FR2606154A1 - Procede de detection et de dosage immunologique des acides nucleiques presents dans les milieux biologiques - Google Patents
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Abstract
PROCEDE DE DETECTION ET DE DOSAGE IMMUNOLOGIQUE D'ACIDES NUCLEIQUES PRESENTS DANS DES MILIEUX BIOLOGIQUES, QUI CONSISTE A IMMOBILISER L'ACIDE NUCLEIQUE A DOSER SUR UN SUPPORT APTE A EN ASSURER LA RETENTION ET A PERMETTRE LA REALISATION D'UNE REACTION D'IMMUNODETECTION, A INCUBER LEDIT ACIDE NUCLEIQUE IMMOBILISE AVEC UN REACTIF IMMUNOLOGIQUE CONSTITUE PAR DES ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-ACIDES NUCLEIQUES PENDANT UN TEMPS APPROPRIE, DANS UN MILIEU D'INCUBATION APPROPRIE, PUIS A REVELER LE COMPLEXE FORME PAR TOUTE METHODE DE REVELATION APPROPRIEE. APPLICATION DUDIT PROCEDE A LA DETECTION ET AU DOSAGE IMMUNOLOGIQUE D'ACIDES NUCLEIQUES AINSI QU'A LA PURIFICATION DE CEUX-CI ET A L'EPURATION D'UN PRODUIT BIOLOGIQUE A USAGE HUMAIN OU VETERINAIRE.
Description
La présente invention est relative à un procédé de détection et de dosage immunologique de fragments d'acides nucléiques, à l'aide d'anticorps monoclonaux antinucléosides; la présente invention est également relative à l'application de ce procédé à la purification de l'acide nucléique concerné ou pour l'épuration d'un produit biologique à usage humain ou vétérinaire.
Le problème fondamental que pose l'utilisation de lignées de cellules continues dans la production de vaccins viraux ou d'autres substances biologiques est le risque que le produit soit contaminé par de 1'ADN de cellules oncogènes. Il est donc du plus grand intéret de trouver une méthode de détection et de dosage de cet ADN étranger, afin de pouvoir purifier les produits biologiques qui le contiennent éventuellement. Il a été montré que de 1'ADN de substrat cellulaire peut être séparé de vaccin polio par différentes pro cédules de purification, jusqu'à concurrence de 10 picogrammes résiduels. Pour pouvoir détecter de si petites quantités d'ADN, un test "dot blot" d'hybridation sur filtre a été mis au point. Cette méthode est très spécifique et très sensible, mais elle présente plusieurs inconvénients.En premier lieu, le test étant fondé sur l'hybridation moléculaire, ceci im- plique l'utilisation d'une sonde d'ADN spécifique analogue à 1'ADN que l'on veut détecter et doser. En conséquence une sonde d'ADN différente est nécessaire pour chaque substrat cellulaire. En second lieu, dans le cas de vaccins inactivés, la sensibilité du test peut être affectée par la réaction entre 1'ADN et le formalde;hyde, ce dernier réagissant, même à de faibles concentrations, svec les groupes aminés d'un ADN monobrin et détruisant les liaisons hydrogène, en sorte que les molécules résultantes ne sont plus propres à s'hybrider avec une sonde d'ADN.
La sensibilité de ce type de test dépend en outre de l'intensité du signal radioactif. La détection de faibles quantités d'ADN nécessite une nick-translation de la sonde avec du 32p. Meme lorsqu'on remplace la sonde par un système- biotine-avidine ou par un marquage enzymatique, la procédure demeure fastidieuse, difficile à standardiser et à utiliser dans la routine de la production usuelle de substances biologiques.
Neurath a publié tJ. Virol. Methods 1983, p. 155-1663 une méthode de détection d'ADN de virus transmis lors de transfusions sanguines (notamment pour le virus de l'hépatite B) basée sur un test radioimmunologique. Dans cette méthode, 1'ADN extrait du plasma humain est adsorbé sur des micropuits enduits de polylysine, puis révélé par un test radioimmunologique à double anticorps, utilisant des autoanticorps polyclonaux anti-ADN de souris auto-immunes NZB/NZW et des immunoglobulines anti-souris marquées à 1'125I. Selon les résultats obtenus par Neurath, son test est capable de détecter un minimum de 5 pg d'ADN.
L'on sait obtenir des anticorps polyclonaux antinucléotides en injectant à des souris des immunogènes portant une ou plusieurs bases d'un acide nucléique, eux-mênes obtenus soit par la méthode de Plescia ("Nucléic Acids in Immunology" 1968 - O.J. Plescia p. 5-15) qui consiste à coupler à la méthyl-albumine bovine de 1'ADE préalablement dénaturé, soit par fixation des nucléosides sur une protéine par oxydation périodique selon la méthode d'Erlanger pErlanger et coll. PNAS 52 (68), 19643, puis à recueillir les anticorps désirés.
Comme on le sait, la technique d'obtention d'anticorps monoclonaux, décrite par Fouler et Milstein (Nature, 256, 495, 1975), consiste à fusionner des lymphocytes de souris préalablement immunisées avec des cellules myélomateuses en présence de polyéthylèneglycol, à recueillir les hybridomes résultant de cette fusion, puis à les cloner afin d'obtenir les anticorps monoclonaux.
La possibilité d'obtenir des anticorps nonoclonaux anti-acides nucléiques en appliquant la méthode d'obtention de Kohler et Milstein a permis aux Inventeurs, par la facilité qu'elle leur a procure, d'étudier la réaction entre les anticorps et les molécules d'acides nucléiques, de développer un procédé de détection et de dosage d'acides nucléiques cellulaires résiduels dans des milieux biologiques et notamment dans des vaccins.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des moyens propres à permettre la détection et le dosage de fragments d'acides nucléiques dans des milieux biologiques qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les moyens proposés dans l'Art antérieur, notamment en ce qu'ils introduisent dans les méthodes de détection et de dosage des acides nucléiques une simplification considérable pour leur facilité de mise en oeuvre, à quoi s'ajoutent leurs grandes sensibilite et fiabilité et leur absence de toxicité.
La présente invention a pour objet un procédé de détection et de dosage immunologique d'acides nucléiques et notamment d'ADN présents dans des milieux biologiques, caractérisé en ce que l'acide nucléique à doser est immobilisé sur un support approprie apte à en assurer la rétention et à permettre la réalisation d'une réaction d'immunodétection, en ce que ledit acide nucléique immobilisé sur ledit support est incubé avec un réactif immunologique constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques pendant un temps ap propres, dans un milieu d'incubation approprié, puis le complexe formé est révélé par toute méthode de révélation appropriée telle que méthode immuno-enzymatlque, par immuno- fluorescence, ou autre.
Selon une disposition avantageuse de la présente invention, le support sur lequel est immobilisé l'acide nucléique est un support solide choisi dans le groupe des composés comprenant les nitrates de cellulose, le nylon, le polystyrène, le polypropylène.
Selon un mode de réalisation avantageux de la pré sente invention, l'immobilisation de l'acide nucléique sur un support solide est précédée d'une étape d'extraction de cet acide nucléique du milieu biologique où il est contenu.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, l'extraction de l'acide nucléique du milieu où il est contenu s'effectue en traitant ledit milieu par de la protéinase K, du SDS, puis en le soumettant à une extraction phénolique et à une précipitation à l'éthanol en présence de dextrane et de sels appropriés, enfin à une centrifugation consécutive, un séchage et une reprise du culot dans un tampon approprié ou de l'eau.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, l'immobilisation de l'acide nucléique du milieu où il est contenu est réalisée par un ligand spécifique qui consiste à immobiliser par voie active ou passive sur un support solide tel une plaque de microtitration, un anticorps ou mélange d'anticorps anti-acides nucléiques ou des molécules spécifiques affines pour les acides nucléiques (histones ...), puis de mettre en contact la solution contenant l'acide nucléique à détecter ou doser avec ce support.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la methode révélant la liaison de l'acide nucléique aux anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques est une méthode immuno-enzymatique, utilisant des composés pris dans le groupe des enzymes, et notamment la phosphatase alcaline.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, la méthode révélant la liaison e l'acide nucléique avec les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques est une méthode utilisant des générateurs de signaux couplés directement ou indirectement à l'anticorps monoclonal anti-acides nucléiques (fluorochromes, enzyme).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de la présente invention, la méthode révélant la liaison de l'acide nucléique avec les anticorps monoclonaux anti-acides nucléi ques est une méthode utilisant des molécules affines choisies dans le groupe des composés comprenant la biotine et l'avidine.
Selon une disposition avantageuse de la présente invention, le réactif immunologique est constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques, caractérisé en ce que ces dits anticorps sont obtenus par préparation d'immunogénes comprenant une ou plusieurs bases constitutives d'un acide nucléique, en ce que ces immunogènes sont injectés à des souris, en ce que les lymphocytes de ces souris sont fusionnés avec des cellules myélomateuses, en ce que les hybridomes sécrétant les anticorps spécifiques anti-acides nucléiques résultant de cette fusion sont clonés, en ce que les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques sont purifiés et contrôlés quant à leur monoclonalité.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de la présente invention, le procédé de détection d'acides nucléiques présents dans un milieu biologique par un réactif immunologique constitué par des anticorps monoclonaux antiacides nucléiques est appliqué pour la capture de tels acides nucléiques pour réaliser l'épuration dudit milieu ou la purification desdits acides nucléiques.
La présente invention a en outre pour objet une trousse (ou kit) prête à l'emploi pour la détection et le dosage d'acides nucléiques et notamment d'ADN dans divers milieux biologiques, laquelle trousse est caractérisée en ce qu'elle contient - Une quantité appropriée éventueIlement subdivise en doses
unitaires suffisantes pou une opération de dosage ou de
détection d'anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques,
et notamment anti-ADN, utilisables en tant que tels pour la
réalisation de ces dits dosage ou détection, - Eventuellement des quantités appropriées de supports soli
des variés, d'agent de traitement, de tampon, d'agents
aptes à reconstituer un milieu de saturation, d'agent per
mettant la reconstitution d'une solution de visualisation
de l'activité enzymatique pour la mise en oeuvre de ces mé-
thodes de détection ou de dosage, - Eventuellement une quantité appropriée, subdivisée le cas
échéant en doses unitaires suffisantes pour une opération
de détection ou de dosage, d'anticorps anti-IgG marqués par
une enzyme ou par fluorescence, de molécules affines, de
fluorochromes, d'enzymes, pour la révélation de la réaction
antigène-anticorps entre l'acide nucléique à étudier et les
anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques.
unitaires suffisantes pou une opération de dosage ou de
détection d'anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques,
et notamment anti-ADN, utilisables en tant que tels pour la
réalisation de ces dits dosage ou détection, - Eventuellement des quantités appropriées de supports soli
des variés, d'agent de traitement, de tampon, d'agents
aptes à reconstituer un milieu de saturation, d'agent per
mettant la reconstitution d'une solution de visualisation
de l'activité enzymatique pour la mise en oeuvre de ces mé-
thodes de détection ou de dosage, - Eventuellement une quantité appropriée, subdivisée le cas
échéant en doses unitaires suffisantes pour une opération
de détection ou de dosage, d'anticorps anti-IgG marqués par
une enzyme ou par fluorescence, de molécules affines, de
fluorochromes, d'enzymes, pour la révélation de la réaction
antigène-anticorps entre l'acide nucléique à étudier et les
anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques.
Outre les dispositions qui précédent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre de l'invention.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1
Obtention des anticorps monoclonaux 1) Préparation des immunogènes
- L'ADN de sperme de saumon, traité aux ultrasons, est dé
naturé par exemple thermiquement (10 min. à 100toc puis
refroidissement brutal à - 20"C) puis couplé à la
Méthyl-Sérum albumine bovine comme décrit par Plescia
- Alternativement d'autres ADN, natifs ou dénaturés peu
vent être utilisés tels ceux extraits de cellules de
mammifères.
Obtention des anticorps monoclonaux 1) Préparation des immunogènes
- L'ADN de sperme de saumon, traité aux ultrasons, est dé
naturé par exemple thermiquement (10 min. à 100toc puis
refroidissement brutal à - 20"C) puis couplé à la
Méthyl-Sérum albumine bovine comme décrit par Plescia
- Alternativement d'autres ADN, natifs ou dénaturés peu
vent être utilisés tels ceux extraits de cellules de
mammifères.
- Suivant une autre méthode décrite dans la Demande de
Brevet au nom de 1'INSTITUT PASTEUR -déposée en même
temps que la présente Demande et intitulée : "Procédé
utilisant des anticorps monoclonaux comme réactif
immunologique pour analyser et déterminer la séquence
d'un acide nucléique", des anticorps monoclonaux dirigés
contre les bases (au sens large) constitutives des aci
des nucléiques et reconnaissant celles-ci dans ce der
nier, peuvent être obtenus en préparant des immunogènes
par fixation des nucléosides sur une protéine par oxyda
tion périodique.
Brevet au nom de 1'INSTITUT PASTEUR -déposée en même
temps que la présente Demande et intitulée : "Procédé
utilisant des anticorps monoclonaux comme réactif
immunologique pour analyser et déterminer la séquence
d'un acide nucléique", des anticorps monoclonaux dirigés
contre les bases (au sens large) constitutives des aci
des nucléiques et reconnaissant celles-ci dans ce der
nier, peuvent être obtenus en préparant des immunogènes
par fixation des nucléosides sur une protéine par oxyda
tion périodique.
2) Immunisation des souris
En vue de l'obtention des anticorps monoclonaux anti-ADN,
on peut immuniser des souris femelles de la lignée cosan
guine BalbC.
En vue de l'obtention des anticorps monoclonaux anti-ADN,
on peut immuniser des souris femelles de la lignée cosan
guine BalbC.
On injecte une première fois (par voie intrapéritoneble)
0,5 mg d'ADN additionné volume à volume d'adjuvant de
Freund complet. 3 semaines après, les souris reçoivent
0,5 mg d'ADN additionné d'adjuvant de Freund incomplet. 2
à 3 mois après les souris reçoivent un rappel par la même
voie de 0,1 à 0,2 mg d'ADN en-milieu aqueux. On contrôle
la présence d'anticorps dans le sérum des animaux immuni
sés une ou deux semaines avant le rappel. 5 à 7 jours
après le rappel, les souris sont sacrifiées et la rate est
prélevée.
0,5 mg d'ADN additionné volume à volume d'adjuvant de
Freund complet. 3 semaines après, les souris reçoivent
0,5 mg d'ADN additionné d'adjuvant de Freund incomplet. 2
à 3 mois après les souris reçoivent un rappel par la même
voie de 0,1 à 0,2 mg d'ADN en-milieu aqueux. On contrôle
la présence d'anticorps dans le sérum des animaux immuni
sés une ou deux semaines avant le rappel. 5 à 7 jours
après le rappel, les souris sont sacrifiées et la rate est
prélevée.
Pour l'obtention des anticorps monoclonaux anti-ADN, on
peut aussi utiliser la rate de souris femelles NZB qui
produisent naturellement ces anticorps et dans ce cas, il
n'est pas nécessaire d'immuniser au préalable les souris.
peut aussi utiliser la rate de souris femelles NZB qui
produisent naturellement ces anticorps et dans ce cas, il
n'est pas nécessaire d'immuniser au préalable les souris.
Si toutefois on souhaite augmenter le nombre de cellules
lymphocytaires B qui produisent les anticorps anti-ADN, on
peut immuniser les souris NZB avec un antigène similaire à
celui employé pour les souris BalbC.
lymphocytaires B qui produisent les anticorps anti-ADN, on
peut immuniser les souris NZB avec un antigène similaire à
celui employé pour les souris BalbC.
3) Fusion
En vue de l'établissement d'hybridomes sécrétant des anti
corps monoclonaux, on fusionne les lymphocytes provenant
de la rate prélevée avec une lignée de myélome murin
HGPRT, comme par exemple SP20. Dans ce but, on pratique
une incision longitudinale dans la rate, prélevée stérile
ment et on obtient les lymphocytes par grattage du paren chyme de l'organe à l'aide d'un scalpel. Après plusieurs rinçages en milieu de culture sans sérum, les lymphocytes sont comptés et mélangés avec les SP2O, dans les proportions de 4 x 107 cellules spléniques pour 107 cellules de myélome.Après centrifugation le culot est repris avec 0,5 ml de PEG 1000 à 30%, incubé 5 minutes à 370C puis repris dans 50 ml de milieu de culture (Dulbecco + 15% de sérum animal) et réparti à raison de 1 ml par cupule dans des plaques à 24 cupules et incubé à 370C en atmosphère humide avec 5% de C02. 24 à 48 h après la fusion, on ajoute 0,5 ml a chaque cupule d'un milieu sélectif comprenant : Dulbecco + 15% de sérum animal + hypoxanthine 10-5 x 5 M + apaserine 10-5 M.
En vue de l'établissement d'hybridomes sécrétant des anti
corps monoclonaux, on fusionne les lymphocytes provenant
de la rate prélevée avec une lignée de myélome murin
HGPRT, comme par exemple SP20. Dans ce but, on pratique
une incision longitudinale dans la rate, prélevée stérile
ment et on obtient les lymphocytes par grattage du paren chyme de l'organe à l'aide d'un scalpel. Après plusieurs rinçages en milieu de culture sans sérum, les lymphocytes sont comptés et mélangés avec les SP2O, dans les proportions de 4 x 107 cellules spléniques pour 107 cellules de myélome.Après centrifugation le culot est repris avec 0,5 ml de PEG 1000 à 30%, incubé 5 minutes à 370C puis repris dans 50 ml de milieu de culture (Dulbecco + 15% de sérum animal) et réparti à raison de 1 ml par cupule dans des plaques à 24 cupules et incubé à 370C en atmosphère humide avec 5% de C02. 24 à 48 h après la fusion, on ajoute 0,5 ml a chaque cupule d'un milieu sélectif comprenant : Dulbecco + 15% de sérum animal + hypoxanthine 10-5 x 5 M + apaserine 10-5 M.
Les cultures sont suivies régulièrement par observation microscopique pour l'apparition des foyers de croissance.
Lorsque ceux-ci sont arrivés à une taille convenable, les cellules sont repiquées à raison d'une cupule dans un milieu de culture cellulaire de 15 ml, toujours en présence de milieu sélectif. Ensuite lorsque les cellules ont suffisamment poussé, on procède au clonage cellulaire par dilution limite dans des plaques à 96 cupules.
Après la sélection des colonies qui sécrètent des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques, les cellules sont multipliées dans des boites de culture pour préparer des stocks congelés.
Pour s'assurer que la sécrétion d'anticorps monoclonaux est stable surtout s'il s'agit de fusion entre cellulesprovenant de souris de lignées différentes (par exemple
NZB + BalbC) il est recommandé dé cloner 2 à 3 fois les cellules sécrétrices. Les anticorps monoclonaux anti-ADN sont obtenus soit par la culture de cellules sécrétrices dans des conditions habituelles pour les cultures cellulaires, soit par production de liquide d'ascite chez des souris BalbC. Pour obtenir des ascites dans le cas d'une fusion NZB + BalbC, il faut utiliser des souris hybrides
NZB + BalbC en lère génération.
NZB + BalbC) il est recommandé dé cloner 2 à 3 fois les cellules sécrétrices. Les anticorps monoclonaux anti-ADN sont obtenus soit par la culture de cellules sécrétrices dans des conditions habituelles pour les cultures cellulaires, soit par production de liquide d'ascite chez des souris BalbC. Pour obtenir des ascites dans le cas d'une fusion NZB + BalbC, il faut utiliser des souris hybrides
NZB + BalbC en lère génération.
4) Sélection des clones
La sélection des clones et la caractérisation des ascites
sont effectuées par voie immunoenzymatique en immobilisant
sur plaque de microtitration ou membrane, par exemple de
nitrate de cellulose, 1'ADN double ou simple brin. Sont
sélectionnés les clones réagissant positivement avec
l'acide nucléique simple ou double brin, ainsi que con
jointement avec les deux formes.
La sélection des clones et la caractérisation des ascites
sont effectuées par voie immunoenzymatique en immobilisant
sur plaque de microtitration ou membrane, par exemple de
nitrate de cellulose, 1'ADN double ou simple brin. Sont
sélectionnés les clones réagissant positivement avec
l'acide nucléique simple ou double brin, ainsi que con
jointement avec les deux formes.
EXEMPLE 2
Mise en évidence ou dosage d'acides nucléiques immobilisés
sur support solide
L'acide nucléique peut être déposé sur tout support solide apte à en assurer la rétention tels que nitrates de cellulose, nylon, polystyrène, polypropylène, gels divers, etc ...
Mise en évidence ou dosage d'acides nucléiques immobilisés
sur support solide
L'acide nucléique peut être déposé sur tout support solide apte à en assurer la rétention tels que nitrates de cellulose, nylon, polystyrène, polypropylène, gels divers, etc ...
Cette méthode peut nécessiter une étape d'extraction effectuée par exemple suivant la technique de NEURATH et modifiée par nos soins pour l'extraction de 1'ADN. Le milieu contenant l'acide nucléique est traité à la Protéinase K, au
SDS puis soumis à une extraction phénolique et à une précipitation à l'éthanol en présence de dextrane et des sels appropriés, à une centrifugation consécutive, un séchage et une reprise du culot dans un tampon approprié tel que du TE (Tris-HCl 10 mM EDTA 2,5 mM pH 7 à 8) ou même de l'eau à une quantité au plus égale au dixième du volume initial soumis au traitement.
SDS puis soumis à une extraction phénolique et à une précipitation à l'éthanol en présence de dextrane et des sels appropriés, à une centrifugation consécutive, un séchage et une reprise du culot dans un tampon approprié tel que du TE (Tris-HCl 10 mM EDTA 2,5 mM pH 7 à 8) ou même de l'eau à une quantité au plus égale au dixième du volume initial soumis au traitement.
L'ADN dénaturé ou non suivant l'anticorps utilisé pour le détecter, et dont la nature d la solution est adaptée à la surface d'immobilisstion sur lequel il va être fixé de façon covalente ou non covalente, par exemple sur nitrate de cellulose en NaCl 0,15 N minimum, est déposé sur le support. Pour ce qui est des nitrates de cellulose couramment utilisés, une cuisson à 80"C, pendant au moins 2 heures, est requise pour obtenir une bonne fixation.
Le filtre, en l'occurrence, est incubé 30 minutes avec un milieu de saturation constitué de TBS (Tris-HCl 0,02 M pH 7 à 8, NaCl 0,15 M) et de SAB 18 (p/v), puis avec la même solution additionnée de Tween 20 0,1% (v/v) (TBST SAB) contenant le ou les anticorps anti-ADN sélectionnés. Après lavage en TBST (3 fois 10 minutes) un anticorps anti-Ig de souris dilué en TBST SAB, couplé à la phosphatase alcaline par exemple, est mis en contact du filtre pendant 1 heure avant lavage comme indiqué ci-dessus. L'activité enzymatique est visualisée par une solution de Tris-HCl 0,1 M MgC12 50 mM pH 9,5 contenant 0,33 mg/ml de nitrobleu tétrazolium et 0,16 mg/ml de 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl phosphate.D'autres substrats sont également disponibles ainsi que d'autres systèmes de révélation possédant des générateurs de signal couplés directement ou indirectement à l'anticorps anti-ADN (fluorochromes, enzymes, etc ...) ou utilisant des molécules affines (avidine/biotine, etc ...).
Avec le système utilisant la phosphatase alcaline, 1 picogramme d'ADN est susceptible d'être mis en évidence, quelle que soit son origine (mammifère, poisson, bactériophage, bactérie, etc ...) et sa taille.
EXEMPLE 3
Mise en évidence ou dosage d'un acide nucléique
immobilisé par un ligand spécifique
Avantageusement un anticorps ou mélange d'anticorps anti-ADN est immobilisé par voie active ou passive sur un support solide tel qu'une plaque de microtitration, puis mis au contact avec la solution contenant 1'ADN à mettre en évi- dence ou à doser. Peuvent également être utilisées des molécules spécifiquement affines pour les acides nucléiques (hi s- tones, etc ...). Après lavage, un anticorps ou mélange d'anticorps anti-ADN est ajouté et sa fixation sur 1'ADN révélée par voie classique immunoenzymatique (par exemple en couplant une enzyme ou de la biotine sur le(s) dit(s) anticorps), d'immunofluorescence ou autre.
Mise en évidence ou dosage d'un acide nucléique
immobilisé par un ligand spécifique
Avantageusement un anticorps ou mélange d'anticorps anti-ADN est immobilisé par voie active ou passive sur un support solide tel qu'une plaque de microtitration, puis mis au contact avec la solution contenant 1'ADN à mettre en évi- dence ou à doser. Peuvent également être utilisées des molécules spécifiquement affines pour les acides nucléiques (hi s- tones, etc ...). Après lavage, un anticorps ou mélange d'anticorps anti-ADN est ajouté et sa fixation sur 1'ADN révélée par voie classique immunoenzymatique (par exemple en couplant une enzyme ou de la biotine sur le(s) dit(s) anticorps), d'immunofluorescence ou autre.
Avec l'utilisation d'anticorps anti-ADN couplés à la O-galactosidase, des sensibilités de 1 à 100 picogramrnmes d'ADN par ml de milieu initial, sont couramment obtenues.
Cette approche peut présenter l'avantage de ne pas avoir recours à tout ou partie des techniques de purification et concentration précédemment décrites.
EXEMPLE 4
Utilisation des anticorps anti-ADN pour la capture d'un
ADN dans un milieu biologique complexe
Les anticorps anti-ADN peuvent être fixés sur les supports solides classiquement utilisés à des fins de chromatographie d'affinité, tels que l'Ultrogel, le Magnogel, les agaroses, etc ....
Utilisation des anticorps anti-ADN pour la capture d'un
ADN dans un milieu biologique complexe
Les anticorps anti-ADN peuvent être fixés sur les supports solides classiquement utilisés à des fins de chromatographie d'affinité, tels que l'Ultrogel, le Magnogel, les agaroses, etc ....
Le milieu contenant l'acide nucléique à capturer est mis au contact du support ainsi activé dans le but - soit de purifier ledit acide nucléique concerné, qui est
dans un premier temps retenu sur le support puis décroché,
après lavage, au moyen des techniques classiques de désta
bilisation des liaisons antigène-anticorps (urée, tampons
glycine à pH acide, etc ...), - soit d'épurer le milieu en question de l'acide nucléique
qu'il contient, comme par exemple afin de nettoyer un pro
duit biologique à usage humain ou vétérinaire obtenu sur
des cellules tumorigènes qui doit être exempt d'un ADN cel
lulaire potentiellement dangereux. Dans ce cas, l'éluat est
directement recueilli à la sortie de la chromatographie et
éventuellement traité de nouveau. Le support peut ensuite
être régénéré par utilisation des solutions précédemment
citées, permettant de rompre la liaison antigène-anticorps
qui a permis de retenir l'anticorps.
dans un premier temps retenu sur le support puis décroché,
après lavage, au moyen des techniques classiques de désta
bilisation des liaisons antigène-anticorps (urée, tampons
glycine à pH acide, etc ...), - soit d'épurer le milieu en question de l'acide nucléique
qu'il contient, comme par exemple afin de nettoyer un pro
duit biologique à usage humain ou vétérinaire obtenu sur
des cellules tumorigènes qui doit être exempt d'un ADN cel
lulaire potentiellement dangereux. Dans ce cas, l'éluat est
directement recueilli à la sortie de la chromatographie et
éventuellement traité de nouveau. Le support peut ensuite
être régénéré par utilisation des solutions précédemment
citées, permettant de rompre la liaison antigène-anticorps
qui a permis de retenir l'anticorps.
Claims (3)
- 30) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'immobilisation de l'acide nucléique sur le support solide est précédée d'une étape d'extraction de cet acide nucléique du milieu biologique où il est contenu.4 ) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'extraction consiste en un traitement du milieu contenant l'acide nucléique avec la protéinase K et le SDS, à une extraction phénolique et à une précipitation à l'éthanol en présence de dextrane et de sels appropriés, à une centrifugation consécutive, un séchage et une reprise du culot dans un tampon approprié ou de l'eau.
- 50) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'immobilisation de l'acide nucléique est réalisée par un ligand spécifique à l'acide nucléique.6 ) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'immobilisation de l'acide nucléique consiste à immobiliser par voie active ou passive sur un support solide tel une plaque de microtitration, un anticorps ou mélange d'anticorps anti-acides nucléiques ou des molécules spécifiques affines pour les acides nucléiques, puis de mettre en contact la solution contenant l'acide nucléique à détecter ou doser avec ce support.7*) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la méthode révélant la liaison de l'acide nucléique avec les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques est une méthode immuno-enzymatique.8') Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la méthode de révélation utilise des composés choisis dans le groupe des enzymes et notamment la phosphatase alcaline.
- 90) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la méthode révélant la liaison de l'acide nucléique avec les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques est une méthode utilisant des générateurs de signaux couplés s directement ou indirectement à l'anticorps monoclonal anti-acides nucléiques choisis dans le groupe des composés comprenant les enzymes et les fluorochromes.10i) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la méthode révélant la liaison de l'acide nucléique avec les anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques est une méthode utilisant des molécules affines choisies dans le groupe des composés comprenant l'avidine et la biotine.11 ) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif immunologique est constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques obtenus par préparation d'immunogènes comprenant une ou plusieurs des bases constitutives d'un acide nucléique, en ce que ces immunogènes sont injectés à des souris, en ce que les lymphocytes de ces souris sont fusionnés avec des cellules myélomateuses, en ce que les hybridomes sécrétant les anticorps spécifiques antiacides nucléiques résultant de cette fusion sont clonés, en ce que les anticorps monoclonauxanti-acides nucléiques sont purifiés et contrôlés quant à leur monoclonalité.12i) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le procédé de détection d'acides nucléiques présents dans un milieu biologique par un réactif immunologique constitué par des anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques est appliqué pour la capture de tels acides nucléiques pour réaliser l'épuration dudit milieu ou la purification desdits acides nucléiques.13i) Trousse - ou kit - prête à l'emploi pour la détection et le dosage immunologique d'acides nucléiques et notamment d'ADN présents dans les milieux biologiques, caractérisée en ce qu'elle comprend - Une quantité appropriée éventuellement subdivisée en dosesunitaires suffisantes pour une opération de dosage ou dedétection d'anticorps monoclonaux anti-acides nucléiques etnotamment anti-ADN, utilisables en tant que tels pour laréalisation de ces dits dosage et détection, - Eventuellement une quantité appropriée, subdivisée le caséchéant en doses unitaires suffisantes pour une opérationde dosage ou de détection, d'anticorps anti-IgG marqués parune enzyme ou par fluorescence, d'enzymes, de fluorochromesde molécules affines, pour la révélation de la réactionantigène-anticorps entre l'acide nucléique à étudier et lesanticorps monoclonaux anti-acides nucléiques, - Eventuellement des quantités appropriées de supports solides variés, d'agent de traitement, de tampon, d'agents aptes à reconstituer un milieu de saturation, d'agent permettant la reconstitution d'une solution de visualisation del'activité enzymatique your la mise en oeuvre de ces méthodes de détection et de dosage.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8615406A FR2606154B1 (fr) | 1986-11-05 | 1986-11-05 | Procede de detection et de dosage immunologique des acides nucleiques presents dans les milieux biologiques |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8615406A FR2606154B1 (fr) | 1986-11-05 | 1986-11-05 | Procede de detection et de dosage immunologique des acides nucleiques presents dans les milieux biologiques |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2606154A1 true FR2606154A1 (fr) | 1988-05-06 |
| FR2606154B1 FR2606154B1 (fr) | 1990-05-11 |
Family
ID=9340540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8615406A Expired - Lifetime FR2606154B1 (fr) | 1986-11-05 | 1986-11-05 | Procede de detection et de dosage immunologique des acides nucleiques presents dans les milieux biologiques |
Country Status (1)
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|---|---|
| FR (1) | FR2606154B1 (fr) |
Cited By (2)
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-
1986
- 1986-11-05 FR FR8615406A patent/FR2606154B1/fr not_active Expired - Lifetime
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2606154B1 (fr) | 1990-05-11 |
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