FI94533C - Menetelmä uuden antibiootin N-asetyylibenanomisiini B:n valmistamiseksi - Google Patents

Description

94533

Menetelmä uuden antibiootin N-asetyylibenanomisiini B:n valmistamiseksi

Keksintö kohdistuu menetelmään uuden antibiootin eli N-asetyylibenanomisiini B:n valmistamiseksi, jolla on sekä sieniä torjuvaa aktiivisuutta että viruksia torjuvaa aktiivisuutta, ja jota voidaan käyttää hoitavana sieniä torjuvana aineena sekä myös viruksia torjuvana aineena ja joka voi myös olla suolanaan tai esterinään.

Alalla tunnetaan jo useita antibiootteja, mutta uusia antibioottisia aineita tarvitaan yhä sekä farmaseuttisia sovellutuksia että maataloudessa käyttöä varten. Sellaisista yhdisteistä, jotka ovat molekyylirakenteensa suhteen oheisessa keksinnössä aikaansaadun uuden, sekä sieniä että viruksia torjuvan antibiootin eli N-asetyylibenanomisiini B:n kaltaisia, voidaan mainita benanomisiini A ja benanomisiini B sekä deksylosyylibenanomisiini B, joita oheiset keksijät ovat jo aikaisemmin saaneet aikaan uusina yhdisteinä (katso japanilaiset patenttihakemukset 277 692/87 ja 327 163/87, jotka on julkaistu "Kokai"-julkaisuina 121 293/83, julkaistu 12. toukokuuta 1989, sekä 254 694/89, julkaistu 11. lokakuuta 1989, vastaavasti, sekä niitä vastaava eurooppalainen patenttijulkaisu 0 315 147 A2, julkaistu 10. toukokuuta | 1989, sekä vastaava US-patenttijulkaisu SN 264 888, jätetty 31. lokakuuta 1988). Lisäksi alalla tunnetaan KS-619-l-aine [Matsuda et ai., Journal of Antibiotics. 40, 1104-1114 (1987)], G-2N-aine ja G-2A-aine [Gerber et ai., Canada. J.

Chem.. 62, 2818-2821 (1984)] sekä pradimisiinit A, B ja C [Oki et ai., Journal of Antibiotics. 41, 1701-1704 (1988); Tsunakawa et ai., J. Orq. Chem.. 54, 2532-2536 (1989); sekä eurooppalainen patenttihakemus, jonka julkaisunumero on 0 277 621]. Näistä yhdisteistä benanomisiini B vaikuttaa samanlaiselta kuin pradimisiini C niiden rakennetutkimusten perusteella.

2 94533

Alalla tunnetaan jo lukuisia antibiootteja, joita mikro-organismit tuottavat. Näiden tunnettujen antibioottien joukossa on kuitenkin vain muutama sellainen, joilla on käyttökelpoista sieniä torjuvaa aktiivisuutta, ja joiden toksisuus nisäkkäille on pieni. Näin ollen olemassa on jatkuva tarve löytää uusia sieniä torjuvia antibiootteja, joita voidaan käyttää erilaisten, eläimissä, ihminen mukaan lukien, esiintyvien sieni-infektioiden hoitamiseen.

Toisaalta ihmisen immuunikato (josta käytetään usein pelkkää lyhennettä "AIDS") on todettu sairaudeksi, joka johtuu siitä, että ihmisveressä läsnäoleva taudinaiheuttajavirus on infektoi-nut ihmisen T-solut. Tätä virusta, joka aiheuttaa ihmisessä immuunikadon, kutsutaan usein ihmisen immuunikatovirukseksi, josta käytetään lyhennettä HIV. Alalla on esitetty, että tiettyjä tunnettuja yhdisteitä voidaan käyttää HI-virusta inakti-voivana aineena tai HI-virusta torjuvana aineena. Yksikään näistä yhdisteistä ei ole kuitenkaan välttämättä immuunikatoa tyydyttävästi parantava aine, ja näin ollen olemassa on huomattava tarve kehittää ja saada aikaan sellainen uusi lääkeaine, jonka toksisuus on pieni, mutta joka on hyvin aktiivista HI—viruksen inaktivointia ajatellen, ja jota voidaan käyttää lääkkenä immuunikadon hoitamiseksi tai ennaltaehkäisemiseksi.

Oheisten keksijöiden aikaisemmissa keksinnöissä ollaan saatu aikaan kaksi antibioottia eli benanomisiini A ja beanomisiini • ♦ B, joilla kummallakin on sieniä tojuvaa aktiivisuutta sekä HI-virusta inaktivoivaa aktiivisuutta, sekä menetelmä benanomisi ini en A ja B tuottamiseksi viljelemällä Actinomvcetes— kantaa MH193—16F4 (talletettu tunnuksella FERM BP-2051; katso edellä mainittu eurooppalainen patenttihakemus, jonka julkaisu-numero on O 315 147 A2 sekä sitä vastaavaa US-patenttihakemusta SN 264 88Θ). Samoin aikaan on saatu aktiivisena aineenaan bena-nomisiinia A tai benanomisiinia B käsittävät farmaseuttiset * koostumukset HI—viruksen inaktivoimiseksi (katso japanilainen patenttihakemus 206346/88, jätetty 22. elokuuta 1988, sekä sitä vastaava eurooppalainen patenttihakemus 89.402315.9, jätetty 21. elokuuta 1989, sekä US-patenttihakemus SN.394 539, jätetty ·· 3 94533 16. elokuuta 1989). Seuraava kaava (II) esittää benanomisiinin B kemiallista rakennetta: , CH.

45 l’l

CONHCHCOOH

(R) t Λ2. «J % JJ<,

(| |J

J lv /.v 5^ a0H 0 ** OH o Λ ΗχΝ t„_ / (II) 0Η'Λ^^"°\ , /

Oheisessa keksinnössä ollaan nyt todettu, että kun benanomi-siini B:n 4"-asemassa oleva aminoryhmä asetyloidaan kemiallisesti, niin tällöin voidaan tuottaa kaavan (I) mukaista N—ase-tyyli benanomisi iniä B: CKs CONHCHCOOH I (R) 0 HO Η0^γί::|'-&Η5 w3 co Η0Λ^°\“3“/ jonka toksisuus on pienempi lähtöyhdisteeseen eli benanomisiini B:hen verrattuna, ja jonka sieniä torjuva aktiivisuus eräitä sieni kantoja vastaan on myös parantunut lähtöyhdisteeseen eli benanomisiini B:hen verrattuna. Keksinnön puitteissa ollaan samoin todettu, että N-asetyylibenanomisiini B:n viruksia tor— * juva aktiivisuus on parantunut tämän yhdisteen sieniä torjuvan aktiivisuuden lisäksi. Keksinnön puitteissa on tutkittu N-asetyyl i benanomisi ini B:n fysikokemiallisia ja biologisia ominai — «'< suuksi a, ja nämä tutkimukset ovat vahvistaneet sen, että N— • · 4 94533 asetyylibenanomisiini B on uusi aine, joka on selvästi erilainen kuin mikään muu tunnettu antibiootti. Keksinnön tavoitteet on tällä tavalla saavutettu.

Keksinnön tavoitteena on saada aikaan menetelmä uuden antibiootin N-asetyylibenanomisiini B:n sekä sen suolojen ja esterei-den valmistamiseksi, joilla on sieniä torjuvaa aktiivisuutta sekä viruksia torjuvaa aktiivisuutta ja joiden toksisuus on pieni. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisessa patenttivaatimuksessa.

Näin ollen keksinnön tavoitteen mukaisesti saadaan aikaan menetelmä uuden, sieniä ja viruksia torjuvan antibiootin N-ase-tyylibenanomisiini B:n valmistamiseksi, joka on edellä esitetyn kaavan (I) mukainen, tai N-asetyylibenanomisiini B:n suolan tai esterin valmistamiseksi.

Keksinnön mukaisesti saadulla N-asetyylibenanomisiini B:llä on seuraavat tunnusomaiset piirteet: 1. N-asetyylibenanomisiini B:n fysikaaliskemialliset ominaisuudet on lueteltu seuraavassa: (1) Väri ja ulkonäkö: punaruskeata jauhetta (2) Alkuaineanalyysi:

Laskettu (yhdisteelle C4,H44N2019.2H20) : C 54,42 %; H 5,35 %; N 3,10 ! Todettu: C 54,05 %; H 5,43 %; N 2,86 %.

(3) Massaspektri (SIMS): m/z 868 (M+)

(4) Sulamispiste: >200 °C

(5) Ultraviolettisäteilyn ja näkyvän säteilyn absorptiospektri: lambda(max), nm (E 1%/1 cm): (metanolissa):205(564), 29(517), 270(sh, 330), 290(403), 300(Sh, 355), 400(Sh, 100), 468(156) (0,1 N HC1-metanolissa): 208(488), 233(528), 270(sh, 325), 294(466), 400(Sh, 115), 458(175) (0,1 N NaOH-metanolissa): 215(1233), 248(540), 319(245), 496(227) (6) Infrapunasäteilyn absorptiospektri (KBr, cm'1) : 3360, 2970, 2910, 1720, 1620, 1600, 1540, 1490, 1440, 1370, 1330, 1290, 5 94533 1250, 1230, 1205, 1160, 1070, 1040, 1000, 970, 870, 830, 740 (7) ‘H-NMR-spektri (400 MHz, DMS0-d«., 40 *C:ssa): 6 (ppm): 0,98(3H, d), 1,35(3H, d), 1,92(3H, s), 2,33(3H, s), 3,06(1H, dd), 3,08(1H, dd), 3,15(1H, dd), 3,29(1H, ddd), 3,70(1H, dd), 3,71(1H, br q), 3,74(1H, dd), 3,81(1H, br), 3,95(3H, s), 4,21(1H, br dd), 4,42(1H, d), 4,43(1H, dq), 4,56(1H, br d), 4,61(1H, br d), 4,64(1H, br d), 6,91(1H, d), 7,24(1H, br s), 7,2B(1H, d), 7,61(1H, br d), B,07(1H, s), 8,45(1H, d), 12,80(1H, br s), 13,82(1H, br) (8) 13C-NMR-spektri (100 MHz, DMSO-d*, 40 eC:ssa): 6 (ppm): 187,5 s, 184,9 s, 173,9 s, 169,9 s, 166,9 s, 166,0 s, 164,7 s, 156,8 s, 151,1 s, 147,8 s, 137,9 s, 137,3 s, 134,3 s, 131,3 s, 127,5 s, 125,6 s, 118,8 d, 115,5 d, 115,5 s, 113,7 s, 110,0 s, 107,6 d, 106,9 d, 104,9 d, 104,7 d, 81,8 d, 80,2 d, 75,8 d, 73,3 d, 71,7 d, 70,5 d, 69,9 d, 69,3 d, 65.4 t, 56,4 q, 52,0 d, 47,6 d, 22,5 q, 19,1 q, 16,9 q, 16.4 q.

(9) Liukoisuus: vain niukkallukoista kloroformiin, etyyliasetaattiin ja asetoniin, ja liukoista ai kali seen veteen, metanoliin, dimetyylisulfoksidiin ja dimetyyliformamidiin.

(10) Ero aineen emäksisen, happaman ja neutraalin luonteen välillä: heikosti hapan aine.

2. Seuraavassa kuvataan N-asetyylibenanomisiini B:n sieniä • t torjuva aktiivisuus N-asetyylibenanomisiini B:n erilaisia sieniä torjuvat pienimmät pitoisuudet määritettiin tavanomaiseen tapaan 1 aimennossarjän avulla käyttäen ravinneagaralustaa, joka sisälsi 1 7. glukoosia (pH 7,0). Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

Benanomisiini B:n sieniä torjuvat pienimmät pitoisuudet määritettiin vertailun vuoksi samalla tavalla ja tulokset on esitetty samoin alla olevassa taulukossa 1.

! ·* m » 4 6 94533

Taulukko 1

Testattu Pienin torjuva pitoisuus, ua/ml mikro-organismi N—asetyylibenano— Benano- (-Punoi )_misiini B_misiini (vert. )

Candida tropical is F-l 50 >100

Candida pseudotropicalis F-2 12,5 6,25

Candida albicans 3147 50 25

Candida Yu-1200 50 12,5

Candida krusei F-5 >100 6,25

Saccharomyces cerevisiae F-7 12,5 12,5

Cryptococcus neoformans F-10 50 1,56

Cochliobolus miyabeanus 50 >100

Pyricularia oryzae >50 50

Pellicularia sasakii 25 50

Xanthomonas citri 50 >100

Xanthomonas oryzae >25 >100

Aspergillus niger F-16 >50 >100

Trichophyton asteroides 429 50 25

Trichophyton mentagrophytes (BB3) 50 25 3. Seuraavassa testataan N—asetyylibenanomisi ini B:n kyky estää HIV-infektio

Seuraavat kokeet suoritettiin sen osoittamiseksi, että N-ase-tyylibenanomisi ini B kykenee estämään ihmisen T—solujen infektoitumista HI-viruksella eli ihmisen immuunikatoviruksella.

, Näissä kokeissa toimittiin seuraavasti: i t · N—asetyylibenanomisiini B:n kykyä estää ihmisen T—solujen infektoituminen ΗΙ-viruksi 11a tutkittiin menetelmällä, joka on samankaltainen kuin julkaisuissa Proc. Natl. Acad. Sei.

USA. BO. 6061-6065 (1983); J. Antibiot.. 40. 1077-1078 (1987); sekä J. Antibiot.. 42. 344-346 (1989), kuvatut menetelmät.

·*

Noin 1x10* solua/ml MT—4-soluja (ihmisen T—solulinja) siirros-tettiin fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa 48 koloa käsittäville Costar—levyille määränä, joka oli 0,5 ml/kolo. Kuhunkin koloon lisättiin 50 μΐ N—asetyylibenanomisi ini B:n im- liuosta [antibiootti liuotettu ensin pitoisuudeksi 10 mg/ml ·· 7 94533 dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja laimennettu sitten fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella N—asetyylibenanomisiini B:n erilaisiksi pitoisuuksiksi!. MT—4—solut infektoitiin kahden tunnin kuluttua lisäämällä kuhunkin koloon 50 μΐ HI-viruksia (1000-10000 plakkia muodostavaa yksikköä). Levyjä inkuboitiin 4 vuorokautta 37 "C:ssa 5 7. C03:ta sisältävässä ilmakehässä. MT-4-soluja levitettiin mikroskooppi lasi lie, kuivattiin Ja kiinnitettiin asetonilla. HIV—antigeenin suhteen positiivisten solujen läsnäolo ilmaistiin epäsuoralla immuunifluoresenssimäärityksellä CY. Hinuma et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 78, 6476—6480 (1981)3. Tätä tarkoitusta varten levyille levitettyjä soluja käsiteltiin 37 °C:ssa 30 minuuttia AIDS—potilaiden seerumilla, joka toimi ensimmäisenä vasta-aineena. Levyt pestiin fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, minkä jälkeen soluja käsiteltiin 37 eC:ssa 30 minuutin ajan fluoresoivaan isotio-syanaattiin konjugoidulla kaniinin anti-ihminen-immunoglobu-1iiniseerumi 1la (Cappel Laboratories, Cochranvi1le, PA, USA), joka toimi toisena vasta-aineena. Sen jälkeen, kun levyille levitetyt solut oli pesty fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella ja peitetty peitinlasilla, niitä tarkasteltiin fluoresenssi mikroskoopin a. Virusantigeenin suhteen positiivisten solujen (eli immuunitluoresoivien solujen, joissa HI—virukseen liittyvät antigeenit olivat ilmentyneet) prosentuaalinen luku-määräosuus kaikista soluista laskettiin.

Lisäksi arvioitiin N-asetyylibenanomisiini B:n sytotoksisuus MT—4—soiui 11e siten, että MT—4-soluja inkuboitiin niihin lisätyissä N-asetyylibenanomisiini B:n erilaisissa pitoisuuksissa, HI—viruksen puuttuessa. Tämä MT—4—solujen inkubointi toteutettiin kuitenkin samalla tavalla ja samoissa olosuhteissa, joita käytettiin edellä kuvatussa kokeessa, jolla määritettiin N— asetyylibenanomisiini B:n kyky estää T—solujen infektoituminen HI—viruksella.

i

Edellä kuvatuista kokeista, joissa toisaalta määritettiin N-asetyylibenanomisiini Brn kyky estää HIV-infektio sekä toisaalta arvioitiin N—asetyylibenanomisiini B:n sytotoksisuus, saadut tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 2. Vertailun 8 94533 vuoksi lähtöyhdiste benanomisiini B testattiin myös edellä kuvatuilla tavoilla.

Taulukko 2

N-asetyylibenanomisiini B Benanomisiini B

_(vertailu)_

Testatun virusanti- sytotok- virusanti- sytotok- yhdisteen geenin suhteen sisuus geenin suhteen sisuus oit. (μσ/ml) pos. solut (%)_dqs. solut (%)_ 100 <1 +* <1 +* 30 <1 - cl- lO 2 - 1 - 3 30 - 70 - 1 70 - 85 - 0 >70 - >90 * DMS0:ssa.

Kuten edellä olevassa taulukossa 2 esitetyistä koetuloksista todetaan, N-asetyylibenanomisiini B ei ole sytotoksista pitoisuutena 30 μg/ml ja tämä pitoisuus kykenee pienentämään merkittävästi virusantigeenin suhteen positiivisten solujen lukumäärää. Pitoisuuden ollessa 1 ja 3 /xg/ml N-asetyylibenanomisiini B:n infektiota estävä aktiivisuus on suurempi kuin benanomisiini B:llä.

Täten on saatu vahvistetuksi se, että N-asetyylibenanomisiini B kykenee estämään lähtöyhdistettä eli benanomisiini B:tä tehok-' kaammin ihmisen T-solujen infektoitumisen HI-viruksella. Täten N-asetyylibenanomisiini B:llä on tavallaan HI-virusta torjuvaa aktiivisuutta.

4. Seuraavassa kuvataan N-asetyylibenanomisiini B:n akuutti toksisuus

Kun N-asetyylibenanomisiini B:n akuutti toksisuus nisäkkäässä testattiin sitä laskimon sisäisesti antamalla, niin todettiin, että keksinnön mukaisen uuden antibiootin akuutti toksisuus on hyvin alhainen. Näin ollen akuutin toksisuuden kokeessa, jossa N-asetyylibenanomisiini B:tä annettiin laskimon sisäisesti ICR-hiirille (naaraspuolisia, 4 viikon ikäisiä, ruumiin paino 19-21 g, 3 • hiirtä ryhmässä), hiiret sietivät N-asetyylibenanomisiini B-an- 9 94533 noksen, jonka suuruus oli 300 mg/kg (eli yksikään hiiri, jolle oli annettu laskimon sisäisesti N-asetyylibenanomisiini B:tä 300 mg/kg suuruisena annoksena, ei kuollut), kun taas hiiret eivät sietäneet benanomisiini B:tä annoksena, jonka suuruus oli 200 mg/kg (benanomisiini B:n tappava annos (LDJ0) on noin 150 mg/kg laskimon sisäisesti annettuna).

Voidaan myös saada aikaan sieniä torjuva koostumus eläimissä, ihminen mukaan lukien, esiintyvien sieni-infektioiden hoitamiseksi. Tämä koostumus käsittää aktiivisena aineenaan sieniä tehokkaasti torjuvan määrän edellä määritellyn kaavan (I) mukaista N-asetyy-libenanomisiini B:tä tai sen suolaa tai esteriä yhdistettynä farmaseuttisesti hyväksyttävään kiinteään tai nestemäiseen kantajaan.

Lisäksi voidaan saada aikaan viruksia torjuva koostumus virusinfektion hoitamiseksi. Tämä koostumus käsittää aktiivisena aineenaan viruksia tehokkaasti torjuvan määrän N-asetyylibenanomisiini B:tä tai sen suolaa tai esteriä yhdistettynä aktiivisen aineen kiinteään tai nestemäiseen kantajaan.

Voidaan myös saada aikaan menetelmä viruksen, erityisesti ihmisen immuunikatoviruksen, aiheuttaman infektion estämiseksi, jossa menetelmässä virusta käsitellään N-asetyylibenanomisiini B:llä tai sen suolalla tai esterillä, jonka käytetty määrä on riittävä vi-ruksen inaktivoimiseksi.

Farmaseuttinen, sieniä tai viruksia torjuva koostumus, joka sisältää aktiivisena aineenaan N-asetyylibenanomisiini B:ä tai sen suolaa tai esteriä, voidaan valmistaa tunnetulla tavalla tavanomaiseksi annettavaksi valmisteeksi, esimerkiksi jauheeksi, rakeiksi, tableteiksi, pillereiksi tai kapseleiksi suun kautta tapahtuvaa antamista varten, tai laskimon sisäisesti, lihaksen sisäisesti tai ihon alaisesti injektoitavaksi liuokseksi tai peräpuikoiksi, käyttäen farmaseuttisesti hyväksyttävää kiinteätä tai nestemäistä kantajaa, joka sopii kyseiseen valmisteeseen.

10 94533

Yleisesti N-asetyylibenanomisiini B:tä voidaan antaa joko suun kautta tai ruuansulatuskanavan ulkopuolisesta käytettäessä sitä sieniä tai viruksia torjuvana koostumuksena.

Kun tämän keksinnön mukaisesti valmistettua, aktiivisena aineena käytettyä yhdistettä eli N-asetyylibenanomisiini B:tä annetaan joko sieniä torjuvana aineena tai HI-virusta torjuvana aineena, niin sitä voidaan antaa yksinään tai sitä voidaan antaa injektiona, suun kautta annettavana valmisteena, peräpuikkona tai muuna vastaavana, joka sisältää lisäksi täyteainetta tai kantajaa keskenään sekoitettuna. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää mitä tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävää täyteainetta ja kantajaa. Käytetyn kantajan luonne ja määrä voivat vaihdella antoreitistä ja -tavasta riippuen. Nestemäisenä kantajana voidaan käyttää esimerkiksi vettä, etanolia tai eläin- tai kasvirasvaa kuten soija-öljyä, seesamöljyä tai mineraaliöljyä tai synteettistä öljyä. Sopivista kiinteistä kantajista voidaan mainita esimerkiksi sokeri kuten maltoosi tai sakkaroosi, aminohappo, selluloosajohdannainen kuten hydroksipropyyliselluloosa, polysakkaridi kuten syk-lodekstriini, epäorgaanisen hapon suola kuten magnesiumstearaatti tai muu vastaava. Injektioiden tapauksessa on yleisesti edullista, että injektioiden nestemäinen väliaine käsittää fysiologista suolaliuosta, puskuroitua liuosta, sokeriliuosta kuten glukoosi-, inositoli- tai mannitoliliuosta tai glykolia kuten etyleeniglyko-lia tai polyetyleeniglykolia. Mahdollista on myös valmistaa ly-ofilisoitu valmiste, joka sisältää aktiivisena aineenaan N-asetyylibenanomisiini B:ä sekoitettuna täyteaineeseen, esimerkiksi sokeriin kuten inositoliin, mannitoliin, glukoosiin, mannoosiin, maltoosiin tai sakkaroosiin tai aminohappoon kuten fenyyliala-niiniin. Tällainen lyofilisoitu valmiste voidaan antohetkellä liuottaa injektointia ajatellen sopivaan liuottimeen, esimerkiksi steriiliin veteen tai suonen sisäisesti annettavaan nesteeseen kuten fysiologiseen suolaliuokseen, glukoosin vesiliuokseen, elektrolyyttien vesiliuokseen tai aminohapon vesiliuokseen.

Vaikka valmistetussa koostumuksessa läsnäolevan N-asetyylibenanomisiini B:n pitoisuus voikin vaihdella huomattavasti valmisteesta ·· toiseen, se voi yleisesti olla alueella 0,1-100 paino-%. Esimer- SI «tl > Hill I ! t K» 1 u. 94533 kiksi injektion tapauksessa on yleisesti toivottavaa, että injektoitava liuos sisältää aktiivisena aineena käytettyä yhdistettä 0,1-20 paino-%:n pitoisuutena. Suun kautta annettaessa aktiivisena aineena käytetty yhdiste voidaan muokata tableteiksi, kapseleiksi, jauheeksi, rakeiksi, kiinteään kantajaan yhdistettynä, tai siitä voidaan valmistaa liuos, kuiva siirappi tai vastaava nestemäiseen kantajaan yhdistettynä. Kapseleiden, tablettien, rakeiden tai jauheen tapauksessa aktiivisena aineena läsnäolevan N-asetyylibenanomisiini B:n määrä on yleensä noin 3-100 paino-%, edullisesti 10-100 paino-%, lopun ollessa kantajaa.

N-asetyylibenanomisiini B:n annoskoko riippuu potilaan iästä, ruumiinpainosta, oireista sekä hoitotavoitteista. N-asetyyli-be-nanomisiini B:n hoitava eli tehokas annos voi olla yleensä 1-200 mg/kg/vrk ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti annettaessa ja alueella 5-500 mg/kg/vrk suun kautta annettaessa. Tämä annos voidaan antaa joko jatkuvalla tai keskeytyvällä tavalla, kunhan vain ko-konaisannos ei ylitä sitä erityistä määrää, johon päädyttiin eläinkokeista saatujen tulosten ja muiden eri tekijöiden perusteella. Samoin ruuansulatuskanavan ulkopuolisesti annettava koko-naisannos voi luonnollisestikin vaihdella riippuen antotavasta, hoidettavan potilaan tai eläimen tilasta, esimerkiksi potilaan iästä, ruumiinpainosta, sukupuolesta, herkkyydestä, ravinnosta tai ruuasta, antamisajasta, antoreitistä, muista samanaikaisesti annettavista lääkkeistä, tilasta ja hoidettavasta sairaudesta.

·· Asiantuntevan lääkärin on määritettävä N-asetyylibenanomisiini B:n sopivan annoskoon ja antotiheyden tietyissä olosuhteissa kokeilla, joilla saadaan selville optimiannos edellä esitetyt suuntaviivat huomioonottaen. Nämä antamiseen liittyvät vaatimukset pätevät myös annettaessa N-asetyylibenanomisiini B:tä suun kautta.

Keksinnön mukaisesti saadaan aikaan menetelmä sieniä ja viruksia torjuvan antibiootin eli N-asetyylibenanomisiini B:n valmistamiseksi, jossa menetelmässä toinen antibiootti eli benanomisiini B muunnetaan kemiallisesti N-asetyylibenanomisiini B:ksi.

• · 12 94533

Ohessa käsitteellä "benanomisiini B muunnetaan kemiallisesti" tarkoitetaan benanomisiini B:n asetyloimista asyloimalla benanomisiini B:n 4"-aminoryhmä etikkahapolla tai sen reaktiivisella johdannaisella kuten asetanhydridillä. Menetelmä lähtöaineena käytettävän benanomisiini B:n valmistamiseksi on kuvattu edellä mainitun EP-patenttihakemuksen, jonka julkaisunumero on 0 315 147 A2, selitysosassa, ja benanomisiini B:n valmistus kuvataan myös jäljempänä viite-esimerkeissä 1-3.

Asylointi, erityisesti benanomisiini B:n 4"-aminoryhmän asety-lointi etikkahapolla tai sen reaktiivisella johdannaisella, voidaan toteuttaa millä tahansa tunnetulla menetelmällä amidien syntetoimiseksi käyttäen hyväksi disykloheksyylikarbodi-imidi-menetelmää, sekahappoanhydridimenetelmää, happokloridimenetel-mää, atsidimenetelmää, aktiiviseen esteriin perustuvaa menetelmää tai muuta vastaavaa. Benanomisiini B:n asetyloiminen toteutetaan kuitenkin edullisesti saattamalla benanomisiini B reagoimaan asetanhydridin ekvimolaarisen määrän tai ylimäärän kanssa alemmassa alkanolissa kuten metanolissa tai etanolissa, tai vedessä tai alemman alkanolin ja veden seoksessa ympäristön lämpötilassa. Tuloksena saatava benanomisiini B:n asetylointi-tuote voidaan helposti eristää ja puhdistaa pylväskromatogra-fisesti käyttäen perinteistä ei-ionista, mikrohuokosia käsittävää hartsia, kuten tuotetta "Diaion" HP 10 tai HP 20 (kummatkin yhtiön Mitsubishi Kasei Co., Ltd., Japani, tuotteita) tai .. "Amberlite" XAD-1 tai XAD-2 (yhtiön Rohm & Haas Co., Ltd., USA, tuotteita) tai molekyyliseulana toimivaa hartsia, kuten tuotetta "Sephadex" LH-20 (yhtiön Pharmacia, Ruotsi, tuote).

Edellä kuvatulla tavalla reaktioliuoksessa muodostunut N-ase-tyylibenanomisiini B voidaan eristää vapaassa muodossaan eli itse N-asetyylibenanomisiini B:nä. N-asetyylibenanomisiini B:tä sisältävä liuos tai sen väkevöity liuos voidaan käsitellä epäorgaanisella emäksellä, esimerkiksi alkalimetalliyhdisteellä, kuten natriumhydroksidilla tai kaiiumhydroksidillä; maa-alkali-metalliyhdisteellä kuten kaisiumhydroksidillä tai magnesiumhy-droksidilla; tai ammoniumsuolalla, tai orgaanisella emäksellä ·· kuten etanoliamiinilla, trietyyliamiinilla tai disykloheksyy- ia m i m* i i i iti i 13 94533 liamiinilla talteenoton ja puhdistuksen jossakin vaiheessa.

Sitten N-asetyylibenanomisiini B voidaan muuntaa vastaavaksi suolaksi ja se voidaan edelleen eristää suolanaan. Edelleen, täten muodostettu N-asetyylibenanomisiini B:n suola voidaan sitten muuntaa vapaaseen muotoon eli itse N-asetyylibenanomisiini B:ksi käsittelemällä sitä sinänsä tunnetulla menetelmällä. Lisäksi vapaana saatu N-asetyylibenanomisiini B voidaan jälleen muuntaa suolaksi saattamalla se reagoimaan edellä mainitun emäksen kanssa tavalliseen tapaan. Edelleen, kun N-asetyylibenanomisiini B saatetaan reagoimaan alkoholin, esimerkiksi alemman alkanolin kuten metanolin tai etanolin, kanssa, niin tällöin saadaan muodostetuksi vastaava esteri sen karboksyyli-ryhmään.

Erityisemmin, kaavan (I) mukaisen N-asetyylibenanomisiini B:n suoloista voidaan mainita N-asetyylibenanomisiini B:n farmaseuttisesti hyväksyttävä suola (karboksylaatti) farmaseuttisesti hyväksyttävän metallikationin, erityisesti farmaseuttisesti hyväksyttävän alkalimetallikationin kuten natrium- ja kaliumka-tionin sekä farmaseuttisesti hyväksyttävän maa-alkalimetallika-tionin kuten kalsium- ja magnesiumkationin, sekä ammoniumkationin kanssa, sekä farmaseuttisesti hyväksyttävä emäsadditiosuola (yhdisteen karbonyyliryhmässä) farmaseuttisesti hyväksyttävän orgaanisen emäksen, erityisesti amiinin, kuten alemman (C,-C6) alkyyliamiinin, erityisesti trietyyliamiinin, etanoliamiinin ja λ disykloheksyyliamiinin kanssa. N-asetyylibenanomisiini B:n estereistä voidaan mainita farmaseuttisesti hyväksyttävä esteri (karboksylaatti) farmaseuttisesti hyväksyttävän, esterin muodostavan radikaalin kanssa, joista radikaaleista voidaan mainita alempi (Cx-C6) alkyyliryhmä, erityisesti metyyli tai etyyli; alempi (C2-C6) alkanoyylioksi-alempi ((^-06) alkyyliryhmä kuten asetoksimetyyli, 1-asetoksietyyli ja pivaloyylioksimetyyli; tai alempi (C,-C6) alkoksikarbonyylioksi-alempi (C]-C6) alkyyliryhmä kuten 1-(etoksikar- « • · 14 94533 bonyylioksi)etyyliryhmä.

Koska benanomisiini B, Jota käytetään lähtömateriaalina N-ase-tyylibenanomisiini Brtä tuotettaessa, on antibiootti. Jota tuotetaan viljelemällä uutta mikro-organismikantaa MH193-16F4, niin tämän antibiootin tuottaminen fermentaatiolla on kuvattu seuraavassa.

Benanomisiini B:n valmistaminen voidaan toteuttaa siirrosta-malla Actinomvcetes-kanta MH193-16F4 vi1Jelyalustaan, Jonka sisältämiä ravinnelähteitä tavalliset mikro-organismit kykenevät käyttämään hyväksi, minkä Jälkeen mainittua benanomisiiniä tuottavaa kantaa inkuboidaan aerobisissa olosuhteissa. Benanomisi ini Bstä syntyy yhdessä benanomisiini A:n kanssa ja niitä kerääntyy pääasiassa viljelyalustaan. Benanomisiini A ja B voidaan ottaa talteen tuloksena saadusta viljelmästä, erityisesti vi1jelyalustasta tai sen suodoksesta.

Viljelyalustassa käytettävissä olevat ravinnelähteet voivat olla mitä tahansa tavanomaisia hiili- ja typpi 1ähteitä, jotka ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi ravinnelähteiksi tunnettuja Actinomvcetes-kantoja vi1jeltäessä. Assimiloituvista typpi lähteistä voidaan mainita esimerkiksi soijajauho, peptoni, lihauute, maissin liotusliemi, puuvillasiemenjauho, maapähkinä-jauho, kuiva hiiva, hiivauute, NZ—amiini, kaseiini, natriumnitraatti, ammoniumsulfaatti ja ammoniumnitraatti, joita on saatavana kaupallisesti. Assimiloituvista hii1ilähteistä voidaan mainita esimerkiksi glyseriini, sakkaroosi, tärkkelys, glukoosi, galaktoosi, maltoosi, dekstriini, laktoosi, melassi, soijaöljy, rasvat ja aminohapot, joita on saatavana kaupallisesti. Vi1jelyalusta voi myös sisältää epäorgaanisia suoloja kuten natriumkloridia, fosfaatteja, kalsiumkarbonaattia, magnesiumsulfaattia, kobolttikloridia ja mangaani kloridia. Tämän lisäksi alustaan voidaan myös lisätä pieniä määriä metallisuo-loja sekä yhtä tai useampaa eläin-, kasvi- tai mineraaliöljyä.

Nesteviljelymenetelmä on edullinen benanomisiini A:n ja B:n tuottamiseksi suuressa mittakaavassa. Viljelylämpötila voidaan ·· 94533 15 valita sellaiselta lämpötila-alueelta. Jossa näitä benanomi— siinejä tuottava mikro-organismi kykenee kasvamaan ja tuottamaan benanomisiini Asta ja B:tä. Vi1jelylämpöti1 a voi olla yleensä 20-40 eC, edullisesti 25-37 “C.

Benanomisiini A:n ja B:n taiteenottamiseksi saatavasta, bena-nomisiini A:ta ja B:tä tuottavan mikro-organismin viljelmästä benanomisiini A ja B voidaan uuttaa tästä viljelmästä tai vi1jelyalustan suodoksesta ja puhdistaa sitten perinteisillä talteenotto- ja puhdistusmenetelmillä, joista voidaan mainita 1iuotinuutto, ioninvaihtohartsiin perustuva menetelmä, adsorptioon tai ositukseen perustuva pyiväskromatografia, geelisuo-datus, dialyysi, saostus ja muut vastaavat, joko yksinään tai yhdistelmänä. Benanomisiini A ja B voidaan esimerkiksi ottaa talteen inkuboidusta myseelikakusta asetonin ja veden tai me-tanolin ja veden seoksella uuttamalla. Toisaalta tuotettu benanomi si ini A ja B, jotka ovat kerääntyneet viljelyalustaan tai sen suodokseen, voidaan adsorboida adsorbenttiin, esimerkiksi mikrohuokosia käsittävään ei-ioniseen adsorbenttiin, josta esimerkkinä voidaan mainita "Di aion" HP-20 (kauppanimi; synteettinen hartsimainen adsorbentti, jota tuottaa yhtiö Mitsubishi Kasei Corporation, Japani). Lisäksi, kun viljelyalusta tai sen suodos uutetaan veteen sekoittumattomal1 a orgaanisella liuottimena, esimerkiksi butanolilla, etyyliasetaatilla tai muulla vastaavalla, niin benanomisiini A ja B uuttuvat tähän orgaaniseen 1iuotinfaasi in.

Benanomisiini A:n ja B:n tuottamiseksi on edullista, että MH193-16F4-kantaa viljellään vi1jelyalustassa aerobisissa olosuhteissa, alueella 25-37 °C olevassa lämpötilassa, edullisesti 3-10 vuorokauden ajan, jolloin benanomisiini A:ta ja B:tä muodostuu ja kerääntyy tuloksena saatavaan vi1jelyalustaan, joka tämän jälkeen suodatetaan ja tuloksena saatava viljelyalustan suodos johdetaan adsorbenttia sisältävän pylvään läpi, jolloin adsorbentti adsorboi benanomisiini A:n ja B:n, minkä jälkeen benanomi si ini A ja B otetaan talteen kromatogra-f isesti toisistaan erillään eluoimalla adsorbenttipyivästä, johon benanomi-siini A ja B ovat adsorboituneet.

ι6 94533

Benanomisiini A:n ja B:n keskinäiseen eristämiseen ja puhdistamiseen voidaan käyttää sopivasti kromatografisia menetelmiä, joissa käytetään adsorbenttia kuten silikageeliä ("Wakogel C-300", kauppanimi; yhtiön Wako Pure Chemical Industries, Ltd., tuote) tai alumiinioksidia tai geelisuodatusainetta "Sephadex LH-20" (kauppanimi; yhtiön Pharmacia AB tuote) tai muuta vastaavaa.

Edellä kuvatulla tavalla viljelmään muoostunut benanomisiini A ja B voidaan eristää vapaassa muodossaan.

MH193-16F4-kanta on talletettu Japanin hallituksen alaiseen valtuutettuun kantakokoelmaan "Fermentation Research Institute", Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, talletusnumerolla FERM P—9529 21. elokuuta 1987. MH193-16F4-kanta on talletettu kanta-kokoelmaan "Fermentation Research Institute" Budapestin sopimuksen (Budapest Treaty) ehdoilla, talletusnumerolla "FERM BP-2051". Mainitun japanilaisen kantakokoelman sijainti on Tsukuba—kaupunki, Ibaragi-ken, Japani.

Seuraavat viite-esimerkit 1-3 havainnollistavat benanomisiini A:n ja B:n valmistamista fermentoimalla.

Viite-esimerkki 1 .. Platinasilmukallinen MH193-16F4—kantaa (tailetusnumero FERM ·* BP-2051), jota oli inkuboitu agaralustasta tehdyllä vinopin- nalla, siirrostettiin 80 ml:aan nestemäistä vi1jelyalustaa, joka käsitti 1,0 7. tärkkelystä ja 3,0 7. soijajauhoa (pH 7,0 ennen sterilointia). Alusta oli laitettu tilavuudeltaan 500 ml:n Sakaguchi-pulloon. Siirrosteen käsittävää viljelyalustaa inkuboitiin 28 *C:n lämpötilassa 3 vuorokautta pyörittävässä ravistelijassa (135 kierr./min), jolloin saatiin ensimmäinen siirrosvi1jelmä. Tämä saatu ensimmäinen siirrosviljelmä siir— * rostettiin 3 ml:n annoksina 80 ml:n suuruisiin eriin nestemäistä vi1jelyalustaa, jonka koostumus oli sama kuin edellä.

Vi 1jelyalusta oli laitettu useisiin Sakaguchi—puiloihin. Siir— ; rosteen käsittäviä viljelyaluksia inkuboitiin 3 vuorokautta il ; ia i imi n i u i 17 94533 samoissa inkubointiolosuhteissa kuin edellä, jolloin saatiin toinen siirrosvi1jelmä. Tämä tulokseksi saatu toinen siirros-viljelmä (2 litraa) siirrostettiin 50 l:aan viljelyalustaa, jonka koostumus oli sama kuin edellä, ja jota oli steriloitu 120 *C:ssa 15 minuuttia, ja joka oli laitettu tilavuudeltaan 100 litran -ferment ori säiliöön. Sitten tätä siirrosteen käsittävää viljelyalustaa viljeltiin 28 eC:n lämpötilassa 2 vuorokautta johtaen alustaan ilmaa nopeudella 50 1/min ja sekoittaen sitä nopeudella 200 kierr./min MH193—16F4—kannan uppovi1jelmän toteuttamiseksi aerobisissa olosuhteissa. Tällä tavalla saatiin kolmas siirrosviljelmä. Tuloksena saatu kolmas siirrosvi1jelmä (12 litraa) siirrostettiin tuotantosiustaan (300 1), joka käsitti 2,0 % glyseriiniä, 1,5 7. soijajauhoa (saatavana kaupallisesti kauppanimellä "Esusan Meat", yhtiön Ajinomoto Co.,

Ltd., Japani), sekä 0,0025 7. KsHPQ», 0,1125 7. KHsPCU, 0,005 7. CoC12-6H20, 0,03 7. sil ioni öljyä "KM72” (vaahdonestoaine, yhtiön Shinetsu Chemicals Co., Ltd., Japani, valmistaman tuotteen kauppanimi) sekä 0,01 7. pinta—akti i vista ainetta "Adekanol " (yhtiön Asahi Denka Kogyo Co. Ltd-, Japani, valmistaman tuotteen kauppanimi). Tuotantoalusta oli steriloitu edeltäkäsin 125 °C:ssa 30 minuuttia ja se oli laitettu tilavuudeltaan 570 litran -f ermentori säi 1 i öön. Viljely toteutettiin 28 °C:ssa 7 vuorokauden ajan sekoittaen nopeudella 300 kierr./min, ja johtaen alustaan happea nopeudella 150 1/min ensimmäisten 24 tunnin aikana ja sitten, kun viljely oli kestänyt jo 24 tuntia, nopeudella 300 1/min. Viljelyn päätyttyä saatuun viljelyalustaan sekoitettiin suodatuksen apuaineeksi piimaata, minkä jälkeen se suodatettiin, jolloin saatiin 250 ml viljelyalustan suodosta (pH 6,0).

Viite—esimerkki 2

Edellä viite—esimerkissä 1 saatu vi1jelyalustan suodos (250 1) « · johdettiin pylvään läpi, joka pylväs sisälsi 15 1 mikrohuo-kosia käsittävää ei-ionista adsorbenttihartsia "Diaion" HP-- 20, joolloin adsorbentti adsorboi aktiiviset aineet. Adsor— benttipylväs pestiin 100 litralla vettä ja 45 litralla «»etanolin 50 7. vesiliuosta, minkä jälkeen adsorbentti pyi västä • eluoitiin 45 litralla metanolin 70 7. vesiliuosta ja sitten 90 • « is 94533 litralla kuivaa metanolia siten, että eluaatista saatiin ensimmäinen -fraktio (53 1), toinen -fraktio (38 1> ja kolmas -fraktio (27 1). Aktiivista ainetta sisältävä ensimmäinen -fraktio väke-vöitiin 3 litraksi alennetussa paineessa, minkä jälkeen sen pH asetettiin arvoon 3,5 laimealla kloorivetyhapolla, jolloin saatiin väriltään punainen sakka. Tämä sakka otettiin talteen suodattamalla ja sitten se kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 152 g ruskeata raakajauhetta, joka käsitti pääasiassa benanomisiini Asta.

Tämä raakajauhe (150 g) liuotettiin 600 ml saan dimetyyli-form— amidia. Tuloksena saatu liuos kyllästettiin vesihöyryllä huoneen lämpötilassa 3 vuorokauden aikana eksikaattorissa, minkä jälkeen saatiin kiteinen saastuma. Tämä saostuma otettiin talteen suodattamalla ja sitten se kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 29 g benanomisi ini A-dimetyyliform-ami di —soivaatti a.

Eluaatin toinen -fraktio käsiteltiin samalla tavalla kuin ensimmäinen fraktio, jolloin saatiin 14 g benanomisiini A—dimetyyli— formamidi-soivaattia.

Yksi gramma ensimmäisestä fraktiosta saatua benanomisiini A-dimetyyliformamidi-solvaattia liuotettiin dimetyylisulfoksidi in (5 ml). Tuloksena saatu liuos lisättiin pisaroittain, sekoittaen, 300 ml:aan metanolia, minkä jälkeen seosta sekoitettiin • « ·· 10 minuuttia, jolloin saatiin väriltään punaruskeata sakkaa.

Sakka erotettiin suodattamalla ja kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 935 mg puhdistettua benanomisiini A:ta punaruskeana jauheena.

Viite-esimerkki 3

Viite-esimerkissä 2 saatu eluaatin kolmas fraktio väkevöitiin 1,5 litraksi alennetussa paineessa, minkä jälkeen sen pH ase- tettiin arvoon 3,5 laimealla kloori vetyhapol la, jolloin saatiin väriltään punainen sakka. Sakka otettiin talteen suodattamalla ja sitten se kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin ·, 98 g ruskeata raakajauhetta, joka sisälsi benanomisi ini B:tä.

• · i’ 94533

Yksi gramma tätä raakajauhetta liuotettiin 10 ml:aan di metyyli--formamidia 40 °C:ssa, minkä jälkeen tuloksena saatu liuos johdettiin tilavuudeltaan 1 litran pylvään läpi, joka pylväs si- \ saisi geelisuodatusainetta "Sephadex" LH-20, joka oli kasteltu dimetyyliformamidi11 a. Sitten tämä "Sephadex"—pyiväs kehitettiin dimetyyliformamidi1la. Eluaatista kerättiin 6 mlsn fraktioita. Aktiivista ainetta sisältävät fraktiot 64-72 otettiin talteen, yhdistettiin ja väkevöitiin sitten kuiviin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 657 mg ruskeata raakajauhetta, joka käsitti benanomisiini B-dimetyyliformamidi-solvaattia. 300 mg tätä raakajauhetta liuotettiin 100 ml:aan metanolia, tähän liuokseen lisättiin 1 ml 1 N kloorivetyhappoa, minkä jälkeen liuos väkevöitiin kuiviin alennetussa paineessa. Tuloksena saatu, väriltään ruskea raakajauhe liuotettiin 3 ml:aan dimetyyl isulfoksi di a. Tuloksena saatu liuos lisättiin pisaroittaan, sekoittaen, 200 ml:aan kloroformia, minkä jälkeen seosta sekoitettiin 20 minuuttia. Tällöin saatiin punaruskea sakka.

Sakka otettiin talteen suodattamalla ja sitten se kuivattiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 258 mg benanomisiini B-hydroklori di a puhdistetussa muodossa.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavilla esimerkeillä, jotka eivät rajoita oheista keksintöä millään tavalla. Täten, N-ase-tyylibenanomisiini B:n yksityiskohtaiset ominaisuudet on saatu ilmeisiksi tässä keksinnössä, ja näin alan asiantuntija kykenee toteuttamaan menetelmän N—asetyylibenanomisiini B:n tuottamiseksi eri tavoilla ottamalla huomioon N-asetyylibenanomisii— ni B:n edellä kuvatut ominaisuudet. Näin ollen keksintö ei ainoastaan kata seuraavissa esimerkeissä kuvattujen toimenpiteiden mahdollisia muunnoksia, vaan sen piiriin kuuluvat myös kaikki sellaiset menetelmät, joissa N—asetyylibenanomisiini B:tä saadaan tuotetuksi, väkevöidyksi, uutetuksi ja/tai puhdistetuksi sinänsä tunnetulla tavalla käyttäen hyväksi N-ase— tyylibenanomisiini B:n ominaisuuksia.

<<«

Esimerkki 1

Benanomisiini B—hydrokloridi (125 mg) liuotettiin 10 ml:aan ·' natriumkarbonaatin 0,1 M vesiliuosta, ja tuloksena saatuun • · 20 94533 liuokseen lisättiin 0,1 ml asetanhydridiä. Saatua seosta sekoitettiin ympäristön lämpötilassa 20 minuuttia. Tuloksena saadun reaktioseoksen pH asetettiin sitten arvoon 4,0 lisäämällä siihen IM kloorivetyhappoa, minkä jälkeen se johdettiin pylvään läpi, joka sisälsi 20 ml ei-ionista, mikrohuokosia käsittävää adsorbenttihartsia "Diaion" HP—20 <yhtiön Mitsubishi Kasei CO., Japani, tuote), jolloin hartsi adsorboi benanomisiini B:n asetylointituotteen. Hartsipyivästä pestiin vedellä ja se kehitettiin asetonin 80 Ύ. vesiliuoksella. Eluaatin punaiset fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin kuiviin. Saatu jäännös liuotettiin metanoliin ja metanoli1iuos johdettiin pylvään läpi, joka sisälsi molekyyliseula-ainetta "Sephadex" LH-20 <yhtiön Pharmacia Co., Ruotsi, tuote), mitä seurasi pylvään kehittäminen metanolilla. Eluaatti, joka tuotti ohutkerros-kromatografisessa analyysissa yhden ainoan, väriltään punaisen täplän silikageelilevyllä, väkevöitiin kuiviin. Tällöin saatiin N-asetyylibenanomisiini B:tä (118 mg) punaruskeana tuotteena, jonka sulamispiste oli yli 200 eC.

Esimerkki 2 N-asetyylibenanomisiini B:n (89 mg) liuos 10 ml vettä ja 1,1 ml 0,1 M NaOH-liuosta käsittävässä seoksessa lyofi1isoiti in. Lyofilisoitu tuote liuotettiin 3 ml:aan metanolia ja käsiteltiin kromatografisesti "Sephadex" LH-20-hartsia (300 ml) sisältävällä pylväällä, joka kehitettiin metanolilla, jolloin saa-. tiin N-asetyylibenanomisiini B:n natriumsuolaa (80 mg) punaruskeana jauheena.

Esimerkki 3 N-asetyylibenanomisiini B:n (89 mg) liuosta 500 ml metanolia ja 1 ml IM HCl-liuosta käsittävässä seoksessa sekoitettiin huoneen lämpötilassa 15 tuntia ja sitten reaktioseos väkevöitiin kuiviin. Jäännös liuotettiin 1 ml:aan dimetyylisulfoksidia ja käsiteltiin kromatografisesti käyttäen "Sephadex" LH-20-•«hartsia (500 ml) sisältävää pylvästä, joka kehitettiin meta-nolilla. Ensimmäinen punertava eluaatti väkevöitiin, jolloin saatiin N-asetyylibenanomisiini B:n metyyliesteriä (60 mg) punaruskeana jauheena.

2i 94533

Keksintöä havainnollistetaan edelleen seuraavilla esimerkeillä.

Jotka esittävät erilaisia keksinnön mukaisia, N-asetyylibena-nomisiini B:tä sisältäviä valmisteita tai koostumuksia.

Esimerkki 4 10 paino-osaan N—asetyylibenanomisiini B:n natriumsuolaa (kar— boksylaatti) lisättiin sellainen määrä puhdasta vettä, että kokonaismääräksi saatiin 1000 paino-osaa. Sen Jälkeen, kun natriumsuola oli liuotettu veteen, täten saatu liuos steriloitiin suodattamalla siten, että se Johdettiin mikrohuokosia käsittävän suodattimen, Jonka kauppanimi on "Millipore Filter 6S", läpi. Viisi grammaa saatua steriiliä suodosta laitettiin Jokaiseen 10 ml:n pikkupulloon Ja lyofilisoitiin, Jolloin saatiin lyofilisoitu valmiste injektiota varten, joka sisälsi 50 mg N-asetyylibenanomisiini B:n natriumsuolaa pulloa kohden.

Esimerkki 5 50 paino-osaa N-asetyylibenanomisiini B:tä, 600 paino—osaa laktoosia, 330 paino—osaa kiteistä selluloosaa ja 20 paino-osaa hydroksipropyyliseiluloosaa sekoitettiin huolellisesti keskenään. Tuloksena saatu jauhemainen seos puristettiin tela-tyyppisellä puristuskoneel1 a (Roller Compactor, tavaramerkki) ja sitten tuloksena saadut kiinteät puristeet murskattiin.

Täten saatu murske seulottiin. Se osa rakeista, joiden koko oli alueella 16-60 mesh, otettiin talteen rakeisena valmisteena.

Esimerkki 6 30 paino-osaa N-asetyylibenanomisiini B:tä, 120 paino-osaa kiteistä laktoosia, 147 paino-osaa kiteistä selluloosaa ja 3 paino-osaa magnesiumstearaattia sekoitettiin V-mallin sekoit-timessa ja puristettiin tableteiksi, joista kukin sisälsi 300 mg N-asetyylibenanomisiini B:tä aktiivisena aineena.

Claims (3)

1. 22 94533 Patenttivaatimus Menetelmä sieniä torjuvan ja viruksia torjuvan antibiootin N-asetyylibenanomisiini B:n, jolla on kaava (I): CHs CDNHCHCOOH j (R)
2. 0 HO Η°'-|^ν-°Η3 HO tai sen suolan tai esterin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että benanomisiini B, jolla on kaava (II) 3' CHs 45 rl 1' CDNHCHCOOH I <R> H0-^\3_CH3 -U. jj, Hj CO ^ 4Λ ^ | 1 ^ MQ *,L Ju jl /1 * 30H δ ^ OH o oh-^_^-o / <IIJ muunnetaan kemiallisesti N-asetyylibenanomisiini B:ksi, (a) asyloimalla benanomisiini B:n 4''-asemassa oleva aminoryhmä etikkahapolla tai sen reaktiivisella johdannaisella edullisesti saattamalla benanomisiini B reagoimaan asetanhydridin kanssa alemmassa alkanolissa tai vedessä tai alemman alkanolin ja ve-·· den seoksessa; ja il ΙΠ I Hill I I I tt ! 23 94533 (b) haluttaessa saatu N-asetyylibenanomisiini B muutetaan vastaavaksi suolaksi tai esteriksi. Förfarande för framställning av ett antibiotikum N-acetyl-benanomicin B eller dess salt eller ester, soin bekämpar svampar och virus, med formeln (I): CH3 CONHCHCOOH (R) HO,
3. 0 HO C0 OH ^ ou «oo kännetecknat av att benanomicin B med formeln (II) 3’ CHs •(5 z’\ f .· CONHCHCOOH I (R) «l % ^ I1, ύ I II re Λ! , JJL f °« 0 OH ^0 OH OH OH / (II> m 94533 omvandlas kemiskt till N-acetylbenanomicin B, (a) genom acylering av aminogruppen vid 4''-position pä be-nanomicin B med ättiksyra eller ett reaktivt derivat därav, fö-reträdesvis genom omsättning av benanomicin B med acetanhydrid i lägre alkanol eller i vatten eller i en blandning av lägre alkanol och vatten; ooh (b) om sä önskas det erhällna N-acetylbenanomicinet B omvandlas till motsvarande sait eller ester. Il lit Λ liiti lito· - i