FR2605107A1 - Procede de purification et de separation de cellules ou de molecules homogenes a partir d'une suspension de cellules ou de molecules heterogenes, polymere modifie apte a realiser ladite separation et procede de production dudit polymere modifie - Google Patents

Abstract

PROCEDE DE PURIFICATION ET DE SEPARATION DE CELLULES OU DE MOLECULES HOMOGENES A PARTIR D'UNE SUSPENSION DE CELLULES OU DE MOLECULES HETEROGENES. SELON CE PROCEDE ON MODIFIE LA SURFACE D'UN POLYMERE PAR DE L'OZONE POUR Y INTRODUIRE DES CHARGES NEGATIVES SUR LESQUELLES SE FIXENT LES CELLULES OU LES MOLECULES QUE L'ON CHERCHE A SEPARER, EN PRESENCE D'UN COMPETITEUR OU D'UN INHIBITEUR, PUIS ON RECUPERE LES CELLULES OU MOLECULES AINSI SEPAREES. POLYMERE MODIFIE APTE A REALISER LADITE SEPARATION ET PROCEDE DE PRODUCTION DUDIT POLYMERE. APPLICATIONS NOTAMMENT A L'ETUDE DES PROPRIETES FONCTIONNELLES DES CELLULES DIFFERENCIEES SEPAREES.

Description

La présente invention est relative à un procédé de purification et de séparation de cellules ou de molécules homogènes à partir d'une suspension de cellules ou de molécules hétérogènes, à l'aide d'un polymère, tel que le polystyrène par exemple, modifié par ozonation
afin d'être adapté à la fixation de populations de cellules ou de molécules déterminées.

On s'est depuis une dizaine d'années intéressé à la fixation de cellules en particulier d'origine microbienne sur divers supports tels des plaques, des boîtes, des flacons, des tubes, des bouteilles, afin de permettre la culture de cellules nécessitant une fixation d'ancrage sur lesdits supports (K. Mosbach, Ed Methods in Enzymology, vol. 44, Academic Press, New York, 1976 ; Chubata and
T. Rosa in LB Wingard et al. "Applied Biochemistry and
Bioengineering", vol. 1, Academic Press, New York, U.S.A.

1976, p. 329-357), et l'on s'est successivement intéressé à l'immobilisation de cellules végétales en suspension (P. Brodelius et al., FEBS letters 103, 93-97, 1979) ainsi qu'à celle de cellules animales indifférenciées (A.L. Van Wezel, Nature, 26, 64-65, 1967 ; Levine et al. in "Cell culture and its . applications", Academic
Press, New-York, 1977, p. 191-216). En ce qui concerne les cellules animales, la préoccupation majeure des chercheurs fut d'obtenir des lignées cellulaires peu différenciées se développant rapidement dans un rapport volume cellulaire/volume du liquide nutritionnel aussi élevé que possible, ce qui devait conduire aux cultures sur microsupports (Brevet français M.I.T. 2 370 792 ; Morbach et al., Demande Internationale PCT 81/01098 du 4/03/1982).

Une modification intéressante a été apportée aux microsupports pour obtenir la culture cellulaire la plus riche:
ce fut de calculer la quantité de charges mises sur un polymère et d'utiliser de 0,1 à 4,5 milliéquivalents par gramme (Brevet français M.I.T. 2 370 792). Les groupes utilisés sont des hydroxydes de métaux alcalins- et des amines tertiaires ou quaternaires, fixés sur des groupes hydroxyles que comporte le polymère. Les perles de dextrane sont traitées dans des bains variés et on autoclave ensuite. Les micro supports sont traités par différents rapports amine/substance alcaline ou des groupes phosphonium pour obtenir la fixation de charges positives sur des dextranes.

D'autres micro supports à base de silice poreuse ont également été décrits (B. Bizzoni. et al., US Patent n0 3 717 551), algonate (P. Brodelius et al., FEBS Letters, 103, 93, 1979).

Il est connu d'autre part de modifier par voie chimique la surface de substrats organiques ou inorganiques à l'aide d'un plasma (Brevets Becton Dickinson
US 4 452 679 et EP 0 076 562). Les fonctions chimiques greffées peuvent différer en fonction des conditions de formation de ce plasma et du gaz utilisé, qui peut être de l'oxygène, de l'annoniac de l'anhydride sulfureux, du gaz carbonique,...

Il est également connu d'appliquer ce procédé de modification chimique de la surface de substrats organiques ou inorganiques pour favoriser la croissance de certaines cultures cellulaires et inhiber celle d'autres cellules (Brevet Becton Dickinson EP 0 092 302) et plus particulièrement favoriser la croissance de cellules primaires tout en inhibant la croissance des fibroblastes.

D'autre part, on connait différentes méthodes d'attachement de macromolécules (Brevet Becton Dickinson
EP 0104608) sur un polymère, en traitant la surface de ce polymère de différentes manières, telles que l'utilisation d'homopolymères sélectifs, la copolymérisation, le grattage de la surface ou le traitement à l'aide d'un plasma, afin de générer des groupes chimiques spécifiques.

Les difficultés d'utilisation tiennent à ce que dans tous les cas le bain est liquide et nécessite un chauffage plus ou moins long, avec de nombreuses manipulations, et que le contrôle du matériau n'est pas assuré avec précision ; Se plus, les seules cultures cellulaires décrites sont des fibroblastes, cellules non différenciées; par ailleurs un traitement antiseptique est nécessaire.

Le problème fondamental que pose l'utilisation d'un polymère synthétique, tel le polystyrène, pour la culture de cellules et de tissus animaux ou humains, est la caractéristique hydrophobe de sa surface, qui empêche les solutions liquides et notamment aqueuses d'adhérer à la surface de ce dit polymère. Il a été ainsi proposé, pour rendre la surface de ces polymères hydrophile, de traiter de différentes manières ces dits polymères, afin de permettre l'adhésion ultérieure de suspensions cellulaires sur ces polymères modifiés.

On connaît un procédé consistant à traiter la surface de la matière plastique par un milieu comportant des radicaux libres pouvant réagir avec ladite matière afin d'introduire dans sa couche superficielle des groupes hydrophiles (Brevet Nunc BF 2 168 .013). On peut utiliser l'eau oxygénée et l'eau pour former ces radicaux libres par exposition aux rayonnements ultraviolets en présence d'un oxydant, et l'ozone qui se forme en quantité importante apparaît comme un composé intermédiaire important dans la réaction avec la matière plastique.

Il est également connu (Brevet Wako japonais 52-41291) de traiter des polymères à haut poids moléculaire, tels que le polystyrène, par de l'ozone afin d'introduire des groupes hydrophiles à la surface dudit polymère pour permettre la culture de tissus. La concentration d'ozone utilisée varie de 0,2 à 10 %, la température de manipulation est la température ambiante, enfin la durée d'exposition du polymère est comprise entre une et quatre heures.

L'ozonation du polystyrène pour favoriser l'ancrage et la croissance des cellules sur les boîtes de
Pétri en polystyrène semble avoir été très peu étudiée.

L'adhésion de cellules BHK et de leucocytes, sur des surfaces de polystyrène ayant subi différents traitements chimiques, a été décrite par Curtis en 1983 (A.S. Curtis,
Adhesion of cells to polystyrène surface - J. Cell Biology, 97, 1983, 1500 - 1506). En traitant la surface de boites de Pétri en polystyrène pendant 25 minutes, à une température de 25 C, avec une concentration d'ozone à 2 %, selon
Curtis, I'ozonation augmente l'adhésion des cellules BHK et des leucocytes par rapport aux surfaces non traitées, mais l'attachement est moins bon que celui obtenu avec d'autres traitements tels que l'immersion dans les acides sulfurique ou chlorhydrique.

Enfin, l'on connaît également une méthode de séparation de cellules ("panning" de Mike Mage, 1977) qui consiste à fixer sur une matière plastique des anticorps dirigés contre des antigènes de surface cellulaires qui retiennent les cellules exprimant ces antigènes, ou de façon indirecte, à fixer des anticorps à la surface d'un antigène puis à les fixer sur une matière plastique recouverte d'anticorps antiimmunoglobulines, cette adhésion spécifique étant réalisée dans un milieu contenant 10 % de sérum de veau foetal. Cette technique a comme inconvénients de nécessiter le recours à des anticorps spécifiques et l'obligation d'une interaction entre cellules et anticorps, ce qui risque d'altérer les réactions physiologiques de la cellule.

La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des moyens propres à permettre la purification et la séparation de cellules ou de molécules homogènes à partir d'une suspension de cellules ou de molécules hétérogènes, qui répondent mieux aux nécessités de la pratique que les moyens proposés dans l'Art antérieur, notamment en ce qu'ils introduisent une simplification considérable dans la mise en oeuvre de la séparation des cellules ou des molécules, à quoi s'ajoute une absence d'altération des fonctions physiologiques de la cellule ou de la molécule.

La présente invention a pour objet un procédé de purification et de séparation de cellules ou de molécules homogènes à partir d'une suspension de cellules ou de molécules hétérogènes, caractérisé en ce que lesdites purification et séparation sont réalisées à l'aide d'un polymère présentant une surface modifiée par ozonation à une température comprise entre 20 et 1000C environ, pour y introduire des charges négatives sur lesquelles se fixent les cellules ou molécules que l'on cherche à séparer, en pré
sence d'un compétiteur ou d'un inhibiteur, et en ce que
les cellules ou les molécules séparées sont ensuite récupérées par tout moyen approprié.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé objet dela présente invention, le polymère utilisé qui subit le traitement à l'ozone est un polymère choisi dans le groupe comprenant notamment le polystyrène, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle, les polyesters, les copolymères d'éthylènepropylène, l'acétylcellulose, les polycarbonates, le polypropylène, les polyacrylates.

Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé conforme à la présente invention pour la séparation de cellules, le compétiteur ou inhibiteur mis en oeuvre est une protéine.

Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la protéine utilisée en tant que compétiteur ou inhibiteur est choisie dans le groupe qui comprend notamment le sérum de veau foetal, la serumalbumìne, les immunoglobulines, la gélatine.

Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, la protéine utilisée en tant que compétiteur ou inhibiteur est présente à une concentration comprise entre 0,001 et 100 mg/ml.

Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à la présente invention, les cellules séparées fixées sur le polymère modifié susdit sont récupérées de ce dernier en séparant le surnageant contenant les cellules non adhérentes, en soumettant les cellules fixées à une pluralité de lavages successifs, en suite de quoi-l'ensemble des surnageants et des liquides de .lavage sont mélangés et contrôlés pour déterminer leur teneur en cellules, qui est élevée.

Selon une modalité avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le surnageant contenant des cellules non. adhé- rentes est 9 nouveau mis en contact avec le polymère conforme à la présente invention en présence d'une concentration de compétiteur ou de l'inhibiteur différente de la concentration utilisée pour la fixation d'un premier type de cellules, pour fixer un second type de cellules, cette opération pouvant être répétée autant de fois que l'on souhaite séparer de types de cellules.

Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, on réalise la séparation et la purification successives de plusieurs populations de cellules dont chacune est homogène, en faisant varier la concentration en compétiteur ou inhibiteur et éventuellement la température de mise en oeuvre du procédé.

Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre du procédé conforme à la présente invention, convenant plus particulièrement à la séparation et à la purification de différentes fractions de molécules homogènes, ces dites molécules sont séparées d'une suspension de molécules hétérogènes par chromatographie en faisant varier la force ionique du milieu et le p d'un tampon mis en oeuvre pour la séparation d'une fraction de molécules spécifiques par rapport aux autres fractions.

La présente invention a également pour objet un polymère modifié pris dans le groupe comprenant notamment le polystyrène, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle, les polyesters, les copolymères d'éthylènepropylène, l'acé tylcellulose, les polycarbonates, le polypropylène, les polyacrylates, dont la surface est modifiée par introduction sur cette dernière de charges négatives par traitement du polymère initial par de l'ozone à une températurecoqprise entre 20 et 1000C environ et pendant une durée comprise entre 20 mn et 8 heures environ.

La présente invention a également pour objet un procédé de modification de la surface d'un polymère pris dans le groupe comprenant notamment le polystyrène, le.

polyéthylène, le chlorure de polyvinyle, les polyesters, les copolymères d'éthylènepropylène, l'acétylcellulose, les polycarbonates, le polypropylène, les polyacrylates, lequel procédé est caractérisé en ce que ledit polymère est soumis à un traitement par l'ozone gazeux à une te.mpé- rature comprise entre 20 et 100 CC environ, pendant 20 mn à 8 heures environ.

Selon un mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, l'ozone est introduit dans le milieu à traiter dans des conditions telles que sa concentration dans celuici soit de l'ordre de 0,0001 à 5 % environ.

Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux de ce procédé, l'ozone est introduit dans le milieu à traiter sous la forme d'un mélange oxygène-ozone.

La présente invention a en outre pour objet une trousse (ou kit) prête à l'emploi pour l'étude des propriétés fonctionnelles de cellules différenciées (lymphocytes, cellules hypophysaires, cellules surrenaliennes...) et pour le diagnostic d'immunodéficiences, laquelle trousse est caractérisée en ce qu'elle contient - un support en polymère modifié apte à fixer la population
de cellules à analyser - des quantités appropriées éventuellement subdivisées en
doses unitaires suffisantes de protéines et de tampons
pour la mise en oeuvre du procédé de séparation et de
purification de différentes fractions cellulaires homo
gènes.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.

L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.

Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples de mise en oeuvre sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Traitement du polystyrène par ozonation.

- Les matériaux suivants ont été traités
* les films polystyrène "qualité diélectrique"
. épaisseur 25 Am
. haute pureté chimique
* boites de Pétri en polystyrène "cristal"
. diamètre 35 mm
. obtenues par moulage-injection
* plaques de micro-titration en polystyrène "cristal"
. 96 cupules
. obtenues par moulage-injection
* plaques de titration en polystyrène "cristal"
24 cupules
. obtenues par moulage-injection.

- Les paramètres de traitement suivants ont été utilisés
Température de traitement : 250C à 600C
Temps de traitement : 20 mn, 1 heure, 2 heures, 4 heures,
8 heures.

- Le traitement des différents matériaux se fait en phase
vapeur pendant un temps et à une température variables
Le produit à traiter est placé dans un réacteur de type
filtre thermostatique de diamètre 17,5 cm et de profon
deur 15 cm.

La régulation de température est assurée par circulation
d'eau dans l'enveloppe extérieure du réacteur et
contrôlée par un thermomètre passant dans le couvercle.

L'étanchéité est assurée par des joints Téflon.

Le mélange oxygène-ozone provient d'un ozoniseur à rayon
nement UV ROTAX.

Les débits sont contrôlés à l'aide de débitmètres à billes
BROOKES, préalablement étalonnés. Les vapeurs d'ozone
sont neutralisées par une solution d'iodure de potassium
(KI).

L'homogénéisation du gaz à l'intérieur du réacteur est
assurée par la rotation d'une hélice.

L'ozonation se déroule de la façon suivante
- les supports à traiter sont mis en place dans le réacteur
où on fait circuler l'azote pendant 15 mn avec un débit
de 130 litres/heure, ce qui correspond à dix fois le
volume du réacteur environ ; le réacteur est ensuite
balayé un temps donné par un mélange oxygène/ozone, avec
un débit de 12 litres/heure
- le système est purgé par un fort courant d'azote pen
dant 10 mn
- les supports traités sont placés sous vide primaire pen
dant 24 heures, puis emballés.

EXEMPLE 2 : Séparation de différentes fractions de lymphocytes de porc au sein d'une suspension de lymphocytes de sang de porc.

On sépare en une 1ère étape les globules rouges, les monocytes et les polynucléaires par les techniques classiques de traitement au Fer-carbonyle, suivi de centrifugation en gradient de "Ficoll" et de 3 ou 4 lavages permettant d'obtenir une suspension de lymphocytes qui comprend les cellules B, les cellules T activées (en très petit nombre), les cellules T suppressives et les cellules T auxiliaires.

On place en une 2ème étape cette suspension dansun milieu de culture tamponné à l'Hépès et contenant soit 10 % de sérum de veau foetal, soit 24 mg/ml d'albumine sérique bovine, soit une autre protéine. On ajuste cette suspension de 3.106 à 107 cellules par ml. Après une heure de contact à température du laboratoire, une partie de la population cellulaire est fixée à la surface du polymère : on enlève doucement le liquide surnageant contenant les cellules non adhérentes et on lave 8 à 10 fois avec du milieu additionné ou non soit de 10 8 de sérum de veau foetal, soit avec du sérum physiologique, soit avec tout autre milieu et on mélange l'ensemble des surnageants et des liquides de lavages qui renferment de 90 à 98 % de cellules
SIg-, qui se révèlent être des cellules T.Les cellules adhérentes sont récoltées en projetant un jet de milieu avec une seringue de 20 ml sur la boite de plastique et se révèlent être essentiellement des cellules SIg+ (cellules
B avec 4 ou 5 % de cellules T activées SIg+)(le pourcentage de SIg- n'excède pas 2 à 5 %).

En une 3ème étape, les cellules SIg- sont alors lavées et replacées dans le même milieu contenant cette fois, par exemple, 0,375 mg d'albumine sérique bovine à raison de 106 à 107 cellules/ml placées sur les boîtes de
Pétri pour une heure à la température et l'on opère de la même façon : dans ces conditions, les cellules adhérentes sont représentées par 85 à 95 % de cellules PT8 (cellules suppressives) et les cellules surnageantes pour 80 à 95 % de cellules PT4 (cellules auxiliaires).

Le Tableau I ci-après représente un exemple de purification de lymphocytes de sang de porc et fournit le pourcentage de types de cellules en fonction du traitement que ces cellules subissent.

TABLEAU I

<tb> <SEP> Po <SEP> Types <SEP> de <SEP> Mono <SEP> : <SEP> : <SEP>
<SEP> Pou <SEP> X <SEP> Types <SEP> de <SEP> Mono- <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> <SEP> centa- <SEP> \ <SEP> cellu- <SEP> cytes <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> <SEP> ge <SEP> de <SEP> N <SEP> es <SEP> :et <SEP> po- <SEP> SIg+ <SEP> : <SEP> SIg- <SEP> : <SEP> PT4 <SEP> : <SEP> PT8
<tb> <SEP> cellules <SEP> \ <SEP> lynx <SEP> .<SEP> :
<tb> <SEP> d'après <SEP> le <SEP> \ <SEP> :cléai-: <SEP> : <SEP> :
<tb> <SEP> traitement <SEP> subi\:res
<tb> traitement <SEP> subi <SEP> :res
<tb> <SEP> Origine <SEP> : <SEP> 15#25: <SEP> 7-12 <SEP> : <SEP> 70-80 <SEP> : <SEP> 20-30 <SEP> : <SEP> 40-50
<tb> <SEP> 1ère <SEP> étape <SEP> : <SEP> :
<tb> :traitement <SEP> au <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> fer-carbonyle <SEP> 1-3 <SEP> : <SEP> 10-15 <SEP> : <SEP> 80-90 <SEP> : <SEP> 25-35 <SEP> :
<tb> <SEP> 2ème <SEP> étape <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> ~
<tb> : <SEP> 2ème <SEP> étape <SEP> : <SEP> :
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<tb> ozonisé) <SEP> cellules <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> adhérentes <SEP> : <SEP> 0-3 <SEP> : <SEP> 90-98 <SEP> : <SEP> 2-5 <SEP> : <SEP> 0-3 <SEP> : <SEP> 0-5
<tb> <SEP> 3ème <SEP> étape <SEP> . <SEP> . <SEP> .<SEP> .
<tb>

: <SEP> 3ème <SEP> étape <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> :(sur <SEP> le <SEP> plastique <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> :ozonisé) <SEP> cellules <SEP> : <SEP> : <SEP> : <SEP> :
<tb> adhérentes <SEP> : <SEP> 0 <SEP> : <SEP> 1-3 <SEP> : <SEP> 90-98 <SEP> : <SEP> 1-10 <SEP> : <SEP> 85-95
<tb> :cellules <SEP> :
<tb> <SEP> cellules <SEP> . <SEP> ~ <SEP> . <SEP> .
<tb>

<SEP> surnageantes <SEP> : <SEP> 0 <SEP> : <SEP> 0-3 <SEP> : <SEP> 95-98 <SEP> : <SEP> 80-95 <SEP> : <SEP> 2-10
<tb>
EXEMPLE 3 : Purification des cellules gonadotropes de 1' hypophyse.

On peut dans certains cas modifier la technique telle que décrite dans l'Exemple 2 en utilisant un polymère sur lequel se fixe par exemple une hormone dont on connaît les cellules exprimant à leur surface le récepteur spéci fichue.

Les cellules gonadotropes de l'hypophyse sont présentes à raison de 10 à 15 % de la population cellulaire et sont connues pour être seules dans l'hypophyse à posséder à leur surface des récepteurs spécifiques de la LHRH hormone hypotalamique.

Dans un premier temps nous avons préparé 3 polystyrènes modifiés de façon différente par l'acide sulfurique et 4 polystyrènes modifiés de fanon différente par l'ozone, comme le montre le Tableau Il qui va suivre.

TABLEAU II

<tb> I <SEP> <SEP> POLYSTYRENES <SEP> I <SEP> TEMPS <SEP> I <SEP> TEMPERATURES
<tb> I <SEP> TRAITES
<tb> |
<tb> I <SEP> AS <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 157 <SEP> SEC. <SEP> I <SEP> 370 <SEP> I <SEP> | <SEP> TRAITEMENT
<tb> AS <SEP> <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 150 <SEP> SEC. <SEP> I <SEP> 600 <SEP> 1 <SEP> <SEP> PAR <SEP> L'ACIDE <SEP> I <SEP>
<tb> I <SEP> AS <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 150 <SEP> SEC.<SEP> I <SEP> 800 <SEP> I <SEP> SULFURIQUE <SEP> I <SEP>
<tb> <SEP> |
<tb> I <SEP> OZ <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> H <SEP> 1 <SEP> 200 <SEP> <SEP> i <SEP> TRAITEMENT <SEP> I <SEP>
<tb> I <SEP> OZ <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 20 <SEP> MN <SEP> I <SEP> 600 <SEP> I <SEP> PAR
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<tb> |
<tb>
puis nous avons comparé ces polystyrènes traités au polystyrène non traité, en fonction de la capacité de chacun d'entre eux de fixer après deux heures de contact à la température ordinaire la LHRH marquée à l'iode en solution.C'est ce que montre le Tableau III ci-après.

TABLEAU III

<tb> I <SEP> POLYSTYRENES <SEP> I <SEP> CAPACITE <SEP> DE <SEP> FIXATION <SEP> <SEP> t <SEP>
<tb> I <SEP> <SEP> UTILISES <SEP> I <SEP> <SEP> DE <SEP> LA <SEP> LHRH
<tb> t <SEP> NON <SEP> <SEP> TRAITE <SEP> I <SEP> <SEP> 3,5 <SEP> %
<tb> I <SEP> AS <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 16,5 <SEP> %
<tb> I <SEP> <SEP> AS <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 13 <SEP> %
<tb> I <SEP> AS <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 17,5 <SEP> %
<tb> I <SEP> <SEP> OZ <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 73 <SEP> %
<tb> I <SEP> <SEP> OZ <SEP> 2 <SEP> 1 <SEP> 50,8 <SEP> %
<tb> I <SEP> <SEP> OZ <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 48,5 <SEP> %
<tb> I <SEP> <SEP> OZ <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 86,5 <SEP> %
<tb> |
<tb>
Prenant alors des boites de polystyrène traitées par l'ozone à 600C pendant deux heures (qui s'était révélé le plus actif dans la fixation de la LHRH), nous l'avons traité pendant une heure avec des solutions de concentrations différentes de LHRH, puis après 5 lavages au sérum physiologique ou au PBS,nous avons placé une suspension de cellules hypophysaires (obtenues par trypsinisation) puis incubation d'une nuit à 370C en culot dans un milieu additionné de 10 % de sérum de veau foetal.

Après traitement identique à celui décrit dans l'Exemple 2, le pourcentage de cellules gonadotropes adhérentes a été de 80 % sur le polymère où a été préalablement fixée la LHRH, alors que sur un polymère non traité de la manière décrite ci-dessus pour fixer la LHRH, le pourcentage de cellules gonadotropes adhérentes n'a été que de 12 à 15 %.

La caractérisation des cellules gonadotropes. a été faite par des anticorps anti-LH secrétion spécifique de ces cellules. Dans ces conditions, on obtient une suspension contenant au moins 45 % de cellules gonadotropes.

Si au lieu de 10 % de sérum de veau foetal, on utilise un milieu pour culture cellulaire (MEM-Earl Dulbecco, etc...) tamponné par de l'Hépès auquel on ajoute de 0,10 à 5 mg d'albumine bovine (ou toute autre protéine) on obtient une purification qui peut aller de 70 à 95 % de cellules gonadotropes.

de 70 à 95 % de cellules gonadotropes.

EXEMPLE 4 : Utilisation de polystyrène ozonisé pour la séparation de molécules.

Le procédé qui consiste à traiter le polystyrène par de l'ozone à différentes températures pour des périodes variables permet d'obtenir un nouveau matériau servant à la séparation de molécules soit pour la chromatographie à basse pression, soit pour la chromatographie à haute pression.

On peut utiliser soit des billes d'un matériau quelconque d'un diamètre de 5 à 25 micromètres enrobées de polystyrène d'une épaisseur de quelques micromètres, soit des billes en polystyrène. Ces billes sont traitées ultérieurement par l'ozone selon des modalités appropriées et peuvent être ensuite empilées dans des colonnes de verre ou de plastique comme cela se pratique en
chromatographie à basse ou haute pression pour la sépara tion de peptides ou de protéines en fonction de la force ionique du milieu et du pH du tampon.

Le procédé de purification et de séparation de cellules ou de molécules tel que décrit dans la présente invention comporte de nombreuses applications dont quelques exemples sont cités ci-après.

- Dans l'industrie agroalimentaire, il peut être intéressant de séparer les levures des bactéries.

En particulier dans les industries de fermentation, il est possible d'élaborer des capteurs capables de rechercher une levure anormalement présente dans un certain milieu et d'effectuer ainsi des contrôles de qualité sur un milieu à analyser.

- Aux fins de la recherche cellulaire, le procédé selon la présente invention permet de tester les capacités fonctionnelles de sous-populations de lymphocytes humains pour le diagnostic d'immunodéficiences et de la même manière les propriétés fonctionnelles de n'importe quelle cellule différenciée, par l'utilisation d'un kit comprenant tous les composés nécessaires à la mise en oeuvre dudit procédé.

Claims (16)

REVENDICATIONS

1.- Procédé de purification et de séparation de cellules ou de molécules homogènes à partir d'une suspension de cellules ou de molécules hétérogènes, caractérisé en ce que lesdites purification et séparation sont réalisées à l'aide d'un polymère présentant une surface modifiée par ozonation à une température comprise entre 20 et 1000C , pour y introduire des charges négatives sur lesquelles se fixent les cellules ou les molécules que l'on cherche à séparer, en présence d'un compétiteur ou d'un inhibiteur et en ce que les cellules ou les molécules séparées fixées sont ensuite récupérées par tout moyen approprié.

2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère utilisé qui subit le traitement à l'ozone est un polymère choisi dans le groupe comprenant notamment le polystyrène, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle, les polyesters, les copolymères d'éthylènepropylène, l'acétylcellulose, les polycarbonates, le polypropylène, les polyacrylates.

3.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le compétiteur ou inhibiteur est une protéine.

4.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine utilisée en tant que compétiteur ou inhibiteur est choisie dans le groupe qui comprend notamment le sérum de veau foetal, la serumalbumine, les immunoglobulines, la gélatine.

5.- Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la protéine utilisée en tant que compétiteur ou inhibiteur est présente à une concentration comprise entre 0,001 et 100 mg/ml.

6.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules séparées fixées sur le polymère modifié sont récupérées de ce dernier en séparant le surnageant contenant les cellules non adhérentes, en soumettant les cellules fixées à une pluralité de lavages succes sifs, en suite de quoi l'ensemble des surnageants et des liquides de lavage sont mélangés et contrôlés pour déterminer leur teneur en cellules.

7.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que l'on réalise la séparation et la purification successives de plusieurs populations de cellules dont chacune est homogène, en faisant varier la concentration en compétiteur ou inhibiteur et éventuellement la température de mise en oeuvre du procédé.

8.- Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le surnageant contenant des cellules non adhérentes est à nouveau mis en contact avec le polymère modifié, en présence d'une concentration du compétiteur ou de l'inhibiteur différente de la concentration utilisée pour la fixation d'un premier type de cellules, pour fixer un second type de cellules, cette opération pouvant être répétée autant de fois que l'on souhaite séparer de types de cellules.

9.- Procédé selon la revendication 1, appliqué à la séparation et à la purification de molécules, caractérisé en ce que différentes fractions de molécules homogènes sont séparées à partir d'une suspension de molécules hétérogènes par chromatographie en faisant varier la force ionique du milieu et le pH d'un tampon mis en oeuvre pour la séparation de molécules spécifiques par rapport aux autres fractions.

10.- Polymère modifié pris dans le groupe qui comprend notamment le polystyrène, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle, les polyesters, les copolymères d'éthylènepropylène, l'acétylcellulose, les polycarbonates, le polypropylène, les polyacrylates, caractérisé en ce que la surface dudit polymère est modifiée par introduction sur cette dernière de charges négatives par traitement du polymère initial par de l'ozone à une température comprise entre 20 et 100cl environ et pendant une durée comprise entre 20 mn et 8 heures environ.

11.- Procédé de modification de la surface d'un polymère pris dans le groupe comprenant notamment le polystyrène, le polyéthylène, le chlorure de polyvinyle, les polyesters, les copolymères d'éthylènepropylène, l'acétylcellulose, les polycarbonates, le polypropylène, les polyacrylates, caractérisé en ce que ledit polymère est soumis à un traitement par l'ozone gazeux à une température comprise entre 20 et 1000C environ, pendant 20 mn à 8 heures environ.

12-.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'ozone est introduit dans le milieu à traiter dans des conditions telles que sa concentration soit de l'ordre de 0,0001 à 5 % environ.

13.- Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'ozone est introduit dans le milieu à traiter sous forme d'un mélange oxygène-ozone.

14.- Trousse - ou kit - prête à l'emploi pour l'étude des propriétés fonctionnelles de cellules différenciées et pour le diagnostic d'immunodéficiences, laquelle trousse est caractérisée en ce qu'elle contient : - un support en polymère modifié apte à fixer la population

de cellules à analyser ; - des quantités appropriées éventuellement subdivisées en

doses unitaires suffisantes de protéines ; - des quantités appropriées de tampons pour la mise en so

lution des protéines susdites, pour la mise en oeuvre du procédé de séparation de différentes fractions cellulaires homogènes, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8.

15.- Trousse ou kit selon la revendication 14, caractérisée en ce que les protéines qu'elle comprend sont prises dans le groupe qui comprend notamment le sérum de veau foetal, la serumalbumine, les immunoglobulines, la gélatine.

16.- Trousse ou kit selon l'une quelconque des revendications 14 et 15, caractérisée en ce que la protéine qu'elle contient est dissoute dans le tampon à différentes concentrations et en ce que ladite trousse ou kit comprend une pluralité de conditionnements contenant chacun une solution de protéines dans du tampon, à différentes concentrations.