NO176826B - Konsentrert, romtemperaturstabilt ultralydbildemiddel av mikrobobletype - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et konsentrert, romtemperaturstabilt ultralydbildemiddel.

Det har vært kjent siden 1968-70 at kontrastekkokardio-grafi kan anvendes for å avbilde iritrakardiale strukturer, vurdere knappefunksjon, påvise intrakardiale shunter og identifisere perikardial effusjon. (Gramiak og Shah, 1968

og Feigenbaum et al., 1970). Ultralydavbildning av hjertet har potensielt viktige fordeler ved anvendelighet, sikker-het og reduserte omkostninger fremfor nåværende diagnostiske fremgangsmåter, slik som angiografi, som påkrever anvendelse av radio-opake fargestoffer for røntgenstråleavbildning, eller anvendelse av radio-nuklide bildemidler for radioav-bildning. Imidlertid har fremskritt ved praktiske anvendel-ser av ultralydavbildning blitt forsinket på grunn av mangelen på effektive klinisk anvendelige bildemidler.

Ved ultralydavbildning anvendes en ultralydscanner for å frembringe og motta lydbølger. Scanneren plasseres på en kroppsoverflate som ligger over området som skal avbildes, og lydbølger rettes mot dette område. Scanneren påviser reflek-terte lydbølger og oversetter disse data til bilder. Når ultralydenergi overføres gjennom et stoff, avhenger de akustiske egenskaper til stoffet av overføringshastigheten til og tettheten av stoffet. Forandringer av stoffets akustiske egenskaper (f.eks. variasjoner i akustisk impedans) er mest frem-tredende ved grenseflatene av forskjellige stoffer, som en væske-faststoff-grenseflate eller en væske-gass-grenseflate. Når ultralydenergi ledes gjennom stoffer, vil forandringer i akustiske egenskaper følgelig føre til mer intense lydreflek-sjonssignaler for påvisning ved hjelp av ultralydscanneren.

Ultralydbildemidler kan bestå av små faste eller gass-formige partikler som, når de injiseres i kretsløpssystemet, tilveiebringer forbedret lydrefleksjon og avbildningsklar-het. Bildemidler av mikrobobletype består av meget små

bobler av en gass (vanligvis luft) som er dispergert i en bærervæske for parenteral injeksjon. "Mikroboblene" fraktes

av Kretsløpssystemet til organet som skal avbildes.

Det er foreslått å danne en dispersjon av luftmikro-bobler i en varm vandig gelatinoppløsning, og avkjøling av oppløsningen til en størkningstemperatur for å innesperre mikroboblene. For administrering oppvarmes den stivnede dispersjon inntil den smelter, og administreres parenteralt med mikroboblene dispergert i den smeltede gelatin. (Tickner et al. US patent nr. 4.276.885 og Tickner et al., National Technical Information Service HR-62917-1A, april, 1977).

Gelatin-innesperrede mikrobobler har en kort levetid ved innføring i blodstrømmen. De oppløses hurtig. En annen mangel er at mikroboblene er for store for å passere gjennom kapillærlag, og er derfor ikke egnet for hjerteavbildning ved perifer intravenøs administrering.

Fremleggelsen ved dr. Steven B. Feinstein av sonikeringsfremstilte bildemidler av mikrobobletype, representerte et viktig fremskritt i teknikken. Ved anvendelse av viskøse vandige oppløsninger, som 70% sorbitol eller dextrose, frem-stilte dr. Feinstein en dispersjon av mikrobobler ved høy-energetisk sonikering av oppløsningene. De dannede mikrobobler var av størrelse mindre 1.0 ym, og var i stand til å passere gjennom kapillærlag. Vedvaringen av mikroboblene, ennskjønt i størrelsesorden noen få minutter, tillot av-bildningsmidlet å fremstilles og administreres intravenøst for hjerteavbildning. (Feinstein et al., 1984 og Feinstein US patent 4.572.203) .

Deretter forsøkte dr. Feinstein å forbedre vedvaringen av mikroboblene. Ved sonikering av varmefølsomt protein som albumin, fant han at mikrobobler med forbedret stabilitet ble erholdt. (Se Feinstein, PCT søknad WO84/02838, til-svarende godkjent US søknad med serie nr. 805.975, inngitt 5. desember 1985). Konsentrasjoner av mikrobobler med 10 til 14 x 10 mikrobobler pr. milliliter ble erholdt med boblestørrelser fra 2 til 9 ym (Keller, Feinstein og Watson, 1987). Mikroboblene vedvarte i 24 til 48 timer.

Imidlertid var ikke det sonikeringsfremstilte bildemiddel av albumin-mikrobobletype ifølge Feinstein tilstrekkelig stabilt for kommersiell fremstilling. Stabili-teter i størrelsesorden uker eller måneder (snarere enn timer eller dager) er påkrevet for ,å muliggjøre, fremstilling av et bildemiddel på et sentralt sted, og distribuering til hospitaler i USA og andre land. For kommersiell gjennomførbar fremstilling, transport og hospitallagring forut for anvendelse, behøves en stabilitetstid på minst 4 uker og fortrinnsvis minst 8 uker eller lengre.

For den mest effektive avbildning er det videre ønskelig å ha den høyest oppnåelige konsentrasjon av mikrobobler i bildemidlet. Imidlertid har bestanden av mikrobobler med de ønskede små størrelser en tilbøyelighet til å avta ved oppbevaring av de sonikerte albuminoppløsninger. Svinn av de små boblestørrelser kan forekomme enten ved sammenbrudd av mikroboblene eller ved sammensmeltning med overdimensjonerte mikrobobler. Følgelig har et videre viktig mål vært å finne midler for å øke konsentrasjonen av mikrobobler i bildemidlet. Et bildemiddel med meget høye mikroboblekon-sentrasjoner er ifølge sakens natur bedre, og en sikkerhets-faktor tilveiebringes. Med en konsentrasjon av mikrobobler høyere en minimum påkrevet for effektiv avbildning, kan noe tap av mikrobobler med den ønskede størrelse aksepteres.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et konsentrert, romtemperaturstabilt ultralydbildemiddel som er kjennetegnet ved at det er fremstilt ved en fremgangsmåte hvor en vandig oppløsning av et varmedenaturerbart, bioforenlig protein utsettes for sonikering under dannelse av gass-mikrobobler mens oppløsningen oppvarmes for å uoppløseliggjøre en del av proteinet, idet enden av sonikatortrakten under en innledende sonikeringsfase kontaktes direkte med oppløsningen, og sonikering og oppvarming av oppløsningen utføres uten vesentlig skumdannelse, deretter trekkes sonikatortrakten tilbake til en posisjon i den omgivende atmosfære umiddelbart i nærheten av overflaten av oppløsningen og oppløsningen skummes for å øke antallet mikrobobler, og mikroboblene innkapsles med denaturert protein, hvorved det fås en dispersjon av mikrosfærer med forhøyet konsentrasjon som er ca. 5 % når proteinet er humant serumalbumin, og som er stabilisert i minst 48 timer, videre oppbevaring av en hoveddel av den således erholdte mikrosfæredispersjon uten omristing i tilstrekkelig tid for å tillate mikrosfærene å stige og konsentreres i et øvre lag over den klarede proteinoppløsning, og atskillelse av en del av den klarede proteinoppløsning fra det konsentrerte lag, hvorved det fås en dispersjon med høy mikrosfærekonsentrasjon, eventuelt at en mikrosfærefraksjon inneholdende de største mikrosfærer som samles nær den øvre overflate av dispersjonen, etterlates.

Dette forbedrede bildemiddel omfatter et sterilt vandig medium inneholdende en dispersjon av mikrosfærer med diametere hovedsakelig mindre enn 10 ym, og er derved anvende-lig for parenteral intravenøs administrering. Mikrosfærene består av gass-mikrobobler innkapslet i et vann-uoppløselig-gjort bioforenlig materiale som albumin. Bildemidlet ifølge foreliggende oppfinnelse har en homogen, dispergert konsentrasjon høyere enn 100 x 10 (f.eks. 10 ) mikrosfærer pr. milliliter, noe som representerer et vesentlig fremskritt i teknikken. Denne høye konsentrasjon kan opprettholdes ved vanlige romtemperaturer (20 - 25°C) i utvidede tidsperioder

(4 til 8 uker eller lengre). I optimaliserte utførelser oppnåes mikrosfærekonsentrasjoner i størrelsesorden 300 til 500 x 10^ mikrosfærer pr. milliliter. Disse ultrahøye konsentrasjoner kan overraskende opprettholdes i over 8 uker. Bildemidlene ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor til-passet fremstilling og distribusjon på et kommersielt grunn-lag. Etter forsendelse kan de opprettholdes på lager av hospitaler i mange uker, og således være tilgjengelig for diagnostisk anvendelse som påkrevet.

Bildemidlene ifølge foreliggende oppfinnelse fremstilles som nevnt fra et varmedenaturerbart bioforenlig protein ved en trinnvis sonikeringsfremgangsmåte. Som ved fremgangsmåten ifølge Feinstein, utsettes en vandig oppløsning av

et protein for sonikering under dannelse av gass-mikrobobler, samtidig med at oppløsningen oppvarmes for å oppløseliggjøre små porsjoner av proteinet. Imidlertid anvender den forbedrede sonikeringsfremgangsmåte som fører til den økede konsentrasjon av ytterst stabile mikrobobler, en ny sekvensiell sonikering. I den innledende sonikeringsfase bringes sonikatortrakten direkte i kontakt med oppløsningen (dvs. ved nedsenking like under overflaten av oppløsningen). Denne inn-

ledende sonikering utføres uten merkbar skumming av oppløs-ningen. I den neste fase av sonikeringen befordres skumming. Sonikatortrakten trekkes tilbake til en posisjon i den omgivende atmosfære ovenfor, men nært inntil overflaten av oppløsningen. Intens skumming og aerosolering inntreffer. Bestanden av mikrobobler økes derved sterkt, og mikroboblene innkapsles med denaturert protein for å erholde en dispersjon av ytterst stabile mikrosfærer. I tillegg tillates stabiliteten av mikrosfærene at de kan konsentreres og/eller frak-sjoneres. Ved slike manipulasjoner kan boblekonsentrasjonen dobles eller tredobles, og overdimensjonerte bobler kan elimineres.

Konsentrasjonen av mikrosfærene som fremstilles inn-ledningsvis kan være fra 50 til 150 x IO<6>. Ved en flyte-adskillelsekonsentrasjonsfremgangsmåte kan mikrosfærekon-sentrasjonen økes til 200 til 600 x IO<6> mikrosfærer pr. milliliter. Ved en annen adskillelse av flyte-typen kan de fleste av mikroboblene med større størrelse enn 10 <y>m fjernes, noe som fører til ét bildemiddel overveiende sammensatt av mikrosfærer med diametere vesentlig mindre enn 10 ym. Minst 80%

av mikrosfærene kan f.eks. ha diametere i området fra 1 til 9 ym.

De medfølgende figurer illustrerer en foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av ultralydbildemidlet ifølge foreliggende oppfinnelse. Figurene IA til ID illustrerer trinnene i den sekvensielle sonikeringsfremgangsmåte. Figur 2 er et tverrsnittsbilde tatt på linje 2-2 i figur IB, som illustrerer forbindelsen av sonikatortrakten med innsiden av sprøyten som inneholder albuminoppløsningen som sonikeres. Figur 3 illustrerer en separeringsbeholder i hvilken forøkelser av mikrosfæredispersjonene sammenslåes for flyte-adskillelseskonsentrasjon. Figurene 4, 4A og 4B illustrerer en fremgangsmåte for fraksjonering av mikrosfæredispersjoner for å fjerne overdimensjonerte mikrosfærer. Figur 5 er et diagram av eksperimentelle data som viser konsentrasjonen av mikrosfærene i bildemidlet som fremstilt, og deres lagringsstabilitet.

Startmaterialet for praktisering av foreliggende oppfinnelse er en vandig oppløsning av et egnet bioforenlig materiale. Innkapslingsmaterialet bør være varmefølsomt, slik at det delvis kan gjøres uoppløselig ved oppvarming i løpet avsonikering. Nærmere bestemt, samtidig med sonikeringen, oppvarmes en liten porsjon av det oppløste bioforenlige materiale, eller behandles på annen måte slik at dets oppløselighet reduseres. Dette fører til et lite volum av fastfase-materiale, som danner de innkapslede lag rundt mikrosfærene. Fortrinnsvis utvelges et følsomt protein som albumin, hemo-globin eller kollagen. For administrering til mennesker foretrekkes humant protein. Humant serumalbumin (HSA) er spesielt egnet. HSA er tilgjengelig kommersielt som en steril 5% vandig oppløsning, som kan anvendes direkte som startmateriale for fremstilling av mikrosfærene. Imidlertid kan andre konsentrasjoner av albumin eller andre varmedenaturerbare pro-teiner anvendes. HSA-konsentrasjon kan varieres, f.eks. innen området fra 1 til 25 vekt%.

Kommersielt tilgjengelig sonikatorutstyr kan anvendes

1 praktisering av foreliggende oppfinnelse. Teoretisk kan soni-kator-vibrasjonsfrekvenser variere over et betydelig område, som fra 5 til 30 kiloHerz (kHz), men de fleste kommersielt tilgjengelige sonikatorer opererer ved 20 kHz eller 10 kHz. 2 0 kHz-sonikatorer virker godt til den foreliggende oppfinnelses formål. Slikt sonikatorutstyr kan erholdes fra Heat Systems-Ultrasonics, Inc., Farmingdale, New York, og andre selskaper. Ultrasonics Model W-380 eller en lignende modell kan anvendes med en høyutvinnings-sonikatortrakt med flat tupp. Kraften anvendt på sonikatortrakten kan varieres over kraftinnstillinger gradert fra 1 til 10 av fabrikanten, som med Ultrasonics Model W-380. En mellomliggende kraftinnstilling kan anvendes (dvs. fra 4 til 8). Vibrasjonsfre-kvensen og den anvendte kraft må være tilstrekkelig for å danne hulrom i væsken som sonikeres.

Oppløsningen som skal sonikeres kan behandles i små mengder. F.eks. kan 8 mm mengder av oppløsningen sonikeres individuelt. Innledende sonikering kan utføres med den flat-endede sonikatortrakt i kontakt med oppløsningen, fortrinnsvis nedsenket i den øvre del av oppløsningen. Nedsenking er ønskelig for å utføre den innledende sonikering uten vesentlig skumdannelse. Med en kraftinnstilling på 4 til 6, kan den innledende sonikering utføres på mindre enn 1 minutt

(dvs. 15 til 45 sekunder).

Direkte etterfølgende den innledende fase av sonikeringen, trekkes sonikatortrakten tilbake til en posisjon

ovenfor oppløsningen, men i umiddelbar nærhet av oppløsningens øvre overflate. I den andre fase utføres sonikeringen bevisst på en slik måte at det foregår en intens skumdannelse av opp-løsningen i motsetning til tradisjonelle sonikeringer, hvor det er ønskelig å unngå skumdannelse. I henhold til foreliggende oppfinnelses mål er skumdannelse og aerosolering viktige for å erholde bildemidlet med med forhøyet konsentrasjon og stabilitet.

For å fremme skumdannelse kan krafttilførselen til sonikatortrakten forhøyes i det andre trinn. F.eks. kan kraft-innstillingen flyttes fra en innledende innstilling på 4 til en innstilling på 6. Den andre fase av sonikeringen kan ut-føres på mindre enn 1 minutt (dvs. fra 15 til 45 sekunder). Den totale sonikeringstid for både den første og den andre fase kan være i størrelsesordenen 1 minutt. F.eks. kan en sonikering på 25 til 35 sekunder anvendes for hver fase. Skumdannelsen som frembringes i den andre fase av sonikeringen kan øyeblikkelig påvises ved hjelp av det uklare utseende av oppløsningen, og ved det dannede skum.

Ved hjelp av den sekvensielle sonikering som omfatter den hulromdannede fase etterfulgt av en skumdannende fase, kan konsentrasjonen av de innkapslede mikrobobler, heri referert til som "mikrosfærer" sterkt økes. Konsentrasjoner høyere enn 25 x 10 mikrosfærer pr. milliliter kan lett erholdes, som konsentrasjoner fra 50 til 150 x IO<6>. I tillegg vil de dannede mikrosfærer overveiende ha diametere mindre enn 10 ym. F.eks. kan 80% eller mer av mikrosfærene ha diametere i området fra 1 til 9 ym med en gjennomsnittsdiameter

på 4 til 6 ym.

Når sonikeringen utføres i kontakt med luft som den omgivende atmosfære, vil mikrosfærene ha luftsentere. Luft er antatt å være den mest egnede omgive1sesatmosfære, men hvis ønskelig kan sonikering utføres under andre gassatmos-færer (dvs. nitrogen, oxygen eller carbondioxyd).

Etter innledende fremstilling kan mikrosfære-dispers jonene videre behandles for å øke konsentrasjonen og/ eller å fjerne overdimensjonerte mikrosfærer. Fordi mikrosfærene er lettflytende, har de en tilbøyelighet til å

stige opp til overflaten av dispersjonen. Ved å oppbevare dispersjonen uten omrysting i et antall timer (dvs. 4 til 12 timer), vil de fleste mikrosfærer stige til overflaten og konsentreres i et øvre lag ovenfor den klarede oppløsning. Ved denne "flyteadskillelse" av mikrosfærene i et øvre lag kan deler av den klarede oppløsning fjernes nedenfor mikrosfærene, derved erholdes en dispersjon med høyere .mikrosfærekonsentrasjon. F.eks. kan 50 til 75% av oppløsnings-volumet fjernes ved denne konsentrasjonsfremgangsmåte.

Flyte-adskillelse av overdimensjonerte mikrosfærer kan erholdes enten før eller etter den ovenfor beskrevne konsentrasjon. Mikrosfærer med stort format slik som de med diametere større enn 10 ym, har forholdsvis større oppdrift. De vil derfor stige hurtigere til overflaten av oppløsningen. Ved anvendelse av en kort oppbevaringstid, som fra 15 til 45 minutter, kan de største mikrosfærer selektivt innsamles i et lite øvre lag ovenfor en dispersjon som ennå vil inne-holde vesentlig alle mikrosfærer med liten størrelse. Ved å fjerne denne mikrosfæredispersjon under laget av overdimensjonerte mikrosfærer kan en fraksjonering oppnåes, hvori de større mikrosfærer vil forbli i beholderen som fraksjon-eringen utføres i.

Bildemidlet fremstilt ved denne kombinasjon av to-trinns sonikering og flyte-adskillelseskonsentrasjonen kan ha en homogen dispergert konsentrasjon høyere enn 300 x IO<6>, som fra 300 til 900 x IO<6> (3 til 9 x IO<8>) mikrosfærer pr. milliliter. Høye konsentrasjoner kan opprettholdes i lange opp-bevaringsperioder ved omgivende romtemperaturer (20-25°C). Konsentrasjoner over 200 og typisk over 300 x 10 g mikrosfærer pr. milliliter kan opprettholdes i perioder på minst 4 og vanligvis 8 uker eller lengre.

I figur IA vises en 10 ml sprøyte med en åpen topp og en ventil av stoppekrantype ved dens nedre utløpsende. Sprøyten fylles til 8 ml-nivået med 5% albumin (HSA)-opp-løsningen. Sonikatortrakten innsettes i sprøyten til 7 ml-nivået, avmerket ved T^-posisjonen i figur IB. I denne posisjon nedsenkes sonikatortrakten i den øvre del av oppløs-ningen, oppløsningsnivået er som vist i figur IB. Innledende sonikering utføres vesentlig uten skumdannelse av oppløs-ningen .

Umiddelbart etter innledende sonikering og uten å stenge av sonikatoren, trekkes trakten opp til 10 ml-nivået, vist som T2~posisjonen i figur 1C. Krafttilførselen til sonikatortrakten kan også økes idet den trekkes tilbake til T^-posisjonen. Umiddelbart etter tilbaketrekkingen begynner skumdannelse av albuminoppløsningen og oppløsningen blir melkeaktig av utseende. Oppløsningen vil skumme oppover rundt sonikatortrakten i løpet av den andre fase. Utseende av den skummede oppløsning er illustrert i figur ID, mikroboblene er vist med sterkt forstørret diameter i forhold til deres virkelige størrelse i um-området.

Den sonikerte oppløsning inneholder både oppløst og innblandet luft. Oppløsningen står i kontakt med den omgivende atmosfære rundt sonikatortrakten. (Klaringen mellom trakten og innsiden av sprøyten kan sees i tverrsnittsbildet i figur 2). Luftkontakten letter skumdannelsen og aeroso-ler ingen av oppløsningen i det andre trinn av sonikeringen.

Dispersjonene fra et visst antall sonikeringsporsjoner kan slåes sammen for konsentrering. F.eks. kan et stort antall av dispersjonsmengdene innføres i en separatorbeholder, som kan være en stor sprøyte eller en skilletrakt utstyrt ved bunnen med et utløp kontrollert av en avtappingsventil. En slik separatorbeholder i form av en stor sprøyte er vist

i figur 3. Ved å oppbevare de sammenslåtte dispersjoner i flere timer uten omrysting, slik som oppbevaring over natten, vil mikrosfærene stige opp til toppen av oppløsningen og danne et lag av flyte-adskilte mikrosfærer. Nedenfor det oppsamlede lag vil den klarede albuminoppløsning være vesentlig

fri for mikrosfærer. Det er derfor mulig å tappe av en stor del av oppløsningen gjennom bunnutløpet. F.eks. kan halv-parten til tre fjerdeparter av oppløsningen fjernes. Imidlertid er det ønskelig å beholde et tilstrekkelig volum av opp-løsningen for å tillate fullredispersjon av de konsentrerte mikrosfærer.

Figur 4 illustrerer mikrosfærekonsentratet med mikrosfærene redispergert. Mikrosfærene er tilstrekkelig stabile slik at de ikke kleber seg vedvarende til hverandre i et konsentrert lag, men forblir som adskilte intakte mikrosfærer. Mikrosfærene kan lett redispergeres ved forsiktig omrysting.

Etter redispersjon til en vesentlig homogen tilstand

kan fraksjonering utføres for å fjerne overdimensjonerte mikrosfærer. Ved å oppbevare redispersjonen i en kort tid,

som 30 minutter, vil mikrosfærene med størst diameter fortrinnsvis stige til toppen og samles i et lag, som vist i figur 4A. Når dette har skjedd kan mikrosfæredispersjonen nedenfor de overdimensjonerte mikrosfærer fjernes gjennom avtappingsventilen. Når de oppsamlede, overdimensjonerte mikrosfærer nærmer seg ventilen, stenges ventilen slik at det overdimensjonerte lag forblir i separatorbeholderen, som vist i figur 4B. Det erholdte produkt er et konsentrert, fraksjonert albumin-mikrosfæreprodukt hvori minst 80% av mikrosfærene har diametere i område fra 1 til 9 ym. Det fore-trukne produkt har minst 90% av mikrosfærene med diametere

fra 2 til 8 ym.

Videre veiledende detaljer for de foreliggende fore-trukne fremgangsmåter er beskrevet i det følgende under de egnede overskrifter.

Sonikering:

En 10 ml sprøyte med ovalt tverrsnitt, utstyrt ved dens nedre utløpsende med en stoppekran, fylles til 8 ml-merket med sterilt 5% humant serumalbumin. En sonikatorprobe med mindre tverrsnitt plasseres i sprøyten slik at bunnen av proben befinner seg ved 7 ml-merket. Sonikering utføres ved energiinnstilling 6 i 30 sekunder, deretter (med sonikatoren fremdeles på) beveges probeenden til 10 ml-merket, mens energi-innstillingen flyttes til 8. Sonikeringen utføres i ytter-ligere 25 sekunder. Sonikatoren stenges av, proben fjernes og innhold av sprøyten tappes over i en 6 0 ml sprøyte eller en skilletrakt med et bunnutløp kontrollert av en stoppekran. Fra 5 til 6 sprøytevolumer sammenslåes.

Konsentrering:

De sammenslåtte mengder tillates å stå over natten (8-12 timer) uten omrysting i separatorbeholderen. Når vesentlig alle mikrosfærene har dannet et lag på toppen, tappes to tredjedeler av volumet fra bunnen.

Fraksjonering:

Mikrosfærene resuspenderes og 60 ml sprøyte fylles med disse. Etter 30 minutters henstand tappes hele volumet utenom de siste 3-4 ml over i en oppsamlingsbeholder. De overdimensjonerte mikrosfærer etterlates. En prøve telles og konsentrasjonen, den gjennomsnittlige diameter og prosendelen mindre enn 10 ym beregnes. Dersom en mengde mindre enn 99,5% har en størrelse mindre enn 10 ym, foretas en refraksjonering. Dersom redispersjon er påkrevet kan konsentrasjonen justeres med 5% HSA.

Resultater

Konsentrasjonsmålinger er beskrevet i det følgende i tabell A for tre representative fremstillinger under anvendelse av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. Den innledende konsentrasjon av dispersjonene etter sonikering var i størrelsesordenen 130 til 140 x 10 /ml. Denne ble øket ved flyte-adskillelseskonsentrasjonen til 340 til 450 x 10<6>/ml.

For produktkontroll kan mikrosfærene telles ved hjelp av en Coulter-teller, tilgjengelig fra Coulter Electronics, Inc., Highleaf, Florida (dvs. Coulter-teller Modell Tall). Mikrosfæretellinger beskrevet ovenfor ble bestemt på denne måte.

Stabiliteten av et representativt produkt ble undersøkt ved et forsøk som varte i 20 uker. Den innledende konsentrasjon var tilnærmet 4,31 x 10 8 (431 x 10 6) mikrosfærer pr. milliliter. Konsentrasjonsmålinger ble utført i tilnærmet ukentlige intervaller. Resultatene er samlet i tabell B. Målingene, som ble utført ved hjelp av en Coulter-teller, er vist grafisk i figur 5. Prøvene ble oppbevart ved omgivende romtemperatur (20-25°C). Konsentrasjonen på tilnærmet 400 x 10 g mikrosfærer pr. milliliter ble opprettholdt i 20 uker. Dette viser en høy grad av romtemperaturstabilitet.

Stabiliteten av mikrosfærene kan påvirkes ved uvanlige høye eller lave temperaturer. Selv ved temperaturer så lave som.4°C eller så høye som 37°C kan imidlertid mikrosfærekonsentrasjoner høyere enn 200 x 10 g/ml opprettholdes i perioder på 8 uker eller lengre. For kommersiell distribusjon eller langtidsoppbevaring bør likevel meget lave eller høye temperaturer unngåes. Romtemperaturoppbevaring foretrekkes. Temperaturbeskyttelse av mikrosfærene under forsendelse kan anvendes.

Referanser

Feigenbaum et al. (1970), Circulation 41:615-621

Feinstein, US patent 4.572.203

Feinstein PCT-søknad WO84/02838

Feinstein et al. (1984), i. Am. Coll. Cardiol. 3:14-20 Gramiak og Shah (1968), Invest. Radiol. 3:356-358

Keller, Feinstein og Watson (1987), Amer. Heart J., 114: 570-575

Tickner et al. US patent 4.276.885

Tickner et al., National Technical Information Service Report HR 62917-1A, April 1977, s. 34-40.

Claims (3)

1. Konsentrert, romtemperaturstabilt ultralydbildemiddel, karakterisert ved at det er fremstilt ved en fremgangsmåte hvor en vandig oppløsning av et varmedenaturerbart, bioforenlig protein utsettes for sonikering under dannelse av gass-mikrobobler mens oppløsningen oppvarmes for å uoppløseliggjøre en del av proteinet, idet enden av sonikatortrakten under en innledende sonikeringsfase kontaktes direkte med oppløsningen, og sonikering og oppvarming av oppløsningen utføres uten vesentlig skumdannelse, deretter trekkes sonikatortrakten tilbake til en posisjon i den omgivende atmosfære umiddelbart i nærheten av overflaten av oppløsningen og opp-løsningen skummes for å øke antallet mikrobobler, og mikroboblene innkapsles med denaturert protein, hvorved det fås en dispersjon av mikrosfærer med forhøyet konsentrasjon som er ca. 5 % når proteinet er humant serumalbumin, og som er stabilisert i minst 48 timer, videre oppbevaring av en hoveddel av den således erholdte mikrosfæredispersjon uten omristing i tilstrekkelig tid for å tillate mikrosfærene å stige og konsentreres i et øvre lag over den klarede proteinoppløsning, og adskillelse av en del av den klarede proteinoppløsning fra det konsentrerte lag, hvorved det fås en dispersjon med høy mikrosfærekonsentrasjon, eventuelt at en mikrosfærefraksjon inneholdende de største mikrosfærer som samles nær den øvre overflate av dispersjonen, etterlates.

2. Ultralydbildemiddel ifølge krav 1, karakterisert ved at proteinet er humant serumalbumin.

3. Ultralydbildemiddel ifølge krav 1, karakterisert ved at mikrosfærene overveiende har diametere mindre enn 10 um, men omfatter mikrosfærer med større diametere, og hvor fremgangsmåten omfatter de videre trinn med oppbevaring av en hoveddel av mikrosfæredispersjonene uten omristing i tilstrekkelig tid til å la i det minste mikrosfærene med større diameter enn 10 um stige og konsentreres i det øvre lag, og fjerning av en dispersjon under det øvre lag inneholdende det meste av mikrosfærene med diameter mindre enn 10 um, mens en mikrosfærefraksjon inneholdende det meste av mikrosfærene med diameter større enn 10 pm, etterlates.