FR2532307A1 - Nouvel amide utilisable comme substrat synthetique et procede de dosage l'utilisant - Google Patents

Abstract

NOUVEAU SUBSTRAT SYNTHETIQUE ET PROCEDE DE DOSAGE L'UTILISANT; LE NOUVEAU SUBSTRAT EST UN AMIDE DE FORMULE (CF DESSIN DANS BOPI) DANS LAQUELLE LES SYMBOLES SONT DEFINIS; UN PROCEDE DE DOSAGE SELON L'INVENTION S'APPLIQUE EN PARTICULIER AU DOSAGE DE PEPTIDASES, NOTAMMENT LA LEUCINE-AMINOPEPTIDASE ET LA G-GLUTAMYL-TRANSPEPTIDASE.

Description

2532307-

-1 -

L'invention concerne un nouveau substrat syn-

thétique et un procédé de dosage l'utilisant.

Plus particulièrement, l'invention concerne un

nouveau substrat synthétique pour le dosage de l'activi-

té peptidasique et un procédé de dosage des peptidases. L'invention concerne un amide de formule: xx

R NH OH

y

dans laquelle R est un radical L-leucyle ou (-L-gluta-

myle et X et Y sont semblables ou différents et sont des atomes d'halogène, ou un sel correspondant, et un procédé de dosage des peptidases qui comprend: un procédé de dosage de l'activité enzymatique qui consiste à traiter un amide de formule: Rl R

R 1 NH R

R R

2 5

6 5

dans laquelle R 1 est un radical L-leucyle ou -L-gluta-

myle, R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 sont un atome d'hydrogène ou un radical halogéno, alkyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué hydroxy, carboxy ou sulfo et R 5 et R 6 peuvent former ensemble un cycle carboné, ou un sel soluble correspondant, avec une peptidase, à traiter l'amine ainsi libérée de formule -2-

R 2 R

H 2 N R 4

R 6 R 5

dans laquelle R 2, R 3, R 4, R et R 6 ont les mêmes signi-

fications que précédemment, avec une oxydase qui con-

somme de l'oxygène et forme un colorant en présence d'un coupleur de formule:

R 8 /

R 7 10 o

R 12 R 11

dans laquelle R 7 est un atome d'hydrogène ou un radical amino, amino substitué ou hydroxy, R 8, R 9, R 10, R 11 et

R 12 sont un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un radi-

cal alkyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino

substitué, hydroxy, carboxy ou sulfo et R 11 et R 12 peu-

vent éventuellement former ensemble un cycle carboné, ou R 7 peut éventuellement être un atome d'hydrogène lorsqu'au moins un des symboles R 8, R 9, R 10, R 11 et R 12 est un radical amino, amino substitué ou hydroxy, puis à mesurer quantitativement les changements détectables, et un procédé de dosage qui consiste à traiter un amide de formule X /

R H OH

-3-

dans laquelle R est un radical L-leucyle ou -L-gluta-

myle et X et Y sont semblables ou différents et sont des atomes d'halogène, ou un sel correspondant, avec une peptidase dans un échantillon pour libérer un dérivé d'aniline de formule X

H 2 N 7 OH

dans laquelle X et Y ont les mêmes significations que précédemment, oxyder ledit dérivé d'aniline et mesurer

quantitativement les changements détectables.

Le terme bien connu de peptidase désigne les enzymes qui agissent sur la liaison peptidique des LI peptides et provoquent un clivage de 1 extrémité NA terminale pour libérer des amino-acides ou des peptides plus petits Par exemple des aminopeptidases, telles que la leucine- aminopeptidase (LAP vraie de la chimie clinique) ou l'arylamidase (LAP clinique de la chimie clinique, parfois appelée ci-après A) (ci-après la AIP

vraie et la LAP clinique sont désignées de façon géné-

rale par l'abréviation LAP), la cystine-aminopeptidase, la prolineaminopeptidase, l'arginine-aminopeptidase,

l'alanine-aminopeptidase ou la ' glutamyl-transpepti-

dase ( -GTP) sont bien connues.

Parmi les enzymes précédentes, la AIP et la-

Y -GTP sont abondamment réparties dans les tissus vi-

vants et dans le sérum Ces enzymes présentent des te-

neurs accrues dans des états pathologiques et sont des éléments importants du diagnostic clinique et pour le

dosage de l'activité enzymatique dans les détermina-

tions cliniques.

-4- La LAP est une enzyme qui hydrolyse le reste

amino-terminal d'un L-peptide qui comporte de la L-leu-

cine ou un peptide apparenté comme reste N-terminal, pour libérer la Lleucine et qui in vivo est répartie dans les tissus et le sérum La teneur sérique en LAP varie beaucoup selon l'état de l'organisme et elle est accrue dans l'hépatite aiguë, l'hépatome, l'hépatome

métastatique, la cirrhose du foie et l'angiocholite.

Donc l'activité de la LAP est révélatrice de ces-symp-

temes et le dosage de l'activité de la LAP est indispen-

sable au diagnostic clinique de ces symptômes.

La 'Y -GTP est une enzyme associée au métabo-

lisme in vivo des Y-glutamyl-peptides qui catalyse la

réaction d'hydrolyse du groupe '-glutamyle des J-gluta-

myl-peptides et transfère ledit groupe a d'autres amino-

acides ou peptides et est abondaiment répartie in vivo

dans les tissus et dans le sérum La -GTP sérique va-

rie selon les états symptomatiques On indique que la teneur sérique de la f-GTP est élevée dans l'hépatite par cholostase, l'ictère par obstruction, l'hépatome métastatique primitif et l'hépatite chronique active

et réduite dans l'hépatite chronique non active La dé-

termination de l'activité de la '-GTF sérique est spé-

cifique de l'hépatite chronique et est utile pour le diagnostic clinique et l'évaluation pathologique de

telles maladies.

A ce jour les procédés de dosage de la LAP sont bien connus et la plupart d'entre eux sont des procédés de dosage colorimétrique de l'amine libérée sous l'effet de l'activité de la LAP Dans le dosage on emploie le Lleucyl p-nitroanilide comme substrat

synthétique et on mesure la couleur jaune de la p-nitro-

aniline produite par l'action enzymatique de la LAP, cependant, lors de la détermination colorimétrique de cette couleur, le maximum d'absorption colorée fait -5- l'objet d'une superposition désavantageuse et de plus des composants du sérum, tels que le pigment bilirubine,

ont un effet désavantageux On connaît également un pro-

cédé utilisant comme substrat synthétique le L-leucyl-

8-naphtylamide Cependant ce procédé a de nombreux in- convénients Le procédé de dosage est très complexe et

nécessite une réalisation précise, par exemple la -

naphtylamine formée est couplée avec le diazotate de -nitro-2aminométhoxybenzène pour former un colorant ou la 9-naphtylamine ainsi formée est diazotée avec le

nitrite de sodium pour être couplée avec la N-( 1 =naph-

tyl)-éthylènediamine ou est condensée avec le p-diméthyl-

aminobenzaldéhyde ou le p-diméthylamino cinnamaldéhyde pour former un colorant qu'on dose par colorimétrie De plus la substance standard qu'est la R-naphtylamine est toxique et provoque des cancers ou des tumeurs de la vessie On connaît des procédés de dosage de la Y-GTP

et la-plupart d'entre eux sont des dosages colorimétri-

ques d'une amine libérée à partir d'un substrat sy Ethé-

tique par la y-GTP Par exemple, dans un procédé de do-

sage utilisant le '-glutamyl-p-nitroanilide, on traite

le Y-glutamyl-p-nitroanilide avec la -GTP pour libé-

rer la p-nitroaniline jaune que l'on mesure par colori-

métrie à 410 nm L'absorbance à 410 nm est masquée par des composés présents dans les humeurs de l'organisme, en particulier la bilirubine Pour éviter l'effet du pigment bilirubine, un dosage témoin de l'échantillon doit faire l'objet d'une mesure stricte et exacte, ce

qui entraîne des inconvénients Egalement, la p-nitro-

aniline libérée est condensée avec un aldéhyde tel que

le p-diméthylamino cinnamaldéhyde ou le p-diméthyl-

aminobenzaldéhyde pour produire une coloration que l'on dose par colorimétrie dans le rouge à grande longueur d'onde La sensibilité de ce dosage colorimétrique est -6-

modifiée par la température ce qui nuit à la reproduc-

tibilité Il existe de plus un procédé dans lequel la

p-nitroaniline est diazotée et condensée avec le 3,5-

xylénol et la couleur rouge ainsi formée est mesurée.

Cependant ce procédé de dosage est assez complexe et nécessite de nombreux stades réactionnels Il existe de plus un procédé de dosage employant un substrat synthétique, le K-L-glutamyl-B 3-naphtylamide Dans ce procédé la t-nàphtylamine libérée par la <-GTP est transformée en le sel de diazonium et est mesurée par

colorimétrie ou est mise à réagir avec la 3-méthyl-2-

benzothiazolinone-hydrazone et un agent oxydant pour produire une couleur qu'on mesure par colorimétrie ou on condense l'aldéhyde de l'agent colorant précédent

avec elle pour effectuer le dosage colorimétrique.

Dans ces procédés, le caractère cancérigène de la B-

naphtylamine pose un problème et également ces procédés

de dosage nécessitent une régulation stricte du proces-

sus réactionnel complexe, ce qui entraîne des inconvé-

nients.

La demanderesse a précédemment découvert que l'amide de formule suivante (qui n'existe pas dans le sérum) R" L Leu NH -R'

dans laquelle R' est un radical hydroxy, amino ou di-

alkylamino inférieur et R" est un atome d'hydrogène ou un radical alkyle inférieur ou carboxy, est un excellent substrat synthétique pour la LAP et libère l'amine sous l'effet de la LAP Ladite amine est oxydée par l'action

d'une oxydase, telleue l'ascorbate-oxydase ou la lac-

case et de l'oxygène est consommé pour former un chro-

253-307

-7- mogène L'activité de la,LAP peut être déterminée par

mesure de la quantité d'oxygène consommé ou de chromo-

gène produit.

Le procédé de dosage employant le substrat synthétique ci-dessus a pour inconvénients que le maxi- mum d'absorption du chromogène ne dépasse pas 550 nm et

qu'il est gêné par des substances contaminantes présen-

tes dans les humeurs de l'organisme, si bien qu'on re-

cherche un substrat formant un chromogène ayant un maxi-

mum d'absorption plus élevé O La demanderesse a découvert que l'amide de formule ( 1) est un substrat synthétique supérieur pour la LAP ou la <GTP et que l'amine ainsi libérée est couplée avec le coupleur de formule ( 3) sous l'effet d'une oxydase avec consommation d'oxygène pour former par condensation par oxydation un chromogène ayant des maximums d'absorption plus éleyés à 550-750 nm et une couleur stableo Ladite absorption N 9 est pas affectée

par les substances contaminantes contenues dans les hu-

meurs de l'organisme O

De plus, la demanderesse a découvert un nou-

veau substrat synthétique ayant une réactivité supé-

rieure pour le dosage de la LAP ou de la Y-GTP répon-

dant à la formule suivante

X

NH O E ( 4)

\y dans laquelle R, X et Y ont les mêmes significations que précédemment et qu'une amine de formule X -8- x

2 " S OH ( 5)

Y dans laquelle X et Y ont les mêmes significations que précédemment, est libérée du substrat ci-dessus sous l'effet de l'action de la LAP ou de la '-GTP puis est

oxydée par un agent oxydant ou une oxydase pour per-

mettre le dosage de l'activité enzymatique.

Un des objets de l'invention est de fournir un procédé de dosage d'activité enzymatique qui consiste à traiter un amide de formule

R 2 R 3

\, /

R 1 NHR 4 ( 1)

R 6 5

dans laquelle R 1 est un radical L-leucyle ou e-L-glu-

tamyle, R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 sont un atome d'hydrogène

ou d'halogène ou un radical alkyle inférieur, alcoxy in-

férieur, amino, amino substitué, hydroxy, carboxy ou sulfo et R 5 et R 6 peuvent constituer ensemble un cycle carboné, ou un sel soluble dans l'eau correspondant, avec une peptidase, traiter l'amine ainsi libérée de

3 C formule -

R 2 R-

H 2 N R 4 ( 2)

R R

6 5

-9 -

dans laquelle R 2, R 3, R 4, R 5 et R 6 ont les m 9 mes si-

gnifications que précédemment, avec une oxydase qui consomme de l'oxygène et forme un pigment, en présence d'un coupleur de formule

R 8 R 9

R 7 R 103)

R R

R 12 R 1

dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical amino, amino substitué ou hydroxy, R 8, R 9, R 10 i Rl et R 12 sont un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un radical

alkyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substi-

tué, hydroxy, carboxy ou sulfo, et R 11 et R 12 peuvent

ensemble former un cycle carboné ou R 7 peut éventuelle-

ment être un hydrogène lorsqu'au moins un des symboles R 8, R 9, R 10, R 11 et R 12 est un radical amino, amino substitué ou hydroxy, puis à mesurer quantitativement

les changements détectables.

Un autre objet de l'invention est de fournir un procédé de dosage qui comprend le traitement d'un amide de formule

/X

R:: OH ( 4)

\y C

dans laquelle R est un radical L-leucyle ou Y -L-gluta-

myle et X et Y sont semblables ou différents et sont des atomes d'halogène, ou un sel correspondants avec une peptidase dans un échantillon pour libérer un dérivé d'aniline de formule: -10- X

H 2 N OH ( 5)

dans laquelle A et Y ont les mêmes significations que précédemment, l'oxydation dudit dérivé d'aniline et la

mesure quantitative des changements détectables.

Un autre objet de la présente invention est

de fournir un nouveau substrat synthétique pour le do-

sage de l'activité Deptidasique de formule x

R -NH OH

dans laquelle R est un radical L-leucyle ou -L-gluta-

myle et X et Y sont semblables ou différents et sont des

atomes d'halogène, ou un sel correspondant.

Un amide ( 1) ou ( 4) constituant un substrat synthétique pour le dosage de la LAP ou de la Y-GTP de l'invention, peut être pr Qduit selon des procédés classiques de synthèse des peptides, par exemple par réaction du groupe carboxy de la L-leucine ou du groupe Y-carboxy de l'acide Lglutamique avec l'amine ( 2) ou

le dérivé d'aniline ( 5).

Dans la réaction de condensation ci-dessus, des radicaux réactifs ne participant pas à la réaction,

tels que le radical amino de la L-leucine ou le radi-

cal amino et le radical a-carboxy de l'acide L-gluta-

_ 11 -

mique, doivent être protégés Des exemples de radicaux

protecteurs du radical amino sont des radicaux protec-

teurs classiques d'u Ixadical x-amino, tels que tert-

butoxycarbonyle, tert-pentoxycarbonyle, benzyloxycarbo-

nyle, p-nitrobenzyloxycarbonyle ou o-nitrophénylthio. Le radical acarboxy de l'acide L-glutamique est de

préférence protégé sous forme d'un ester méthylique, d'-

un ester éthylique, d'un ester tert-butylique, d'un es-

ter tert-benzylique, d'un ester p-nitrobenzylique ou

d'un ester p-méthoxybenzylique et ledit radical protec-

teur peut être de préférence éliminé avec le radical

protecteur du radical amino selon une opération d'éli-

mination en un seul stade Par exemple, le radical ami-

no est protégé par un radical benzyloxycarbonyle -et le

radical m-carboxy est protégé sous forme de l'ester ben-

zylique. Des exemples d'aminep ( 2) employées dans la

réaction de condensation sont celles comportant des ra-

dicaux alkyles inférieurs, alcoxy inférieurs, amino, amino substitués, hydroxy, carbonyles ou sulfo par exemple l'o (m ou p-) toluidine, l'o (m ou p-) éthylaniline, la 2,3 ( 294-, 2,5-9 2,6 3,4 ou 3,5)

xylidine, l'o (m ou p-)anisidine, la 2,5-diméthoxy-

aniline, la 2,5-diéthoxyaniline, l'o-(m ou p-)chloro-

aniline, l'o (m ou p-)bromoaniline, l'o (m ou p-) phénylènediamine, la N, N-diméthyl-m-phénylènediamine,

la N,N-diméthyl-p-phénylènediamine, la,N-diéthyl-p-

phénylènediamine, la N,-dipropyl-p-phénylènediamine,

l'o (m ou p-)aminophénol, l'acide o (m ou p -)amino-

benzoïque, l'acide p-aminobenzènesulfonique, la 4-hy-

droxy-3,5-dichloroaniline, la 4-hydroxy-3,5-dibromo-

aniline, la 2-(ou 4-) méthyl-o-phénylènediamine, la 2-

hydroxy-5-toluidine, la 3 (ou 4-) chloro-o-toluidine, la 2-(ou 4-)méthylm-phénylènediamine, la 2-(ou 4-)

chloro-m-phénylènediamine, l'acide 4-méthyl-m-amino-

-12- benzolque, l'acide 2 (ou 3-) hydroxy-o-aminobenzorque,

l'acide 4-hydroxy-m-aminobenzoique, le 4-chloro-2-amino-

phénol, la N-éthyl,N-hydroxy-éthyl-p-phénylènediamine, le 4-méthyl-2aminophénol, la 2-méthoxy-5-chloroaniline, la 3-chloro-o-toluidine ou la 4-chloro-o-toluidine. D'autres exemples d'amines ( 2) sont les composés de type

naphtylamine, tels que l'c-naphtylamine ou l'acide 1-

amino-6-naphtolsulfonique. Des exemples de dérivés d'aniline ( 5) sont

la 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline, la 3,5-dichloro-4-

hydroxyaniline ou la 3-chloro-5-bromo-4-hydroxyaniline.

Pour effectuer la réaction de condensation, on active le radical acarboxy de la L-leucine dont le radical a-amino est protégé ou le radical Y-carboxy de

l'acide L-glutamique dont le radical -amino et le radi-

cal a-carboxy sont protégés, en employant un halogénure d'acide, un anhydride d'acide,,un azide d'acide, un imidazolide d'acide ou un ester activé tel qu'un ester cyanométhylique, un ester p-nitrophénylique, un ester 2,4-dinitrophénylique, un ester de N-hydroxysuccinimide ou un ester de N-hydroxyphtalimide et on fait réagir avec l'amine ( 2) ou le dérivé d'aniline ( 5) Sinon, on

fait réagir la L-leucine ou l'acide L-glutamique proté-

gés ci-dessus avec l'amine ( 2) ou l'aniline ( 5) en pré-

sence d'un agent de condensation, par exemple un carbo-

diimide tel que le li,N'-dicyclohexylcarbodiimide ou le N,N'carbonylimidazole et un sel d'isoxazolium tel qu'un

réactif de Woodward.

On effectue la réaction de condensation ci-

dessus dans un solvant organique inerte tel que le dimé-

thylformamide, le diméthylacêtamide, le diméthylsuifo-

xyde, le tétrahydrofuranne, le dioxanne, le benzène, le chloroforme, le dichlorométhane ou le dichloroéthane, avec une quantité égale d'aminoacide protégé et d'amine

( 2) ou de dérivé d'aniline ( 5) à la température ordi-

-13- naire ou en dessous On peut suivre la réaction par chromatographie en couche mince sur gel de silice (CCM) ou chromatographie liquide haute performance (CLHP)

et on peut l'arrêter lorsqu'on a constaté la dispari-

tion de la matière de départ.

On dissout le produit réactionnel ainsi obte-

nu, après avoir ou non chassé le solvant réactionnel par distillation, dans un solvant organique non miscible

l'eau tel que le chloroforme, le dichlorométhane, l'a-

cétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthylisobutyl-

cétone, le benzène ou l'éther éthylique, en lavant avec de l'eau acide ou de l'eau alcaline et en éliminant le solvant pour isoler le produit Si une purification complémentaire est nécessaire, on recristallise avec un solvant de recristallisation approprié ou on purifie par chromatographie sur une colonne de gel de silice,

d'alumine active ou de résine, absorbante.

L'élimination du radical protecteur peut être effectuée selon un procédé classique de la chimie des

peptides Par exemple on élimine le radical tert-butoxy-

carbonyle d'un radical a-amino avec de l'acide chlorhy-

drique 2 N dans l'acide acétique, de l'acide trifluoro-

acétique ou de l'acide formique et on élimine le radical

benzyloxycarbonyle par réduction catalytique en emplo-

yant du charbon palladié ou de l'acide bromhydrique dans l'acide acétique On élimine l'ester benzylique d'un radical a-carboxy de l'acide Lglutamiqueopar réduction

catalytique avec du charbon palladié.

On peut isoler l'amide ( 1) ou l'amide ( 4) ainsi obtenu par neutralisation du mélange réactionnei dans le cas de l'élimination du radical protecteur par décomposition acide ou par élimination du catalyseur dans le cas de la réduction catalytique, addition d'un

solvant organique non miscible à l'eau, tel que le chlo-

roforme, le dichlorométhane, le dichloroéthane, l'acé-

*-14-

tate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthylisobutyl-

cétone, le benzène ou l'éther éthylique, lavage à l'eau

acide et l'eau alcaline puis élimination du solvant.

On effedtue une purification complémentaire par recris-

tallisation avec un solvant approprié ou par chromato- graphie sur une colonne en employant du gel de silice,

de l'alumine active ou une résine adsorbante.

L'amide ( 1) ou l'amide ( 4) peuvent être éven-

tuellement préparés sous forme d'un sel, par exemple d'un sel minéral tel que le chlorhydrate, le sulfate, le nitrate ou le phosphate, ou d'un sel organiques tel que le formiate, l'acétate, le propionate, le maléate,

le citrate, le tartrate ou l'oxalate.

Dans l'invention, un amide ( 1) est hydrolysé par la LAP ou la 1-GTP de l'échantillon pour libérer l'amine ( 2) qui est condensée avec oxydation avec le coupleur ( 3) sous l'effet d'une oxydase pour former un composé chromogène (appelé ci-après chromogène) Des

exemples de coupleurs ( 5) peuvent être un composé aro-

matique formant un chromogène ayant des maximums d'ab-

sorption à 550-750 nm et qui est condensé par oxydation

avec l'amine ( 2) sous l'effet d'une oxydase.

Des exemples préférés sont les phénols, les aminophénols, les anilines et les naphtols Des exemples de phénols sont le phénol, l'acide salicylique, l'acide m-hydroxybenzoique, l'acide p-hydroxybenzo'ique, l'acide

2,6-dihydroxybenzoique, le salicylate de méthyle, l'o-

(m ou p-)crésol, l'o (ou m-)éthylphénol, le 2,3-( 2,4-, 2,5- 3,5 ou 2,6-) xylénol, l'o (m ou p-)méthoxyphénol, 3 C le 2,6-diméthoxyphénol, l'o (m ou p-) chlorophénol,

le 2,4 (ou 2,6-) dichlorophénol, l'o (m ou p-) bromo-

phénol, le 2,4 (ou 2,6-) dibromophénol, le 2-méthyl-6-

chlorophénol, le 2-chloro-5-méthylphénol, l'o-carboxy-

méthylphénol ou le 2-hydroxy-4-aminoéthylphénol Des exemples d'aminophénols sont le 4-chloro-2-aminophénoi, le N,N-diéthyl-maminophénol, le 4-méthyl-2-aminophènol,

l'acide-5-amino-2-h droxybenzoique, l'acide 2-amino-3-

hydroxyben zoîQue, l'o (m ou p-) aminophÈnol, le 2,6-

d.ichloro -4-aminophé nol ou le 2, 6-dib romo-4-a-aninophènol, D Jes exemplesd'anilines sont l'anilie, Ilo (mn ou p-) toluidine, la Nméthylaniline, la N-é'thylaniline, la

N,N-diinéthylaniline, la N,N-diéthylaniline, la N,N-

diméthyl-o-toluidine, la N,N-diméthyl-p-toluidine, la N,N-diéthyl-otoluidine, la N,N-diéthyl-p-toluidin e l'o (ou m-) chioroaniline, la mbromoaniline, l'acide

anthranilique, l'acide 3-aminobenzoique, l'acide p-

diméthylaminobenzoique, la 4-chloro-o-toluîdine, l'acide 3-amino-4méthylbenzoîque, la ni-phény 1 ènediamine, la

NIN-diîméthyl-m-ph 6 rnylènediamine, la 4-maéthyl-o phény-

lènediamnine, la 4-méth 7 l-m-phénylènediàmine, la 2-chlo-

ro-m-phénylènedi amine, la 4-chloro-m-phénylènediamine, la 3-chloro-otoluid ine, la 2-méthoxy-5-chloroanilinie, 1 ' o-éthylaniline,-la 2,5diéthoxyaniline, la N-4thyl-=

N-hydlroxyéthylanil:ine ou la N-éthyl-N-hydroxy 6thyl-m=-

toluidine Des exemples de naphto ls sont l'O&-naphtol,

le f'<-naphtol, l'acide 1-naphtol-2-ca-rboxylique, le 4 '-

chloro-1-naphtol, l'acide 1-hyjdroxy-2-naphtoique, l'a-

cide 1-naphtol-2-sulfonique, l 'acide I 1-naphtol-4-sulf'o-

nique, l'acide 1-naphtol-'8-sulfonique, 'l'acide 2-naph-

tol-6-sulfonique, l'acide 2-naphtol-7-sulfonique, l'a-

-cid e 2-na Dhtol-8-sulf'oninue, l'acide 2-naphtol-3,6-

disuilfonique ou l' acide 2-naphtol-6,8-disulfonïque.

Des exeniples d'oxydases sont une oxydase qui consomme de l'oxygène et qui peut formaer un chromogéne par oxydation de l'amine libérée ( 2) isolément ou par couplage par oxydation de l'amine libérée ( 2) avec le

coupleur ( 5) On peut mentionner par exemple 1 'ascor-

bate-oxydase, la laccase-, la tyrosinase, 1 'aminophénol-

oxydase, la phénol-oxydase ou la poly-phé-nol-oxydase.

Des exemples préférés sont l' ascorbate-oxy,dase prove-

-16-

nant du potiron, du concombre ou de la chayotte (Se-

chium edule) (brevet japonais publié non examiné n 56-88793) ou la laccase provenant de la laoue (urushi,

vernis japonais) ou de Basidiomycetes (Coriolus versi-

color, Rhizopus ou Polyporus versicolor lJ 'Biochem,50, 264 ( 1861), Biochim Bio Dhys Acta, 73, 204 ( 1963),

Acta Chem Stand 21, 2367 ( 1967)l.

Un mode de réalisation de dosage de la LAP ou

de la '-GTP employant l'amide ( 1) est le suivant.

Dans le dosage de la LAP, on traite l'amide ( 1) constituant un substrat synthétique pour la LAP,

dans lequel R 1 est un radical L-leucyle, ou un sel cor-

respondant, avec la LAP de l'échantillon pour libérer

l'amine ( 2).

L'échantillon est un échantillon de sérum dont le volume est de 0,01 à 5 ml On effectue la réaction enzymatique à 37 C pendant 5 minutes ou plus Le p H

optimal de l'enzymeest p H 6,5-8,0.

Des exemples de solutions tampons sont les so-

lutions tampons à base de phosphate, borate, barbital,

carbonate ou tris(hydroxyméthylamino)éthane.

Dans le dosage de la Y-GTP, on traite un amide ( 1) constituant le substrat synthétique pour la Y -GTP, dans lequel R 1 est le radical Y-Lglutamyle, ou un sel correspondant, avec la \-GTP de l'échantillon pour libérer l'amine ( 2) Le volume d'un échantillon de

sérum est de 0,01 à 5 ml On effectue la réaction enzy-

matique à 37 C pendant 5 minutes ou plus Le p H optimal de l'enzyme est p H 7,5-9,0 On effectue la réaction enzymatique dans le tampon de p H 7,59,0 contenant comme

accepteur un amino-acide ou un peptide tel que la gly-

cylglycine pour déterminer l'amine ( 2) qui se forme en fonction de l'activité de la / -GTP Des exemples de tampons sont les tampons phosphate, borate, barbital,

carbonate, triéthanolamine, glycine ou tris(hydroxy-

253 3 o 07 -17- méthylamino)méthane. On peut, pour effectuer la détermination quantitative de l'amine ( 2), traiter avec une oxydase en présence du coupleur ( 3) La réaction colorée est effectuée au p H optimal de l'oxydase, généralement p H 6-7, pour former le chromogène par condensation par oxydation Des exemples de tampons employés sont les

tampons phosphate, borate, carbonate, acétate ou tris-

(hydroxyméthylamino)méthane La réaction enzymatique s'effectue à environ 37 C Le chromogène formé par la

condensation par oxydation de l'amine ( 2) et du cou-

pleur ( 3) a des maximums d'absorption à 550-750 nm

selon la nature du coupleur ( 3) En général, le chromo-

gène présente une couleur bleue ayant des maximums d'ab-

sorption à 570-700 nm, avec une grande sensibilité et une grande stabilité, insensibles à la température et que ne modifie pas une substance contaminante telle que la bilirubine et est préférable pour le dosage de la

LAP ou de la 1-GTP.

Dans l'invention, la réaction enzymatique entre l'amide ( 1) et la LLP ou la X-GTP et la réaction de condensation par oxydation enzymatique entre l'amine

( 2) et le coupleur ( 3) peuvent s'effectuer simultané-

ment Dans ce cas le p H optimal doit être un p H commun à la LAP ou la YGTP et à l'oxydase, tel que p H 7,0

On peut choisir la même solution tampon que précédemment.

La détermination quantitative du chromogène

ainsi formé peut de préférence être effectuée par colo-

rimétrie à une longueur d'onde d'absorption spécifique du chromogène La détermination de la longueur d'onde d'absorption spécifique peut être effectuée par mesure classique d'un spectre d'absorption du chromogène et on

l'effectue généralement à 550-770 nm. On peut mesurer l'activité de la LJP ou de la -GTP d'un échantillon par

détermination de la quantité

253 Z 307

-18- d'oxygène conso=ré et on opère de préférence avec une électrode à oxygène De plus l'oxydase précitée est immobilisée selon une technique d'immobilisation connue et cette enzyme immobilisée est combinée à l'électrode pour constituer une électrode enzymatique On peut ef- fectuer des dosages rapides, simples et répétés au moyen de ladite électrode enzymatique et cette électrode

peut être montée dans un système de dosage automatique.

Egalement, la mesure effectuée à partir des modifica-

tions électrochimiques de l'électrode à oxygène permet d'économiser l'enzyme coûteuse L'activité de la LAP ou

de la Y-GTP peut être déterminée par conversion de l'im-

portance de la valeur enregistrée ou lue de la modifica-

tion électrochimique mesurée par l'électrode.

Comme précédemment expliqué, l'invention con-

cerne un procédé de dosage dont chaque stade réactionnel est simple et qui permet une mesure exacte et rapide de la LAP ou de la Y-GTP De plus, le chromogène formé a des maximums d'absorption à 550-750 nm avec lesquels les substances contaminantes des échantillons n'interfèrent pas.

Un mode de réalisation de dosage d'une pepti-

dase avec un amide ( 4) est le suivant.

On traite un amide ( 4) ou un sel correspon-

dant, par la peptidase de l'échantillon, en particulier la LAP ou la yGTP pour libérer le dérivé d'aniline

( 5) Ledit dérivé d'aniline est transformé en chromo-

gène par l'action d'un agent oxydant ou d'une oxydase, et on mesure Dar colorimétrie le composé coloré ou on

mesure avec une oxydase la quantité d'oxygène consommée.

On préfère effectuer un dosage colorimétrique du chromogène par mesure de la coloration produite par

la condensation par oxydation du coupleur ( 3) et du dé-

rivé d'aniline ( 5) Des exemples de coupleurs sont des

composés aromatiques qui forment un chromogène par con-

253230 ?

-19- densation par oxydation avec le dérivé d'aniline ( 5) et on préfère les coupleurs ( 3) de la série du phénol,

de l'aminophénol, de l'aniline ou du naphtol précédem-

ment mentionnées.

On effectue la condensation par oxydation à un p H de 4-12 pour achever la réaction coloréeo Des

tampons ou des solutions alcalines aqueuses d'ajuste-

ment du p H sont constitués de tampons carbonate, phos-

phate ou borate ou d'une solution d'hydroxyde alcalin.

La condensation s'effectue en présence d'un agent oxy-

dant ou d'une oxydase pouvant condenser par oxydation

le dérivé d'aniline ( 5) avec le coupleur ( 3) Des exem-

ples d'agents oxydants sont de façon générale les agents oxydants halogénés tels qu'un periodate, la

chloramine T ou l'acide hypochloreux, des agents oxy-

dants de type peroxyde tels qu'un persulfate ou le pe-

roxyde d'hydrogène ou un complexe cyanoferrique et un

exemple préférable en est le métaperiodate de sodium.

Des exemples préférables d'oxydases sont la laccase, l'ascorbate-oxydase ou la tyrosinaseo L'oxydation par l'oxydase peut être effectuée de la m 9 me faqon que celle de l'amide ( 1)O Le chromogène ainsi formé par la condensation par oxydation du dérivé d'aniline ( 5) et dg coupleur ( 3) a une longueur d'onde d'absorption maximale située à environ 550-770 nm selon la nature du coupleur et c'est généralement un pigment coloré dont la longueur d'onde d'absorption maximale est de 570-680 nm Cette coloration est très sensible et stable et la température et les substances contaminantes de l'échantillon, telles que la bilirubine, sont sans effet sur elle O Donc elle ne provoque pas d'erreur absolue et elle est préférable pour le dosage d'une peptidase telle que la LAP ou la

-GTP.

Un autre procédé de dosage colorimétrique du -20-

dérivé d'aniline ( 5) consiste à effectuer la détermina-

tion colorimétrique de la couleur produite par traite-

ment d'un complexe pentacyanoferrique avec un peroxyde.

Des exemples de peroxydes sont le periodate de sodium, le periodate de potassium, le permanganate de potassium ou le peroxyde d'hydrogène Le peroxyde d'hydrogène est préférable On peut obtenir un réactif constitué d'un

complexe ferrique stable, par mélange du complexe cyano-

ferrique ci-dessus avec un bicarbonate tel que le bi-

carbonate de sodium, le bicarbonate de lithium ou le bicarbonate de potassium et un dextrane de bas poids moléculaire Ce mélange complexe est stable sous forme

d'une poudre lyophilisée et est préférable comme réac-

tif pour un nécessaire de dosage colcrimtrique.

On effectue le dosage colorimétrique en em-

ployant un complexe cyanoferrique à un p H acide, de préférence à p H 3-7 et mieux à p H 4-5,5 Pour maintenir le p H on emploie un tampon classique Des exemples de tampons sont un tampon lactate, citrate ou oxalate 0,01-1 M et de préférence 0,05-0,4 M. Le chromogène qui est formé par la réaction du complexe cyanoferrique et du dérivé d'aniline ( 5) a un maximum d'absorption au voisinage de 700 nm avec une coloration stable et il convient au dosage d'une

peptidase telle que la LAP ou la -GTP.

On peut de plus doser une peptidase telle que la LAP ou la <-GTP par colorimétrie du chromogène qui est formé par la réaction du pentacyanoacoferriate

de sodium Na 2 lFe(CN)5 H 20 l et du dérivé d'aniline libé-

ré ( 5) De plus, le dosage d'une peptidase peut être effectué par colorimétrie selon un procédé de dosage

colorimétrique chimique classique, par exemple par co-

lorimétrie d'une amine aromatique, selon le procédé de copulation diazolque, ou par colorimétrie de la base de Schiff formée par réaction avec un composé de type -21- aldéhyde.

Le dosage de la LAP avec un amide ( 4) est il-

lustré en détail ci-après.

On effectue la réaction enzymatique du subs-

trat synthétique de la LAP qu'est le L-leucyl-3,5-di- halogéno-4hydroxyanilide avec la LAP de l'échantillon pour libérer le dérivé d'aniline ( 5), c'est-à-dire la

3,5-dihalogéno-4-hydroxyaniline On emploie comme échan-

tillon 0,01 à 7 ml de sérum et on effectue la réaction

enzymatique à 37 C pendant plus de 5 minutes Le p H op-

timal de la réaction est p H 6,5-8,0 et on le maintient avec une solution d'un tampon tel qu'un phosphate, un barbital, un borate ou le tris(hydroxyamino)méthaneo

On peut effectuer la détermination colorimé-

trique du dérivé d'aniline ( 5) ainsi formé en présence d'un coupleur, tel que le p-xylénol, et en conditions

alcalines, à partir du chromogène formé par condensa-

tion par oxydation avec un réactif oxydant, tel que le métapériodate de sodium ou sinon on peut effectuer une

détermination colorimétrique par emploi du réactif colo-

ré obtenu par oxydation de pentacyanoaminoferroate avec un réactif oxydant tel que le peroxyde d'hydrogène De plus, le dosage colorimétrique peut être effectué par traitement avec une oxydase pour consommer de l'oxygène

et libérer le chromogène avec mesure de l'oxygène con-

sommé ou du chromogène formé o Un mode de réalisation du dosage de la AGTP employant un amide ( 4) est illustré en détail ci-après

Cn effectue la réaction enzymatique du subs-

trat synthétique de la K-GTP qu'est le i -L-glutamyl-

3,5-dihalogéno-4-hydroxyanilide avec la '-GTP d'un

échantillon pour libérer le dérivé d'aniline ( 5) cons-

titué de la 5-dihalogéno-4-hydroxyaniline Le volume

de l'échantillon de sérum est de 0,01-5 ml.

On effectue la réaction enzymatique de la -22- -GTP à 57 C pendant plus de 5 minutes à un p H optimal de 7,5-9,0 On peut effectuer la réaction dans un tampon à p H 7,5-9,0 contenant comme accepteur un amino-acide ou un peptide tel que la glycyl-glycine et on détermine le dérivé d'aniline ( 5) qui se forme proportionnellement

à l'activité de la '-GTP.

Des exemples de solutions tampons sont les solutions de phosphate, barbital, borate, carbonate,

triéthanolamine, glycine ou tris(hydroxyméthylamino)-

méthane.

On peut déterminer le dérivé d'aniline ( 5)

de la même façon que dans le dosage de la LAP.

Comme précédemment expose, un procédé de do-

sage de l'invention utilisant comme substrat synthé-

tique un amide ( 4) est constitué de stades réactionnels

simples et permet de doser rapidement et de façon pré-

cise une peptidase comme la LAP ou la y -GTP De plus comme le chromogène formé a un maximum d'absorption à

550-750 nm, l'effet d'une substance contaminante pré-

2 G sente dans l'échantillon peut être évité et le dosage

précis d'une peptidase peut être réalisé.

De plus, un procédé de dosage de l'invention

est réalisé avec un stade de réaction enzymatique modé-

rée et la LAP ou la '-GTP peuvent faire l'objet d'un dosage enzymatique selon un stade réactionnel unique et simple Le procédé peut facilement être adapté à un

système automatique et on peut ainsi obtenir une vi-

tesse de dosage impossible selon le procédé de dosage

chimique classique antérieur.

L'invention sera mieux comprise à la lecture

de la description qui suit faite en regard des dessins

annexés dans lesquels:

la figure 1 est le spectre IR du L-leucyl-

3,5-dichloro-4-hydroxyanilide H Cl;

la figure 2 est le spectre IR du BOC-L-leucyl-

-23- 3,5-dibromo-4-hydroxyanilide;

la figure 3 est le spectre IR du i-L-gluta-

myl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide;

la figure 4 est le spectre IR du '-L Igluta-

myl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide; la figure 5 est la courbe d'absorption du

colorant formé à partir du L-leucyl-4-NX-diéthylamino-

anilide, du 1-naphtol-2-sulfonate, de la laccase et du sérum;

les figures 6 et 7 sont des courbes de la va-

riation de l'absorption effectuées par mesure de l'ac-

croissement de l'absorption en fonction du temps de ré-

action lorsqu'on emploie le L-leucyl-4-NN-diéthyl aminoanilide, le 1naphtol-2-sulfonate, la laccase et le sérum; la figure 8 est une courbe de la variation de l'absorption semblable à celles des figures 6 et 7, si ce n'est que le 1-naphtol-2-sulfonate est remplacé par du phénol; la figure 9 est une courbe de l'absorption du colorant formé dans les mêmes conditions que pour la figure 8; la figure 10 est une courbe de la variation de l'absorption semblable à celles des figures 6 et 7 si ce n'est que le L-leucyl-4-N,K-diéthylaminoanilide est remplacé par le Lleucyl-4-I,N-diméthylaminoanilide; la figure 11 est une courbe de la variation de l'absorption semblable à celle de la figure 10, si ce n'est que le 1-naphtol-2-sulfonate est remplacé par du phénol; la figure 12 est une courbe de la variation de l'absorption semblable'à celles des figures 6 et 7, si ce n'est que le L-leucyl-4-N,N-diéthylaminoanilide,

la laccase et le sérum sont remplacés par le L-leucyl-

3,5-dibromo-4-hydroxyanilide, l' ascorbate-oxydase et -24- 1 'arylanmidase; la figure 13 est une courbe d'absorption du colorant formé dans les mêmes conditions que pour la figure 12; la figure 14 est une courbe de la consomma- tion d'oxygène en fonction du temps de réaction pour la

réaction employant le L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxy-

anilide, le 1-naphtol-2-sulfonate, l'ascorbate-oxydase et l'arylamidase;

la figure 15 est une courbe de la consomma-

tion d'oxygène en-fonction du temps de réaction pour

la réaction employant le L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxy-

anilide, le 1-naphtol-2-sulfonate, la laccase et l'aryl-

amidase; les figures 16 et 17 sont des courbes de la

variation de l'absorption déterminées par mesure con-

tinue de l'accroissement de l'absorption en fonction du

temps de réaction pour la réaction employant le Y -L-

glutamyl-4-N,N-diéthylaminoanilide, la glycylglycine, le 1-naphtol-2sulfonate, la laccase et le sérum; la figure 18 est une courbe d'absorption du colorant formé dans les mêmes conditions que pour les figures 16 et 17; la figure 19 est une courbe de consommation

d'oxygène en fonction du temps de réaction pour la ré-

action employant le t -L-glutamyl-4-N,NI-diéthylamino-

anilide, la glycylglycine, le 1-naphtol-2-sulfonate, la laccase et le sérum; et la figure 20 est une courbe étalon de la

3 C V -GTP déterminée par emploi du -L-glutamyl-3,5-

dibromo-4-hydroxyanilide, de la glycylglycine, du

p-xylénol et du métaperiodate de sodium.

On emploie ci-après les abréviations suivan-

tes: -

Leu: 1-leucyle; -25- Y -Glu: Y -L-glutamyle; BOC: tert-butoxycarbonyle; O Su: ester N-hydroxysuccinimidique; Ac OH: acide acétique Bu OH: butanol

Exemple 1

L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide H Cl On ajoute goutte à goutte en agitant à 0-5 C, une solution ( 25 ml) de 3,28 g ( 10 mmoles)de BOC-LeuO Su

dans le dioxanne à 1,78 g ( 10 mmoles) de 2,6-dichloro-

4-aminophénol et 0,92 g ( 15 mmoles) de bicarbonate de sodium dissous dans 25 ml d'eau On agite le mélange pendant une nuit à la température ordinaire et on

chasse le dioxanne par distillation sous vide en des-

sous de 30 C On dissout le résidu dans 200 ml d'acé-

tate d'éthyle, on lave trois fois avec du bicarbonate de sodium saturé, de l'eau, de, l'acide chlorhydrique I N et une solution saturée de chlorure de sodium

(chaque fois 50 ml) On sèche la couche d 'acétate d'é-

thyle avec du sulfate de magnésium anhydre et on con-

centre sous vide pour obtenir 2,96 g de BOC-L-leucyl-

3,5-dichloro-4-hydroxyanilide On dissout le produit dans 15 ml d'H Cl 2 N / Ac OH, on agite à la température

ordinaire et on cristallise par addition de 100 ml d'é-

ther éthylique anhydre qu'on a soumis à deux décanta-

tions avec de l'éther anhydre On sèche les cristaux sous vide pour obtenir le L-leucyl-3,5-dichloro-4

hydroxyanilide H Cy 1.

Rendement: 1,89 g (rendement 8396 %) Formule moléculaire: C 12 H 16 N 202 C 12 H Cl P.F: 127-133 C (décomposition) CCI: Rf = 0,63 L Bu OH-Ac OHeau ( 4/1/1)l Spectre IR (K Br): figure 1 -26-

Exemple 2

L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide HC 1: On ajoute goutte à goutte 70 ml d'une solution de 6,01 g ( 18,3 mmoles) de BOC-Leu-O Su dans le dioxanne à 0-5 C dans 4,90 g ( 18,8 mmoles) de 2,6-dibromo-4-aminophénol et 1,68 g ( 20 mmoles) de bicarbonate de sodium

dissous dans 20 ml d'eau On agite le mélange à la tem-

* pérature ordinaire pendant plus d'une nuit et on chasse

le dioxanne par distillation en dessous de 300 C On dis-

sout le résidu dans 400 ml d'acétate d'éthyle et on lave

trois fois Tvec une solution aqueuse saturée de bicarbo-

nate de sodium, de l'eau, de l'acide chlorhydrique I N et une solution saturée de chlorure de sodium ( 100 ml chaque fois) On sèche la couche d'acétate d'éthyle avec du sulfate de magnésium anhydre et on concentre sous

vide pour obtenir 5,8 g de BOC-L-leucyl-3,5-dibromo-4-

hydroxyanilide On dissout le produit dans 3,0 ml d'HC 1 2 N/Ac O H et on agite à la température ordinaire pendant

2 heures puis on ajoute de l'éther anhydre pour cristal-

liser le produit, le L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxy-

anilide H Cl.

Rendement: 2,50 g (rendement: 49,7 %) Formule moléculaire C 12 H 16 N 202 Br 2 ( 416,54) CC 01 (gel de silice: Rf = 0,65 ln-Bu OH/Ac OH/ eau ( 4/1/1)l P.f 151-154 C (décomposition)

Spectre IR (K Br): figure 2.

Exemple 5

-L-glutamyl-5,5-dichloro-4-hydroxyanilide: On agite à 60 O pendant 2 heures 5,16 g

( 20 mmoles) d'anhydride de l'acide N,N-phtaloyl-L-gluta-

mique et 5,56 g ( 20 mmoles) de 4-amino-2,6-dichlorophé-

nol dissous dans 50 ml de dioxanne On chasse le dio-

xanne par distillation sous vide et on ajoute 1,5 ml d'hydrate d'hydrazine dans 50 ml de méthanol puis on -27- laisse reposer à la température ordinaire pendant 2 jours On chasse le méthanol par distillation sous vide, on ajoute de l'eau-au résidu' et on ajuste le p H

à 3 par addition d'acide chlorhydrique 0,5 N pour obte-

nir 3,96 g de 1-L-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyani-

lide précipité.

Rendement: 3,96 g (rendement: 72,9 %) Formule moléculaire: C 11 H 12 N 204 C 1 P.f: 214-217 C (décomposition)

CCM sur gel de silice: Rf = 0,49 (Bu OH-

Ac OH-H 20 = 4/1/1) Spectre IR (K Br): figure 3

Exemple 4 -

< -L-glutamyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide: On agite à 60 C pendant 1,5 heure, 2,18 g

( 8,4 mmoles) d'anhydride de l'acide NN-phtal vl-L-

glutamique et 2,26 g ( 8,4 mmolps) de 4-amino-2,G 6 dichlorophénol dissous dans 20 ml de dioxanneo On chasse le dioxanne par distillation sous vide et on ajoute au résidu 0,7 ml d'hydrate d'hydrazine dans

ml de méthanol et on laisse reposer à la température-

ordinaire pendant 2 jours On chasse le méthanol par distillation sous vide, on ajoute de l'eau au résidu

et on ajuste le p H à 3 par addition d'acide chlorhydri-

que 0,5 N pour obtenir 2,13 g de Y -L-glutamyl 3,% 5

dibromo-4-hydroxyanilide précipité.

Rendement: 2,13 g (rendement 64,0 %) Formule moléculaire: C 11 H 12 N 204 Br 2 P.f: 191-194 C (décomposition)

CCM sur gel de silice: Rf = 0,53 (Bu OH-Ac OH-

H 2 = 4/1/1)

Spectre IR (K Br): figure 4

Exemple 5

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-I,li-

diéthylaminoanilide, l'acide 1-naphtol-2 =sulfonique et

2532307-

-28- la laccase: On prépare une solution substrat constituée d'une solution de tampon phosphate C,1 M (p H 7,0) de L-leucyl-4-N,1 idiéthylaminoanilide 2 H Cl ( 2 mmoles) et comme coupleur le 1-naphtol-2sulfonate de potassium ( 0,5 mmole) On ajoute à 2,0 ml de la solution substrat 1001 l ( 330 U) de solution de laccase provenant de Polyporus versicolor et 50 01 de sérum (LAP: 879 unités

G-R/ml) et on incube à 37 C pour former un colorant.

(Le spectre d'absorption du colorant est illustré par la figure 5, maximum d'absorption: 655 nm) Dans la réaction on mesure en continu l'absorption à 655 nm

du colorant formé à chaque moment Le résultat est il-

lustré par la figure 6.

La figure 7 montre le résultat obtenu par em-

ploi de sérum à 414 unités G-R/ml.

Comme le montrent les figures 6 et 7, l'acti-

vité de la -LAP sérique peut être mesurée exactement se-

lon un procédé de dosage de l'invention et, contraire-

ment à la méthode de colorimétrie chimique connue, le mélange se colore dès le début de l'action de la LAP,

ce qui permet un dosage cinétique.

Exem Dle 6

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-N,N-

diéthylaminoanilide, le phénol et la laccase: On prépare un substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-4-N,l-diéthylanilide 2 H Cl et I mmole de phénol

comme coupleur dans du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0).

On ajoute à 2 ml de solution substrat 1001 ul ( 330 U) de solution de laccase et 50 ul de sérum (LAP: 879 unités

G-R/ml) et on incube à 37 C pour former un colorant.

Dans la réaction, on mesure en continu la couleur (ma-

ximum d'absorption à 670 nm) formée à chaque moment de

réaction Le résultat est illustré par la figure 8.

Comme le montre la figure 8, un procédé de do-

-29- sage de l'invention est un procédé de dosage simple et exact de la LAP et, de plus, le mélange réactionnel se

colore dès que l'action de la LAP commence, ce qui per-

met un dosage cinétique.

La courbe d'absorption du colorant formé dans le procédé ci-dessus pour chaque longueur d'onde est

illustrée par la figure 9 sur laquelle le maximum d'ab-

sorption est à 670 nm.

Exemple 7

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-N,E-

diéthylaminoanilide, un coupleur ( 2, 3-diméthylphénol,

2,4-diméthylphénol, 2,5-dimêthylphénol et 2,6-dimêthyl-

phénol) et la laccase

On reprend l'exemple 5 en remplaçant le 1-

naphtol-2-sulfonate par le 2,3-diméthylphénol, le 2,4-

diméthylphénol, le 2,5-diméthylphénol ou le 2,6-diméthyl-

phénol pour préparer une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl4-1,N-diéthylaminoanilide et 0,5 mmole de coupleur dans du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) On ajoute à 2 ml de la solution substrat 100 i/ul de solution de laccase ( 330 U) et 50/ul de sérum (LAP: 879 unités GR/ml) et on incube à 37 Co Après 10 minutes, on mesure l'absorption du colorant formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale Les résultats figurent

dans le tableau 1.

Tableau I

Coupleur haximum d'absorption Densité optique 2,3-diméthylphénol 630 nm 0168 2,4 " 630 nm 0,187 2,5 " 650 nm 0,231 2,6 " 630 nm 0-193

Dosage de la L 1 AP avec la L-leuc-,l,-4-1;,I -

diéthy 11 aminoariiline, un coupleur ( 1-naphtol-2-sulfonate,

phénol, 2, 3-diméthylphénol, 2,'-diméthvlphénol, 2,5-

diméthylphénol ou 2,6-dimèthylphénol) et l'ascorbate- oxydase On prétare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leuc-yl-4-N,Ndiéthylaminoaniline 2 HC 1 et un coupleur ( 1-niaphtol-2-sulfonate de potassium,

phénol, 2,5-diméthylphénol, 2,4-diméthylphénol, 2,5-

diméthylphénol ou 2 > 6-diméthylphénol) dans du tampon phosphate 0,1 Ii (pli 7,0) On ajoute IOC,,ul ( 130 U') d'une solution d'ascorbate-oxydase provenant de la chayotte (Sechium edule) et 50/,ul de sérum (L 1 AP

879 unités G-R,/ml) et on incube à 37 % Après 10 mj-

nutes, on mesure l'absorrtion du pigment formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale Les résultats

f igurent dans le tableau 2.

Tableau 2

Coupleur Absorption Densité maximale optique (DO) 1 -naphtol2-sulflonate 655 mn 0,411 Phénol 670 nm 0,547 2,3-diméthylphénol 650 mn 0,356 294 " 650 mn 0,267 2,5 65 C mn 0,222 2,6 650 mn 0,427

Exemple 9

Dosage de la LAP avec le L-leuc 7 l-4-IN,N-dimé-

thylaminoanilide, le 1-naphtol-2 sulfonate et la lac-

case

On reprend l'exemple 5 en remplaçant le L-

leucyl-4-I;,14-diéthylam-i-noanilide 2 H Cl par le L-leucyl-

-31 4-N,N-diméthylaminoanilide 2 HC 1 et en ajoutant du sérum (LAP: 879 unités G-R/ml), le reste du mode opératoire

étant le même que dans l'exemple 5.

Le maximum d'absorption du colorant formé est de 650 nm et on mesure l'absorption à chaque moment de réaction à 650 nm Les résultats sont illustrés par la

figure 10.

Comme le montre la figure 10, on peut doser

l'activité de la LAP selon le procédé de l'invention.

Exem-ple 10

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-N,N-

diméthylaminoanilide, le phénol et la laccase: On reprend le mode opératoire de l'exemple 6 en remplaçant le L-leucyl-4-,idliéthnylaminoanilideo 2 HC 1

par le L-leucyl-4-N,I-diméthylaminoanilideo 2 H Cl en opé-

rant ensuite comme dans l'exemple 6 La longueur d'onde

d'absorption maximale du colorant formé est à 655 nm.

L'absorption pour chaque moment de réaction est illus-

trée par la figure 11 Comme le montre la figure 11, le

dosage de la LAP selon l'invention est excellent.

Exemple 11

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-35,5-dibromo-

4-hydroxyanilide, le 1 lnaphtol-2-sulfonate et l'ascor-

bate-oxydase: On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de Lleucyl 3,5-dibromo-4-hydroxyanilideo 2 HC 1 et 0,5 mmole de 1-naphtol-2sulfonate de potassium dans du tampon phosphate O C 1 M (p H 7,0)o On ajoute à 2 ml de solution substrat 201 l de solution contenant 130 U 3 C d'ascorbate-oxydase et de l'arylamidase (Boehringer-, 1000 unités G-R/ml) et on incube à 37 Co Pour chaque moment de réaction, on mesure l'absorption à 630 nm du

colorabt formé Les résultats sont illustrés par la fi-

gure 12 Comme le montre la figure 12, le procédé-de dosage de l'invention constitue un excellent dosage de -32-

la LAP et un dosage cinétique est possible car la colo-

ration apparaît dès le début de la réaction de la LAP.

La courbe d'absorption du colorant est illustrée par la

figure 13.

Exemple 12

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dibromo-

4-hydroxyanilide, le 1-naphtol-2-sulfonate, l'ascorbate-

oxydase ou la laccase:

On introduit 1,0 ml de solution substrat pré-

parée comme dans l'exemple 11 dans la cuve de réaction

(volume intérieur: I ml) munie d'une électrode à oxy-

gène et préchauffée à 37 C On ajoute 100/ul d'une so-

lution contenant de l'ascorbate-oxydase ( 350 U) et de

l'arylamidase ( 1000 unités G-R/ml) et on incube à 37 C.

On mesure la quantité d'oxygène consommée à chaque instant avec l'électrode à oxygène Les résultats sont illustrés par la figure 14 qui montre que le dosage peut être effectué de façon avantageuse avec une électrode

à oxygène.

Dans la même expérience, on remplace l'ascor-

bate-oxydase par la laccase ( 250 U) et on obtient c'ex-

cellents résultats comme le montre la figure 15.

Exemple 15

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dibromo-

4-hydroxyanilide, un coupleur (phénol, 2,5-diméthyl-

phénol) et la laccase: Dans le mode opératoire de l'exemple 11, on remplace le 1-naphtol-2-sulfonate par le phénol ou le

2,5-diméthylphénol ( 0,5 mmole) pour préparer une solu-

tion substrat On ajoute à 2 ml de la solution substrat ?l d'une solution contenant de la laccase ( 330 U) et de l'arylamidase ( 1000 unités G-R/ml) et on incube

à 37 C pendant 10 minutes On mesure l'absorption du -

colorant formé à la longueur d'onde d'absorption maxi-

male Les résultats figurent dans le tableau 5.

-33-

Tableau 3

Coupleur Longueur d'onde Densité d'absorption maximale optique (DO) Phénol 610 nm 0,160 2,5-diméthylphénol 585 lm 0,452

Exemple 14

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dibromo-

4-hydroxyanilide,9 le phénol et la tyrosinase: On prépare une solution substrat contenant 0,25 mnole de L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide H Cl et 0,5 mmole de phénol dans du tampon phosphate 091 M à p H 7,0 On ajoute à 2 ml de solution substrat 100/ul de solution de tyrosinase ( 300 U) et 2011 d'arlamidase

( 1000 unités G-R/ml) et on incube à 37 C pendant 10 mi-

nutes. On mesure l'absorption du colorant formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale de 610 nm

-o (DO 610 = 0,158) On peut doser la IP avec un bon résul-

tat.

Exemple 15

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-2-methyl-4 + aminoanilide, le 1-naphtol2-sulfonate et la laccase: o On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-2 =méthyl-4-aminoanilide 2 H Cl et 0,5 mmole de 1naphtol-2-sulfonate de potassium dans du tampon phosphate (p H 7,0)O On ajoute à 2 ml de la solution substrat

100,ul de solution de laccase ( 530 U) et 50/ul de solu-

I tion d'arylamidase ( 1000 unités G-R/ml) et on incube à

37 C pendant 30 minutes On mesure l' absorption du pig-

ment formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale

de 565 nm (D 0565 = 0,143).

Exemple 16

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-aminoani-

lide, le 1-naphtol-2-sulfonate et la laccase: On prépare une solution substrat contenant 2,5 mmoles de L-leucyl-4-aminoanilide 2 H Cl et 0,5 mmole de 1-naphtol-2-sulfonate de potassium dans du tampon

phosphate 0,1 M (p H 7,0).

On ajoute à 2 ml de la solution substrat /ul de solution de laccase ( 330 U) et 50/ul de solu-

tion d'arylamidase ( 1000 unités G-R/ml) et on incube à

37 C pendant 30 minutes On mesure l'absorption du co-

lorant formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale

de 565 nm (DC 565 = 0,143).

Exemple 17

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-N,i E-di-

propylanilide, l'acide 1-naphtol-2-sulfonique et la laccase: On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-4-N,Ndipropylaminoanilide 2 H Cl et 0,5 mmole de p-naphtol-2-sulfonate de potassium dans du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) On ajoute à 2 ml de la solution substrat 100/ul de solution de laccase ( 330 U) et 50/ul de solution d'arylamidase ( 1000 unités

G-R/ml) et on incube à 37 C pendant 10 minutes On me-

sure l'absorption du colorant formé à sa longueur d'onde

d'absorption maximale de 650 nm (DO 650 = 0,430).

Exemple 18

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dichlo-

ro-4-hydroxvanilide, le 1-naphtol-2-sulfonate ou le phénol et la laccase: On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-3,5dichloro-4-hydroxyanilide H Cl et 0,5 mmole de 1-naphtol-2-sulfonate de potassium dans du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) On ajoute à 2 ml de la solution substrat 100/ul de solution de laccase -35

( 330 U) et 20/ul' de solution d'arylamidase ( 1000 uni-

tés G-R/ml) et on incube à 37 C pendant 10 minutes On mesure l'absorption du colorant formé à 630 nm (D 0630 =

0,535).

On remplace le 1-naphtol-2-sulfonate par 0,5 mmole de phénol et on mesure le colorant formé à

610 nm (DO 610 09111).

Exemple 19

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-4-N-éthyl-

N-hydroxyéthylaminoanilide, le 2,6-dibromophénol et la lacpase: On ajoute 1001 ul de solution de laccase ( 330 U) et 20/ul de solution d'arylamidase ( 1000 unités G-R/ml) à 2 ml de solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-4-N-éthyl-N-hydroxyéthylaminoanilide 2 H Cl

et 0,5 mmole de 2,6-dibromophénol dans du tampon phos-

phate 0,1 M (p H 7,0) et on incube à 57 C pendant 5 mi-

nutes On mesure l'absorption du colorant formé à

705 N (DO 705 = I 47).

Exem-ple 20 Dosage de la LAP avec le L-leucyl-anilide, la 3,5-dibromo-4hydroxyaniline et la laccase

Dans l'exemple 19, on remplace le L-leucyl-

4-N-éthyl-N-hydroxyéthylaminoanilideo 2 HC 1 par 2 mmoles

de L-leucylanilide H Cl On mesure l'absorption du colo-

rant formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale

de 655 nm (D 0655 = 0,178).

Exeple 21

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-2-éthylani-

lide, la 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline et la laccase:

Dans l'exemple 19, on remplace le L-leucyl-

4-N-éthyl-N-hydroxjét hylaminoanilideo 2 HC 1 par 2 mmoles de L-leucyl-2étnylanilid o Cl On mesure l'absorption du colorant formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale de 675 nm (D 0675 = 0,428):

Exemple 22

Dosage de la LAY avec le L-le-acyl-2-carboxy-, an.ilide, la 3,5-dibromo-4hydrox,-anili ne ou la 4 NL -diét'hylaminoaniline et la laccase On ajoute IOC,ul de solution de laccase ( 33 G U) et 50 i/ul de solution d'arjlamidase ( 1000 unités G-R/ml) à la solution substrat contenant 2 mmoles de

L-leucyl-2-carboxyan,ilide HC 1 et 0,5 mmnole de 3, 5-

dibromo-4 hydroxyaniline dans du tampon phosphate 0,1 M

à p H 7,0 et on incube à 370 C pendant 10 minutes On me-

sure l'absorption du colorant formé à sa longueur d'onde dasrption maximale de 645 n(D 0,9) Dans le mode opératoire ci-dessus, on remplace

la 3,5-dibromo-4-hydroxyaniline par 0,5 mmole de 4-K,-

diéthylaminoaniline On mesure l'absorption du colorant formé à sa loneueur d'onde d'absorotion maximale de

690 n m (DC 690 = 0,615).

Exem Dle 23

Dosage de la LA P avec des substrats synthé-

-tiques et des coupleurs divers et la laccase Substrats synthétiques pour le dosage de la LA? (A) (-B)

(C)

I L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide H Cl L-leucyl-4-1 %, Idiéthylaminoanilide 2 H 01; ou

L-leucyl-4-Iï,K-diméthylaminoanilide 2 H Cl.

Coupleurs ('1) 1 -éth-,vl-I 7 L-h-ydroxyéthylani Lline; ( 2) 2,6dibromophénol; ( 3) 2,4-dichlorophénol; ( 4) 2,6-diméthoxyphénol; ( 5) aniline; ( 7) acide anthrani-lique; 8) m-méthylphénol; ( 9) ocarboxy'méthylphénol; ( 10) N-éthy-,l N-hyd 1 rox Yéthyl-m-toluidine; (Il) N,N-diméthyl-m-toluidine; ( 12) o-6thylaniline; ( 14) a,-dimhthylnlie ( 15) N,N\-dimiéthylaniline; ( 16) N,-chiorohylnol;n ( 17) o-chlorophénol; ( 18) m-éthylphénol; ( 19) o-méthoxyphénol; ( 20) 4-chloro-mphénylènediamine; ( 21) 2- méthy 11-6-chlorophênol; ( 22) 2-chloro-5méthylphénol; ( 23) 4-chloro-1-naphtol;

( 24) acide 1-naphtol-2-carboxylique.

On prépare une solution substrat contenant

2 mimoles de substrat s;ymthétique et O,5 mmole de cou-

pleur dans du tampon phosphate 0,1 M (PH 7,0) On

ajoute à 2 mil de la solution substrat 10 lde solu-

tion de laccase ( 330 UJ) et 5 00,Aul de solution d'aryl-

amidase ( 1000 muntés G-R/ml) et on incube à 370 C Pen-

dant 10 minutes On miesure l'absorption du colorant f'ormé à sa longueur d'onde d'absorption maximale Les

résultats figurent dans le tableau 4.

-38-

Tableau 4

j Substrat synthétique de la LAP Coupleur (Ar (B) j (C)

DO 705 = 3,712

DO 6 -0 1 '031

DO 660 = 0,508

DO 580 = 0,56 ?

DO)655 = 0,45

DO 675 = 0,396

DO 645 = 0,401

DO 600 = 0,495

DO 590 = O ',693

DO 715 = 0, 421

DO 675 ='108

DO -7 = 0,338

D 00 0,261

*DO -0 = 0,536

DO 65 = 0,698

DO 650 = 0,)495

DO 605 = 0,338

DO 590,0468

DO 630 = 0,842

DO 610 = 0,63

DO 635 = 0,567

DO 580 0,356

DO 590 O O 419

DO 730

DO 705

DO 695

DO 635

D 0690

DO 710

DO 690

DO 665

D 0650

DO 745

DO 740

DO 700

DO 640

DO 730

DO 730

D 0690

= 1,849

= 0,187

0,259

= 0, 157

= 0,301

= 0,260.

= 0,244

= 0,201

= 0,329

= 3,79

= 3,54

= 2,0 05

= 0,157

= 1,01

= 1,22

= 0,449

D'7 OO = 0,168

DO 690 = 0,271

D 700 = 0,234

DO 690 = 0,219

DO 725 = O ',907

DO 80 = 0,404

DO 685 = 0,203

D 0640 = 0905

( 1) ( 2) ( 3) ( 4) ( 5) ( 6) ( 7) ( 8) 1 '9) ( 10) ( 11) ( 12) ( 13) ( 14) ( 15) ( 16) ( 17) ( 18) ( 19)

I ( 20)

-( 21)

-22) ( 23) ( 24) i i i i -39-

Exemple 24

Dosage de la e-GTP avec le *-L-glutamyl-4-

N,N-diéthylaminoanilide, le 1 'l-naphtol-2-sulfonate et la laccase: On prépare une solution substrat contenant mmoles de '-L-glutamyl-4-N,Ndiéthylaminoanilide

mmoles de glycylglycine et 0,5 mmole de 1-naphtol-

2-sulfonate de potassium dans du tampon phosphate à mmoles (p H 8,0)o On ajoute à 2 ml de la solution substrat 100 l de laccase ( 1000 U/ml) et 501 i de sérum (y-GTP: 416 m U/ml) et on incube à 37 OC On mesure à

655 nm-à chaque moment de réaction l'absorption du colo-

rant formé Les résultats sont illustrés par la figure

16 On dose un sérum (X -GTP: 105 m U/ml) et les résul-

tats sont illustrés par la figure 17 Comme le montrent les figures 16 et 179 le procédé de l'invention permet un excellent dosage de l'activité de la K-GTP et le mélange réactionnel se colore dès le début de l'action

de la GTP, si bien qu'un dosage cinétique est pos-

sible La courbe d'absorption du colorant formé est illustrée par la figure 18 o

Exemple 25

Dosage de la YGTP avec le Y-L-glutamyl-4-

N,N-diéthylaminoanilide, le 1-naphtol-2-sulfonate et la laccase: On introduit I ml de solution substrat de l'exemple 24 dans la cuve de réaction (volume intérieur: I ml) munie d'une électrode à oxygène et préchauffée à 37 C On ajoute 100 1 d'une solution contenant 200 U

de laccase et du sérum ( '-GTP: 416 m U/ml) puis on in-

cube à 37 C On mesure la quantité d'oxygène consommée avec l'électrode à oxygène Le taux de consommation d'oxygène est illustré par la figure 19 qui montre que

l'activité de la '-GTP peut être mesurée de façon avan-

tageuse.

-40-

Exemple 26

Dosage de la '-G-IP avec le Y-L-glutamyl-4-

Iz,:-diéthylaminôanilide, le 1-narhtol-2-sulfonate et 1 l'ascorbateoxydase: On prépare 2 ml d'une solution substrat comme dans l'exemple 24 On ajoute 10/ul de solution d'ascorbate-oxydase ( 100 U) et 50/ul de sérum ( <-GTP: 416 m U/ml) et on incube à 37 C respectivement pendant minutes et 10 minutes On mesure chaque fois l'ab- sorotion du colorant formé à 655 nm (longueur d'onde d'absorption maximale) La densité optique à 655 nm après 5 minutes de réaction est DO 655 = 0,949 et à

minutes elle est D 0655 = 1,895.

Exemple 27

Dosage de la V-GTP avec le e-L-glutamyl-3,5-

dichloro-4-hydroxyanilide, le 1-naphtol-2-sulfonate et la laccase ou la tyrosinase: On prépare une solution substrat contenant mmoles de Yf-Lglutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide,

100 mmoles de glycylglycine et 0,5 mmole de 1-naphtol-

2-sulfonate de potassium dans du tampon borate 50 m M (p H 7,1) On ajoute 1001 u 1 de solution de laccase ( 100 U) et 50/ul de sérum ( /-GTP: 416 m U/ml) à 2 ml de la

solution substrat et on incube à 57 C pendant 10 mi-

nutes On mesure l'absorption du colorant formé à sa longueur d'onde d'absorption maximale de 650 nm

(D 0630 = 1,04 C 44).

On remplace la laccase par 100 ul de solution de tyrosinase ( 100 U) dans l'expérience ci-dessus et on opère de la même façon que ci-dessus On obtient comme

résultat DO 650 = 1,042.

Exemple 28

Dosage de la Y-GTP avec des substrats synthé-

tiques de la Y-GTP et des coupleurs divers et de l'as-

corbate-oxydase: -41- Substrats synthétiques (À) -L-glutamyl=-4-N,I-diéthylaminoanilide; (B) 't-L-glutamnyl-4-1 N,N-diméthylam Thnoanilide; (C) ' -L-glutamyl-4-N,N-dipropvlaminoanilide; (Dl) '-L-glutamyl, 5dibromo 4-hydroxyanilide. Coupleurs ( 1) 1-n aphtol-2-sulf'onate de potassium; ( 2) 2,5-diméthylphénol; ( 3) 2,6-dibromophénol; ( 4) 2,6diméthoxyphénol; ( 6) IN-éth-yl-Ki-hydroxyéthylaniline; ( 7) N,Ndinméthyl-m-toluidine; ( 8) o-éthylaniline; ( 9) m-chlorophénol; ( 10) ométhylphénol; ( 11) o-méthoxyphénol; ( 12) ca-naphtol;

( 13) phénol.

On prépare une solution substrat contenant mmnoles de substrat, 100 mniolesde glycylglycine et 0,5 mniole de coupleur dans du tampon borate 5 O rn, (p H 8,0) On ajoute à 2 ml de la solution substrat ,/ul de solution d'ascorbate-oxydase ( 100 U) et 50,,ul de sérum ( '-GTP: 416 m U/ml) et on incube à 3700 pendant 5 minutes On mesure l'absorption du

colorant formé à sa lonpzueur d'onde d'absorption maxi-

maie Les résultats figurent dans le tableau 5.

c'

Tableau 5

Couplur _____________Substratsynthétique

(A) ( 13) (C) (D)

( 1) DO,8 DO 002 O

650 = 098 D 650 6,93060,803

( 2) DO 0585 = 0,6145

( 5) DO 70= 0,568 DO O 9 DO 12

705 700 59 D 670 1,2

( 4) DO 63550,313 D 595 = O,3522 DO 580 0,511

( 5) DO 730 1,362 DO -2 = 1)404

( 6) DO 730 1,)6217 DO 70 1,907

( 7) DO 740 = 2,)426

( 8) DO 700 = 1871 -DO 675 = 0,826

( 9) DO 695 = 0,453 DO 655 = 0,495

( 10) DO 650 O' 0,51 DO 590 = 0,622

( 11) DO 59,0

( 12) DO 640 = 0,2917

( 15) DO 655 = 0562 DO 610 = 0,71 '7

p Lq C> -43-

Exemple 29

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-

dichloro-4-hydroxyanilide, le métaperiodate de sodium et le p-xylénol On prépare une solution substrat contenant mmoles de L-leucyl-3,5-dichloro-4hydroxyanilide H Cl dissous dans du tampon phosphate 0,1 M à p H 7,0 On' ajoute 20/ul d'un échantillon de sérum provenant d'un malade (LAP: 236 unités G-R) à 1 ml de la solution substrat, on mélange soigneusement et on incube à 37 C

pendant 20 minuteso On ajoute pour produire une colora-

tion 3 ml de solution de réactif oxydant contenant 2 mmoles de métaperiodate de sodium et 10 mmoles de p-xylénol dans de l'hydroxyde de potassium 0,2-No On mesure l'absorption du colorant formé à 585 nm et on

obtient D 0585 O A 18.

Exemple 30

Dosage de la LAIP avec le L-leucyl-395-dibromo-

4-hydroxyanilide, le métaperiodate de sodium et le p-

xylénol: On prépare une solution substrat contenant mmoles de L-leucyl-3, 5-dibromo-4-hydroxyanilideo HC 1 dissous dans du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) On ajoute 20/ul d'un échantillon de sérum provenant d'un malade (LAP 250 unités G-R) à 1 ml de la solution substrat, on mélange soigneusement et on incube à 370 C pendant 20 minutes On ajoute pour former la couleur 3 ml d'une solution de réactif oxydant contenant 2 mmoi

les de métaperiodate de sodium et 10 mmoles de p-xylé-

nol dans de l'hydroxyde de potassium 0,2 NE On mesure l'absorption du colorant à 585 nm

(D 0585 = 0,18).

Exemple 31

Dosage de la -GTP avec-le i -L-glutamyl-

3,5-dichloro-4-hydroxyanilide, le métaperiodate de so-

-44- dium et le p-xylénol: On prépare une solution substrat contenant mmoles de -L-glutamyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide et 5 mmoles de glycylglycine dans du tampon Tris-HC 1 5 m E (p H 8,0) On ajoute à 0,5 ml de la solution subs- trat 10/ul d'échantillon de sérum ( j-GTP: 130 m U/ml), on mélange soigneusement et on incube à 37 C pendant minutes On ajoute pour former une coloration 2 ml de solution de réactif oxydant contenant 2 mmoles de métaperiodate de sodium et 10 mmoles de p-xylénol dans

de l'hydroxyde de potassium 0,2 N On mesure l'absorp-

tion à 585 nm (DO 585 = 0,112).

Exemple 32

Dosage de la î-GTP avec le <-L-glutamyl-3,5-

dibromo-4-hydroxyanilide, le métaperiodate de sodium et le p-xylénol: On prépare une solution substrat contenant mmoles de) -L-glutamyl-3,5dibromo-4-hydroxyanilide et 100 mmoles de glycylglycine dissous dans du tampon

Tris-H Cl 50 m I (p H 8,0) On ajoute à 0,5 ml de la so-

lution substrat 10 Oil d'échantillon de sérum de malade ( Y-GTP: 130 m U/ml) et on incube à 37 C pendant minutes On ajoute pour former la coloration 2 ml de solution de réactif oxydant contenant 2 mmoles de métaperiodate de sodium et 10 mmoles de p-xylénol dans

de l'hydroxyde de potassium 0,2 N On mesure l'absorp-

tion à 585 nm (D 0585 = 0,140).

Exemple 33

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dibromo-

4-hydroxyanilide, le métaperiodate de sodium et le 2-

chloro-5-méthylphénol: On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide H Cl dissous dans du tampon phosphate 0,1 M (pti 7,0) On ajoute à 1 ml de solution substrat 20/ul d'échantillon -45- de sérum de malade (LAP: 250 unités G-R) et on incube à 37 C pendant 20 minutes On ajoute pour-former une

coloration 3 ml de solution de réactif oxydant conte-

nant 2 mmoles de métaperiodate de sodium et 5 mmoles de 2-chloro-5méthylphénol dans de l'hydroxyde de potas- sium 0,2 N On mesure l'absorption du colorant à 635 nm

(D 0635 = 0,33).

Exemple 54

Dosage de la -GTP avec le '-L-glutamyl-

3,5-dibromo-4-hydroxyanilide, le métaperiodate de sodium et le 2-chloro-5méthylphénol: On prépare une solution substrat contenant mmoles de v-Lglutamyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide

et 100 mmoles de glycylglycine en solution dans du tam-

pon Tris-HC 1 50 m M (p H 8,0) On ajoute à 0,5 ml de so-

lution substrat 10,/1 d'échantillon de sérum de malade

( -GTP: 130 m U/ml) et on incube à 370 C pendant 20 mi-

nutes On ajoute pour former une coloration 2 ml de ré-

actif oxydant contenant 2 mmoles de métaperiodate de sodium et 5 mmoles de 2-chloro-5-méthylphénol dans de l'hydroxyde de potassium 0,2 N On mesure l'absorption

à 635 n= pour obtenir une D 0635 = 0,214.

Exemple 35

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dibromo-

4-hydroxyanilide et le pentacyanoaminoferroate de so-

dium: On ajoute 60 nml de peroxyde d'hydrogène à

0,3 % à 2 g de pentacyanoaminoferroate de sodium dis-

sous dans 20 ml d'eau et on ajoute de plus 20 ml de so-

lution à 10 % de bicarbonate de sodium On ajoute 4 g de Dextran T-10 (Pharmacia) pour préparer une solution

de coloration non diluée On prépare une solution de co-

loration et d'arrêt de la réaction non diluée par addi-

tion de 50 ml de tampon citrate 0,2 M (p H 4,5) conte-

nant 1 % de chlorure de sodium et 0,5 % de Tween 80 à -46-

I ml de la solution de coloration non diluée.

On ajoute 20 p 1 d'un échantillon de sérum provenant d'un malade (IAP: 250 unités G-R) à 5 mmoles de L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide HC 1 dissous dans I ml de tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0), on mé-

lange soigneusement et on incube & 37 C pendant 20 mi-

nutes On ajoute 5 ml de la solution de coloration et

d'arrêt de la réaction et on laisse reposer à la tempé-

rature ordinaire pendant 20 minutes pour qu'une colora-

tion se forme On mesure l'absorption à 700 nm pour ob-

tenir une DO 700 = 0,21.

Exemple 36

Dosage de la %-GTP avec la Y -L-glutamyl-

3,5-dibromo-4-hydroxyanilide et le pentacyanoamino-

ferroate de sodium: On ajoute 20/ul d'échantillon de sérum de malade ( YGTP: 130 m U/ml à 1 ml d'une solution de mmoles de ' -L-glutamyl-3,5dibromo-4-hydroxyanilide et 100 mmoles de glycylglycine dans du tampon Tris-HC 1 50 m M (p H 8,0), on mélange soigneusement et on incube à 370 C pendant 20 minutes On arrête la réaction et on

forme une coloration comme dans l'exemple 35 pour ob-

tenir une absorption de D 0700 = 0,132.

Exemple 37

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-3,5-dibromo-

4-hydroxyanilide et le pentacyanoacoferriate de sodium: On prépare une solution substrat contenant mmoles de L-leucyl-3,5-dibromo-4hydroxyanilide HC 1 l en solution dans du tampon phosphate 0,1 M (p H 7,0) On ajoute 2 Ou 1 d'échantillon de sérum de malade (LAP:

250 unités G-R) à I ml de la solution substrat, on mé-

lange soigneusement et on incube à 37 C pendant 15 mi-

nutes On ajoute 4 ml d'une solution préparée par addi-

tion de 90 ml d'une solution 0,2 M d'EDTA 2 Na (p H 11) dans 30 ml de pentacyanoacoferriate de sodium à 1 % et

on incube à 37 C pendant 15 minutes On mesure l'absorp-

tion à 730 nm pour obtenir une Do 0730 = 0,232.

On prépare le pentacyanoacoferriate de sodium à 1 % par irradiation par les ultraviolets pendant 15 minutes d'une solution à 1 % de nitroprussiate de

sodium NalFe(CN)5 N O l et à 1 % de carbonate de sodium.

Exemple 38

Etablissement d'une courbe d'étalonnage de la

3-GTP avec le -L-glutamyl-3,5-dibromo-4-hydroxv-

anilide On prépare une solution substrat contenant mmoles dthydroxyanilide et 100 mmoles de glycylgly- cine dans du tampon Tris-H Cl 50 mei (p H 8,0) On ajoute

à 0,5 ml de la solution substrat 10,,ul de sérum conte-

nant de la 1-GTP ( 74-370 m U/ml), on mélange soigneuse-

ment et on incube à 37 C pendant 20 minutes On ajoute une solution de réactif oxydant contenant 2 nmmoles de métaperiodate de sodium et 10 mmoles de p-xylénol dans de l'hydroxyde de potassium 0,2 N pour produire une coloration On mesure l'absorption du colorant formé à 585 nm Les résultats sont illustrés par la figure 20 qui montre que l'on peut mesurer de façon avantageuse la -GTP sériqueo

Exemple 39

Dosage de la LAP avec le L-leucyl-53,5 =dichlo-

ro-4-hydroxyanilide ou le L-leucyl-3 5-dibromo= 4-hydro-

xyanilide, le 2,5-diméthylphénol et l'ascorbate-oxydase: On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-35,-;-dichloro-4 hydroxyanilideo H Cl

ou 2 mmoles de L-leucyl-3,5-dibromo-4-hydroxyanilide.

H Cl et 2 mmoles de 2,5-diméthylphénol dans du tampon

phosphate 0,1 MI (p H 7,0) On ajoute à 2 ml de la solu-

tion substrat 13 C U d'ascorbate-oxydase et 20 Il d'é-

chantillon de sérum de malade (LAP 1113 unités G-R/ml)

et on incube à 57 C pendant 10 minutes On mesure l'ab-

-48 -

sor Dtion à la longueur d'onde d'absorption maximale.

Les résultats sont les suivants.

L-.leuc Yl-5,5-dichloro-4-hydroxyanilide: O 585 = 0,586 L-leucyl-3,-5dibromo-4-hydroxyvanilide DO 8 0,5

Exemple 40

Dosage de la LAI' avec le L-leucyl-3,5-di-

chloro-4 hydroxyanilide, le 2,5-diméthylphénol et la-

laccase On prépare une solution substrat contenant 2 mmoles de L-leucyl-3, 5-dichloro-4-hydroxyanilide HC 1

et 2 mmoles de 2,5-diméthylphénol dans du tampon phos-

phate 0,1 Fi (p H 7,0) On ajoute à 2 ml de la solution substrat 2 O Al d'une solution contenant de la laccase ( 330 U 1) et de l'arylamidase ( 1000 unités G-R/ml) et on

incube à 370 pendant 10 minutes - L'absorptiori à 585 nm.

est DO 58 0,386.

Exem-ple 41

Dosage de la "Il -GTP avec le 'Y-L-glutamiyl-3,5-

dichloro-4-hycdroxyanilide, le 2,5-diméthylphénol et l'ascorbate-oxydase On prépare une solution substrat contenant mmnoles de 'i-L-glutamyl, 5dichloro-4-hydroxyanilide,

mmoles de glycylglycine et 0,5 mmole de 2,5-dim'é-

thylphénol dans du tampon borate 50 m N (p H 8,0) On

ajoute à 2 ml de la solution substrat 100,ul d'ascor-

bate-oxydase ( 100 U) et 50/ 11 de sérum (-GTP

416 m U/ml) et on incube à 3700 pendant 5 minutes L'ab-

sorption à 585 mn est DO 585 = 0, 547.

Exemple 42

Dosage de la 'Y-GTP avec le Y'-L-glutamyl-3,5-

dichloro-4-hydroxyanilide ou le >-L-51 uta-myl-3,5-

dibromo-4-hydroxyanilide, le 2,5-diméthylphénol et la laccase On prépare une solution substrat contenant 5 nmmoles '-IL-glutamyl-3,5-dichloro 4hydroxyanilide -49-

ou 5 mmnoles de '-L-glutamyl-3,5-dibromo-4-hyrdroxyanili-

de, 100 mmuoles de glycylglycine'et 0,5 rnmole de 2,5-

diméthylphénol dans du tampon borate 50 ml, (p H 8,0) On

ajoute à 2 ml de chaque soluti 6 N substrat 100,>il de so-

lution de laccase ( 100 U) et 50/ul de sérum ( '-GTP 416 m U/ml) et on incube à 37 % pendant 5 minutes On mesure l'absorption du colorant formé Les résultats sont les suivants -L-glutam Yl-5,5-dichloro- 4hydroxyanilide

DO 58 = 0,476

Y -L-glutamyl, 5-dibromo-4-hydroxyanilide

DO 8 = 0,526

-50-

Claims (12)

REVEND ICATIONS - I Amide de formule x R S < OH Y dans laquelle R est un radical L-leucyle ou '-L-gluta- myle, et X et Y sont semblables ou différents et sont des atomes d'halogène, -ou un sel correspondant.
1. 2 Amide ou sel correspondant selon la re-

   vendication 1, o R est un radical L-leucyle et les

   atomes d'halogène sont des atomes de chlore ou de brome.
2. 3 Amide ou sel correspondant selon la reven-

   dication 2, ledit amide étant le L-leucyl-3,5-dibromo-

   4-hydroxyanilide ou le L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxy-

   anilide.
3. 4 Amide ou sel correspondant selon la reven-

   dication 1, o R est le radical '-L-glutamyle et les

   atomes d'halogène sont des atomes de brome ou de chlore.

   Amide ou sel correspondant selon la reven-

   dication 4, ledit amide étant le Y-L-glutamyl-5,5-di-

   bromo-4-hydroxyanilide ou le Y -L-glutamyl-3,5-dichloro-

   4-hydroxyanilide.
4. 6 Procédé de dosage d'une activité enzyma-

   tique qui comprend le traitement d'un amide de formule

   R 2 R 3

   k /

   R 1 N H R 4

   -51-

   dans laquelle R 1 est un radical L-leucyle ou '-L-gluta-

   myle, R 2 R R, R 5 et R 6 sont un atome d'hydrogène ou

   d'halogène ou un radical alkyle inférieur, alcoxy infé-

   rieur, amino, amino substitué, hydroxy, carboxy ou sul-

   fo, et R et R 6 peuvent constituer ensemble un cycle car- boné, ou un sel soluble dans l'eau correspondant, avec une peptidase, le traitement de l'amine ainsi libérée

   de formule.

   R 2 R 3

   H 2 N,R'

   H 21 <R 4

   R R

   6 5

   dans laquelle R 2, R 5, R 4 R 5 et R 6 ont-les mêmes signi-

   fications que précédemment, avec une oxydase qui con-

   somme de-l'oxygène et forme un colorant en présence d'un coupleur de formule

   R.8 R 9

   R / \\ RR 10
5. 7 _ R 10

   R 12 1

   dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical 7. amino, amino substitué ou hydroxy, R 8, R 9, R 10, R 11 et

   R 12 sont un atome d'hydrogène ou d'halogène ou un radi-

   cal alkyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxy, carboxy ou sulfo, et R 11 et R 12 peuvent éventuellement former ensemble un cycle carboné ou R 7 peut éventuellement être un atome d'hydrogène lorsqu'au moins un de R 8, R 9, R 10 c R 11 et R 12 est un radical amino, amino substitué ou hydroxy, puis la -52-

   mesure quantitative des changements détectables.
6. 7 Procédé de dosage selon la revendication

   6, dans lequel 1 'oxydase est la laccase, l'acide ascor-

   bique-oxydase ou la tyrosinase.
7. 8 Procédé de dosage selon la revendication

   6, dans lequel la peptidase est la leucine-aminopepti-

   dase. 9 Procédé de dosage selon la revendication

   6, dans lequel la peptidase est la Y -glutamyl-trans-

   peptidase.

   Procédé de dosage qui comprend le traite-

   ment d'un amide de formule X

   R NI, OH

   dans laquelle R est un radical L-leucyle ou Y-L-gluta-

   myle, et X et Y sont semblables ou différents et sont un atome-d'halogène, ou un sel correspondant, avec une

   peptidase d'un échantillon pour libérer un dérivé d'a-

   niline de formule

   X

   H 2 N OH

   Xy dans laquelle X et Y ont les mêmes significations que précédemment l'oxydation dudit dérivé d'aniline et la

   mesure quantitative des changements détectables.
8. 11 Procédé de dosage selon la revendication -53-

   , dans lequel ledit amide est un L-leucyl-3,5-di-

   halogéno-4-hydroxyanilide et la peotidase est la L leucine-aminopeptidase 12 Procédé de dosage selon la revendication 11, dans lequel le L-leucyl-3, 5-dihalogéno-4-hydroxy- anilide est le L-leucyl-3,5-dibromo-4hvydroxyanilide ou

   le L-leucyl-3,5-dichloro-4-hydroxyanilide.
9. 13 Procédé de dosage selon la revendication

   , dans lequel ledit amide est un '-L-glutamyl-3,5-

   dihalogéno-4-hydroxyanilide et la peptidase est la -glutamyltranspeptidase. 14 Prbcédé de dosage selon la revendication

   11, dans lequel le -L-glutamyl-3,5-dihalogéno-4-

   hydroxyanilide est le ' -L-glutanmyl-3,5-dibromo-4-

   hydroxyanilide ou le S?-L-glutamyl-3,5-dichloro-4-

   hydroxyanilide. Procédé de dosage selon la revendication , dans lequel l'oxydation est effectuée en présence

   d'un agent oxydant ou d'une oxydase.
10. 16 Procédé de dosage selon la revendication , dans lequel l'agent oxydant est un halogène, un peroxyde, un complexe de type cyanoferrate ou sa forme oxydée. 17 Procédé de dosage selon la revendication

    15, dans lequel l'oxydase est la laccase, l'asc Qrbate-

    oxydase ou la tyrosinase.
11. 18 Procédé de dosage selon la revendication , dans lequel l'oxydation est effectuée en présence d'un coupleur de formule

    R 8 R 9

    R Rio O

    R 12 R 11

    dans laquelle R est un atome d'hydrogène ou un radical amino, arino substitué ou hydrox,%, R& a R 10, RI,-1 et

    R 12 sont un atome d'hydrorène ou d'halogène ou un radi-

    cal alkyle inférieur, alcoxy inférieur, amino, amino substitué, hydroxy, carboxv ou sulfo, et R 11 et R 12 peuvent éventuellement former ensemble un cycle carboné ou R 7 peut éventuellement être un hydrogène lorsqu'au moins un de R 8, R 9, R 10, R 1 l et R 12 est un radical

    amino, amino substitué ou hydroxy.
12. 19 Procédé de dosage selon la revendication , dans lequel les changements détectables sont la

    quantité de colorant formée par oxydation ou la quanti-

    té d'oxygène consommée par oxydation.

    e J