FR2464301A1 - Composition et procede pour doser l'anticorps correspondant a la nicotinamide-adenine-dinucleotidase streptococcique - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE COMPOSITION POUR METTRE EN EVIDENCE ET DOSER UN ANTICORPS, EN L'ESPECE L'ANADASE, C'EST-A-DIRE L'ANTI-NICOTINAMIDE-ADENINE-DINUCLEOTIDASE STREPTOCOCCIQUE. CETTE COMPOSITION EST CONSTITUEE DE PARTICULES D'UN LATEX D'UN POLYMERE SYNTHETIQUE ET DE NADASE STREPTOCOCCIQUE, CETTE DERNIERE FORMANT UN REVETEMENT SUR LA SURFACE DESDITES PARTICULES. CETTE COMPOSITION EST D'UN TRES GRAND INTERET POUR ETABLIR A COUP SUR LE DIAGNOSTIC DE MALADIES PROVOQUEES PAR LE STREPTOCOQUE HEMOLYTIQUE.

Description

La présente invention concerne une composition pour doser l'anticorps contre la nicotinamide-adéninedinucléotidase (NADase) streptococcique, ainsi qu'un procédé pour doser cet anticorps
L'invention a trait plus précisément à une composition pour le dosage de l'anticorps anti-NADase streptococcique, dont l'emploi permet, contrairement à la méthode enzymatique extrtmement compliquée, longue et conteuse qui était utilisée jusqu'à présent, de déterminer, qualitativement et quantitativement, avec exactitude et précision, l'anticorps anti-NADase streptococcique contenu dans un prélèvement humain par un essai facile à exécuter et ne nécessitant qu'un instrument simple.En outre on peut non seulement faire une analyse précise de l'infection produite par le streptocoque hémolytique mais encore distinguer cette maladie d'autres maladies dont le diagnostic a donné un résultat faussement positif. L'invention concerne également un procédé-pour doser l'anticorps anti
NADase
L'invention a pour objet une composition pour doser l'anticorps correspondant à la NADase streptococcique, composition qui est faite de particules d'un latex polymère synthétique revetuesde NADase.

On sait que le streptocoque hémolytique, surtout le streptocoque hémolytique du groupe A, en particulier
Streptococcus pyogenes, se transmet d'un individu à un autre et provoque des maladies graves, telles que la scarlatine, le rhumatisme articulaire aigu, la glomérulonéphrite aigu, etc..

Toutefois, les maladies causées par le streptocoque hémolytique ne donnent généralement pas de signe cliniques caractéristiques, à l'exception de certaines de ces maladies, telles que la scarlatine dont les symptmes sont typiques. C'est pourquoi il convient d'avoir recours à une méthode d'examen reposant sur une réaction sérologique ayant pour but de déterminer l'anticorps correspondant au streptocoque.

Dans l'examen sérologique actuellement employé on dose l'anticorps correspondant à la streptolysine O (SO), qui est l'exotoxine produite par le streptocoque hémolytique, ce qui revient à dire qu'on dose l'antistreptolysine 0 (ASO). Le défaut bien connu de cette méthode est que, même si l'on est en présence d'une maladie occasionnée par le streptocoque hémolytique, la fréquence avec laquelle la valeur trouvée pour l'ASO présente une augmentation significative n'est pas nécessairement élevée. Par ailleurs, on obtient parfois des valeurs ASO élevées de manière non idiosyncrasique, c'est-à-dire des indications faussement positives.

Il fallait donc trouver un moyen pour diagnostiquer avec une sensibilité t une fiabilité encore plus grandes les troubles causés par le streptocoque hémolytique.

Pour ne pas risquer de faire un diagnostic erroné dA à un résultat faussement positif il est bon que les mesures portent sur des anticorps correspondant à des produits extracellulaires du streptocoque hémolytique autres que SO, par exemple à des enzmestelles que la hyaluronidase et la
NADase, c'est-a-dire sur l'anticorps anti-hyaluronidase (AH , également désigné par l'expression "anticorps correspondant à la hyaluronidase")et l'anticorps anti-NADase (ANADase c'est-a-dire l'anticorps correspondant à la NADase),et que ce soit à partir des résultats de ces deux mesures que soit établi le diagnostic des troubles dus au streptocoque hémolytique.On peut ainsi accomplir un progès sensible, en ce qui concerne la fiabilité et la précision, en établissant le diagnostic sur la base de ces deux valeurs et il devient possible de distinguer avec précision les maladies occasionnées par le streptocoque hémolytique d'autres troubles qui donnent des signes faussement positifs.

La NADase est l'une des enzymes les plus importantes parmi celles qui prennent part à la réaction antigène-anticorps. C'est une protéine produite dans le liquide de culture du streptocoque hémolytique Elle scinde le nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) en amide de l'acide nicotinique et adénosine-diphosphate-ribose.

La méthode enzymatique est la seule méthode actuellement appliquée pour doser l'anticorps correspondant à la NADase. On ne connatt pas encore de méthode reposant sur une véritable réaction immunologique. En d'autrestermei on n'a jamais fait la moindre proposition en ce qui concerne le dosage de l'anticorps anti-NADase au moyen d'une agglutination passive sur latex.

La méthode précédente pour le dosage de l'ANAdase(qui est la seule actuellement utilisée)est mentionnée dans Peterson, K. F,, Z. HygO Infectionskr. 147:357 (1961). Cette méthode est effectuée de la façon suivante.

La NADase ayant été mélangée avec l'anticorps dans un tube à essai une partie de la NADase est neutralisée et la NADase qui reste réagit avec le substrat. On dose la quantité de la NADase qui reste et on calcule la quantité d'ANAdase. L'inconvéneint de cette méthode est que le NAD utilisé comme substrat et l'alcool-déshydrogénase (ADH) utiliséepour doser le NAD sont des substances coûteuses.

En outre, la mesure elle-mEme est extrêmement compliquée et prend beaucoup de temps, et c'est pourquoi on ne peut guère l'envisager pour des examens de routine, En fait elle n'est que très peu utilisée.

Les présents inventeurs ont cherché à mettre au point un procédé permettant de doser l'ANADase et qui n'ait plus aucun des inconvénients, exposés ci-dessus, des méthodes classiques, Ils sont ainsi parvenus à ouvrir une voie nouvelle pour le dosage de lANADase par la méthode d'agglutination passive.

Ils ont en effet découvert qu'il est possible, en utilisant la NADase purifiée obtenue à partir d'un filtrat de culture d'une souche engendrant de la NADase, telle que Streptococcus pyogenes, de sensibiliser les particules d'un latex polymère synthétique, et en outre qu'il est possible, en utilisant cet ensemble constitué de particules d'un latex polymère synthétique et, appliquée en revêtement à la surface desdites particules de latex, de la NADase purifiée, de doser l'ANADase avec précision, avec une grande sensibilité et avec une grande fiabilité, et cela rapidement par une opération extrêmement simple utilisant la réaction d'agglutination passive sur latex selon la méthode de microtitrage ou la méthode sur lamelle de verre.

Autre avantage de ce procédé, il revient beaucoup moins cher que la méthode connue qui nécessite des réactifs motteux, tels que NAD et ADH.

La présente invention a donc pour objet une remarquable composition destinée à être utilisée pour le dosage de 1'ANADase, et également un très bon procédé pour doser 1'ANADaoe.

On peut se servir de différents types de particules de latex synthétiques pour préparer la composition de l'invention qui doit servir au dosage de l'ANADase. Les polymères et copolymères formant un tel latex sont notamment ceux qui dérivent d'un ou plusieurs des monomères de l'ensemble constitué par le styrène, le chlorostyrène, les alkylstyrènes, le vinyltoluène, le divinylbenzène, la vinyl-pyrrolidone, l'acide acrylique, les acrylates d'alkyles, l'acide méthacrylique, les méthacrylates dalkyleS,l'acrylo- nitrile, le chlorure de vinyle, l'acétate de vinyle, le chlorure de vinylidène et le butadiène, ou les produits carboxylés de ces polymères ou copolymères ainsi que leurs produits carboxylés contenant un groupe amino.

Comme exemples de ces polymères ou copolymères on citera le polystyrène, le polystyrène carboxylé, le polystyrène.carboxylé porteur d'un groupe amino, le polychloro-styrène, le poly-vinyltoluène, les copolymères de styrène et de butadiène, les copolymères de styrène et de butadiène carboxylés, les copolymères de styrène et de a divinylbenzène, les copolymères de vinyltoluène et de tertbutyl-styrène, le poly-(acide acrylique), le poly-(acide méthacrylique), le polyacrylonitrile, les copolymères d'acrylonitrile et de butadiène, les copolymères d'acétate de vinyle et d'acrylate, la poly-vinyl-pyrrolidone et les copolymères de chlorure de vinyle et d'acrylate.

parmi les particules en un latex polymère synthétique on apprécie tout particulièrement les particules en un latex polymère synthétique du type styrène pris dans l'ensemble constitué par les polymères du styrène, les polymères du chlorostyrène, les copolymères du styrène, tels que les copolymères du styrène avec le chlorostyrène, le méthacrylate de méthyle et le chlorure de vinylidène, les produits carboxylés qui en dérivent et les produits à la fois carboxylés et aminés correspondants.

Ces particules en un latex polymère synthétique peuvent dtre utilisées après traitement préalable de leurs surfaces par un surfactif non ionique. Par exemple il est recommandé d'utiliser ces particules après adsorption d'un surfactif non ionique à base d'oxyde d'éthylène conformément au procédé décrit dans la demande de brevet japonais NO 9716/76 mise à l'inspection publique le 26 janvier 1976.

Comme surfactifs non ioniques à base d'oxyde d'éthylène on citera par exemple les copolymères séquencés d'oxyde d'éthylène et de poly-oxy-propyldne-glycol, les produits de poly-éthoxylation d'alcanolset les produits de poly éthoxylation d' alkyl-phénols
Les particules de latex polymère synthétique utilisées dans la présente invention ont un diamètre particulaire moyen qui est compris de préférence entre 0,01 et 1OLm, plus particulièrement entre 0,1 et 1 > um ou, mieux encore, entre 0,3 et 09 M , car ainsi on parvient à diminuer le temps nécessaire pour la mesure.La densité des particules de latex est de préférence comprise entre environ 0,9 et 1,4, plus spécialement entre environ 1,1 et 1,3 ou, mieux encore, égale à 1,2 + 0,05. Lorsque le dosage est effectué par une réaction d'agglutination sur une lamelle de verre les particules de latex utilisées peuvent avoir des densités s'étendant sur un grand intervalle. Dans le cas de la méthode de microtitrage il vaut mieux utiliser des particules de latex ayant une densité dtau moins 1,1.

Comme NADase à utiliser pour sensibiliser les particules en un latex polymère synthétique on peut utili
ser par exemple celle qui a été isolée d'un filtrat de culture d'une souche productrice de NADase, telle que
Streptococcus pyogenes, et qui a été purifiée0 I1 est
également possible d'utiliser celle qui a été isolée d'un produit commercial contenant de la NADase, tel que la "VARIDASE" (produit de Lederle Ltd., Japon), et qui a été purifiée.

Les souches productrices de NADase appartiennent au genre Streptococcus. Leur méthode de culture et la méthode servant à récolter la NADase à partir du filtrat de culture sont connues : elles peuvent être utilisées dans la présente invention
Ainsi qu'on le sait, la NADase est produite par pratiquement toutes les souches des groupes A, C et G du genre Streptococcus. La NADase peut donc entre obtenue
à partir de l'une quelconque de ces souches. I1 va sans dire qu'il faut utiliser les souches qui accumulent le plus
de NADase.Parmi ces souches on citera par exemple celle qui peut être obtenue sous le nom de Streptococcus pyogenes, 058, (Richards), auprès de l'"Institute of Medical Science,
Université de Tokyo, Japon (situé à Shiroganedai, Minato-ku,
Tokyo, Japon), et celle qui peut être obtenue sous le nom
de Streptococcus pyogenes ATCC 10389 auprès de l'American
Type Culture Collection (situé Rockville, Maryland,
Etats-Unis d'Amérique).

La NADase peut être produite par culture de
streptocoques de ce genre connus et disponibles, dans des milieux de culture connus, tels que le milieu de Todd-Hewit,
le milieu d'infusion de veau, le milieu au soja trypticase etc..., dans des conditions de culture connues, par exemple
à une température d'environ 370C, avec une durée de culture d'environ 16 à 24 heures. Du point de vue de la quantité produite on préfère le milieu de Todd-Hewit. Ces milieux
se trouvent dans le commerce. Par exemple, le milieu de
Todd-Hewit peut être obtenu auprès des Laboratoires Difco (Etats-Unis d'Amérique). La récolte de la NADase à partir du bouillon de culture peut être effectuée par des moyens connus.C'est ainsi qu'on peut isoler la NADase brute en séparant les cellules bactériennes du filtrat de culture par centrifugeage à une vitesse d'environ 3000 à 5000 tpm pendant environ 10 à 30 minutes.

La NADase brute contient de la DNase B (désoxy ribonucléase B),de la hyaluronidase, de la streptokinase, une protéinase etc...C'est pourquoi on purifie la NADase brute ainsi obtenue avant de l'utiliser. La purification peut se faire par exemple par relargage au moyen d'une solution à demi saturée de sulfate d'ammonium, par une méthode de filtration sur gel avec Sephadex G-200 (produit de
Pharmacia Fine Chemicals, Suède), DEAE-Sephadex (produit de Pharmacia Fine Chemical, Suède),par chromatographie avec Sephadex A-50 (produit de Pharmacia Fine Chemicals,
Suède), par chroSatographie sur une colonne de 2',5' ADP
Sepharose 4B (produit de Pharmacia Fine Chemicals, Suède), ou par une association de ces méthodes. I1 est conseillé d'employer la chromatographie avec 2',5' ADP-Sepharose.

I1 est recommandé d'avoir recours soit à cette méthode seule, soit à une association de cette méthode avec l'une quelconque des autres méthodes mentionnées ci-dessus à titre d'exemples.

La chromatographie avec ADP-Sepharose dont il a été question ci-dessus peut être exécutée par exemple de la façon suivante. La NADase brute obtenue de la manière décrite plus haut est appliquée sur une colonne d'ADP
Sepharose sur laquelle elle est adsorbée sélectivement.

On élimine ensuite les impuretés par lavage en faisant s'écouler vers le bas, par exemple, un tampon Tris 0,02 M à un pH d'environ 7,4, après quoi on utilise un tampon identique au précédent mais renfermant environ 1 M de chlorure de sodium, et on élue la NADase. I1 est également possible d'utiliser un produit commercial, tel que'Varidase" (produit de Lederle Ltd.), après purification de celui-ci de la manière habituelle.

La composition de la présente invention, qui sert à doser l'ANADase, peut être fabriquée très simplement.

Par exemple on peut l'obtenir en mettant les particules de latex en contact avec l'antigène WADase) dans un milieu aqueux approprié, tel que l'eau, un soluté physiologique, diverses solutions tampons etc...

Le- tampon utilisé peut être par exemple une solution saline tamponnée au phosphate, telle qu'un tampon au phosphate M/60 (pH 7,5) renfermant 0,15 M de NaCl (PBS) ou une solution saline tamponnez à la glycine.

La mise en contact dont il rient d'être question peut être effectuée de la manière suivante. On met la
NADase en contact avec une suspension des particules de latex en les mélangeant dans un milieu aqueux à un pH compris par exemple entre environ 6,4 et 7,6, de préférence à un pH de 7 + 0,5 ou, mieux encore, égal à environ 7, à une température d'environ 4 à 300C, de préférence d'environ 4 à 200C, pendant une durée d'environ 30 minutes à 24 heures, et, si on le désire, tout en agitant ou en secouant. Le contact est réalisé à une concentration des particules de latex comprise de préférenceentre environ de 0,05 et 3 % en volume ou, mieux encore, entre environ 0,5 et 1 % en volume, et à une concentration en la NADase comprise de préférence entre environ 100 et 1000 u/ml.

Après avoir sensibilisé les particules de latex avec la NADase de la manière décrite ci-dessus il est également possible de saturer la partie non adsorbée de la NADase sur la surface des particules de latex en traitant lesdites particules de la même façon avec, par exemple, de l'albumine sérique de bovin (BISA)
La réaction de revêtement terminée; on lave le mélange réactionnel avec, par exemple, du tampon PBS
La NADase non adsorbée par les particules de latex peut être éliminée complètement par lavage.

La composition ainsi obtenue1 qui est cons-tituée de particules d'un latex polymère sxnthétique revêtues de NADase, peut etre utilisée, sous la forme d'une suspension dans un diluant, pour le dosage de l'ANADase
La composition est de préférence utilisée sous la forme d'une suspension dans le diluant a une concentration de l'ordre d'environ 0,25 à 0,5 % en volume Comme diluant on peut utiliser celui que l'on obtient en ajoutant environ 0,1 % de BSA à une solution de chlorure de sodium tamponnée par de la glycine ou à une solution de chlorure de sodium tamponnée par du phosphate, à laquelle on a en outre ajouté de 0,01 à 0,5 % deazoture de sodium (NaN3) e
Les particules de latex enduites de NADase, obtenues comme décrit ci-dessus, sont stables. Elles peuvent être conservées au réfrigérateur sous la forme d'une suspension dans le diluant, ou encore elles peuvent être lyophilisées.

Lors de la lyophilisation on peut ajouter au diluant, en tant que stabilisants, divers amino-acides, de préférence la glycine ou le glutamate de sodium, et/ou le dextrane, en des quantités de 0,2 à 2 % en poids dans le cas des amino acides et de 0,3 à 3 % en poids dans le cas du dextrane, après quoi les particules de latex enduites de NADase peuvent être congelées rapidement dans de l'azote liquide ou de l'air liquide, puis être lyophilisées0 La durée de préservation est encore prolongée par lyophilisation, et les particules de latex revêtues de l'antigène qui ont été lyophilisées peuvent ordinairement être conservées pendant environ 2 ans ou davantage.

Par ailleurs le produit lyophilisé peut être utilisé de la même manière qu'un produit frais, simplement par addition d'un diluant et d'un dissolvant.

Comme les particules de latex revêtues de
NADase, conformément à l'invention, sont agglutinées par l'ANADase on ajoute les particules de latex à un prélèvement d'humeur humaine, par exemple du sérum humain even- tuellement dilué, et on les laisse réagir avec l'ANADase.

On peut ensuite lire les configurations d'agglutination.

L'invention a également pour objet un procédé pour mettre en évidence (analyse qualitative) ou pour doser (analyse quantitative) l'ANADase dans le sérum humain à l'aide de la réaction précédente, procédé selon lequel on utilise une composition comprenant des particules d'un latex polymère synthétique et, appliquée en revêtement sur ces particules, de la NADase.

Pour l'analyse on peut avoir recours à des moyens connus : par exemple la teneur sérique en ANADase peut être déterminée facilement par la méthode de microtitrage, Selon cette méthode on introduit une quantité donnée d'un diluant, en portions, dans une plaque de micro-analyse, on introduit ensuite dans la première cavité de la plaque une quantité donnée de l'échantillon à analyser, qui est par exemple du sérum, et on réalise au moyen d'un dilueur une série de dilutions de deux en deux.

Après cela on ajoute et on mélange une quantité donnée des particules de latex revêtues de NADase. On laisse reposer les mélanges pendant une durée déterminée à la température ambiante et on observe ensuite les points finals d'agglutination.

Comme diluant pour la série de dilutions mentionnée ci-dessus on peut utiliser celui que l'on obtient en ajoutant environ 0,1 % de BSA à une solution de chlorure de sodium tamponnée par de la glycine ou à une solution de chlorure de sodium tamponnée par du phosphate, à laquelle on a en outre ajouté de 0,01 à 0,05 e d'azoture de sodium (NaN3)
La présente composition pour le dosage de l1ANADase, sous la forme d'un latex ou d'un produit séché, a les très grands avantages suivants. Il ne risque pas d'y avoir un anticorps contre le support. En fait on n'a jamais fait d'observation en ce sens. Par conséquent l'humeur essayer n'a pas besoin d'être soumise à un quelconque traitement préalable et il n'est pas non plus nécessaire d'effectuer un essai pour confirmer le résultat d'un tel prétraitement. Le dosage lui-meme consiste simplement à mettre l'humeur, diluée ou non, dans une cavité d'une plaque de micro-analyse, puis à ajouter le latex goutte à goutte. Ainsi, le dosage de l'ANADase peut être effectué sans la moindre difficulté par une opération très simple, et aucune technique spéciale n'est nécessaire. En outre, la NADase ayant subi une purification très poussée, elle est extrêmement spécifique. De plus la sensibilité de l'essai est pleinement satisfaisante pour l'analyse de l'humeur humaine.Elle est de plus de 10 fois supérieure à celle de la méthode enzymatique mentionnée plus haut, c'est-à-dire la seule méthode usuelle, Ajoutons à cela qu'il est possible d'effectuer simultanément sur plusieurs échantillons les analyses qualitatives et quantitatives.

La détermination de la concentration d'une humeur en ANADase, qui devait être effectuée jusqu'à présent par la méthode enzymatique compliquée, peut dès lors être exécutée facilement, rapidement, à bon compte et par une technique simple si l'on se sert des particules de latex revêtues de NADase conformes à la présente invention. I1 devient ainsi possible d'effectuer une analyse étiologique précise de malades, aussi bien pour évaluer les résultats .de traitements administrés que pour déterminer le pronostic de la maladie. En outre, le dosage de 1'ANADase, que la méthode enzymatique usuelle ne permettait pas d'effectuer de manière courante ou routinière, peut maintenant être exécuté n'importe où, facilement et à peu de frais, comme essai de routine.La contribution apportée au diagnostic par la présente invention est donc extrêmement grande.

Ayant constaté que le latex revêtu de NADase ne réagit qu'avec l'ANADase (anticorps), donc ne réagit pas du tout avec des anticorps autres que l'ANADase, et qu'un latex non revêtu ne réagit ni avec l'ANADase (anticorps) ni avec des anticorps autre que l'ANADase, on peut affirmer que la NADase est fixée à ce latex sous la forme d'un revêtement.

Les exemples suivants, certains relatifs à la préparation, d'autres à l'application, illustrent la présente invention.

Préparation de la NADase.

On ensemence avec Streptococcus pyogenes, souche Richards, un erlenmeyer de 5 litres contenant 1 litre d'un bouillon de Todd-Hewit (produit des Laboratoires Difco,
Etats-Unis d'Amérique), et on cultive ce micro-organisme en laissant reposer le milieu ensemencé pendant 18 heures à 370C. La culture terminée, on centrifuge le bouillon à 10 000 tpm pendant 30 minutes, puis on prélève le surnageant, que l'on nomme "filtrat de culture". On ajoute du sulfate d'ammonium à ce filtrat jusqu'd la semi-saturation, on sépare le précipité qui s'est ainsi formé, on le dissout dans de l'eau distillée et on le dialyse.On l'applique ensuite sur une colonne (1,5 x 33 cm) garnie de 2',51ADP-Sepharose 43 (produit de Pharmacia Fine Chemicals,
Suède), on lave avec un tampon Tris 0,02 M (pH 7,4), puis on élue avec un tampon Tris 0,02 M contenant 1,0 M de NaCl. Après avoir séparé la fraction NADase on effectue une filtration sur qel au moyen de Sephadex G-200 pour séparer une fraction NADase. On relargueensuite avec du sulfate d'ammonium à une concentration égale à 8/10 de la concentration de saturation, on dissout le précipité dans de l'eau distillée, puis on dialyse : on obtient ainsi 10 ml d'une solution contenant 2,8 x 105 unités de
NADase. Dans cet échantillon il est impossible de détecter la présence de hyaluronidase, de streptokinase, de streptolysine 0 et de DNase.

EXEMPLE 1
Sensibilisation de particules de latex avec
la NADase,
(1) Avec du pBS1) M/60 de pH égal à 7,2 on dilue une suspension à 5 % de Latex SDL 59 (produit de Takeda ChemicalCompany) pour obtenir une suspension à 0,25 %.

On mélange ensuite avec cette suspension un volume de NADase diluée à 500 u/ml avec du PBS, et on effectue la sensibilisation à la température ambiante pendant 3 heures. Durant tout ce temps on secoue souvent le mélange légèrement.

(2) On lave ensuite le latex trois-fois avec PBS, puis on le met en suspension dans un volume d'un diluant2) pour préparer le latex sensibilisé.

(3) Si on le désire on peut lyophiliser le latex sensibilisé en le mettant en suspension dans 0,2 volume d'un milieu lyophilisant3), puis en refroidissant brusquement la suspension dans de l'azote liquide et enfin en lyophilisant.

1) PBS
Tampon au phosphate M/15, pH 7,2 25 ml
Soluté physiologique 75 ml
Azoture de sodium 0,1 g
2) Diluant
PBS 100 ml
Albumine sérique de bovin 0,07 g
Azoture de sodium 0,1 g
3) Milieu lyophilisant
Diluant 100 ml
Glycine 0,5 g
Dextrane (poids moléculaire
de 200 000 à 300 000, de
Dai-ichi Chemical Co.) 0,7 g.

EXEMPLE 2
Réaction d'agglutination passive du latex,
obtenue avec un latex réactif conforme à
1' invention
I. Réaction d'agglutination par la méthode de
microtitrage.

(1) Lorsqu'il y a des corps solides dans le liquide à étudier, par exemple le sérum ou une autre humeur, on les élimine par centrifugation, mais, à part cela, le liquide ne subit aucun traitement.

(2) Lorsque le latex réactif est un produit lyophilisé on le dissout en ajoutant un diluant.

(3) Le dosage de l'anticorps correspondant à la NADase (anti NADase ou ANADase) est effectué de la façon suivante. Sur une plaque de micro-analyse (qui peut etre du type en U ou du type en V) on introduit des fractions de 0,025 ml d'un diluant dans chacune des cavités, au moyen d'un compteoutte de 0,025 ml. On ajoute ensuite, au diluant contenu dans la première cavité, 0,025 ml du liquide à étudier. Après avoir effectué une dilution en série de deux en deux avec un dilueur on introduit goutte à goutte le latex réactif, en une quantité de 0,025 ml, dans chacune des cavités. Après avoir bien remué les mélanges on les laisse reposer pendant la nuit à la température ambiante.

Le lendemain on évalue les configurations d'agglutination au fond des cavités : l'inverse de la dilution maximale du liquide essayé qui présente une agglutination positive est nommée "titre d'anticorps"
Si l'on ne veut effectuer qu'une analyse qualitative il suffit d'introduire goutte à goutte 0,025 ml du latex dans la cavité où l'on n'a versé que 0,025 ml du liquide à assayer, puis d'estimer la configuration d'agglutination de la même façon que ci-dessus.

II. Réaction d'agglutination sur lamelle de
terre.

On laisse tomber une goutte de sérum sur une lamelle de verre et, après avoir laissé tomber une goutte du latex réactif sur celle-ci, on étale les deux avec, par exemple, un cure-dent de manière à couvrir un carré de 2 cm. On secoue doucement la lamelle pendant 3 minutes, puis on examine s'il y a eu ou non agglutination. L'agglutination traduit la présence d'un anticorps, tandis que la non-agglutination montre qu'il n'y a pàs d'anticorps.

Lorsque le résultat est positif il est conseillé d'effectuer une autre détermination par la méthode de microtitrage.

(voir tableau pane suivante)
Comparaison de la méthode enzymatique avec la
méthode,conforme à l'invention, d'agglutination
passive du latex, effectuée selon la techniaue
de microtitrage.

Concentration de
l'antigène sensi- Valeur anticorps
bilisant
100 200 400 800 1600 3200 Diluant
800 u/ml + + + + + -
400 u/ml + + + + + - -
200 u/ml + + + + + - -
100 u/ml + + - - - - -
50 u/ml - - - - - - -
+ * agglutination, c'est-à-dire indication positive
- : non-agglutination, c'est-a-dire indication négative.

L'anticorps utilisé dans ce cas est un sérum de malade ayant un titre de 160, déterminé par la méthode enzymatique.

Ainsi qu'on le voit sur ce tableau, le procédé d'agglutination du latex se montre à peu près dix fois plus sensible que le procédé enzymatique En outre il donne un résultat tout à fait négatif avec le solvant. De même, un latex non sensibilisé donne un résultat négatif. Par ailleurs la réaction est spécifique, ainsi que le montre le fait que la valeur anticorps ne peut pas être détectée, que ce soit par la réaction d'agglutination ou par la réaction enzymatique, lorsque l'anticorps est neutralisé à l'avance par l'addition de NADase purifiée

Claims (8)

REVENDICATIONS

1.- Composition pour doser l'anticorps antinicotinamide-adénine-dinucléotidase streptococcique, composition caractérisée en ce qu'elle comprend des particules d'un latex polymère synthétique dont la surface est revêtue de nicotinamide-adénine-dinucléotidase streptococciaue.

2.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les particules du latex ont un diamètre particulaire moyen compris entre 0,01 et lOftm.

3.- Composition selon la revendication 2, caractérisée en ce que les particules du latex ont un diamètre particulaire moyen compris entre 0,1 et l > *m.

4.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les particules du latex ont une densité comprise entre 0,9 et 1,4

5.- Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que les particules du latex ont une densité comprise entre 1,1 et 1,3.

6.- Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que les particules du latex de polymère synthétique sont des particules d'un polymère ou d'un copolymère dérivant d'un ou plusieurs monomères pris dans l'ensemble constitué par le styrène, le chlorostyrene, les alkylstyrenes, le vinyltoluène, la vinyl-pyrrolidone, le divinylbenzène, les acrylates d'alkyles, les méthacrylates d'alkyles, l'acrylonitrile, le chlorure de vinyle, l'acétate de vinyle, le butadiène et le chlorure de vinylidène, ou de produits carboxylés et de produits carboxylés et aminés dérivant de ces polymères ou copolymères.

7.- Procédé pour doser l'anticorps anti nicotinamide-adénine-dinucléotidase streptococcique, procédé caractérisé en ce qu'on met un échantillon de l'humeur en contact avec une composition-comprenant-des particules d'un latex synthétique dont la surface est revêtue de nicotinamide-adénine-dinucléotidace streptococcique..

8.- Procédé selon la revendication 7, carac térisé en ce que le dosage est effectue par la méthode de microtitrage.