FI93698C - Konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä, mikrokuplatyyppinen ultraäänikuvausaine - Google Patents

Description

93698

Konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä, mikrokuplatyyppi-nen ultraäänikuvausaine 5 Esillä olevan keksinnön kohteena on konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä ultraäänikuvausaine, jota käytetään diagnostisia tarkoituksia varten.

Vuosista 1968-70 lähtien on ollut tunnettua, että kontras-10 tiin perustuvaa kaikukardiografiaa (sydänkäyrän piirtämistä) voidaan käyttää sydämensisäisten rakenteiden hahmottamiseen, läppätoiminnan arvioimiseen, sydämensisäisten ohitusten sel-villesaamiseen sekä sydänpussin nestepurkautuman todentamiseen (Gramiak ja Shah, 1968; ja Feigenbaum et ai, 1970). Sy-15 dämen ultraäänikuvauksella on potentiaalisesti huomattavia etuja vaivattomuuden, turvallisuuden ja alhaisten kustannusten suhteen verrattuna nykyisin käytössä oleviin diagnostisiin menetelmiin, kuten verisuonten kuvaukseen, joka edellyttää röntgensäteitä läpäisemättömien väriaineiden käyttöä 20 röntgenkuvausta varten tai radionuklidikuvausaineden käyttä mistä radiokuvausta varten. Ultraäänikuvauksen käytännön sovellutusten kehitys on kuitenkin viivästynyt tehokkaiden kliinisesti käytettävien kuvausaineiden puutteen johdosta.

25 Ultraäänikuvauksessa käytetään ultraäänikeilainta ääniaal tojen synnyttämistä ja vastaanottamista varten. Keilain asetetaan kehon pintaan kuvattavan alueen päälle ja ääniaallot suunnataan kohti tätä aluetta. Keilain ilmaisee heijastuneet ääniaallot ja muuttaa nämä tiedot kuviksi. Kun ultraääni-30 energiaa siirretään jonkin aineen kautta, tämän aineen akustiset ominaisuudet ovat riippuvaisia äänienergian siirtonopeudesta ja kyseisen aineen tiheydestä. Muutokset aineen akustisissa ominaisuuksissa (esimerkiksi akustisessa impedanssissa) ovat huomattavimpia eri aineiden rajapinnoissa, 35 kuten nesteen ja kiinteän aineen tai nesteen ja kaasun rajapinnassa. Siten ultraäänienergiaa lähetettäessä väliaineen läpi akustisten ominaisuuksien muutokset aiheuttavat voimak 93698 2 kaammat ääniheijastussignaalit, jotka ultraäänikeilain havaitsee.

Ultraäänikuvausaineet voivat käsittää pieniä kiinteitä tai 5 kaasumaisia aineosia, jotka kiertojärjestelmään ruiskutettuina antavat paremman ääniheijastuman ja kuvaselvyyden. Mikrokuplatyyppiset kuvausaineet sisältävät pieniä kaasukuplia (tavallisesti ilmakuplia), jotka on hajotettu kantaja-nesteeseen ruoansulatuskanavan ulkopuolista ruiskutusta var-10 ten. Nämä "mikrokuplat" siirretään kiertojärjestelmän avulla kuvattavaan elimeen.

On ehdotettu ilmamikrokuplien dispersion muodostamista lämpimään vesipitoiseen gelatiiniliuokseen, minkä jälkeen tämä 15 liuos jäähdytetään jähmettymislämpötilaan asti mikrokuplien vangitsemiseksi. Tätä varten hyytynyt dispersio on lämmitettävä nesteytymiseensä asti ja ruiskutettava ruoansulatuskanavan ulkopuolella näiden mikrokuplien ollessa hajaantuneina nestemäiseen liivatteeseen. (Tickner, et ai, US-patenttijul-20 kaisu 4 276 885; ja Tickner et ai, National Technical Information Service Report HR-62917-IA, huhtikuu, 1977).

Liivatteeseen vangituilla mikrokuplilla on verenvirtaukseen jouduttuaan lyhyt elinikä. Ne hajoavat nopeasti. Toisena 25 haittana on se, että mikrokuplat ovat liian suuria kulkeak-seen kapillaarikerrosten läpi ja siten ne eivät ole soveliaita käytettäviksi sydänkuvauksessa laskimonsisäistä ääreis-käsittelyä varten.

30 Tri Steven B. Feinsteinin keksimät sonikaation avulla tuotetut mikrokuplakuvausaineet edustavat tärkeää edistysaskelta tällä alalla. Käyttämällä viskoosisia vesipitoisia liuoksia, jotka sisälsivät esimerkiksi 70 % sorbitolia tai deks-troosia, tri Feinstein sai aikaan mikrokupladispersion näi-35 den liuosten suurenergisen sonikaation avulla. Tulokseksi saadut mikrokuplat olivat kooltaan alle 10 μπι ja ne kykenivät kulkemaan kapillaarikerrosten läpi. Näiden mikrokuplien kestoaika, vaikka se olikin vain muutamien minuuttien suu 93698 3 ruusluokkaa, mahdollisti kuvausaineen valmistamisen ja sen ruiskuttamisen laskimonsisäisesti sydänkuvausta varten. (Feinstein, et ai, 1984; ja Feinstein US-patenttijulkaisu 4 572 203.) 5 Tämän jälkeen tri Feinstein yritti parantaa mikrokuplien pysyvyyttä. Hän havaitsi, että lämpöherkän valkuaisaineen, kuten albumiinin, sonikaation avulla saatiin tulokseksi stabiliteetiltaan parempia mikrokuplia. (Ks. Feinstein, PCT palo tenttihakemus WO 84/02838, joka vastaa hyväksyttyä US-pa-tenttihakemusta No. 805 975, jätetty sisään 5. joulukuuta, 1985). Mikrokuplapitoisuudet 10-14 x 106mikrokuplaa/milli-litra voitiin saavuttaa kooltaan 2-9 μιη olevien kuplakokojen yhteydessä (Keller, Feinstein ja Watson, 1987). Mikrokuplat 15 pysyivät olemassa 24-48 tunnin ajan.

Tämä tri Feinsteinin sonikaation avulla valmistama mikrokup-lakuvausaine ei ollut kuitenkaan riittävän pysyvä kaupallista valmistusta varten. Viikkojen ja kuukausien pysyvyyttä 20 (muutamien tuntien tai päivien asemasta) vaaditaan kuvaus-aineen valmistuksen sallimiseksi jossain keskuspaikassa ja sen jakamiseksi sitten eri sairaaloihin Yhdysvalloissa tai muissa maissa. Kaupallisiin tarkoituksiin tapahtuvaa valmistusta varten on kuljetusjärjestelyjen ja sairaalavarastoin-25 nin oltava ennakolta valmiina, ja kuvausaineen pysyvyyden on oltava vähintään neljä viikkoa ja sopivimmin ainakin kahdeksan viikkoa tai enemmänkin.

Lisäksi kaikkein tehokkainta kuvausta varten on suotavaa 30 käyttää mahdollisimman suurta mikrokuplapitoisuutta kuvaus-aineessa. Haluttujen pienikokoisten mikrokuplien määrä pyrkii kuitenkin vähenemään sonikaation avulla valmistetuissa albumiiniliuoksissa. Pienikokoisten kuplien keskinäistä hankausta saattaa esiintyä joko mikrokuplien kokoonpuristumisen 35 tai niiden ylisuuriksi mikrokupliksi yhtymisen johdosta. Siten keksinnön eräänä tärkeänä lisätavoitteena on ollut keinon aikaansaaminen mikrokuplien määrän lisäämiseksi kuvaus-aineessa. Erittäin paljon mikrokuplia sisältävä kuvausaine 93698 4 on luontaisesti parempi ja sisältää turvatekijän. Kun mikro-kuplien määrä ylittää tehokasta kuvausta vaaditun minimimäärän, voidaan hyväksyä kooltaan haluttujen mikrokuplien jossain määrin tapahtuva häviäminen.

5

Esillä olevan keksinnön mukaisesti aikaansaadaan konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä ultraäänikuvausaine, jolle on tunnusomaista, että se käsittää ruoansulatuskanavan ulkopuo-lisesti annettavan vesipitoisen väliaineen, joka sisältää 10 dispersion, jossa on mikropalloja, joista vähintään 80 %:lla on läpimitta välillä 1-9 μιη, jotka mikropallot muodostuvat kaasumikrokuplista, jotka on koteloitu veteen liukenemattomaan, lämmön avulla denaturoitavissa olevaan biologisesti sopivaan valkuaisaineeseen, joka kuvausaine omaa homogeeni-15 sesti dispergoituneen konsentraation, joka on suurempi kuin 100 x 106 mikropalloa/ml, ja ylläpitää tämän konsentraation yli neljän viikon ajan lämpötilassa 20-25°C. Suositeltavammissa sovellutusmuodoissa saavutetaan suuruusluokkaa 300 -500 x 106 mikropalloa/millilitra olevat konsentraatiot. Häm-20 mästyttävää kyllä, nämä erittäin korkeat konsentraatiot voidaan ylläpitää yli kahdeksan viikon ajan. Esillä olevan keksinnön mukaiset kuvausaineet sopivat siten kaupallista valmistusta ja jakelua varten. Kuljetuksen jälkeen niitä voidaan säilyttää sairaaloiden varastossa useiden viikkojen 25 ajan, jolloin ne ovat tarvittaessa käytettävissä diagnosti-• siin tarkoituksiin.

Erään keksinnön mukaisen edullisen sovellutusmuodon mukaisesti aikaansaadaan konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä 30 ultraäänikuvausaine suonensisäistä ruiskutusta varten, jolle on tunnusomaista, että se käsittää ihmisseerumialbumiinin steriilin vesipitoisen liuoksen, joka sisältää dispersion, jossa on mikropalloja, joista vähintään 80 %:lla on läpimitta välillä 1-9 μπι, jotka mikropallot muodostuvat ilmakuplas-35 ta, joka on koteloitu mainitun albumiinin veteen liukenemattomaan kerrokseen, joka kuvausaine omaa homogeenisesti dispergoituneen konsentraation, joka on 300-600 x 106 mikropal- 5 93698 loa/ml ja ylläpitää tämän konsentraation vähintään kahdeksan viikon ajan lämpötilassa 20-25°C.

Esillä olevan keksinnön mukaiset kuvausaineet valmistetaan 5 lämmön avulla denaturoitavasta biologisesti sopivasta valkuaisaineesta asteittaisen sonikaation avulla. Samalla tavoin kuin Feinsteinin menetelmässä asetetaan vesipitoinen valku-aisaineliuos sonikaation alaiseksi kaasumikrokuplien muodostamiseksi kuumentamalla tämä liuos samalla valkuaisaineen 10 pienten osien tekemiseksi veteen liukenemattomiksi. Parannetussa sonikaatiomenetelmässä, joka johtaa erittäin stabiilien mikrokuplien lisääntyneeseen konsentraatioon, käytetään kuitenkin uutta peräkkäistä sonikaatiotapaa. Sonikaation alkuvaiheessa sonikaattoritorvi asetetaan suoraan kosketukseen 15 liuoksen kanssa (so. upottamalla se aivan liuoksen yläpinnan alapuolelle). Tämä alkusonikaatio suoritetaan liuoksen huomattavammin vaahtoamatta. Sonikaation seuraavassa vaiheessa synnytetään vaahtoa. Sonikaatiotorvi vedetään pois ulkoiseen ilmakehään, mutta kuitenkin lähelle liuoksen pintaa. Tällöin 20 tapahtuu runsaasti vaahtoamista ja aerosoloitumista. Mikro-kuplien määrä lisääntyy tällöin suuresti ja mikrokuplat tulevat koteloiduiksi denaturoidulla valkuaisaineella erittäin stabiilien mikropallojen muodostaman dispersion saavuttamiseksi. Näiden mikropallojen stabiilisuus mahdollistaa lisäk-25 si niiden tiivistämisen ja/tai fraktionoimisen. Tällaisten käsittelymenetelmien avulla kuplapitoisuus voidaan kaksin-tai kolminkertaistaa ja ylisuuret kuplat eliminoida.

Aluksi muodostettujen mikropallojen konsentraatio voi esi-3 0 merkiksi olla 50 - 150 x 106. Kelluntaerotukseen perustuvan-tiivistysmenetelmän avulla mikropallojen konsentraatio voidaan nostaa arvoon 200 - 600 x 106 mikropalloa/millilitra. Erään toisen kelluntatyyppisen erotusmenetelmän avulla useimmat kooltaan yli 10 μπ\ olevat mikrokuplat voidaan pois-35 taa, jolloin tulokseksi saadaan pääasiassa läpimitaltaan huomattavasti alle 10 μιη olevat mikropallot käsittävä ku-vausaine. Vähintään 80 %:lla näistä mikropalloista on läpimitta välillä 1-9 μιη.

93698 6

Oheiset piirustukset esittävät suositeltavaa menetelmää esillä olevan keksinnön mukaisen ultraäänikuvausaineen valmistamista varten.

5 Kuviot IA-ID esittävät eri vaiheita peräkkäisessä sonikaa- tiomenetelmässä; kuvio 2 esittää kuvion IB linjaa 2-2 pitkin otettua poikki-leikkauskuvantoa, näyttäen sonikaattoritorven sekä sonikoi-tavaa albumiiniliuosta sisältävän ruiskun sisäpuolen välisen 10 suhteen; kuvio 3 esittää erotusastiaa, jossa mikropallodispersioiden lisämäärät yhdistetään kelluntaerotustiivistämistä varten; kuviot 4, 4A ja 4B esittävät mikropallodispersioiden frak-tionointimenetelmää ylisuurten mikropallojen poistamista 15 varten; kuvio 5 esittää graafisesti kokeiden perusteella saatuja tietoja näyttäen mikropallojen pitoisuuden valmistetussa kuvausaineessa sekä niiden varastointistabiilisuuden.

20 Tämän keksinnön toteuttamista varten käytettynä alkumateri aalina on biologisesta sopivasta materiaalista tehty vesi-liuos. Koteloivan materiaalin olisi myös oltava lämpöherkkä, niin että se voidaan tehdä osittain veteen liukenemattomaksi kuumentamisen avulla sonikaation aikana. Yksityiskohtaisem-25 min tarkastellen kuumennetaan sonikaation yhteydessä pieni ♦ osa hajaantunutta biologisesti sopivaa materiaalia tai sitä käsitellään muulla tavoin, niin että sen liukenevuus vähenee. Tämän tuloksena saadaan pieni määrä kiinteässä tilassa olevaa materiaalia, joka muodostaa koteloivat kerrokset mik-30 ropallojen ympärille. Käytetään lämpöherkkää valkuaisainet ta, kuten albumiinia, hemoglobiinia, kollageenia jne. Käyttöä varten ihmisiin ihmisproteiini on suositeltavin. Ihmisen seerumialbumiini (HSA) on erityisen sopiva tähän tarkoitukseen. Tätä seerumialbumiinia on saatavissa kaupallisesti 35 steriilinä 5 % vesiliuoksena, jota voidaan käyttää suoraan aloitusmateriaalina mikropallojen valmistamista varten. Muitakin albumiinin tai toisten lämmön avulla denaturoitavien valkuaisaineiden konsentraatioita voidaan käyttää. Tämä HSA- 7 O X G O / o O / u konsentraatio voi vaihdella esimerkiksi 1-25 painoprosentin välillä.

Kaupallisesti saatavissa olevia sonikaattorilaitteita voi-5 daan käyttää tämän keksinnön yhteydessä. Sonikaattoriväräh-telytaajuudet voivat teoreettisessa mielessä vaihdella sangen laajalla alueella, kuten 5-30 kHz, useimpien kaupallisesti saatavien sonikaattorien toimiessa kuitenkin taajuudella 20 kHz tai 10 kHz. 20 kHz sonikaattorit sopivat hyvin 10 tämän keksinnön yhteyteen. Tällaisia sonikaattorilaitteita on saatavissa Heat Systems-Ultrasonics, Inc'stä, Farmingda-le, New York, tai muista yhtiöistä. Ultrasonics Model W-380:tä tai vastaavanlaisia malleja voidaan käyttää yhdessä tasakärkisen erittäin tehokkaan sonikaattoritorven kanssa.

15 Sonikaattoritorveen kohdistettua tehoa voidaan vaihdella tehosäätimien välityksellä, jotka niiden valmistaja on varustanut 1-10 olevilla asteikoilla, kuten esimerkiksi Ultrasonics Model W 380 -mallin yhteydessä. Myös välitehosäätöä voidaan käyttää (esimerkiksi välillä 4 - 8). Värähtelytaa-20 juuden ja käytetyn tehon on tällöin oltava riittäviä aiheuttaakseen kavitaation sonikoitavassa nesteessä.

Sonikoitava liuos voidaan käsitellä pieninä osina. Esimerkiksi 8 ml suuruiset liuosmäärät voidaan sonikoida yksilöi-25 lisesti. Alkusonikaatio voidaan suorittaa tasapäisen sonikaattoritorven ollessa kosketuksessa kyseisen liuoksen kanssa, sopivimmin upotettuna liuoksen yläosaan. Upotus on suositeltavaa alkusonikaation suorittamiseksi ilman huomattavampaa vaahtoamista. Tehonsäädöllä 4-6 voidaan alkusoni-30 kaatio suorittaa alle minuutissa (so. 15 - 45 sekunnissa).

Heti sonikaation alkuvaiheen jälkeen sonikaattoritorvi vedetään pois liuoksen yläpuolelle, mutta kuitenkin liuoksen yläpinnan läheisyyteen. Toisessa vaiheessa sonikaatio suori-35 tetaan tarkoituksellisesti siten, että liuos vaahtoaa voimakkaasti, toisin kuin tavanomaisten sonikaatioiden yhteydessä, jolloin vaahtoamista pyritään välttämään. Esillä olevan keksinnön tarkoituksia varten vaahtoaminen ja aerosoloi- 93698 8 tuminen ovat tärkeitä tekijöitä konsentraatioltaan ja sta-biilisuudeltaan lisääntyneen kuvausaineen saavuttamiseksi.

Vaahtoamisen edistämiseksi voidaan sonikaattoriin syötettyä 5 tehoa lisätä toisessa vaiheessa. Tehonsäädin voidaan siirtää esimerkiksi alkuperäisestä asetusarvosta 4 arvoon 6. Soni-kaation toinen vaihe voidaan suorittaa alle minuutissa (so. 15 - 45 sekunnissa). Sonikaatioon kuluva kokonaisaika sekä ensimmäistä että toista vaihetta varten voi olla yhden mi-10 nuutin suuruusluokkaa. Esimerkiksi 25 - 35 sekuntia kestävää sonikaatiota voidaan käyttää kummassakin vaiheessa. Toisen sonikaatiovaiheen yhteydessä syntyvän vaahtoamisen ilmaisevat välittömästi liuoksen sumuinen ulkonäkö sekä tulokseksi saatu vaahto.

15

Peräkkäisen sonikaation avulla, joka käsittää kavitaatiovai-heen ja sitä seuraavan vaahdotusvaiheen, voidaan koteloitujen mikrokuplien, joita tässä yhteydessä kutsutaan "mikro-palloiksi", pitoisuutta suuresti lisätä. Yli 25 x 106 mikro-20 palloa/millilitra olevat konsentraatiot, kuten 50 - 150 x 106 konsentraatiot, ovat helposti saavutettavissa. Lisäksi tulokseksi saatujen mikropallojen läpimitat ovat yleensä alle 10 μπι. 80 % tai enemmän mikropalloista ovat läpimitaltaan 1-9 μιη, keskimääräisen läpimitan ollessa 4-6 μπι.

25 t Kun sonikaatio suoritetaan kosketuksessa ilmaan, esimerkiksi ympäröivään ilmakehään, mikropallot saavat ilmaa sisältävät keskukset. Ilman uskotaan olevan sopivin ympäristöllinen väliaine, mutta haluttaessa sonikaatio voitaisiin suorittaa 30 muidenkin kaasujen (so. typen, hapen, hiilidioksidin jne.) alaisena.

Valmistuksen alkuvaiheen jälkeen mikropallodispersioita voidaan käsitellä edelleen konsentraation lisäämiseksi ja/tai 35 liian suurten mikropallojen poistamiseksi. Koska mikropallot ovat kelluvia, ne pyrkivät nousemaan dispersion pintaan. Pitämällä dispersio lepotilassa sitä hämmentämättä useiden tuntien (so. 4 - 12 tunnin) ajan, useimmat mikropallot nou- 93698 9 sevat pintaan ja tiivistyvät selkeytetyn liuoksen päällä olevaan yläkerrokseen. Tämän mikropallojen sanottuun pääl-liskerrokseen tapahtuvan "kelluntaerotuksen" avulla voidaan selkeytetyn liuoksen osat poistaa mikropallojen alta ja saa-5 da siten tulokseksi suuremmalla mikropallopitoisuudella varustettu dispersio. Esimerkiksi 50 - 75 % liuosmäärästä voidaan poistaa tämän konsentraatioprosessin yhteydessä.

Joko ennen edellä selostettua konsentraatiovaihetta tai sen 10 jälkeen voidaan suorittaa liian suurten mikropallojen kel- luntaerotus. Suurilla mikropalloilla, joiden läpimitat ylittävät esimerkiksi 10 μιη, on suhteellisesti suurempi kellu-vuus. Ne nousevat siten nopeammin liuoksen pintaan. Käyttäen lyhyttä pitoaikaa, esimerkiksi 15 - 45 minuuttia, voidaan 15 kooltaan suurimmatkin mikropallot kerätä valinnaisesti dispersion päällä olevaan ohueen yläkerrokseen, joka yhä sisältää pääasiassa kaikki kooltaan pienet mikropallot. Poistamalla tämä mikropallodispersio liian suurten mikropallojen muodostaman kerroksen alta voidaan saavuttaa fraktionointi, 20 jonka yhteydessä suuremmat mikropallot pysyvät siinä astiassa, jossa tämä fraktionointi suoritetaan.

Tämän kaksivaiheisen sonikaation ja kelluntaerotuskonsent-raation muodostaman yhdistelmän avulla tuotettu kuvausaine 25 voi sisältää homogeenisesti hajaantuneen konsentraation, . joka on suurempi kuin 300 x 106, esimerkiksi 300 - 900 x 106 (3 - 9 x 108) mikropalloa/millilitra. Suuret konsentraatiot voidaan säilyttää pitkien ajanjaksojen ajan pitämällä niitä ympäristöllisessä huonelämpötilassa (20-25°C). Yli 200 ja 30 tyypillisesti yli 300 x 106 mikropalloa/millilitra olevat konsentraatiot voidaan ylläpitää ainakin neljän ja tavallisesti kahdeksan tai useammankin viikon ajan.

Kuviossa IA on esitetty 10 ml ruisku, jossa on avoin yläosa 35 ja sulkuhanatyyppinen venttiili ruiskun alhaalla olevassa poistopäässä. Ruisku täytetään 8 ml tasoon asti 5 % albumii-niliuoksella (HSA). Sonikaattoritorvi asetetaan ruiskuun 7 : ml tasoon asti eli kirjaimella T, kuviossa IB esitettyyn 93698 10 asentoon. Tässä asennossa oleva sonikaattoritorvi on upotettuna liuoksen yläosaan, liuoksen tason ollessa kuviossa IB esitetyn kaltainen. Alkusonikaatio suoritetaan pääasiassa liuoksen vaahtoamatta.

5 Välittömästi alkusonikaation jälkeen ja sonikaattoria sulkematta torvi vedetään 10 ml tasolle eli kirjaimella T2 merkittyyn asentoon kuviossa 1C. Tehonsyöttöä sonikaattoritor-veen voidaan myös lisätä torvea vedettäessä T2-asentoon.

10 Välittömästi tämän poisvedon jälkeen albumiiniliuos alkaa vaahdota ja liuos tulee ulkonäöltään maitomaiseksi. Liuos vaahtoaa ylöspäin sonikaattoritorven ympärillä toisen vaiheen aikana. Vaahdotetun liuoksen ulkonäkö on esitetty kuviossa ID, mikrokuplien ollessa näytettyinä huomattavasti 15 suurennetuilla läpimitoilla varustettuina niiden todellisiin mikronikokoihin verrattuna.

Sonikoitava liuos sisältää sekä liuennutta että mukana kulkeutunutta ilmaa. Liuos on kosketuksessa sonikaattoritorven 20 ympärillä olevan ilmakehän kanssa. (Torven ja ja ruiskun sisäpuolen välinen välysetäisyys on nähtävissä kuvion 2 esittämässä poikkileikkauskuvannossa.) Ilmakosketus helpottaa liuoksen vaahtoamista ja aerosoloitumista sonikaation toisessa vaiheessa.

25 . Useista sonikaatioeristä saadut dispersiot voidaan yhdistää konsentraatiota varten. Esimerkiksi useita dispersioannoksia voidaan syöttää erotusastiaan, joka voi olla suuri ruisku tai erotussuppilo varustettuna pohjassaan olevalla poisto-30 aukolla, jota laskuventtiili valvoo. Tällainen erotusastia on esitetty suuren ruiskun muodossa kuviossa 3. Pitämällä yhdistettyjä dispersioita useiden tuntien ajan lepotilassa niitä hämmentämättä, kuten esimerkiksi yön yli, mikropallot nousevat liuoksen pintaan ja muodostavat kelluntaerotettujen 35 mikropallojen kerroksen. Tämän kerroksen alapuolella oleva selkeytetty albumiiniliuos on pääasiassa vapaa mikropallois-ta. On siten mahdollista poistaa suurin osa liuoksesta poh-: jassa olevan laskuaukon kautta. Esimerkiksi 1/2 - 3/4 liuok- 11 Q 7 < go ; ju7u sesta voidaan poistaa tällä tavoin. On kuitenkin suotavaa säilyttää riittävä liuosmäärä konsentroitujen mikropallojen täydellisen uudelleendispersion mahdollistamiseksi.

5 Kuvio 4 esittää mikropallokonsentraatiota, näiden mikropalloj en ollessa uudelleendispergoituja. Mikropallot ovat riittävän stabiileja, niin että ne eivät kiinnity pysyvästi toisiinsa muodostaakseen konsentroidun kerroksen, vaan pysyvät erillisinä ehjinä mikropalloina. Ne voidaan helposti disper-10 goida uudelleen kevyesti hämmentämällä.

Uudelleendispersion jälkeen pääasiassa homogeeniseen tilaan voidaan fraktionointi suorittaa liian suurten mikropallojen poistamiseksi. Pitämällä tämä uudelleen muodostettu disper-15 sio lepotilassa lyhyen ajan, esimerkiksi noin 30 minuuttia, nousevat läpimitaltaan suurimmat mikropallot ensin pintaan kerääntyen kerrokseksi kuvion 4A esittämällä tavalla. Tämän tapahduttua näiden kooltaan liian suurten mikropallojen alla oleva mikropallodispersio voidaan poistaa laskuventtiilin 20 kautta. Kun yhteenkerääntyneet liian suuret mikropallot lähestyvät tätä venttiiliä, venttiili sulkeutuu, jolloin liian suurten mikropallojen muodostama kerros pysyy erotusastiassa kuvion 4B mukaisesti. Tällä tavoin saatu tuote käsittää tiivistetyt fraktionoidut albumiinimikropallot, joista ainakin 25 80 % on läpimitaltaan 1-9 μπι. Suositeltava tuote sisältää . vähintään 90 % läpimitaltaan 2-8 μπι olevia mikropalloja.

Lisäyksityiskohtia nykyisin parhaana pidetyistä menetelmistä selostetaan seuraavassa.

30

Sonikaatio suoritetaan siten, että poikkileikkaukseltaan soikea 10 ml ruisku, jonka alhaalla olevaan poistopäähän on kiinnitetty laskuhana, täytetään 8 ml merkkiin asti steriilillä 5 % ihmisseerumialbumiinilla. Poikkileikkaukseltaan 35 pienempi sonikaattorikoetin asetetaan ruiskuun siten, että koettimen pohja tulee 7 ml merkin kohdalle. Sonikaatio suoritetaan energiasäädöllä 6,30 sekunnin ajan, minkä jälkeen • (sonikaattorin ollessa yhä toiminnassa) koetinkärki siirre- ----- 1 __ 93698 12 tään 10 ml merkkiin asettaen samalla energiasäätö arvoon 8. Sonikaatiota jatketaan 25 sekunnin ajan. Sonikaattori suljetaan, koetin poistetaan ja ruiskun sisältö tyhjennetään 60 ml ruiskuun tai erotussuppiloon, jonka pohja-aukon toimintaa 5 valvoo sulkuhana. Viisi - kuusi ruiskutilavuutta yhdistetään toisiinsa.

Konsentraatio suoritetaan antamalla toisiinsa yhdistettyjen osatilavuuksien olla lepotilassa yön yli (8-12 tuntia) niitä 10 hämmentämättä erotusastiassa. Kun pääasiassa kaikki mikro-pallot ovat muodostaneet liuoksen päällä olevan kerroksen, 2/3 liuosmäärästä poistetaan pohja-aukon kautta.

Fraktionointi suoritetaan suspendoimalla uudelleen mikropal-15 lot ja täyttämällä 60 ml ruisku niiden avulla. Tämän näytteen annetaan olla lepotilassa 30 minuutin ajan, minkä jälkeen koko näyte viimeistä 3-4 ml lukuunottamatta tyhjennetään kokooja-astiaan. Kooltaan liian suuret mikropallot ovat jäljellä. Näyte tarkastetaan ja lasketaan sen konsentraatio, 20 keskiläpimitta sekä alle 10 μπ\ läpimittaisten pallojen prosentuaalinen osuus. Jos vähemmän kuin 99,5 % palloista on läpimitaltaan alle 10 μπι, suoritetaan fraktionointi uudelleen. Jos uudelleendispersiota vaaditaan, voidaan konsentraatio säätää uudelleen 5 % HSA:n avulla.

25 . Konsentraatiomittaukset on esitetty seuraavassa taulukossa A kolmea edustavaa koetta varten, joiden yhteydessä on käytetty edellä selostettuja menetelmiä. Dispersioiden alkukonsen-traatio sonikaation jälkeen oli suuruusluokkaa 130 - 140 x 30 106/ml. Tämä konsentraatio lisääntyi kelluntaerotusmenetelmän avulla arvoon 340 - 450 x l06/ml.

Tuotevalvontaa varten voidaan mikropallot laskea käyttäen Coulter Counter -laskinta, jota on saatavissa Coulter Elec-35 tronics, Inc'stä, Highleah, Florida (so. Coulter Counter Model TAII). Edellä mainitut mikropallomäärät on laskettu tällä tavoin.

93698 13

Kyseisen tuotteen stabiilisuus tarkastettiin 20 viikkoa kestävän tutkimusjakson kuluessa. Alkukonsentraatio oli noin 4,31 x 108 (431 x 106) mikropalloa/millilitra. Konsentraa-tiomittaukset tehtiin noin viikon välein. Saaduista tulok-5 sista on tehty yhteenveto taulukossa B. Coulter Counter -laskimen avulla tehdyt mittaukset on esitetty graafisesti kuviossa 5. Näytteet pidettiin ympäröivässä huonelämpötilassa (20-25°C). Suuruudeltaan noin 400 x 106 mikropalloa/millilitra olevaa konsentraatiota ylläpidettiin 20 viikon ajan. 10 Tämä on todisteena korkeasta stabiilisuusasteesta huonelämpötilassa.

Mikropallojen stabiilisuuteen voivat vaikuttaa epätavallisen kuumat tai kylmät lämpötilat. Kuitenkin jopa lämpötiloissa, 15 jotka ovat 4-37°C, voidaan mikropallojen yli 200 x 106/ml oleva konsentraatio ylläpitää kahdeksan viikon ajan ja pi-temmäksikin aikaa. Kaupallisen jakelun tai pitkäaikaisen varastossapidon yhteydessä olisi kuitenkin vältettävä erittäin korkeita tai matalia lämpötiloja. Paras säilytyslämpö-20 tila on huonelämpötila. Mikropallojen lämpötilaa voidaan suojella kuljetuksen aikana.

TAULUKKO A

Konsentraatiomittaukset 25 Mikropalloja/ml Mikropalloja/ ; Koe_sonikaation jälkeen_konsentraation jälkeen A 135 x 106 386 x 106 B 141 x 106 483 x 106 C 133 X 106 440 X 106 30 9 3 6 9 8 14

TAULUKKO B

Viikko_Mikropalloien konsentraatio x 108 0 4,31 1 4,49 5 2 4,20 3 3,91 4 3,86 5 4,25 6 4,06 10 7 4,12 8 3,92 9 3,94 10 3,97 11 3,48 15 12 3,48 13 4,09 14 3,70 15 4,92 17 4,15 20 18 3,99 19 4,14 li 93698 15

KIRJALLISUUSVIITTEET

Feigenbaum, et ai. (1970), Circulation 41:615-621.

Feinstein, US-patenttijulkaisu 4 572 203.

5 Feinstein PCT-patenttihakemus W0 8402838.

Feinstein, et ai. (1984, J. Am. Coll. Cardiol. 3:14-20. Gramiak ja Shah (1968), Invest. Radioi. 3:356-358.

Keller, Feinstein ja Watson (1987), Amer. Heart .. 114:570-575.

10 Tickner et ai. US-patenttijulkaisu 4 276 885.

Tickner et ai., National Technical Information Service Report, HR 62917-1A, huhtikuu 1977, S. 34-40.

«

Claims (9)

93698

1. Konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä ultraääniku-vausaine, tunnettu siitä, että se käsittää ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annettavan vesipitoisen väliaineen, 5 joka sisältää dispersion, jossa on mikropalloja, joista vähintään 80 %:lla on läpimitta välillä 1-9 μπι, jotka mikro-pallot muodostuvat kaasumikrokuplista, jotka on koteloitu veteen liukenemattomaan, lämmön avulla denaturoitavissa olevaan biologisesti sopivaan valkuaisaineeseen, joka kuvausai-10 ne omaa homogeenisesti dispergoituneen konsentraation, joka on suurempi kuin 100 x 106 mikropalloa/ml, ja ylläpitää tämän konsentraation yli neljän viikon ajan lämpötilassa 20-25°C.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kuvausaine, tunnettu sii-15 tä, että mikropallojen homogeenisesti dispergoitunut kon- sentraatio on suurempi kuin 200 x 106 mikropalloa/ml, ja että kuvausaine ylläpitää tämän konsentraation yli neljän viikon ajan lämpötilassa 20-25°C.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kuvausaine, tunnettu siitä, että mikrokuplat on koteloitu ihmisseerumialbumiinin avulla.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kuvausaine, tunnettu 25 siitä, että mikropallot ovat suspendoidut sen saman valkuaisaineen vesipitoiseen liuokseen, johon mikrokuplat ovat koteloidut.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen kuvausaine, tunnettu 30 siitä, että sen homogeenisesti dispergoitunut konsentraatio on 300-600 x 106 mikropalloa/ml, ja että kuvausaine ylläpitää tällaisen konsentraation vähintään kahdeksan viikon ajan lämpötilassa 20-25°C.

6. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen kuvausaine, tun nettu siitä, että valkuaisaine on ihmisseerumialbumiini. 93698

7. Patenttivaatimuksen 4 tai 5 mukainen kuvausaine, tunnettu siitä, että 90 %:lla tai enemmän mikropalloista on läpimitta välillä 2-8 μπι.

8. Konsentroitu, huoneenlämpötilassa pysyvä ultraääniku- vausaine suonensisäistä ruiskutusta varten, tunnettu siitä, että se käsittää ihmisseerumialbumiinin steriilin vesipitoisen liuoksen, joka sisältää dispersion, jossa on mikropallo-ja, joista vähintään 80 %:lla on läpimitta välillä 1-9 μπι, 10 jotka mikropallot muodostuvat ilmakuplasta, joka on koteloi tu mainitun albumiinin veteen liukenemattomaan kerrokseen, joka kuvausaine omaa homogeenisesti dispergoituneen konsen-traation, joka on 300-600 x 101 2 3 4 5 mikropalloa/ml ja ylläpitää tämän konsentraation vähintään kahdeksan viikon ajan lämpö-15 tilassa 20-25°C.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen kuvausaine, tunnettu siitä, että vähintään 90 %:lla mikropalloista on läpimitta välillä 2-8 μιη. 20