimée en Z; avec en ordonnées : la densité optique D) après 5 minutes dtinclrhtion.
EXEMPLE 4
Dosage indirect des PDF
On introduit préalablement dans la cuve de mesure 200 l d'anticorps, dans le cas d'espèce un anti-PDF, et 60O de
PDF libres prédilués. On déclenche ensuite la réaction en ajoutant les billes de latex sensibilisées par des PDF (à 0,75%) [préparées selon l'exemple 1 par adsorption de PDF sur lesdites billes] afin d'obtenir un volume final de 1 ml.
Les concentrations en PDF à doser, se traduisant par une inhibition de la réaction, sont exprimées en fonction de la variation de la densité optique ou de l'absorbance mesurée à 600 nm sur spectrophotomètre.
La figure 4 ci-après donne la courbe d'inhibition de l'agglutination du réactif latex/PDF dans le système densité optique D (en ordonnées), concentration des PDF exprimée en ugîmi (en abscisse) à 600 nm.
Conformément à l'invention on préconise des nécessaires ou trousses de dosages contenant notamment en suspension dans un liquide aqueux (i) des microsphères de latex destinées à être liées par adsorption avec la substance immunologique de l'utilisateur, ou (ii) des réactifs immunologiques dans lesquels la substance immunologique est adsorbée sur chacune des microsphères pour constituer, notamment un réactif immunologique utile en particulier dans le domaine de l'hémostase, tel que latex/PDF, latex/anti-PDF, latex/anti-AT III ou latex/AT III.

Claims (15)

FiNn3NDICAIIoRS
1. Procédé d'adsorption d'un matériel immunologique, choisi parmi les antigènes et les anticorps, sur des microparticules, ledit procédé étant caractérisé en ce que successivement (a) l'on met en contact les microparticules avec un matériel immunologique, dans un milieu liquide approprié, à un pH compris entre environ 4 et environ 10, pendant au moins 1 h, à une température de O à 600C, (b) l'on met en contact ~les microparticules revêtues dudit matériel imunologique adsorbé ainsi obtenues avec un matériau stabilisant choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, afin de bloquer les sites d'adsorption actifs desdites particules non liés audit matériel immunologique.
2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel, au stade (a), on met en contact dans ledit milieu liquide 100 parties en poids de microparticules avec 1 à 50 de préférence 2 à 20 parties en poids de matériel immunologique à adsorber, pendant 148 h.
3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel, au stade (a), les microparticules ont un diamètre moyen inférieur au égal à 300 m, de préférence un diamètre moyen inférieur ou égal à 200 rn, et mieux un diamètre moyen situé dans la gamme allant de 5 à 100 rin.
4. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel, au stade (b), lton met en contact, après les avoir rincées, les microparticules, sur lesquelles a été adsorbé le matériel immunologique, avec ledit matériau stabilisant, à raison de 10 à 100 parties en poids de matériau hydroxylé pour 100 parties en poids de microparticules initialement utilisées au stade (a), pendant 1 à 48 h, à un pH de 4-10, avantageusement 6-9, de péférence 8,2-8,5 et mieux à un pH de 8,35, à une température de 0-600C.
5. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que ledit matériau stabilisant est une substance choisie parmi les composés contenant au moins 2 groupes OH par molécule et leurs mélanges avec les protéines.
6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le stade (b) est suivi d'une opération comprenant (c) l'addition d'un ballast notamment protéique ou hydroxylé pour conservation.
7. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le milieu d'adsorption du stade (a) et le milieu de stabilisation du stade (b) ont chacun une force ionique comprise entre environ 0,01 et environ 0,5.
8. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que, successivement (a) on met en contact 100 parties en poids de particules submicroniques de latex ayant un diamètre moyen inférieur ou Egal à 300 nm, avec 2 à 20 parties en poids de matériel immrnologiqe, dans un tampon glycine, à pH 8,2-8,5 et mieux à un pH de 8,35, pendant 1-24 h, à une température de 560C, la force ionique du milieu aqueux de mise en contact étant comprise entre environ 0,01 et environ 0,5;; (b) on met en contact, après les avoir rincées, lesdites particules de latex sur lesquelles ledit matériel immunologique a été adsorbé avec un matériau stabilisant en excès par rapport aux sites actifs d'adsorption encore libres sur lesdites particules un matériau stabilisant choisi parmi 1'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/au carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, de préférence à raison de 10 à 100 parties en poids dudit matériau stabilisant pour 100 parties en poids de particules de latex utilisées au stade (a), dans un tampon glycine, à pH 8,2-8,5 et mieux à un pH de 8,35, pendant 1-24 h, à une température de 560C, la force ionique du milieu aqueux de mise en contact étant comprise entre environ 0,01 et environ 0,5; puis, le cas échéant, (c) on ajaute ledit ballast.
9. Particules de latex submicroniques, revêtues d'une substance immunologique choisie parmi les antigènes et respectivement les anticorps, lesdites particules, qui sont utiles dans les dosages immunologiques du type antigène/anticorps, étant caractérisées en ce que
(1) leur diamètre moyen (d) est inférieur à 300 w, de préférence inférieur ou égal à 200 nu et mieux situé dans la gamme allant de 5 à 100 nm,
(2) le latex desdites particules assure la fixation par adsorption de ladite substance immunologique, les sites actifs desdites particules non liés à ladite substance immunologique étant essentiellement bloqués par un matériau stabilisant choisi parmi 1' ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes 0E par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges.
(4) lesdites particules revêtues de ladite substance immunologique et dudit matériau stabilisant mises en suspension dans ledit milieu liquide aqueux deviennent "visibles" par agglutination quand elles sont exposées audit rayonnement après mise en contact avec une substance choisie parmi les anticorps et respectivement les antigènes et qui correspond à ladite substance immunologiqua fixée sur lesdites particules.
(3) lesdites particules revêtues de ladite substance immunologique et dudit matériau stabilisant mises en suspension dans un milieu liquide aqueux sont invisibles quand elles sont exposées à un rayonnement ayant une longueur d'onde (A) supérieure au diamètre moyen (d) desdites particules, et
10. Particules suivant la revendication 9, caractérisées en ce qu'elles sont élaborées à partir d'un latex dans lequel la fonctionnalité réactive représente approximativement 100 à 450 micro-équivalents de groupes réactifs par gramme de latex.
11. Utilisation de particules de latex suivant i 'une quelconque des revendications 9 à 10, dans le domaine des dosages immunologiques du type antigènelanticorps.
12. Procédé de dosage mettant en oeuvre une réaction du type antigène/anticorps caractérisé en ce qutil consiste (A) à mettre en contact, dans un milieu liquide aqueux ayant un pH situé dans la gamine de 5 à 10 et une force ionique située dans la gamme de 0,01 à 0,5, (i) des particules ayant un diamètre moyen (d) inférieur à 300 nm et revêtues d'une substance ininunologique choisie parmi les antigènes et les anticorps et liée par adsorption à chacune desdites particules, les sites actifs de chacune desdites particules non liés à ladite substance immunologique étant essentiellement bloqués par un matériau stabilisant choisi parmi l'ensemble constitué par les substances hydroxylées contenant un ou mieux plusieurs groupes OH par molécule, les substances protéiniques, les substances peptidiques, les substances polyosiques comportant un ou plusieurs groupes acide carboxylique et/ou carboxylate, la polyvinylpyrrolidone, leurs analogues et leurs mélanges, avec (ii) une substance complémentaire ou conjuguée de ladite substance immunologique, et (B) à apprécier l'évolution de l'agglutination par exposition à un rayonnement ayant une longueur d'onde (À) située dans la gamme de 300 à 1000 nm, telle que le rapport A /d soit supérieur ou égal à 5.
13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que la température de la mesure de l'évolution de l'agglutination se situe dans la gamme allant de 4 à 60"C et de préférence dans la gamme de 15 à 370C.
14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé en ce que l'on mesure (i) l'agglutination desdites particules, ou (ii) l'inhibition de l'agglutination desdites particules.
15. Nécessaire pour dosage inimmologique, caractérisé en ce qu'il comprend, en suspension dans un liquide aqueux des particules de latex submicroniques selon la revendication 9.
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