FR2477145A1 - 25-hydroxy-26, 26, 26, 27, 27, 27-hexafluorocholecalciferol - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE. ELLE A POUR OBJET UN NOUVEAU DERIVE DE LA VITAMINE D, A SAVOIR LE 25-HYDROXY-26, 26, 26, 27, 27, 27-HEXAFLUOROCHOLECALCIFEROL, DE MEME QU'UN PROCEDE POUR LE PREPARER. CE COMPOSE A UNE ACTIVITE VITAMINOIDE D EN RAISON DE SON APTITUDE A AUGMENTER LE TRANSPORT INTESTINAL DU CALCIUM, A ELEVER LE TAUX SERIQUE DU CALCIUM ET A EMPECHER LE RACHITISME. CE COMPOSE TROUVE SON APPLICATION PREFEREE DANS LE REMPLACEMENT DE LA VITAMINE D POUR LE TRAITEMENT D'AFFECTIONS OU INTERVIENNENT LE METABOLISME DU CALCIUM ET LA DEFICIENCE EN PHOSPHORE.

Description

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La présente invention concerne un dérivé de

la vitamine D3.

La vitamine D3 est un agent bien connu inter-

venant dans l'homéostase du calcium et du phosphore.

Chez l'homme ou l'animal dans son état normal, ce com-

posé stimule, comme on le sait, le transport intestinal du calcium et la mobilisation du calcium osseux et est

efficace pour prévenir le rachitisme.

Il est bien connu aussi que pour être effica-

ce, la vitamine D3 doit être convertie in vivo en ses

formes hydroxylées. Par exemple, la vitamine est d'a-

bord hydroxylée dans le foie en 25-hydroxy-vitamine D3 et celle-ci est hydroxylée à son tour dans les reins en

la la,25-dihydroxy-vitamine D ou 2+,25-dihydroxy-vita-

mine D3. La forme la-hydroxylée de la vitamine est gé-

néralement considérée comme étant la forme physiologique-

ment active ou hormonale de la vitamine et comme étant à

l'origine d'activités dites vitaminoides D, comme l'aug-

mentation de l'absorption intestinale du calcium et des phosphates, la mobilisation des minéraux osseux et la

rétention du calcium dans les reins.

Depuis la découverte des métabolites biologi-

quement actifs de la vitamine D, la préparation d'ana-

logues structurels de ces métabolites a suscité beaucoup d'intérêt parce que de tels composés peuvent être des

agents thérapeutiques précieux pour le traitement d'af-

fections résultant de troubles du métabolisme du cal-

cium. Divers composés qui sont des vitaminoides D ont déjà été synthétisésnotamment différents dérivés de la vitamine D 3fluorés en chalne latérale et analogues du

dihydrotachystérol fluorés en chafne latérale.

Conformément à la présente invention, on a

préparé un nouveau dérivé de la vitamine D3 qui manifes-

te une excellente activité vitaminoide D, comme le mon-

tre la mesure de son aptitude à stimuler le transport du calcium dans l'intestin, son aptitude à mobiliser le

calcium osseux (augmentation du taux sérique de cal-

cium) et son activité antirachitique déterminée par l'épreuve de ligne chez le rat. Ce composé peut donc servir de produit de remplacement pour la vitamine D

et pourrait être utile pour le traitement de différen-

tes affections métaboliques des os. Ce dérivé a été

identifié comme étant le 25-hydroxy-26,26,26,27,27,27-

hexafluorocholécalciférol (25-hydroxy-26,26,26,27,27,27-

hexafluorovitamine D3 ou 25-OH-26,27-F6-D3).

Ce composé peut être synthétisé de la manière

suivante.

L'éther tétrahydropyrannylique du 3P-hydroxy-

chol-5-ène-24-ol (1) est facile à obtenir par traitement de l'acide cholénique ou des esters d'acide cholénique disponibles dans le commerce, par exemple par conversion en dérivé 3-tétrahydropyrannylique, puis par réduction

de la fonction acide ou ester à l'aide d'un hydrure mé-

tallique tel que 1 'hydrure de lithium-aluminium de ma-

nière connue.

Le composé (1) comprenant un radical 24-OH est d'abord converti en le bromure correspondant (2). Le bromure (2) est condensé avec l'hexafluoroacétone au

cours d'une réaction de Grignard pour donner l'hexafluo-

rure (3). Eventuellement, le radical tétrahydropyran-

nyle est éliminé avec formation du composé comprenant un radical 3-OH libre,après quoi ce radical 3-OH est protégé au moyen d'un radical acétyle ou radical acyle analogue avec formation du composé (+). Le composé (4)

(ou le composé (3)) est alors mis à réagir avec le N-

bromosuccinimide pour donner le 5,7-diène(5). Ce diène est alors irradié et soumis à une hydrolyse modérée,dans

un ordre quelconquepour donner le dérivé recherché (6).

OH Br

+

CF3 Ac(

Ether tétrahydropyrannylique du bromure de 3B-hydroxy-

chol-5-ényle (2) On ajoute une solution de n-butyl-lithium (3,5 millimoles) dans l'hexane à -78 C à une solution

d'éther tétrahydropyrannylique de 3 p-hydroxychol-5-ene-

24-ol (1) (1,4 g, 3,15 millimoles) dans du tétrahydro-

furnnne (15 ml). Après 5 minutes d'agitation, on ajoute

du chlorure de p-toluènesulfonyle (670 mg, 3,5 milli-

moles) dans du tétrahydrofuranne (5 ml) et on agite le

mélange pendant 1 heure. On verse le mélange de réac-

tion dans de l'eau glacée et on l'extrait au chlorure de méthylène. Après lavage à l'eau et séchage sur du sulfate de magnésium nnhydre, on chasse le solvant par

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évaporation. On dissout le résidu dans un mélange de tétrahydrofuranne (15 ml) et d'acétone (15 ml), puis on

ajoute la solution à du bromure de lithium (3,0 g).

Après 2 heures de chauffage au reflux, on sépare le pré-

cipité par filtration et on chromatographie le filtrat

sur une colonne de gel de silice. Par élution au chlo-

rure de méthylène, on obtient le composé 2 (1,l14 g,

88%/o), P.F. ll7-119 C (méthanol-acétone).

Analyse pour C29H4702Br calculé C, 68,62; H, 9,33% trouvé C, 68,84; H, 9, 43%

3P-Acétoxy-26,26,26,27,27,27-hexafluoro-25-hydroxycho-

lest-5-ène (4)

On chauffe au reflux pendant 2 heures en at-

mosphere d'argon une suspension de potassium (150 mg)

et de chlorure de magnésium (200 mg) dans du tétrahydro-

furanne (5 ml),puis on la refroidit jusqu'à la tempéra-

ture ambiante. On ajoute le bromure 2 (251+ mg, 0,5 mil-

limole) dans du tétrahydrofuranne (5 ml) et on agite le mélange à la température ambiante pendant 2 heures. Sous

refroidissement dans un bain de neige carbonique et d'a-

cétone, on ajoute un excès d'hexafluoroacétone gazeuse

et on agite le mélange pendant 15 minutes, puis on ajou-

te du méthanol (5 ml) et on agite le nouveau mélange

pendant 10 minutes à la température ambiante. Après ad-

dition d'acide chlorhydrique dilué, on extrait le mé-

lange de réaction à l'éther. On chromatographie l'ex-

trait sur une colonne de gel de silice. A partir du produit d'élution avec un mélange benzène-éther (30:1),

on isole 1 'hexafluorure 3 (18 mg 16%).

Spectre de masse, m/e 510 (i+ 4C), 492, +77, 255.

Spectre de résonance magnétique nucléaire (CDC13), 6, 0,68 (s, C-18), 0, 94 (d, J=6 C-21), 1,00 (s, C-19), 3,88 (m, 0-3), 3,48 (m,! 3,88 (m, 0-3),

4,72 (m, C -0_), 5,32 (m, C-6).

On dissout l'hexafluorure 3 dans du méthanol

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(3 ml) et du chlorure de méthylène (3 ml) et on ajoute de l'acide ptoluènesulfonique (10 mg) pour obtenir le composé 3-hydroxylé correspondant. On agite le mélange pendant 2 heures à la température ambiante, puis on le concentre sous vide. On dissout le résidu dans du chlo- rure de méthylène (2 ml), on agite la solution avec de l'anhydride acétique (1 ml) et de la pyridine (1 ml)

pendant 16 heures. On purifie le produit sur une co-

lonne de gel de silice pour obtenir 28 mg du 3-acétate

4, P.F. 165-166 C.

Spectre de masse, m/e +92 (M+ -AcOH), 477, 38i, 371, 255. Spectre de résonance magnétique nucléaire (CDC13) S 0,68 (s, C-18), 0,93 (d, J=6 Hz, C-21), 1,01 (s, C-19),

2,02 (s, acétyle),),56 (m, C-3), 5,34 (m, C-6).

Si la chose est désirée, on peut utiliser des radicaux protecteurs 0acyle autres que le radical 3-acétyle. Par exemple, on peut utiliser le radical tétrahydropyrannyle ou un radical acyle de 1 à environ 4 atomes de carbone, par exemple acétyle, propionyle,

butyryleou bien un radical acyle aromatiquepar exem-

ple benzoyle ou benzoyle substitué (comme nitrobenzoyle

ou chlorobenzoyle),auquel on parvient aisément en fai-

sant réagir le composé 3-hydroxylé avec l'anhydride ou halogénure d'acyle approprié, par exemple le chlorure,

de manière classique. Dès lors, le substituant en po-

sition 3 des composés i et 5 peut être représenté par un radical RO-,o R représente un atome d'hydrogène ou

un radical tétrahydropyrannyle, acyle de 1 à l ato-

mes de carbone, benzoyle ou benzoyle substitué, bien qu'en règle générale, le radical 3-hydroxyle doive être

protégé pour la synthèse du diène.

3P-Acétoxy-26,26,26,27,27,27-hexafluorocholesta-5,7-dièn-

-ol(5) On ajoute du N-bromosuccinimide (9 mg) à une solution bouillant au reflux de l'acétate + (19 mg) dans du tétrachlorure de carbone (2 ml) et on maintient le mélange au reflux pendant 20 minutes en atmosphère d'argon. Après refroidissement, on sépare le précipité résultant par filtration et on évapore le filtrat sous vide. On dissout le résidu dans du xylène (1,5 ml) et on verse la solution dans une solution bouillant au re-

flux de s-collidine (0,5 ml) dans du xylène (1,5 ml).

Après 10 minutes d'ébullition au reflux, on extrait le mélange à l'acétate d'éthyle. On dissout le produit

brut dans de l'acétone (5 ml) et on fait réagir la so-

lution avec de l'acide p-toluènesulfonique (10 mg) par 14 heures d'agitation à la température ambiante. Après

addition d'eau, on extrait le mélange à l'acétate d'é-

thyle. On purifie le produit de réaction par chromato-

graphie en couche mince préparative (benzène-acétate d'éthyle, 50:1, deux fois) pour obtenir le 5,7-diène 5

(4,9 mg).

Spectre UV, X max(C2H50OH)262 (épaulement), 271, 282,

293 nm.

-Hydroxy-26,26,26,27,27,27-hexafluorovitamine D (Q) On irradie le 5,7diène 5 en solution dans l'éthanol (40 ml)-benzène (90 ml) au moyen d'une lampe à vapeur de mercure à moyenne pression à travers un filtre Vycor pendant 150 secondes en atmosphère d'argon et sous refroidissement dans de la glace. On chauffe

le mélange ensuite au reflux pendant i heure. On éva-

pore le solvant et on chromatographie le résidu sur une colonne de gel de silice,puis onle soumet à une chromatographie en couche mince préparative (benzène-acétate d'éthyle, :1, deux fois) pour obtenir 1,2 mg de l'acétate de

vitamine D brut. On fait réagir une solution de l'acé-

tate dans du tétrahydrofuranne (4 ml) avec de 1 'hydroxy-

de de potassium à 5% dans du méthanol (5 ml) pendant

13 heures à la température ambiante sous argon. On ex-

trait le produit à l'acétate d'éthyle et on le purifie par chromatographie liquide sous haute pression dans

une colonne Zorbax-SIL (15 cm x 4,6 mm diamètre inté-

rieur) en utilisant comme solvant un mélange chlorure

de méthylène-hexane (2:1) pour obtenir 0,75 mg du com-

posé 6.

Spectre UV, min (C2H50H) 227,5, X max 264 nm.

Spectre de masse, m/e 508 (M+), 493, 490, 475, 271, 253,

136, 118.

La 25-OH-26,27-F6-D3 résultante peut, si la chose est désirée, être obtenue sous forme cristalline

par dissolution dans un solvant ou système solvant ap-

proprié, par exemple éther, éther-hexane, métha-

nol-éther, ou acétate d'éthyle-alcane,puis par élimi-

nation du ou des solvants par évaporation ou autrement.

De même, si la chose est désirée, dans le pro-

cédé ci-dessus, le 5,7-diéne (5) peut être hydrolysé au moyen d'hydroxyde de potassium dans le méthanol comme précédemment ou suivant une autre technique d'hydrolyse alcaline modérée classiqueavant l'irradiationpour la

conversion du radical acétoxy en position 3 en un radi-

cal hydroxyle en position 3.

L'activité biologique de la 25-OH-26,27-F6-D3 a été confirmée par des épreuves in vivo appropriées chez le rat. A cette fin, des rats mâles sevrés acquis

chez la société Holtzman Co., Wisconsin reçoivent à vo-

lonté de l'eau et soit un aliment à teneur faible en

calcium et adéquate en phosphoremais déficient-en vi-

tamine D comme décrit par Suda et al (J. Nutrition 100, 1049, 1970), soit un aliment à teneur élevée en calcium et faible en phosphoremais déficient en vitamine D comme décrit par Tanaka et DeLuca (PNAS 71, 1040, 1974)

pendant 3 semaines.

Transport intestinal du calcium On répartit les rats ayant reçu l'aliment à

teneur faible en calcium et déficient en vitamine D pen-

dant 3 semaines en 3 groupes de cinq animaux chacun et

on leur administre respectivement 650 picomoles de 25-

OH-26,27-F6-D3 ou de 25-hydroxy D3 (25-OHD3) en solu-

tion dans 0,1 ml d'éthanol à 95% par voie intrajugulaire

22 heures avant de les sacrifier. On administre le vé-

hicule éthanolique de la même manière aux rats du groupe

témoin. On sacrifie les animaux par décapitation et on col-

lecte le sang. On prélève immédiatement le duodénum pour la mesure de l'activité de transport intestinal du calcium suivant le procédé décrit par Martin et DeLuca (Am. J.

Physiology 216, 1351, 1969). Les résultats sont rassem-

blés à la première colonne du tableau I. Concentration sérique en calcium On soumet le sang collecté chez les rats de la

manière indiquée ci-dessus à la centrifugation pour iso-

ler le sérum. On mélange 0,1 ml de sérum avec 1,9 ml de solution de chlorure de lanthane à 0,1% et on mesure la

concentration en calcium au spectrophotomètre d'absorp-

tion atomique (Perkin-Elmer modèle HO-214). Les résul-

tats sont rassemblés à la seconde colonne du tableau I. Du fait que la 25OH-26,27-F6D3 a une aptitude à augmenter la concentration sérique en calcium qui est sensiblement plus élevée que celle de la 25-0HD3, comme

il ressort du tableau I, on effectue une étude cinéti-

que de l'augmentation du calcium sérique après adminis-

tration de 25-OHD3 ou de 25-OH-26,27-F6D3.

On répartit en groupes de 5 animaux des rats

ayant reçu l'aliment à teneur faible en calcium et dé-

ficient en vitamine D pendant 3 semaines. On adminis-

tre aux rats 325 picomoles de 25-OH-26,27-F6-D3 ou de -OHD3 en solution dans 0,1 ml d'éthanol à 95% par voie intraJugulaire. On administre ces composés 6, 17,

27 ou 48 heures avant de sacrifier les animaux.

TABLEAU I

Transport intestinal du calcium et augmentation de la

concentration sérique en calcium sous l'effet d'une do-

se unique de 25-OH-26,27-F -D3 ou de 25-OHD3 (doses de 650 pigomoles Composé administré Transport intes- Calcium sérique tinal de Ca (mg/lO0 ml) Ca intern'5ca / externe Témoin 2,1+0, 6*a) 56+0,1e) -OH-26,27-F6-D3 5, 610,8),4+0)l,) -oD3,90o8 c) 9O 3 3o Ecart type de la moyenne b) et c) par rapport à a) p < 0,001 b) par rapport à c) non significatif e) et f) par rapport à d) p < 0,001 e) par rapport à f) p < 0,005

Les rats du groupe témoin reçoivent de la mê-

me façon uniquement le véhicule éthanolique. On sacri-

fie les rats par décapitation aux moments indiqués, on

collecte le sang et on le centrifuge pour obtenir le sé-

rum. On détermine la concentration sérique en calcium comme indiqué cidessus. Les résultats sont rassemblés

au tableau suivant.

TABLEAU II_

Taux sérique de calcium en mg/100 ml

Nombre d'heures écoulées après admi-

nistration Composé 6 17 27 48 Témoin 4,1 4,3 4,1 4,O -0OH-D3 4,4 5,8 53 b) 53 -OH-26,27-F6-D3 4,7 5,7 6,2 a)5,8 a) par rapport à b) p < 0,001

Il ressort de manière évidente de ces résul-

tats que le composé hexafluoré conforme à l'invention non seulement induit une augmentation rapide du calcium sérique (sensiblement équivalente à celle induite par la -OH-D3),mais de plus maintient le calcium sérique à

un taux plus élevé que celui atteint avec la 25-

OH-D3 pendant le reste de la durée de l'épreuve.

Activité antirachitique On répartit en 3 groupes de 5 animaux des rats ayant reçu l'aliment à faible teneur en phosphore et

déficient en vitamine D comme décrit ci-dessus. On ad-

ministre aux animaux, par voie intrajugulaire, une se-

maine avant de les sacrifier,une dose unique de 325 pi-

comoles de 25-OH-26,27-F6-D3 ou de 25-OHD3 en solution dans 0,1 ml d'éthanol à 95%. Les rats du groupe témoin reçoivent de la même manière le véhicule éthanolique.Apres une semaine, on sacrifie les rats par décapitation et onen isole le duodénum pour mesurer l'activité de transport intestinal du calcium comme décrit précédemment.Les ré- sultats sont rassemblés à la première colonne du tableau III. On prélève le radius et le cubitus qu'on évalue conformément à l'épreuve de ligne du rat (Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique, 15e édition, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1955, page 889). Les résultats obtenus

sont rassemblés à la seconde colonne du tableau III.

TABLEAU IIL

Activité de transport intestinal du calcium et activité

antirachitique sous l'effet d'une dose unique (385 pico-

moles) de 25-OH-26,27-F6-D ou de 25-OHD une semaine avant le sacrifide des animaux3

Composé administré Transport intes- Activité antira-

tinal de Ca chitique (unité) Ca inter _ externe Témoin 2,0+0,3* a) 0 -0H26,27-F6-D3 7,1+14 b)6 -OHD3 6,9+0,6 c) >

6,9+_0,./_

* Ecart type de la moyenne b) et c) par rapport à a) p < O,001 b) par rapport à c) non significatif

Il ressort de manière évidente de ces résul-

tats que la 25-OH-26,27-F6-D3 a une activité vitaminol-

de D marquée et apparait sous ce rapport tout aussi ef-

ficace que la 25-OHD3.

- La 25-OH-26,27-F6-D3 peut être administrée

aisément sous forme de solutions stériles parentéra-

les par injection par voie intraveineuse ou bien par le tractus digestif sous forme de dosesà usage oral ou sous forme de suppositoires. Les doses d'environ 0,1 à 2,5 /ug par jour sont généralement efficaces pour provoquer les réponses physiologiques d'équilibre du il

calcium décrites qui caractérisent l'activité vita-

minoide D, des doses d'entretien étant par exemple d'en-

viron 0,25 & 0,5 /ug, celles d'environ 0,25 /ug étant appropriées. Des formes dosées du composé peuvent être pré-

parées par mélange de celui-ci avec un excipient non to-

xique pharmaceutiquement acceptable. De tels excipients peuvent être des solides ou des liquides, par exemple l'amidon de mais, le lactose, le saccharose, l'huile

d'arachide, l'huile d'olive, l'huile de sésame et l'eau.

Lors de l'utilisation d'un excipient solide, les formes dosées sont notamment des comprimés, capsules, poudres,

pastilles et tablettes. Lors de l'utilisation d'un ex-

cipient liquide,les capsules de gélatine molle, les sirops, les suspensions, émulsions ou solutions liquides peuvent être les formes dosées. Les formes dosées peuvent aussi contenir des adjuvantscomme des agents de conservation, des stabilisants, des agents mouillants ou émulsionnants

et des auxiliaires de dissolution. Elles peuvent égale-

ment contenir d'autres substances thérapeutiquement uti-

les.

Il convient de noter que bien que des inter-

valles de doses aiant été indiqués, la dose particulière

à administrer au patient dépend de l'affection spécifi-

que traitée, du résultat final recherché dans le cas particulier et de différents autres facteurs connus du spécialiste de l'application thérapeutique de ces agents médicinaux. Ce nouveau dérivé peut constituer un agent préféré pour denombreuses applications thérapeutiques parce qu'il résiste à la poursuite du métabolisme au

niveau du carbone 26. Il est bien connu que la 25-hy-

droxy-vitamine D3 peut être davantage métabolisée invivo en ,26-dihydroxyvitamine D3. Cette forme 26-hydroxylée est toutefois moins active que la 25-hydroxy-vitamine D3 elle-même et la 26-hydroxylation peut en effet être le premier stade vers la dégradation et l'élimination

de ce composé hors de l'organisme animal. Dans le dé-

rivé de l'invention, la présence des trois atomes de

fluor sur le carbone 26 empêche évidemment l'hydroxyla-

tion de cet atome de carbonede sorte que le composé n'est pas soumis au métabolisme atténuant l'activité que subit le 25-hydroxycholécalciférol. La prévention

de ce métabolisme de la chaîne latérale devrait per-

mettre l'entretien d'un taux tissulaire plus élevé de l'analogue pendant une plus longue durée, ce qui lO est un facteur d'un avantage évident pour de nombreuses

applications thérapeutiques.

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RE V E N D ICAT I O N S

1 - Le 25-hydroxy-26,26,26,27,27,27-hexafluoro-

cholécalciférol. 2 - Le composé suivant la revendication 1 sous forme cristalline. 3 - Composé de formule: F3 OH lO CO3 RO v

o R représente un atome d'hydrogène, un radical tétra-

* hydropyrannyl-e,un radical acyle de i à environ 4 ato-

mes de carbone, un radical benzoyle ou un radical benzo-

yle substitué.

- Le 33-acétoxy-26,26,26,27,27,27-hexafluo-

rocholesta-5,7-cdine-25-ol.

5 - Le 3p-hydroxy-26,26,26,27,27,27-hexafluo-

rocholesta-5,7-diane-25-ol. 6 - Composé de formule:

OH

RO

o R représente un atome d'hydrogène, un radical tétra-

hydropyrannyle, un radical acyle de 1 à environ i ato-

mes de carbone, un radical benzoyle ou un radical ben-

zoyle substitué.

7 - Le 3p-acétoxy-26,26,26,27,27,27-hexafluo-

ro-25-hydroxycholest-5-ène.

8 - Le 3p-hydroxy-26,26,26,27,27,27-hexafluo-

ro-25-hydroxycholest-5- ène.

9 - Composition pharmaceutique, caractérisée

en ce qu'elle comprend un composé suivant la revendica-

tion 1 ou 2,outre un diluant ou excipient pharmaceuti-

quement acceptable.

10 - Procédé de préparation du 25-hydroxy-26, 26,26,27,27,27hexafluorocholécalciférol,caractérisé en

ce qu'on brome le radical 24-OH de l'éther tétrahydropy-

rannylique de 3p-hydroxychol-5-èn-24-ol, on condense le bromure résultant avec l'hexafluoroacétone au cours d'une réaction de Grignard, on convertit l'hexafluorure

résultant en 5,7-diéne correspondant au moyen de N-bro-

mosuccinimide et, dans un ordre quelconque, on irradie

le diène et on le soumet à une hydrolyse modérée.