FR2495326A1 - Procede de dosage immunologique, du type a agglutination, pour deceler des anticorps de type immunoglobuline - Google Patents
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Abstract
Procédé de dosage immunologique, du type à agglutination, pour déceler des anticorps de type immunoglobuline. On revêt tout d'abord des creux de plaques de microtitrage avec de l'anticorps anti-humain IgM, puis l'on ajoute l'échantillon de sérum d'essai et l'on fait incuber. Après enlèvement des matières non adsorbées des creux, on ajoute à un pH basique une forme insoluble de l'antigène toxoplasmique, comme des organismes entiers. Si le sérum ne contient pas d'anticorps antitoxoplasmiques IgM, l'antigène apparaîtra sous forme d'un culot lisse au fond du creux et, si de tels anticorps sont présents en une quantité importante, l'antigène sera distribué sous forme d'un revêtement uniforme sur la paroi mouillée du creux. Application : détection d'une infection, notamment celle due à Toxoplasma gondii en cas de toxoplasmose.
Description
L'invention concerne un procédé de dosage irrmu- nologique du type à agglutination, destiné à déceler des
immunoglobulines, anticorps qui sont spécifiques d'un
antigène donné. L'invention convient particulièrement bien
pour déceler des immunoglobulines (IgM), anticorps associés
à des formes aiguës d'une infection par des toxoplasmes
ou d'une toxoplasmose infectieuse.
immunoglobulines, anticorps qui sont spécifiques d'un
antigène donné. L'invention convient particulièrement bien
pour déceler des immunoglobulines (IgM), anticorps associés
à des formes aiguës d'une infection par des toxoplasmes
ou d'une toxoplasmose infectieuse.
On a utilisé jusqu a présent plusieurs techniques pour effectuer le diagnostic sérologique d'une infection par des toxoplasmes en décelant des anticorps de l'antigène de toxoplasmes. Parmi ces essais, il y a l'essai d'agglutination directe(DA) et ses variantes ainsi que l'essai ou test IgM-ELISA. L'essai d'agglutination directe et ses perfectionnements sont étudiés par G. Desmonts et J.S.
Remington dans "Direct Agglutination Test for Diagnosis of Toxoplasma Infection : Method for Increasing Sensitivity and Specificity" /Essai d'agglutination directe pour le diagnostic d'une infection par des toxoplasmes : procédé pour en augmenter la sensibilité et la spécificité7, J.Clin.
Microbiology, volume 11, NO 6, pages 562-568, juin 1980.
Ce procédé implique d'ajouter des organismes entiers à diverses dilutions de sérum dans les creux ou puits d'une plaque de microtitrage et d'effectuer une lecture visuelle de la forme de distribution des organismes (ou de leur "agglutination") dans les creux. Un culot ou bouton lisse d'organises au fond d'un creux constitue une lecture cor
respondant à un résultat entièrement négatif. Une distribution uniforme des organismes sur la paroi mouillée d'un
creux constitue une lecture correspondant à un résultat nettement positif. Des lectures intermédiaires sont des
indices de la présence de quantités variables d'anticorps
antitoxoplasmiques dans le sérum. On peut effectuer des
extrapolations quantitatives de ces lectures visuelles en
les corrélant à des lectures effectuées sur des sérums
normaux.Comme indiqué dans l'article précité, l'essai basique d'agglutination directe manque de spécificité et de sensibilité, mais l'essai peut etre amélioré par l'utilisation d'une préparation particulière d'un organisme et par le traitement du sérum à l'aide du 2-mercaptoéthanol pour inactiver les immunoglobulines IgM ou anticorps.
respondant à un résultat entièrement négatif. Une distribution uniforme des organismes sur la paroi mouillée d'un
creux constitue une lecture correspondant à un résultat nettement positif. Des lectures intermédiaires sont des
indices de la présence de quantités variables d'anticorps
antitoxoplasmiques dans le sérum. On peut effectuer des
extrapolations quantitatives de ces lectures visuelles en
les corrélant à des lectures effectuées sur des sérums
normaux.Comme indiqué dans l'article précité, l'essai basique d'agglutination directe manque de spécificité et de sensibilité, mais l'essai peut etre amélioré par l'utilisation d'une préparation particulière d'un organisme et par le traitement du sérum à l'aide du 2-mercaptoéthanol pour inactiver les immunoglobulines IgM ou anticorps.
L'essai IgM-ELISA /''enzyme-linked immunosorbent assay" ; procédé de dosage à l'aide d'un agent de sorption immunologique avec liaison sur une enzyme7 est décrit dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique n 194 682 intitulée "IUNOASSAY FOR DETECTING ANT ITOXOPLASt4A ANTIBODIES /Procédé de dosage immunologique pour déceler des anticorps antitoxoplasmiques/. C' est un essai en double sandwich dans lequel une surface d'un agent de sorption immunologique, comme le creux d'une plaque de microtitrage, est tout d'abord revêtue d'un anticorps d'immunoglobuline M (IgM) anti-humain.
Un échantillon de fluide corporel est ensuite appliqué à la surface, et tous les anticorps antitoxoplasmiques d'immuno- globulines [i(IgM) de l'échantillon se fixeront sur le revêtement de l'anticorps d'immunoglobuline M anti-humain. Une solution de l'antigène Toxoplasma gondii est ensuite appliquée puis l'on applique un conjugué dsanticorps antitoxoplasmique de non-primate marquépar une enzyme. La présence du conjugué (et donc celle des anticorps antitoxoplasmiques de l'echantillon) est décelee par le traitement de la surface par un substrat d'enzyme et par la lecture de la surface par examen spectrophotométrique.
Le procédé de la présente invention combine des aspects de l'essai d'agglutination directe et de l'essai de
IgM-ELISA, et l'invention propose une technique bien plus sensible et spécifique que l'essai d'agglomération directe et plus simple et plus facile à lire que l'essai IgM-ELISA.
IgM-ELISA, et l'invention propose une technique bien plus sensible et spécifique que l'essai d'agglomération directe et plus simple et plus facile à lire que l'essai IgM-ELISA.
L'invention vise un procédé de dosage immunologique destiné à déceler des immunoglobulines, anticorps spécifique d'un antigène, dans un échantillon de fluide corporel. Le procédé comprend les étapes consistant à
a) adsorber sur une surface solide un anticorps de ces immunoglobulines ;
b) appliquer l'échantillon sur l'anticorps des irninunoglobulines adsorbé et à faire incuber le mélange résultant
c) séparer la fraction non-adsorbée de la fraction adsorbée du mélange provenant de l'étape (b)
d) appliquer une forme insoluble de l'antigène la fraction adsorbée ; et
e) déterminer le degré de liaison de l'antigène à la fraction adsorbée en observant la distribution de l'antigène sur cette surface.
a) adsorber sur une surface solide un anticorps de ces immunoglobulines ;
b) appliquer l'échantillon sur l'anticorps des irninunoglobulines adsorbé et à faire incuber le mélange résultant
c) séparer la fraction non-adsorbée de la fraction adsorbée du mélange provenant de l'étape (b)
d) appliquer une forme insoluble de l'antigène la fraction adsorbée ; et
e) déterminer le degré de liaison de l'antigène à la fraction adsorbée en observant la distribution de l'antigène sur cette surface.
Dans son application à la détermination des immunoglobulines, anticorps associés à une forme aiguë d'infection par toxoplasme dans un échantillon de fluide corporel humain, le procédé de dosage implique les étapes consistant a :
a) adsorber sur une surface solide des anticorps (IgM) anti-humains
b) appliquer l'échantillon sur les anticorps anti-humains (IgM) adsorbés et faire incuber le mélange résultant ;
c) séparer la fraction non-adsorbée de la fraction adsorbée du mélange incube provenant de l'étape (b)
d) appliquer une forme insoluble de l'antigène
Toxoplasma gondii à la fraction adsorbée provenant de l'étape (c) a un pH basique et faire incuber le mélange résultant ; et
e) déterminer le degré de fixation par liaison de l'antigène sur la fraction adsorbée provenant de l'étape (c) en observant la distribution de l'antigène sur la surface.
a) adsorber sur une surface solide des anticorps (IgM) anti-humains
b) appliquer l'échantillon sur les anticorps anti-humains (IgM) adsorbés et faire incuber le mélange résultant ;
c) séparer la fraction non-adsorbée de la fraction adsorbée du mélange incube provenant de l'étape (b)
d) appliquer une forme insoluble de l'antigène
Toxoplasma gondii à la fraction adsorbée provenant de l'étape (c) a un pH basique et faire incuber le mélange résultant ; et
e) déterminer le degré de fixation par liaison de l'antigène sur la fraction adsorbée provenant de l'étape (c) en observant la distribution de l'antigène sur la surface.
Voici une description plus détaillée de modes de réalisation de l'invention.
Le procédé de dosage immunologique de l'invention est particulièrement utile pour le diagnostic sérologique de formes aiguës congénitales (néo-natales et péri-natales) et post-natales de la toxoplasmose et d'une infection par toxoplasme affligeant les êtres humains. On pense que les immunoglobulines X (IgM), anticorps antitoxoplasmiques associés à des formes aIguës de cette infection,se présentent dans la plupart, sinon dans la totalité, des fluides corporels comme le sérum, le fluide péritonéal, l'urine, la salive, le fluide vaginal, le fluide cérébrospinal et le fluide amniotique.En raison de la facilité de sa collecte, on préfère le sérum sanguin pour le diagnostic sérologique des formes postnatales de l'infection, alors que l'on préfère le fluide amniotique, -le sang du cordon ombilical ou du sérum pour le diagnostic des formes congénitales.
Dans l'étape initiale du procédé de dosage immunologique, une couche de IgM, anticorps anti-humains, est adsorbée sur une surface solide Le sérum de l'une quelconque des diverses espèces non-humaines du règne animal peut être utilisé comme source de ces anticorps. Ces anticorps doivent présenter une capacité élevée de fixation spécifique des IgM humaines. Cette capacité peut être confirmée a l'aide d'un essai "IgM-IFA" (essai a l'aide d'un anticorps fluorescent indirect avec IgM) ou a l'aide de l'immunoélectrophorèse. De préférence, les immunoglobulines M (IgM), anticorpsanti-humains, sont appliquées sous forme diluée, (par exemple en solution aqueuse) sur la surface dans des conditions de pH, de temps et de température rendant maximale 1' adsorptïon des anticorps anti-humains sur la surface. De préférence, l'application s'effectue a environ 4 a 60C a un ph d'environ 9,8 å 9,9, et on laisse incuber dans ces conditions, durant 18 a 24 heures. Des plaques de inicrotitrage, disponibles dans le commerce, constituent d'excellentes surfaces d'immunosorption sur lesquelles la couche des IgM, anticorps anti-humains, peut être adsorbée.Ces plaques comportent plusieurs puits ou creux dans lesquels la solution de l'anticorps peut être placée et elles sont typiquement réalisées en des matières chimiquement inertes en présence des réactifs couramment utilisés dans les dosages immunologiques. De telles matières comprennent du polystyrène, des polyoléfines comme du polypropylène et du polyéthylène, des polyoléfines chlorées comme le chlorure de polyvinyle, des polyesters comme les térephtalates de polyéthylène, des polyamides et des polyuréthannes.Après une période appropriée d'incubation, l'excès de la préparation des anticorps anti-humains est enlevé par égouttage ou d'une autre façon, de la surface et celle-ci est lavée, par exemple à l'aide d'une solution saline tamponnée par des phosphates (PBS) contenant une faible quantité d'un tensio-actif non ionique, afin d'éliminer de la surface toutes les matières non adsorbées. Afin de garantir le revêtement complet de la surface de la plaque, le lavage est suivi d'un post-revêtement par une albumine ou une protéine semblable.
Le fluide constituant l'échantillon est ensuite appliqué sur la surface adsorbée des IgM, anticorps antihumains, et cet échantillon est laissé au contact des anticorps pour l'incubation. L'échantillon peut avoir été obtenu de fraiche date ou provenir d'un stockage. Si l'échantillon est stocké, il doit être maintenu dans des conditions qui en préservent ou conservent la réactivité.
En général, les fluides corporels peuvent être congelés et maintenus durant des périodes prolongees à des températures inférieures à environ -200C et ils peuvent encore être utilisables dans le procédé de dosage selon l'invention. Les conditions de temps et de température dans lesquelles l'échantillon est incubé au contact de la couche adsorbée de l'anticorps antihumain permettent de préférence de rendre optimale la chance d'obtention d'une liaison de fixation stable entre l'anticorps anti-humain (IgM) adsorbé et tous les anticorps de type IgM présents dans l'échantillon fluide. Des- températures d'environ 30a à 370C et des temps d'incubation de 1 à 2 heures permettent généralement une bonne liaison.
Après l'incubation avec l'échantillon, la portion de l'échantillon qui ne s'est pas liée à l'anticorps antihumain adsorbé est égouttée de la surface, et celle-ci est lavée pour en enlever les matières non adsorbées qui n'ont pas été éliminées par ltegouttage. Après enlèvement, par lavage, de la fraction non adsorbé de l'échantillon de la surface du puits, l'antigène Toxoplasma gondii est appliqué sous forme insoluble à la surface. Par "insoluble", on entend indiquer que l'antigène n'est pas ajouté sous forme de solution et qu'il ne passe pas en solution dans les conditions de son application. Au contraire, il est et reste visible à ltoeil nu.Des formes insolubles de l'antigène Toxoplasma gondii comprennent des organismes entiers tels que ceux utilisés dans l'essai d'agglutination directe (DA) et dont la préparation est décrite dans l'article précité de Desmonts et Remington, et de l'antigène chimiquement ou physiquement attaché à des supports naturels ou synthétiques insolubles afin de les rendre visibles mais encore capables d'une liaison spécifique sur des anticorps (IgM) antitoxoplasmiques. Des exemples de supports utilisables sont des globules rouges du sang et les perles disponibles pour l'immunosorption et qui sont réalisés en du dextrane réticule et activé, de la gélose ou agarose, du verre, du polystyrène, ou du polyacrylamide.
L'antigène est appliqué à la surface à un pH basique, de préférence voisin de 8,2 à 8,4. On peut obtenir de telles conditions de pH en appliquant l'antigène en suspension dans un tampon alcalin approprié. I1 convient d'éviter des pH acides puisqu'une agglutination spontanée se produit lorsque le pH est acide. I1 a été trouve que la concentration de l'antigène, au moins lorsqu'on utilise des organismes entiers, influe sur les résultats de l'essai et que des concentrations d'environ 3,3 à 3,5 x 107 (micro) organismes/ml donnent les meilleurs résultats. Les résultats de l'essai peuvent également subir l'influence de la température. Une incubation de l'antigène à la surface à froid (40C) peut donner des résultats faussement positifs.On préfère une incubation à environ 350-4O0C. I1 convient de prendre soin d'éviter la dessication de la surface. La surface peut être lue après 14 à 18 heures environ ou après une plus longue période, pour autant que cette surface n'a pas séché. On peut utiliser les mêmes critères de lecture que ceux utilisés dans l'essai d'agglutination directe (voir à la page 564 de l'article précité de Desmonts et Remington) pour évaluer la forme et le type de distribution de l'antigène sur la surface et effectuer les corrélations voulues.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent la mise en oeuvre de l'essai selon l'invention pour déceler la présence des anticorps (IgM) antitoxoplasmiques associés à des formes aiguës d'une infection par toxoplasme, ainsi qu'une comparaison de cet essai avec des essais antérieurs.
Voici une description plus détaillée des matières et des modes opératoires mis en oeuvre.
Préparation de l'anti-gène : Les organismes de toxoplasmes purifiés sont des tachyzortes" de la souche
RH de Toxoplasma gondii. Les "tachyzoites n sont obtenus comme décrit par Desmonts et Remington (article précité) ou à partir d'exsudats péritonéaux de souris infectée deux jours auparavant.
RH de Toxoplasma gondii. Les "tachyzoites n sont obtenus comme décrit par Desmonts et Remington (article précité) ou à partir d'exsudats péritonéaux de souris infectée deux jours auparavant.
Essais de l'art antérieur : On a utilisé l'essai de coloration Sabin-Feldman (DT) (J.S. Remington, G. Desmonts, toxoplasmose, dans l'ouvrage de J.R. Remington et J.O. Sein,
Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant Maladies infectieuses du foetus et de l'enfant nouveau-né7, Philadeiphie, W.B. Saunders Company, 1976, pages 191-332 ;
E. Handman et J.S. Remington : "Serological and immunochemical characterization of monoclonal antibodies to
Toxoplasma gondii" /CaractErisation sérologique et immuno chimique des anticorps monoc-loniques de Toxoplasma gondii7,
Immunology 40 : 579-588, 1980 ; l'essai IgM-IFA de détection du toxoplasme (P.C Welch ; H. Masur ; T.C. Jones ; J.S.
Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant Maladies infectieuses du foetus et de l'enfant nouveau-né7, Philadeiphie, W.B. Saunders Company, 1976, pages 191-332 ;
E. Handman et J.S. Remington : "Serological and immunochemical characterization of monoclonal antibodies to
Toxoplasma gondii" /CaractErisation sérologique et immuno chimique des anticorps monoc-loniques de Toxoplasma gondii7,
Immunology 40 : 579-588, 1980 ; l'essai IgM-IFA de détection du toxoplasme (P.C Welch ; H. Masur ; T.C. Jones ; J.S.
Remington :"The serologic diagnosis of acute lymphadenopathic toxoplasmosis" /le diagnostic sérologique de la toxoplasmose lymphadénopathique aigus J. Infect. Dis. 142 : 256-264, 1980 ; ainsi que essai IgM-Elisa précité.
Les titres de facteur rhumatoide (RF) ont été déterminés par la méthode d'agglutination de latex /"Rapi/
Tex RF kit", Behring Diagnostics, American Hoechst Corp.
Tex RF kit", Behring Diagnostics, American Hoechst Corp.
Somerville, New Jersey, Etats-Unis d'Amérique7. Les titres d'anticorps anti-nucléaires (ANA) fluorescents (FANA) ont été déterminés par immunofluorescence.
Anticorps anti-humains (IgM) : de l'immunoglobuline
M (IgM) anti-humaine de lapin ou la fraction IgG de cet anticorps (chaineju spécifique) a été obtenuedes Cappell
Laboratories, Inc, Cochranville, Pennsylvanie, Etats-Unis d'Amerique. La liaison spécifique de l'IgM humaine par cette préparation d'anticorps a été vérifiée et confirmée par un essai "IgM-IFA" (utilisant un anticorps fluorescent) à l'aide du conjugué de fluorescéine de cet anticorps.
M (IgM) anti-humaine de lapin ou la fraction IgG de cet anticorps (chaineju spécifique) a été obtenuedes Cappell
Laboratories, Inc, Cochranville, Pennsylvanie, Etats-Unis d'Amerique. La liaison spécifique de l'IgM humaine par cette préparation d'anticorps a été vérifiée et confirmée par un essai "IgM-IFA" (utilisant un anticorps fluorescent) à l'aide du conjugué de fluorescéine de cet anticorps.
Sérums humains : Les caractéristiques des sérums sont décrites dans les exemples ci-après.
Un échantillon de sérum, obtenu sur un patient un mois après le début clinique d'une toxoplasmose aiguë, et qui a été positif (1:16384) dans l'essai de coloration (DT) ; positif (1:1280) dans l'essai IgM-IFA et également positif (1:16384) dans l'essai IgM-ELISA a servi de'témoin positif.
Un mélange de sept sérums, obtenus sur des individus sains qui donnaient un résultat négatif dans l'essai de coloration (DT) de toxoplasma, l'essai IgM-IFA et l'essai
IgM-ELISA et qui ont également donné un résultat négatif dans la recherche du facteur rhumatolde (RF) et dans celle des titres FANA, a servi de témoin négatif.
IgM-ELISA et qui ont également donné un résultat négatif dans la recherche du facteur rhumatolde (RF) et dans celle des titres FANA, a servi de témoin négatif.
Le procédé selon l'invention : On revêt des puits de plaques de microtitrage, en polystyrène rigide en forme de U, à jeter après usage (Dynatech Laboratories, Inc) avec 100 microlitres d'une fraction IgG de IgM anti-humaine de lapin (chaîne u spécifique), diluée dans un tampon de carbonate de 0,1 M, pH 9,8. Après 18 heures environ d'incubation à 40C, on lave les plaques trois fois pendant 5 minutes à chaque fois dans une solution saline tamponnée par des phosphates (PBS) contenant 0,05 % de "Tween 20" tensio-actif non-ionique (PBS-T). On revêt ensuite les plaques à l'aide de PBS-T contenant 1 % de sérum albumine bovine (BSA) durant une heure à 37 C puis on lave à nouveau.On introduit des parties aliquotes de 150 microlitres de dilution de serum dans PBS (les sérums sont dilués quatre fois à partir d'une dilution de 1:16) dans les puits lavés et l'on fait incuber les plaques durant une heure à 370C puis on les lave deux fois dans PBS-T et deux fois dans PBS. On dilue des suspensions de l'antigène toxoplasma dans un tampon alcalin à pH 8,2-8,4 jusqu'à des concentrations de 3,3-3,5 x 107 microorganismes par ml. On introduit 50 microlitres de ces suspensions dans chaque puits et l'on fait incuber les plaques durant 18 heures environ à 370C.
On note de 0 à +3 les formes d'agglutination, et les titres sont exprimés sous forme de la plus forte dilution de sérum présentant nettement la forme +3. Dans chaque essai, on incorpore un témoin positif et un témoin négatif.
EXEMPLE 1
On a souris à des essais selon le procédé de 1'invention 25 sérums qui ont été négatifs dans l'essai de coloration (DT) et qui provenaient d'individus non infectés. Des résultats négatifs ont été obtenus pour l'ensemble des 25 sérums.
On a souris à des essais selon le procédé de 1'invention 25 sérums qui ont été négatifs dans l'essai de coloration (DT) et qui provenaient d'individus non infectés. Des résultats négatifs ont été obtenus pour l'ensemble des 25 sérums.
EXEMPLE 2
On a soumis à des essais par le procédé de l'invention 25 sérums positifs dans l'essai de coloration (DT) et négatifs dans les essais IgM-IFA et IgM-ELISA et qui provenaient d'individus présentant une infection chronique par toxoplasme. Des résultats négatifs ont été obtenus pour 1'ensemble des 25 sérums.
On a soumis à des essais par le procédé de l'invention 25 sérums positifs dans l'essai de coloration (DT) et négatifs dans les essais IgM-IFA et IgM-ELISA et qui provenaient d'individus présentant une infection chronique par toxoplasme. Des résultats négatifs ont été obtenus pour 1'ensemble des 25 sérums.
EXEMPLE 3
On a soumis à des essais selon le procédé de l'invention 25 sérums positifs dans l'essai de coloration (DT), négatifs dans l'essai IgM-IFA, positifs dans 1 t essai
IgM-ELISA et qui provenaient de personnes ayant récemment présenté une toxoplasmose aiguë. Le tableau I ci-après donne les résultats de ces essais.
On a soumis à des essais selon le procédé de l'invention 25 sérums positifs dans l'essai de coloration (DT), négatifs dans l'essai IgM-IFA, positifs dans 1 t essai
IgM-ELISA et qui provenaient de personnes ayant récemment présenté une toxoplasmose aiguë. Le tableau I ci-après donne les résultats de ces essais.
TABLEAU I
Titre selon l'essai
Patient DT IgM-IFA IgM-ELISA , Invention
VM 4096 Neg** 256 1024
AB 2048 Equivoque 1024 1024
BC 4096 Neg 2048 256
MD 16000 Neg 256 1024
GJ 128 Neg 4 Neg**
MS 2048 Neg 1024 256
GL 8000 Neg 4096 1024
KW 8000 Neg 1024 1024
CM 256 Neg 1024 Neg
DM 1024 Neg 4 Neg
AJ 800Q Neg 256 Neg
SK 1024 Neg 16384 1024
RR 8000 Neg 1024 1024
Rk 4096 Neg 4096 256
CI 8000 Neg 64 Neg
CM 8000 Neg 64 Neg
DL 1024 Neg 4 4
NM 512 Neg 256 256
NMk 1024 Neg 1024 256
FM 4096 Neg 256 256
GS 32 Neg 16 Neg
SL 4096 Neg 256 256
WT 512 Neg 16 256
MJ 128 Neg 256 Neg
BC 128 Neg 128 Neg
* Même patient ** = # 16
EXEMPLE 4
On a soumis à des essais selon le procédé de l'invention 25 sérums qui étaient positifs dans l'essai de coloration (DT), positifs dans l'essai IgM-IFA et positifs dans Vessai IgM-ELISA et qui provenaient de personnes ayant récemment présenté une toxoplasmose aiguë. Les résultats de ces essais sont présentés au tableau II ci-apres.
Titre selon l'essai
Patient DT IgM-IFA IgM-ELISA , Invention
VM 4096 Neg** 256 1024
AB 2048 Equivoque 1024 1024
BC 4096 Neg 2048 256
MD 16000 Neg 256 1024
GJ 128 Neg 4 Neg**
MS 2048 Neg 1024 256
GL 8000 Neg 4096 1024
KW 8000 Neg 1024 1024
CM 256 Neg 1024 Neg
DM 1024 Neg 4 Neg
AJ 800Q Neg 256 Neg
SK 1024 Neg 16384 1024
RR 8000 Neg 1024 1024
Rk 4096 Neg 4096 256
CI 8000 Neg 64 Neg
CM 8000 Neg 64 Neg
DL 1024 Neg 4 4
NM 512 Neg 256 256
NMk 1024 Neg 1024 256
FM 4096 Neg 256 256
GS 32 Neg 16 Neg
SL 4096 Neg 256 256
WT 512 Neg 16 256
MJ 128 Neg 256 Neg
BC 128 Neg 128 Neg
* Même patient ** = # 16
EXEMPLE 4
On a soumis à des essais selon le procédé de l'invention 25 sérums qui étaient positifs dans l'essai de coloration (DT), positifs dans l'essai IgM-IFA et positifs dans Vessai IgM-ELISA et qui provenaient de personnes ayant récemment présenté une toxoplasmose aiguë. Les résultats de ces essais sont présentés au tableau II ci-apres.
TABLEAU II
Titre selon l'essai
Patient DT IgiIFA IgM-ELISA Invention
BR 4096 40 512 256 KL 2048 1024 4096 4096 KL 2048 256 1024 1024
AS 4096 256 256 1024
WC 1024 64 4096 4096
KL 2048 256 4096 1024
GT 4096 16 512 1024
VA 4096 1024 16384 4096
EP 16000 64 1024 256
WC 2048 64 1024 4096 VA 16000 1024 16384 4096
CK 8 64 4 64
MD 32000 256 4096 4096
MD* 8000 256 16384 16384
SE 16000 32 1024 1024
JA 32000 32 64 256
MH 4096 20 2048 4096
GM 8000 64 16 256
CL 4096 64 256 1024
JJ 16000 64 16 +4
KJ 1024 64 64 4096
AL 1024 64 16 16
TN 1024 64 1024 4096
RG 2048 8 16 +4
CK 128 64 16 1024 * Même patient
EXEMPLE 5
On a soumis à des essais DT, IgM-IFA, IgM-ELISA et selon l'invention, 18 sérums positifs selon la déter- mination du titre du facteur rhumathoide (RF) ou selon "FANA", positif à la fois d'après le facteur rhumatoide et FANA, et qui provenaient de personnes présentant de l'arthrite rhumatolde ou du lupus erythemateus disseine.
Titre selon l'essai
Patient DT IgiIFA IgM-ELISA Invention
BR 4096 40 512 256 KL 2048 1024 4096 4096 KL 2048 256 1024 1024
AS 4096 256 256 1024
WC 1024 64 4096 4096
KL 2048 256 4096 1024
GT 4096 16 512 1024
VA 4096 1024 16384 4096
EP 16000 64 1024 256
WC 2048 64 1024 4096 VA 16000 1024 16384 4096
CK 8 64 4 64
MD 32000 256 4096 4096
MD* 8000 256 16384 16384
SE 16000 32 1024 1024
JA 32000 32 64 256
MH 4096 20 2048 4096
GM 8000 64 16 256
CL 4096 64 256 1024
JJ 16000 64 16 +4
KJ 1024 64 64 4096
AL 1024 64 16 16
TN 1024 64 1024 4096
RG 2048 8 16 +4
CK 128 64 16 1024 * Même patient
EXEMPLE 5
On a soumis à des essais DT, IgM-IFA, IgM-ELISA et selon l'invention, 18 sérums positifs selon la déter- mination du titre du facteur rhumathoide (RF) ou selon "FANA", positif à la fois d'après le facteur rhumatoide et FANA, et qui provenaient de personnes présentant de l'arthrite rhumatolde ou du lupus erythemateus disseine.
Les résultats de ces essais figurent au tableau III ci après.
TABLEAU III
Titre selon les essais
Patient FANA RF-Latex DT IgM-IFA IgM-ELISA Invention
MD 64 2560 Neg* Neg** Neg* Neg**
OC 256 5120 Neg Neg Neg Neg
RG 64 10240 Neg Neg Neg Neg
Sa 64 20480 Neg Neg Neg Neg
DE 256 80 Neg Neg Neg Neg GM 64 Neg# Neg Neg Neg Neg
TM 256 Neg 32 Neg Neg Neg
EJ 64 Neg 256 Neg Neg Neg MP 256 Neg Neg Neg Neg Neg
LK 64 Neg Neg Neg Neg Neg
TG Neg Pos & um; & um; 128 256# Neg Neg
VH Neg Pos 512 64# Neg Neg
PR Neg Pos 1024 32 Neg Neg
BC Neg Pos 256 32 Neg Neg
HJ Neg Pos 64 32 Neg Neg
MM Pos Pos 512 256# Neg Neg
FE Neg 1280 64 32 Neg Neg
EM Neg 640 128 32 Neg Neg Neg = Neg = < 16 #Négatif après absorption du sérum sur des particules
de latex revêtues de IgG humaine.
Titre selon les essais
Patient FANA RF-Latex DT IgM-IFA IgM-ELISA Invention
MD 64 2560 Neg* Neg** Neg* Neg**
OC 256 5120 Neg Neg Neg Neg
RG 64 10240 Neg Neg Neg Neg
Sa 64 20480 Neg Neg Neg Neg
DE 256 80 Neg Neg Neg Neg GM 64 Neg# Neg Neg Neg Neg
TM 256 Neg 32 Neg Neg Neg
EJ 64 Neg 256 Neg Neg Neg MP 256 Neg Neg Neg Neg Neg
LK 64 Neg Neg Neg Neg Neg
TG Neg Pos & um; & um; 128 256# Neg Neg
VH Neg Pos 512 64# Neg Neg
PR Neg Pos 1024 32 Neg Neg
BC Neg Pos 256 32 Neg Neg
HJ Neg Pos 64 32 Neg Neg
MM Pos Pos 512 256# Neg Neg
FE Neg 1280 64 32 Neg Neg
EM Neg 640 128 32 Neg Neg Neg = Neg = < 16 #Négatif après absorption du sérum sur des particules
de latex revêtues de IgG humaine.
& um; Neg = < 20 & um; & um; Pos = #20
Les résultats indiqués aux tableaux I et II montrent que l'essai selon l'invention possède une. meilleure sensibilité que l'essai IgM-IFA et une sensibilité comparable à l'essai IgM-ELISA lorsqu'on l'utilise pour déceler des anticorps antitoxoplasmiques dans des sérums provenant de personnes ayant une toxoplasmose acquise aiguë. La spécificité de l'essai- est mise en évidence par les résultats des exemples 1 et 2 et par les résultats indiqués au tableau
III. A cet égard, la-présence du facteur rhumatolde (RF) et/ou de FANA dans le sérum conduit souvent à des résultats faussement positifs dans l'essai IgM-IFA.Comme indiqué au tableau III, la spécificité de l'essai de l'invention n'est pas troublée par la présence de RF ou de FANA dans le sérum.
Les résultats indiqués aux tableaux I et II montrent que l'essai selon l'invention possède une. meilleure sensibilité que l'essai IgM-IFA et une sensibilité comparable à l'essai IgM-ELISA lorsqu'on l'utilise pour déceler des anticorps antitoxoplasmiques dans des sérums provenant de personnes ayant une toxoplasmose acquise aiguë. La spécificité de l'essai- est mise en évidence par les résultats des exemples 1 et 2 et par les résultats indiqués au tableau
III. A cet égard, la-présence du facteur rhumatolde (RF) et/ou de FANA dans le sérum conduit souvent à des résultats faussement positifs dans l'essai IgM-IFA.Comme indiqué au tableau III, la spécificité de l'essai de l'invention n'est pas troublée par la présence de RF ou de FANA dans le sérum.
EXEMPLE 6
On a également soumis a des essais IgM-ELISA et à l'essai selon l'invention douze sérums provenant de patients présentant une infection congénitale aiguë par
Toxoplasma gondii. Deux de ces sérums étaient positifs dans l'essai IgM-IFA et dix étaient négatifs dans l'essai IgM
ELISA. Le tableau IV ci-après -montre les résultats de ces essais.
On a également soumis a des essais IgM-ELISA et à l'essai selon l'invention douze sérums provenant de patients présentant une infection congénitale aiguë par
Toxoplasma gondii. Deux de ces sérums étaient positifs dans l'essai IgM-IFA et dix étaient négatifs dans l'essai IgM
ELISA. Le tableau IV ci-après -montre les résultats de ces essais.
TABLEAU IV
TITRE SELON L'ESSAI
Patient ID N0 IgM-IFA IgM-ELISA Invention
31 Pos 1024 64
36 Pos 64 64
40 Neg 1024 256
39 Neg 64 64
45 Neg 4096 16
34 Neg Neg Neg
44 Neg 64 64
32 Neg 1024 64
47 Neg Neg Neg
49 Neg 1024 256
50 Neg 64 64
46 Neg 256 16
* Pos = > 50
Les résultats indiqués au tableau IV montrent la sensibilité accrue du procédé de l'invention en comparaison de l'essai IgM-IFA et ils montrent également que l'essai de l'invention a une sensibilité comparable à celle de l'essai IgM-ELISA pour déceler les formes congénitales d'infection par toxoplasme
Le mode, décrit ci-dessus, de mise en oeuvre de l'invention concerne particulièrement la détection des immunoglobulines M, anticorps associés aux formes aiguës d'une infection par Toxoplasma gondii chez les êtres humains.Des essais en vue d'une detection sérologique de la présence d'organismes pathogènes autres que Toxoplasma gondii, comme les immunoglobulines, anticorps spécifiques des virus de l'hépatite A, de la rubéole, de la polioniyé- lite, de l'herpès simplex, du cytomégalo.virus, des virus d'Epstein-Barr et de divers autres champignons, protozoaires et helminthes dans le sang ou dans d'autres fluides du corps des êtres humains et d'autres espèces du règne animal peuvent être effectués de façon semblable à l'aide du procédé selon l'invention L'invention peut également être utilisée pour déceler des anticorps dans la totalité des immunoglobulines ou dans d'autres classes d'immunoglobulines comme IgG, IgA, IgE et IgD et leurs sous-classes dans le sérum et dans d'autres fluides du corps des êtres humains et d'autres espèces du règne animal. Dans de telles autres formes de mise en oeuvre de l'invention, il peut s'avérer nécessaire, pour l'obtention des meilleurs résultats, d'utiliser des températures, des pH et des concentrations qui diffèrent de ceux utilisés pour un essai de détermination des anticorps antitoxoplasmiques de type IgM.
TITRE SELON L'ESSAI
Patient ID N0 IgM-IFA IgM-ELISA Invention
31 Pos 1024 64
36 Pos 64 64
40 Neg 1024 256
39 Neg 64 64
45 Neg 4096 16
34 Neg Neg Neg
44 Neg 64 64
32 Neg 1024 64
47 Neg Neg Neg
49 Neg 1024 256
50 Neg 64 64
46 Neg 256 16
* Pos = > 50
Les résultats indiqués au tableau IV montrent la sensibilité accrue du procédé de l'invention en comparaison de l'essai IgM-IFA et ils montrent également que l'essai de l'invention a une sensibilité comparable à celle de l'essai IgM-ELISA pour déceler les formes congénitales d'infection par toxoplasme
Le mode, décrit ci-dessus, de mise en oeuvre de l'invention concerne particulièrement la détection des immunoglobulines M, anticorps associés aux formes aiguës d'une infection par Toxoplasma gondii chez les êtres humains.Des essais en vue d'une detection sérologique de la présence d'organismes pathogènes autres que Toxoplasma gondii, comme les immunoglobulines, anticorps spécifiques des virus de l'hépatite A, de la rubéole, de la polioniyé- lite, de l'herpès simplex, du cytomégalo.virus, des virus d'Epstein-Barr et de divers autres champignons, protozoaires et helminthes dans le sang ou dans d'autres fluides du corps des êtres humains et d'autres espèces du règne animal peuvent être effectués de façon semblable à l'aide du procédé selon l'invention L'invention peut également être utilisée pour déceler des anticorps dans la totalité des immunoglobulines ou dans d'autres classes d'immunoglobulines comme IgG, IgA, IgE et IgD et leurs sous-classes dans le sérum et dans d'autres fluides du corps des êtres humains et d'autres espèces du règne animal. Dans de telles autres formes de mise en oeuvre de l'invention, il peut s'avérer nécessaire, pour l'obtention des meilleurs résultats, d'utiliser des températures, des pH et des concentrations qui diffèrent de ceux utilisés pour un essai de détermination des anticorps antitoxoplasmiques de type IgM.
I1 va donc de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé décrit.
Claims (13)
1. Procédé de dosage immunologique pour déceler dans un échantillon de fluide corporel une immunoglobuline, anticorps spécifique d'un antigène, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à
a) adsorber sur une surface solide un anticorps de ladite immunoglobuline
b) appliquer l'échantilloei sur l'anticorps.del'immunoglobu1ine ainsi adsorbé et faire incuber le mélange résultant ;
c) séparer la fraction non adsorbée de la fraction adsorbée du mélange provenant de l'étape (b) ;
d) appliquer une forme insoluble de l'antigène à la fraction adsorbée ; et
e) déterminer le degré de liaison de l'antigène sur la fraction adsorbée en observant la distribution de l'antigène sur la surface.
2. Procédé de dosage immunologique selon. la reven- dication 1, caractérisé en ce que l'immunoglobuline est un anticorps de type IgM.
3. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 2, caractérisé en ce que le fluide corporel est un fluide du corps humain, et en ce que l'anticorps de l'immunoglobuline est une IgM, anticorps anti-humain.
4. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la-forme insoluble de l'antigène est un organisme entier.
5. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 1, caractérisé en ce que la forme insoluble de l'antigène est l'antigène attaché ou fixé à une matière de support visible.
6. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 5, caractérisé en ce que la matière de support visible est une matière immunoadsorbante particu laire activée.
7. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 5,. caractérisé en ce que la matière du support visible est constituée par des globules rouges du sang.
8. Procédé de dosage immunologique pour déceler dans un échantillon d'un fluide du corps humain des immunoglobulines, anticorps associés à une forme aiguë d'infection par Toxoplasma gondii, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à
a) adsorber des IgM, anticorps anti-humains, sur une surface solide
b) appliquer l'échantillon sur les anticorps anti-humains ainsi adsorbés et faire incuber le mélange résultant ;
c) séparer la fraction non adsorbée de la fraction adsorbée du mélange incubé provenant de l'étape (b)
d) appliquer à un pH basique une forme insoluble de l'antigène Toxoplasma gondii sur la fraction adsorbée provenant de l'étape (c) et faire incuber le mélange résultant ; et
e) déterminer le degré de liaison de l'antigène sur la fraction adsorbée provenant de l'étape Ic) en observant la distribution de l'antigène sur la surface.
9. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 8, caractérisé en ce que, entre les étapes (a > et (b) une albumine est appliquée sur la surface et mise à incuber au contact de cette surface, puis la surface est lavée pour enlever les matières non adsorbées.
10. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 8, caractérisé en ce que la forme insoluble de l'antigène est constituée par des organismes entiers de Toxoplasma gondil et en ce que ces microorganismes sont appliqués à une concentration d'environ 3,3 x 107 à environ 3,5 x 107 microorganismes/mI.
11. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 8, caractérisé en ce quelle pH se situe entre 8,2 et 8,4 inclusivément.
12. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 8, caractérisé en ce que la forme insoluble de l'antigène est l'antigène fixé sur une matière immunoadsorbante particulaire activée.
13. Procédé de dosage immunologique selon la revendication 10, caractérisé en ce que les anticorps anti-humains (IgM) sont appliqués sur la surface à environ 40 à 60C, pH 9,8 à 9,9 ; on fait incuber l'échantillon avec les anticorps anti-humains adsorbés (IgM) à environ 300 à 370C durant environ 1 à 2 heures, et le pH basique se situe entre environ 8,2 et environ 8,4.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21253580A | 1980-12-03 | 1980-12-03 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2495326A1 true FR2495326A1 (fr) | 1982-06-04 |
| FR2495326B1 FR2495326B1 (fr) | 1986-03-28 |
Family
ID=22791425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8108912A Expired FR2495326B1 (fr) | 1980-12-03 | 1981-05-05 | Procede de dosage immunologique, du type a agglutination, pour deceler des anticorps de type immunoglobuline |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2495326B1 (fr) |
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|---|---|
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