FI96040C - Fermentointimenetelmä ihmisen seerumialbumiinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

5 96040

Fermentointimenetelmä ihmisen seerumialbumiinin valmistamiseksi - Fermenteringsförfarande för framställning av human serumalbumin Tämä keksintö koskee parannettuja fermentointimenetelmiä, ja erityisesti menetelmää, jolla lisätään ihmisen seerumin albumiinin (tästä lähtien "albumiini") määrää, jota tuotetaan fermentoimalla albumiinia väliaineeseen erittämään kykene-10 vää, rDNAita sisältävää mikro-organismia.

Albumiini on veriplasman pääkomponentti, ja sitä voidaan käyttää plasman tai seerumin korvikkeena palovammoja, verenvuodon aiheuttaman shokin ja muiden tilojen hoidossa. On 15 kuvattu menetelmiä, joissa albumiinia voidaan tuottaa fer-mentoimalla mikro-organismeja, joihin on lisätty albumiini-geeni yhdistelmä-DNA-teknologialla (GB-A-2 147 903).

Tällaiset organismit muodostetaan edullisesti erittämään al-20 bumiinin ympäröivään kasvatusnesteeseen, koska solunsisäinen albumiini, yhteisesti monien muiden heterologisten proteiinien kanssa, muodostuu ei-aktiivisessa, ei-liukoisessa muodossa, josta natiiviproteiini on saatavissa vain hyvin vaikeasti (katso esimerkiksi: M. Latta et ai; Bio/Technology 5 25 (1987) 1309-1314). Valmistusprosessin tuottavuuden maksimoi- miseksi on suotavaa kasvattaa mikro-organismeja kiivaasti sekoitetussa fermenttorissa solujen ja tuotteiden suurten konsentraatioiden saavuttamiseksi. Epäonneksi nämä olosuhteet jättävät eritetyn proteiinin alttiiksi fysikaaliselle, 30 kemialliselle ja entsymaattiselle hajoamiselle väliaineessa niin, että fermenttorissa tuotetun albumiinin määrä on pal- . jon pienempi kuin mitä voitaisiin odottaa organismien toi- * minnasta vähemmän voimaperäisissä olosuhteissa.

35 Nyt on keksitty, että määrättyjen kemiallisten reagenssien lisäys on tehokas eritetyn albumiinin konsentraation nostamiseen erityisesti minimaalisessa väliaineessa (ts. kasva-tusvällaineessa, joka ei sisällä kompleksisia orgaanisia 2 96040 typpilähteitä). Erityisesti määrättyjen vaahtoamisenestoai-neiden lisäyksellä määriin, jotka ylittävät paljon normaaliin vaahtoamisen kontrolliin vaaditut määrät, on tämä stabiloiva vaikutus. Tehokkaisiin reagensseihin kuuluvat poly-5 propyleeniglykoli (keskimääräinen molekyylipaino 2000) ja "polyrisinaatti" (risiiniöljyrasvahappojen ja etyleenioksi-din kondensaatti, jota tuottaa Croda Chemicals).

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa pa-10 tenttivaatimuksissa.

Voidaan käyttää mitä hyvänsä sopivaa polyalkyleenipolymeeriä tai -sekapolymeeriä toisen yhdisteen kanssa, esimerkiksi po-lyetyleeniglykolia; polypropyleeniglykolia; polysorbaatti 15 80:tä; etyleenioksidin ja propyleenioksidin sekapolymeerejä; ja etyleenioksidin ja/tai propyleenioksidin sekapolymeerejä muiden yhdisteiden, kuten rasvahappojen, rasva-alkoholien, sokerien ja polyolien, esimerkiksi sokerialkoholien (esimerkiksi sorbitolin), etyleeniglykolin, pentaerytritolin ja 20 glyserolin kanssa.

Polyoksipropyleenipolymeereillä on yleinen kaava HO- (CH2-CH(CH3) -O)n-H. Sopiviin polyoksietyleeni/polyoksipro-pyleeni-sekapolymeereihin kuuluvat sellaiset, jotka voidaan 25 esittää kaavalla X-(O-(CH2-CH(CH3)-O)m-(CH2-CH20)n-H)L, jossa ;· X on polyoli, joka sisältää 1 hydroksyyliryhmää, 1 on 2-6, m on 10-30 ja n on 0-10. Toisessa sopivassa yhdistesarjassa käytetään polyetyleeniglykolia, kuten polyolia, jossa on kaksi saatavilla olevaa hydroksyyliryhmää, jotka molemmat 30 ovat korvattavissa ryhmällä -O (CHj-CH(CH3)-0)n-H, jossa kukin n on sama tai erilainen.

*

Kaikkia edellä mainittuja yhdisteitä ja yhdisteluokkia kutsutaan tässä nimellä "polyoksialkyleeniyhdisteet". Nämä yh-35 disteet ovat tavallisesti, mutteivät aina, vaahtoamisenes- toyhdisteitä. Mikäli tällaisella yhdisteellä ei ole vaahtoa-misenesto-ominaisuuksia, niin käsite "ylimäärä verrattuna • « • · 3 96040 määrään, joka vaaditaan ei-toivotun vaahtoamisen määrän ehkäisemiseen" tarkoittaa määrää, joka on suurempi kuin 0.

Sopivia yhdisteitä ovat mm. kauppanimillä "Darastil" (esi-5 merkiksi "Darastil 8231") (Grace Dearborn Ltd, Widnes,

Cheshire, Iso-Britannia) ja Breox FMT30 (Water Management Chemicals Ltd, Kidderminster, Worcs, Yhdistynyt kuningaskunta) .

10 Mikrobitermentoinnin suuria solutiheyksiä saavutetaan tavallisesti syöttöpanosreaktorikasvatuksella. Näissä olosuhteissa fermenttori on prosessin alussa osittain täynnä ja sisältää vain pienen osan hiilisubstraatista. Fermentoinnin edetessä lisätään vaiheittain konsentroitua hiilisubstraattili-15 uosta, ja mahdollisesti muita ravinteita. Vaahtoamisenesto-aineet ovat tällaisissa prosesseissa tavallisia apuneuvoja, jolloin vaahtoamisen kontrolli saavutetaan fermenttorin huippua lähellä sijaitsevalla sensorilla, joka käynnistää vaahtoamisenestoaineen vaahtoa havaittaessa. Koska ferment-20 tori on alussa vain osittain täytetty, lisätään fermentoinnin alkuvaiheissa vain hieman tai ei lainkaan vaahtoamisen-estoainetta, ja vasta prosessin edetessä loppua kohden, astian täyttyessä, vaahdon huippu todennäköisesti yltää sensoriin ja käynnistää sen. Tyypillisiä käyttömääriä ovat 25 0,02-0,2 g/1 fermentointikasvatusliuosta. Vastakohtana tässä ;· kuvatussa prosessissa stabilointiaineita lisätään fermen toinnin alusta (tai aikaisessa vaiheessa). Reagenssi voidaan lisätä joko yhtenä ainoana annoksena fermentoinnin alussa tai lähellä sitä, tai ajoittain sarjana eriä prosessin läpi. 30 Tällä tavalla on mahdollista pitää yllä toisaalta solubio-massan tai albumiiniin ja toisaalta reagenssin välisiä likimääräisiä suhteita.

•

Voidaan käyttää yhtä tai useampia stabilisaattoriyhdisteitä. 35 Tässä prosessissa käyttömäärät ovat sellaisia, että ne tuottavat stabilisaattorin (tai stabilisaattoreiden kokonaismäärän, jos useampia kuin yhtä käytetään) konsentraation välil-• lä 0,5 ja 10 g/1 (edullisesti 1-5 g/1). Vaikka syöttöpanos- 4 96040 reaktorikasvatuksen käyttö on erityisen soveliasta suurten solutiheyksien tuottoon heterologisten proteiinien tuotannossa, ei prosessi rajoitu tämän tyyppiseen fermentointiin. Näiden reagenssien käyttöä näillä konsentraatioilla voidaan 5 soveltaa myös albumiinin tuottoon yksinkertaisessa panoskas-vatuksessa tai jatkuvatoimisessa kasvatuksessa. Jäljemmässä tapauksessa reagenssia voidaan lisätä jatkuvasti tai ajoittain pitämään yllä konsentraatiota toivotulla alueella 0,5-10 g/1 (edullisesti 1-5 g/1).

10

Keksinnön mukaisten stabilisaattoreiden käyttö on havaittu edulliseksi suhteellisen pienisaantoisilla hiivakannoilla. Määrätyillä hiivakannoilla, jotka tuottavat suurempia albu-miinisaantoja, edullinen vaikutus voi olla vähemmän merkit-15 tävä jos fermentointitapa on sellainen, että sillä tuotetaan suuria solutiheyksiä, mutta se on edelleen havaittava, jos tuotetaan alhaisempia solutiheyksiä. Albumiini voi olla luonnollisesti esiintyvä tai albumiinin modifioitua muotoa, mukaanlukien niiden fragmentit, sillä ehdolla, että yhdiste 20 säilyttää ainakin yhden HSA:n ominaispiirteen, esimerkiksi sen turvotus- tai ligandinsitomisominaisuudet tai sen käytön laboratoriovällaineena. Erityisesti albumiini voi olla EP-patenttihakemuksessa 322 094 esitetty. Eritystä voi välittää mikä hyvänsä sopiva signaalisekvenssi, esimerkiksi pre-HSA-25 sekvenssi tai hiivan a-faktorisignaalisekvenssi.

Mikro-organismi voi olla mikä hyvänsä organismi (mukaan lukien eläin- ja kasvisoluviljelmät), joka erittää albumiinia fermentointiväliaineeseen, kuten sopivat bakteerikannat 30 (esimerkiksi Bacillus tai Streptomyces spp.) tai hiivat (kuten Saccharomyces cerevisiae tai Kluvveromyces lactis). Al-bumiinia erittävät hiivat ja niiden fermentointi albumiinin tuottamiseksi on esitetty EP-patenttihakemuksissa 322 094 ja 201 239.

35

Esimerkki 1. Albumiinin stabilointi fermentointiväliaineessa Laboratoriofermenttori täytettiin puoleen nimellisestä työ-• tilavuudestaan alku-"panos"-väliaineella, joka sisälsi 50 5 96040 ml/1 suolaseosta (sisältäen 114 g/1 KH2P04f 12 g/1 MgS04, 3,0 g/1 CaCl2*6H20, 2,0 g/1 Na2EDTA; 10 ml/1 hivenaineliuosta, joka sisälsi 3 g/1 ZnS04-7H20, 10 g/1 FeS04-7H20, 3,2 g/1 MnS04· 4H20, 79 mg/1 CuS04-5H20, 1,5 g/1 H3B03, 0,2 g/1 KI, 0,5 5 g/1 Na2Mo04· 2H20, 0,56 g/1 CoC12-6H20, 75 ml/1 H3P04; 20 g/1 sakkaroosia; 50 ml/1 vitamiiniseosta, joka sisälsi 1,6 g/1 Ca-pantotenaattia, 1,2 g/1 nikotiinihappoa, 12,8 g/1 m ino-sitolia, 0,32 g/1 tiamiini-HCl, 0,8 g/1 pyridoksiini·HC1 ja 8 mg/1 biotiinia. Yhtä suurta tilavuutta "syöttö"-väliainet-10 ta, joka sisälsi 100 ml/1 suolaseosta, 20 ml/1 hivenaineliuosta, 500 g/1 sakkaroosia ja 100 ml/1 vitamiiniliuosta, pidettiin erillisessä säiliössä, joka oli yhdistetty ferment-toriin mittapumpulla.

15 500 mg/1 albumiinia lisättiin fermenttoriin, joka oli siir- rostettu Saccharomyces cerevisiaella. pH pidettiin arvossa 5,7 ± 0,2 ammoniakin tai rikkihapon automaattisella lisäyksellä, lämpötila pidettiin 30°C:ssa, ja sekoittimen nopeus säädettiin antamaan liuenneen hapen osapaineen (DOT) > 20-% 20 ilmakylläisyysasteen ilmavirtanopeudella 1 tilavuus/tila- vuus/min. Kun alkuperäinen substraatti oli kulutettu, mitta-pumppu käynnistettiin, pitäen yllä kasvunopeutta noin 0,15 h'1. Pumpun nopeutta kasvatettiin tämän kasvunopeuden ylläpitämiseksi, kunnes sekoittimen nopeus saavutti maksi-25 miarvonsa, jossa pisteessä pumpun nopeuden lisääminen oli mahdotonta aiheuttamatta DOT:n laskemista alle 15-% ilmakyl-läisyyteen, joka oli pienin sallittu arvo. PPG 2000:ta lisättiin vasteena vaahtosensorille. Sitä ei lisätty lainkaan, ennen kuin yli 50 % syöttöliuoksesta oli lisätty. Lisäyksen 30 lopputaso oli 0,2 g/1. Biomassakonsentraatio fermentoinnin lopussa oli 93 g/1. Noin 90 % albumiinista, joka oli läsnä .’ alunperin, oli hajonnut 24 h sisällä syötön alkamisesta.

Seuraavassa kokeessa muuten identtisissä olosuhteissa PPG:tä 35 lisättiin fermentoinnin alussa määrä 1 g/1. Fermentoinnin eteneminen oli hyvin samanlainen, saavuttaen lopullisen kuivapainon 94 g/1, mutta tässä tapauksessa albumiinin hajoaminen väheni myöhemmin niin, että fermentoinnin lopussa noin 6 96040 60 % alunperin läsnä olevasta albumiinista oli hajoamattomana.

Esimerkki 2. Eritetyn albumiinin konsentraation kasvattami-5 nen Järjestettiin koesarja edellä kuvattua syöttöpanosreaktori-kasvatustapaa käyttäen modifioiden siten, että tässä tapauksessa pumpun nopeutta lisättiin automaattisesti tietokone-kontrollijärjestelmää käyttäen, joka tarkkaili myös hengi-10 tysosamäärää (RQ) niin, että syöttönopeutta alennettiin, jos RQ ylitti 1,2. Tällä tavalla vältetään "Crabtree"-affektista johtuva saannon aleneminen. Fermenttorit siirrostettiin kaikissa tapauksissa Saccharomyces cerevisiaella. joka sisälsi plasmidin, joka koodittaa eritetyn albumiinin tuotantoa.

15 Vaahtoamisenestoaineen lisäykseen käytettiin seuraavia työtapoja, jolloin saatiin seuraavat tulokset.

Esimerkki 2A (vertaava esimerkki) PPG 2000:ta lisättiin ainoastaan vasteena vaahtosensorille. 20 Fermentoinnin alussa ei lisätty lainkaan, kasvattaen määrään 0,1 g/1, kun 10 % syötöstä oli lisätty, ja kohottaen sitten lopulliseen tasoon 0,2 g/1 syötön viimeisen 50 %:n aikana. Lopullinen biomassa oli 84 g/1, ja albumiinitasoksi havaittiin mielivaltaisella skaalalla 1,0 yksikköä.

25

• Esimerkki 2B

Polyrisinaattia lisättiin tasoon 1,5 g/1 fermentoinnin alussa, lisäten edelleen tasoon 2,2 g/1, kun 35 % syötöstä oli lisätty, lisäten edelleen pitämään yllä tason 2,5 g/1, kun 30 syöttö oli lähes lopussa. Edelleen lisäys sen jälkeen, kun syöttö oli loppunut, nosti lopullisen tason 3,5 g/1:aan.

:* Lopullinen biomassa 83 g/1, albumiinitaso 3,81 yksikköä.

Esimerkki 2C

35 PPG 2000:ta lisättiin alkuarvoon 1 g/1, lisäten edelleen sen jälkeen, kun 50 % ja 80 % syötöstä oli lisätty, tämän kon-sentraation ylläpitämiseksi. Lopullinen biomassa 88 g/1, albumiinikonsentraatio 4,2 yksikköä.

Il 7 96040

Esimerkki 3. Eritetyn albumiinin konsentraation kasvattaminen (toinen tapaus) Järjestettiin sarja syöttöpanosreaktorifermentointeja esimerkin 2 tavan mukaisesti paitsi, että käytettiin eri S_s_ 5 cerevisiae-kantoi a (mutta jotka edelleen sisälsivät plasmi- din albumiinin erittämiseksi). Vaahtoamisenestoaineita lisättiin esimerkin 2C tavalla, jolloin saatiin seuraavat tulokset .

10 Vaahtoamisenesto- Biomassa Albumiinikonsentraatio aine (g/1) (mielivaltaista yksikköä) maapähkinäölj y 95,4 1,0

Crill 1 86,8 0,8 15 Breox FMT30 81,8 3,2

Darstil 8231 81,6 2,5

On ilmeistä, että polyalkeenioksidiperäiset vaahtoamisenes-toaineet (Darastil 8231 ja Breox FMT30) tuottivat muita suu-20 remmat albumiinisaannot.

• ·

Claims (7)

96040

1. Menetelmä ihmisen seerumialbumiinin valmistamiseksi fermentoimalla albumiinia erittävää mikro-organismia sopivassa väliaineessa niin, että albumiini erittyy väliainee- 5 seen, tunnettu siitä, että väliaineeseen lisätään fermen-toinnin alussa tai aikaisessa vaiheessa polyoksialkyleeni-yhdistettä antamaan keskimääräinen taso yli 0,2 g/1, joka on ylimäärä verrattuna määrään, joka vaaditaan ei-toivottujen vaahtoamisen määrien ehkäisemiseen. 10

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polyoksialkyleeniyhdistettä lisätään antamaan keskimääräinen taso 1,0-6,0 g/1.

3. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että polyoksialkyleeniyhdiste on vaahto-amisenestoyhdiste.

4. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel-20 mä, tunnettu siitä, että polyoksialkyleeniyhdiste on poly- propyleeniglykoli; risiiniöljyrasvahappojen ja etyleenioksi-din kondensaatti; propyleenioksidin ja etyleenioksidin seka-polymeeri polyolin kanssa; tai propyleenioksidi/polyetylee-niglykoli-sekapolymeeri. 25

5. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi on hiiva.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu sii-30 tä, että hiiva on Saccharomyces cerevisiae.

: 7. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että väliaine on minimaalinen väliaine. II 9 96040