FI93442C

FI93442C - Menetelmä uusien kysteiinijohdannaisten valmistamiseksi

Info

Publication number: FI93442C
Application number: FI893478A
Authority: FI
Inventors: Anders Rudolf Hallberg; Per Anders Sigvard Tunek
Original assignee: Draco Ab
Priority date: 1987-11-19
Filing date: 1989-07-18
Publication date: 1995-04-10
Also published as: NO170413C; JPH02502189A; PT89035A; NO892787D0; ATE79371T1; FI93442B; HUT50759A; MY106950A; EP0317540B1; NO892787L; NO170413B; NZ226898A; FI893478L; IE61181B1; CN1033802A; AR245693A1; IL88342A0; DE3873696D1; ZA888509B; IL88342A

Description

93442

Menetelmä uusien kysteiinijohdannaisten valmistamiseksi -Förfarande för framställning av nya cysteinderivat 5 Tämä keksintö koskee menetelmää uusien kysteiinijohdannaisten, joilla on tulehduksenvastäinen vaikutus, valmistamiseksi .

Keksinnön kohde on antaa käyttöön tulehduksenvastainen kyste-10 iinijohdannainen. Sellainen aine on hyödyllinen erilaisten sairauksien hoidossa.

N-asetyyli-L-kysteiiniä on käytetty terapeuttisena aineena esimerkiksi kroonisen keuhkoputkentulehduksen hoitoon yli 20 15 vuotta. Eräs patenttijulkaisu otsikolla "Decongestant Compositions comprising N-acetylated Sulphydryl Compounds" (GB 954268) julkaistiin vuonna 1964.

Varhaisten tutkimusten ja patenttien jälkeen N-asetyyli-L-20 kysteiiniä on käytetty laajalti lähinnä tukkeuttavien keuhkotautien kuten kroonisen keuhkoputken tulehduksen hoitoon esittäen sen toimivan limanirrottajana. Lisäksi tätä yhdistettä on käytetty vasta-aineena parasetamolin liikä-annoksen aiheuttamaa maksatoksisuutta vastaan.

25 N-butyryylikysteiini esitetään patenttijulkaisussa DE-1208450 hiusvalmisteen valmistusaineena.

Tämän keksinnön mukaisesti on keksitty, että kaavan I mukai-30 sella yhdisteellä

HS

35 I

HN COOH

CO

40 R

93442 2 jossa R on -CH(CH3)2 tai -C(CH3)3 tai sen fysiologisesti hyväksyttävällä suolalla tai optisella isomeerillä on paljon parempi biosaatavuus oraalisen oton jälkeen kuin N-asetyyli-L-kysteiinillä. Siten uusi yhdiste saavuttaa oraalisen oton 5 jälkeen systeemisessä verenkierrossa tasoja, jotka ovat suuruusluokkaa korkeampia kuin N-asetyyli-L-kysteiinin maksimi-tasot. Koska kaavan I mukaisella yhdisteellä on samanlainen tai identtinen kyky kuin N-asetyyli-L-kysteiinillä 1) katkaista disulfidisiltoja, 2) toimia hapetuksenestoaineena ja 10 3) toimia radikaalinsiepparina, olisi oraalinen keuhkotaudin vastainen hoito uusilla yhdisteillä paljon tehokkaampaa kuin N-asetyyli-L-kysteiinillä, mikäli taudin aiheuttaa tai sitä ylläpitää jonkintyyppinen hapettava rasitus.

15 US-patentissa 3 091 569 on esitetty N-propionyylikysteiini, jossa on suoraketjuinen substituentti molekyylissä toisin kuin esillä olevan keksinnön yhdisteissä, joissa vastaavassa asemassa on haaroittuneita ryhmiä. Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet eli N-isobutyryylikysteiini ja N-pivalo-20 yylikysteiini omaavat haaroittuneita asyylijäännöksiä. Olemme havainneet, että nämä kysteiinijohdannaiset eivät hydrolysoidu entsymaattisesti havaittavissa määrin maksan sytosolisessa osassa. Tämä biologinen stabiliteetti johtaa näiden yhdisteiden korkeaan oraaliseen biosaatavuuteen (kuvattu edellä N-25 asetyylikysteiinille). Toisaalta suoran asyyliketjun omaava yhdiste, N-propionyylikysteiini, hydrolysoituu tehokkaammin entsyymien avulla.

On myös huomautettava, että toinen seuraus kaavan I mukaisen 30 yhdisteen biologisesta stabiilisuudesta on, että vapautuu hyvin vähän, jos lainkaan, L-kysteiiniä. Tämä tarkoittaa, että nämä yhdisteet muodostavat vain hyvin pieniä määriä glutatio-nin esiasteita. Siksi alla kuvaillun happitoksisuusjärjestel-män vaikutukset tuntuvat riippuvan synteettisistä tioleista 35 sinänsä eikä glutationibiosynteesistä.

Keksintö tuo siten esiin yhdisteitä ja niiden fysiologisesti hyväksyttäviä suoloja ja isomeerejä, jotka ovat käyttökelpoi- 3 93442 siä inflammatorisen keuhkosairauden, kuten kroonisen keuhkoputkentulehduksen ja muiden muiden sairauksien terapeuttiseen hoitoon, muiden sairauksien ollessa 5 1) muut keuhkotaudit, joita vaikeuttaa sitkeän liman eritys kuten rakkulasidekudostuminen, astma ja keuhkonlaajentuma, 2) sidekudossairaudet, kuten nivelreuma, 10 3) keuhkovauriosairaudet kuten septinen shokki, ARDS ja bronkopulmonaarinen kasvuhäiriö, 4) säteilyn aiheuttamat sairaudet kuten röntgensäteiden aiheuttama keuhkokuume ja sidekudostuminen, 15 5) keuhkon peruskudoksen sairaudet, kuten sarkoidoosit, sidekudostuminen, jyväiskasvamatauti, kollageenisairaus, ja 6) diabetesiin liittyvät sairaudet, kuten β-solujen tuhoutu-20 minen ja verkkokalvosairaus.

Tämän keksinnön suojapiiriin sisältyvät myös kaavan I mukaisten yhdisteiden fysiologisesti hyväksyttävät suolat, kuten natrium-, kalsium- tai magnesiumsuolat yhdessä sen ei-toksis-25 ten happolisäyssuolojen kanssa.

Kaavan I mukaiset yhdisteet esiintyvät 2 erilaisessa optisessa muodossa, L- ja D-isomeerit: 30

HS HS

X X

35 HN COOH HN COOH

I I

CO CO

I I

R R

40 93442 4 jotka molemmat kuuluvat tähän keksintöön.

Kaavan I mukaiset yhdisteet annetaan oraalisesti, farmaseuttisten valmisteiden muodossa, jotka käsittävät vaikuttavan 5 aineen joko vapaana emäksenä tai farmaseuttisesti hyväksyttävänä ei-toksisena happolisäyssuolana yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän väliaineen kanssa. Väliaine voi olla kiinteä, puolikiinteä tai nestemäinen laimennusaine tai kapseli. Tavallisesti vaikuttava aine käsittää määrän välillä 0,2 - 50 10 paino-% oraaliseen antoon sopivista valmisteista.

Farmaseuttisten valmisteiden valmistamiseksi, jotka sisältävät kaavan I mukaisen yhdisteen, annosteluyksiköiden muodossa oraaliseen antoon voidaan valittu yhdiste sekoittaa kiinteän 15 jauhemaisen väliaineen, esimerkiksi laktoosin, sakkaroosin, sorbitolin, mannitolin, tärkkelysten, kuten perunatärkkelys, maissitärkkelys tai amylopektiini, selluloosajohdannaisten, sideaineen kuten gelatiini tai polyvinyylipyrrolidoni, ja voiteluaineen, kuten magnesiumstearaatti, kalsiumstearaatti, 20 polyetyleeniglykolivahat ja muut sellaiset, ja sekoittaa sitten tablettien muodostamiseksi. Vaadittaessa päällystettyjä tabletteja edellä kuvatulla tavalla valmistetut ytimet voidaan päällystää konsentroidulla sokeriliuoksella, joka voi sisältää esimerkiksi arabikumia, ge-latiinia, talkkia, ti-25 taanidioksidia ja muita sellaisia. Vaihtoehtoisesti tabletit voidaan päällystää helposti haihtuvaan orgaaniseen liuotti-meen tai orgaanisten liuottimien seokseen liuotetulla lakalla. Näihin päällysteisiin voidaan lisätä väriaineita, jotta ne erotettaisiin helposti muista, muita vaikuttavia aineita 30 tai vaikuttavien yhdisteiden muita määriä sisältävistä tableteista.

Pehmeiden gelatiinikapseleiden valmistamiseksi (helmenmuotoi-sia suljettuja kapseleita), jotka koostuvat gelatiinista ja 35 esimerkiksi glyserolista tai samanlaisista suljetuista kapseleista, vaikuttavat aineet voidaan sekoittaa kasviöljyn kanssa. Kovagelatiinikapselit saattavat sisältää vaikuttavan aineen rakeita yhdistelmänä kiinteiden, jauhemaisten väliai- 5 93442 neiden kanssa, kuten laktoosi, sakkaroosi, sorbitoli, manni-toli, tärkkelykset (esimerkiksi perunatärkkelys, maissitärk-kelys tai amylopektiini), ja gelatiinin selluloosajohdannaiset .

5

Oraaliseen käyttöön tarkoitetut nestemäiset valmisteet voivat olla siirappien tai suspensioiden muodossa, esimerkiksi liuosten, jotka sisältävät noin 0,2 - noin 20 paino-% tässä kuvailtua vaikuttavaa ainetta, lopun ollessa sokeria ja eta-10 nolin, veden, glyserolin ja propyleeniglykolin seosta. Sellaiset nestemäiset valmisteet voivat sisältää valinnaisesti väriaineita, makuaineita, sakkariinia ja karboksimetyylisel-luloosaa sakeutusaineena.

15 Keksinnön yhdisteiden sopivia päivittäisannoksia ihmisten terapeuttiseen hoitoon ovat 100 - 1200 mg oraalisesti annettuna.

Keksinnön yhdisteet saadaan seuraavalla menetelmällä: 20

Yhdiste, jolla on kaava

HS

” X

HN COOH

CO

30 |

R

jossa R on -CH(CH3)2 tai -C(CH3)3 tai sen optinen isomeeri, 35 voidaan saada saattamalla reagoimaan yhdiste, jolla on kaava

HS

40 /k

H2N COOH

tai sen optinen isomeeri kaavan RCOX

93442 6 mukaisen asylointireagenssin kanssa, jossa kaavassa R on edellä ilmoitettu ja -COX on reaktiivinen ryhmä, joka pystyy reagoimaan aminoryhmän kanssa muodostaen amidiryhmän.

5 Asylointireagenssi saattaa olla esimerkiksi anhydridi 0

II

(RC)20 10 tai vaihtoehtoisesti asyylihalogenidi, amidi, aktivoitu happo tai esteri, tiolihappo, piihappoesteri, asyylioksiboraani, metyyliselenoliesteri, tioesteri, asyyliatsidi, a-ketonitrii-li tai trihalogeeniketoni.

15

Suojatun rikkiatomin sisältävät yhdisteet, jotka ovat edellä olevan menetelmän valmistusaineita, saadaan kysteiinin S-ato-min suojauksella (raseemisen tai optisen isomeerin), jonka jälkeen S-suojattu kysteiini N-asyloidaan.

20

Esimerkki 1. N-isobutvrvvli-L-kysteiinin valmistus L-kysteiinihydrokloridimonohydraatin, 35,2 g (0,20 mol) suspensio 100 mlrssa seosta, jossa oli 80 % tetrahydrofuraania (THF) ja 20 % vettä, sekoitettiin huoneenlämpötilassa typen 25 alla ja käsiteltiin 44,0 g:11a (0,40 mol) natriumisobutyraat-tia. Reaktioseos (valkoinen liete) jäähdytettiin 0 - 5°C:een ja lisättiin typen alla tipoittain 35 ml (0,21 mol) isobuty-ryylianhydridiä. Saatua herkkäliikkeistä suspensiota sekoitettiin 6 h huoneenlämpötilassa, annettiin seistä yön yli ja 30 kuumennettiin lopulta 4 h refluksoiden. Reaktioseos jäähdytettiin jäähauteella ja lisättiin 18 ml konsentroitua suolahappoa. Orgaaninen kerros haihdutettiin, jolloin saatiin väritön öljy. Öljy pestiin heksaanilla ja käsiteltiin sen jälkeen eetterillä, jolloin saatiin 12,9 g otsikkoyhdistettä 35 valkoisena kiinteänä aineena, sp. 103 - 104°C (uudelleenko- teytettiin butyyliasetaatista), [a]“ = +23,4° (c 5,0, H20, pH = 7,0), 'H-NMR (CDC13) : δ 1,2 (6H, d, CH3) , 1,4 (1H, t, SH), 2,5 (1H, sept, CH) , 3,1 (2H, m, CH2) , 4,9 (1H, dt, NCH) , 6,7 (1H, d, NH) , 10,6 (1H, s, OH). 13C-NMR (CDC13) : δ 19, 19,5; 7 93442 26,5; 36; 54, 172, 178. ms: 335 (M+ + 2TMS, silyloinnin jälkeen) .

Esimerkki 2. N-isobutvrvyli-D-kvsteiinin valmistus 5 Yhdiste valmistettiin esimerkissä 1 kuvaillulla tavalla (lähtien D-kysteiinisuolasta) ja sillä oli identtiset fysikaaliset arvot. [a]o= -23,4° (c 5,0, H20) .

Esimerkki 3. N-pivalovyli-L-kysteiinin valmistus 10 L-kysteiinihydrokloridimonohydraatin, 17,6 g (0,10 mol), liuokseen 50 mlrssa seosta, jossa oli 80 % tetrahydrofuraania (THF) ja 20 % vettä, lisättiin typen alla 24,8 g (0,20 ml) natriumpivaloylaattia sekoittaen. Paksu liete jäähdytettiin jäähauteella ja lisättiin tipoittain 21,3 ml (0,105 mol) pi-15 valoyylianhydridiä 15 minuutin aikana. Kun oli lisätty 50 ml seosta, jossa oli 80 % THF ja 20 % vettä, reaktioseosta sekoitettiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja refluksoitiin sen jälkeen 0,5 h. Jäähdytyksen jälkeen jäähauteella lisättiin 8,5 ml konsentroitua suolahappoa. Orgaaninen kerros haihdu-20 tettiin ja raakatuote pestiin useita kertoja heksaanilla ja liuotettiin sen jälkeen 150 ml:aan kloroformia. Suodatuksen ja liuottimen haihdutuksen jälkeen raakatuote uudelleenkitey-tettiin etyyliasetaatista, jolloin saatiin 8,2 g otsikkoyh-distettä valkoisena kiinteänä aineena, sp. 140°C, [a]o = +39° 25 (C = 5,0, H20, pH = 7,0). 'H-NMR (CDC13) : δ 1,2 (9H, S, CH3) , 1,4 (1H, t, SH), 3,1 (2H, m, CH2) , 4,9 (1H, dt, NCH) , 6,7 (1H, d, NH) , 10,6 (1H, s, OH). 13C-NMR (CDC13) : δ 26, 27, 39, 53, 163, 180. ms: 349 (M+ + 2TMS, silyloinnin jälkeen).

30 Esimerkki 4. N-pivaloyyli-D-kvsteiinin valmistus

Yhdiste valmistettiin esimerkissä 3 kuvaillulla tavalla (lähtien D-kysteiinisuolasta), ja sillä oli identtiset fysikaaliset arvot. [α]β= -39,0° (c 5,0, H20, pH = 7,0).

35 Esimerkki 5. N-isobutvyli-D.L-kvsteiinin valmistus

Yhdiste valmistettiin esimerkissä 1 kuvaillulla tavalla (lähtien (raseeminen) D,L-kysteiinisuolasta), ja sillä oli identtiset fysikaaliset arvot. [a]o = 0° (c 5,0, H20) .

93442 8

Esimerkki 6. N-pivalowli-D.L-kysteiinin valmistus Yhdiste valmistettiin esimerkissä 3 kuvaillulla tavalla (lähtien (raseeminen) D,L-kysteiinisuolasta), ja sillä oli identtiset fysikaaliset arvot. [a]£»s= 0° (c 5,0, H20, pH = 7,0).

5

Esimerkki 7

Tablettien valmistamiseksi valmistettiin seuraavat koostumukset .

10 Valmiste A

vaikuttava aine 50 g laktoosi 85 g perunatärkkelys 40 g polyvinyylipyrrolidoni 5 g 15 selluloosa Avicel 18 g magnesiumstearaatti 2 g

Valmiste B

vaikuttava aine 100 g 20 laktoosi 90 g perunatärkkelys 50 g polyvinyylipyrrolidoni 5 g selluloosa Avicel 23 g magnesiumstearaatti 2 g 25

Edellä olevien valmisteiden A ja B koostumuksista valmistettiin 1000 tablettia, joista A sisälsi 50 mg, ja B sisälsi 100 mg vaikuttavaa yhdistettä. Haluttaessa saadut tabletit voidaan kalvopäällystää esimerkiksi metyyliselluloosalla orgaa-30 nisessa liuottimessa.

Valmiste C 1 ml sisältää: 35 vaikuttava aine 30,0 mg sorbitoli 150,0 mg glyseroli 100,0 mg dinatriumedetaatti 0,5 mg 9 93442

Metagin 0,6 mg

Propagin 0,3 mg appelsiiniesanssi 0,05 mg sitruunaesanssi 0,05 mg 5 etanoli 20,0 mg natriumhydroksidi 10,0 mg puhdas vesi 1 ml:aan

Metaboliakokeet 10 Tämän keksinnön eräs kohde on antaa käyttöön molekyylejä, jotka antaisivat oraalisen oton jälkeen korkeita vapaiden tiolien tasoja plasmassa ja lopulta keuhkoissa. Siksi on suoritettu kokeita kaavan I mukaisten yhdisteiden biologisen stabiilisuuden ja biosaatavuuden tutkimiseksi ja näiden tut-15 kimiseksi N-asetyyli-L-kysteiinin kanssa.

In vitro -eläinkokeet N-asetyyli-L-kysteiini hydrolysoitui nopeasti L-kysteiiniksi rotan maksan, sisäelimien limakalvojen ja keuhkojen homoge-20 naateissa. N-isobutyryyli-L-kysteiini ja N-pivaloyyli-L-kys-teiini eivät hydrolysoituneet mitattavassa määrässä in vitro.

N-asetyyli-L-kysteiinin hydrolyysi tapahtui pääosin sytosoli-sessa soluosassa.

25

Yhteenvetona, L-kysteiinin hydrofiilinen N-asetyylijohdannainen hydrolysoitui liukoisessa solujakeessa, oletettavasti asyyli-CoA-transferääsien vaikutuksesta. Haaroittuneet johdannaiset, N-isobutyryyli- ja N-pivaloyyli-L-kysteiini eivät 30 hydrolysoituneet missään soluosassa.

In vivo -eläinkokeet

Tiolit ruiskutettiin nukutettujen rottien sisäelimiin. Otettiin eri aikoina ruiskeiden jälkeen verinäytteitä ja analy-35 soitiin plasman tiolit. Tiolien konsentraatiot plasmassa olivat: N-isobutyryyli-L-kysteiini 13,0 + 2,9 μΜ (n = 9), N-pivaloyyli-L-kysteiini 11,8 + 2,9 μΜ (n = 9) ja N-asetyyli-L- 93442 10 kysteiini 0,7 μΜ (vain yksi suoritettu koe). Ilmoitetut arvot tarkoittavat keskiarvo ± SEM, ellei toisin ole ilmoitettu.

Tulokset osoittavat, että in vivo -saadut plasman tiolitasot 5 ovat suhteessa in vitro -määritettyyn biologiseen stabiili-suuteen. Siten helposti hydrolysoituva yhdiste kuten N-ase-tyyli-L-kysteiini oli niukasti havaittavissa plasmassa sisäelinten sisäisen ruiskeen jälkeen, kun taas N-isobutyryyli-L-kysteiini, joka ei hydrolysoitunut in vitro, saavutti huomat-10 tavia pitoisuuksia.

Vapaaehtoisilla henkilöillä saadut arvot

Plasmapitoisuudet ja eritys virtsassa mitattiin terveillä vapaaehtoisilla ihmisillä oraalisen N-asetyyli-L-kysteiinin 15 ottamisen jälkeen ja N-isobutyryyli-L-kysteiinin ottamisen jälkeen, 1,23 mmol kumpaakin. Plasman tiolien maksimipitoi-suudet olivat <1 μΜ N-asetyyli-L-kysteiinillä ja 10 μΜ N-iso-butyryyli-L-kysteiinillä. Muuttumattomana virtsassa eritettyjen muuttumattomien annosten prosenttiosuudet olivat 2 %, ja 20 74 %.

Metaboliakokeiden yhteenveto

Edellä kuvaillut kokeet ovat osoittaneet, että N-asetyyli-L-kysteiini on biologisesti pysymätön ja että se johtaa huonoon 25 biosaatavuuteen oraalisen oton jälkeen. Muuntelut asyyliosas-sa paransivat biologista stabiilisuutta dramaattisesti ja myös biosaatavuutta. Siten N-isobutyryyli-L-kysteiini saavutti korkeat pitoisuudet plasmassa ja saavuttaa luultavasti myös keuhkot paljon suuremmassa määrin kuin N-asetyyli-L-kys-30 teiini.

Vaikutusmittaukset

Altistus puhtaalle hapelle johtaa keuhkovesipöhöön. Mekanismi on, että lisääntynyt hapen paine johtaa hapen epätäydelliseen 35 pelkistykseen ja siitä johtuen aktivoitujen happilajien kuten superoksidien, peroksidien ja hydroksyyliradikaalien syntymiseen. Jotkin näistä aktivoiduista happilajeista ovat identtisiä tulehduksen yhteydessä syntyneiden kanssa.

11 93442

Muut tutkijat ovat osoittaneet, että laskimonsisäisesti in-fusoitu N-asetyyli-L-kysteiini suojaa osittain hapen aiheuttamalta vesipöhöltä rotilla. Olemme vahvistaneet nämä löydöt ja osoittaneet myös, että N-isobutyryyli-L-kysteiini saa ai-5 kaan suojan, joka on jonkin verran parempi annettaessa samaa tietä. Edellä ilmoitettiin, että N-isobutyryyli-L-kysteiinin pitoisuudella ihmisen plasmassa oli oraalisen ottamisen jälkeen huippuarvo 10 μΜ. Siksi vaikuttaa täysin mahdolliselta saavuttaa suoja hapettavaa rasitusta ja ehkä keuhkojen tuleh-10 dusta vastaan uusien tiolien oraalisella otolla.

Johtopäätökset

Metaboliakokeet osoittivat, että N-isobutyryyli-L-kysteiini ja N-pivaloyyli-L-kysteiini olivat paljon stabiilimpia kuin 15 terapeuttisesti käytetty N-asetyyli-L-kysteiini. Uusien yhdisteiden plasmapitoisuudet oraalisen oton jälkeen olivat paljon korkeammat kuin N-asetyyli-L-kysteiinin. Happitoksi-suusmalli osoitti, että uudet yhdisteet suojasivat keuhkojen vaurioilta ainakin yhtä tehokkaasti kuin N-asetyyli-L-kyste-20 iini laskimonsisäisen annon jälkeen. Tulokset osoittavat, että uudet yhdisteet ovat paljon tehokkaampia kuin N-asetyy-li-L-kysteiini hapettavaa rasitusta vastaan keuhkoissa oraalisesti annettuna.

93442 12 Förfarande for framställning av nya cysteinderivat Föreliggande uppfinning hänför sig tili ett förfarande för 5 framställning av nya derivat av cystein med antiinilammato- risk effekt.

Uppfinningens ändamäl är att tillhandahälla ett antiinflamma-toriskt cysteinderivat. En sädan substans kommer att vara an-10 vändbar i behandlingen av oiikä sjukdomar.

N-acetyl-L-cystein har använts som terapeutiskt läkemedel mot t.ex. kronisk bronkit i över 20 är. Ett patent med titeln "Beredningar av avsvällande medel innehällande N-acetylera-15 de sulfhydrylföreningar" (GB 954 268) publicerades 1964.

Efter tidiga undersökningar och patent har N-acetyl-L-cystein använts i stor omfattning, huvudsakligen mot obstruktiva lungsjukdomar som kronisk bronkit, där det hävdats verka sä-20 som ett mukolytikum. Dessutom har denna förening använts som motgift mot leverförgiftning förorsakad av överdoser av paracetamol .

N-butylrylcystein offentliggörs i DE-1 208 450 säsom be-25 ständsdel i en härberedning.

Enligt föreliggande uppfinning har man funnit, att en förening med formeln

30 HS

X

HN N COOH

35 |

CO

R

40 väri R är -CH(CH3)2 eller -C(CH3)3 eller ett fysiologiskt ac-ceptabelt sait därav eller optisk isomer därav har en mycket 13 93442 bättre biotillgänglighet efter oralt intag än N-acetyl-L-cys-tein. Efter oralt intag kommer sälunda de nya föreningarna att na koncentrationsniväer i den systemiska cirkulationen, som är flera storleksordningar högre än de maximala koncent-5 rationsniväerna av N-acetyl-L-cystein. Eftersom föreningarna enligt formel I har med N-acetyl-L-cystein liknande eller identiska förmägor att 1) bryta disulfidbryggorna, 2) fungera som antioxidantia och 3) fungera som radikalfängare borde oral behandling med de nya substanserna vara effektivare än 10 N-acetyl-L-cystein mot lungsjukdom, förutsatt att sjukdomen förorsakas eller underhälls genom nägon form av oxidativ stress.

US-patentskriften 3 091 569 anför ett N-propionylcystein med 15 en rakkedjig substituent i molekylen, tili ätskillnad frän föreningarna enligt föreliggande uppfinning, som uppvisar förgrenade grupper i motsvarande position. Föreningarna enligt föreliggande uppfinning, dvs. N-isobutyrylcystein och N-pivaloylcystein uppvisar förgrenade acyläterstoder. Vi har 20 observerat att dessa cysteinderivat inte hydrolyseras i märk-bar utsträckning i leverns cytosola del. Pä grund av denna biologiska stabilitet har dessa föreningar en hög oral biotillgänglighet (som ovan beskrivits med avseende pä N-acetyl-cystein). Ä andra sidan hydrolyseras en förening med rakked-25 jig acylkedja, N-propionylcystein, mer effektivt med hjälp av enzymer.

Det mäste ocksä päpekas, att en ytterligare konsekvens av den biologiska stabiliteten hos föreningarna enligt formel I är 30 att mycket litet, om nägot, L-cystein kommer att frigöras.

Detta betyder, att dessa föreningar kommer att ge upphov tili endast mycket läga koncentrationsniväer av glutationprekurso-rer. De nedan beskrivna effekterna pä syretoxicitetssystemet är därför troligen beroende av de syntetiska tiolerna själva 35 och inte pä glutationbiosyntesen.

Uppfinningen tillhandahäller alltsä föreningar och fysiolo-giskt acceptabla salter och isomerer därav, som är användbara 93442 14 vid terapeutisk behandling av inflammatoriska lungsjukdomar säsom kronisk bronkit och andra sjukdomar sdsom 1) andra lungsjukdomar, komplicerade av viskös mucus som cys-5 tisk fibros, astma och emfysem, 2) bindvävssjukdomar som reumatoid artrit, 3) lungskadesjukdomar som septisk chock, ARDS och bronkopul-10 monal dysplasi, 4) sjukdomar förorsakade av straining som gammastrainingsin-ducerad pneumonit och fibros, 15 5) sjukdomar i lungparenkym som sarkoidoser, fibros, granulo- matos, collagenos och 6) sjukdomar associerade med diabetes som förstöring av B-celler och retinopati.

20

Inom omfänget för denna uppfinning innefattas även fysiolo-giskt acceptabla salter av föreningarna med formel I sdsom salterna av natrium, ammonium, kalcium eller magnesium, till-sammans med de icke toxiska syraadditionssalterna därav.

25 Föreningarna med formel I existerar i tva olika optiska former, L- och D-isomerer:

3 0 HS HS

X X

HN ^ COOH HN COOH

35 I I

CO CO

I I

R R

40 vilka bäda innefattas i denna uppfinning.

15 93442 Föreningarna med formel I administreras oralt i form av far-maceutiska beredningar innehällande den aktiva beständsdelen antingen som en fri bas eller som ett farmaceutiskt accepta-belt, icke toxiskt, syraadditionssalt i förbindelse med en 5 farmaceutiskt acceptabelt bärare. Bäraren kan vara ett fast, halvfast eller flytande spädningsmedel eller kapsel. Vanligen utgör den aktiva substansen mellan 0,2 och 50 vikt-% för beredningar lämpliga för oral administration.

10 För att framställa farmaceutiska beredningar innehällande en förening av formel I i form av doseringsenheter för oral tillämpning kan den utvalda föreningen blandas med en fast, pulveriormig bärare t.ex. laktos, sackaros, sorbitol, mannitol, stärkelsematerial säsom potatisstärkelse, majsstärkelse 15 eller amylopektin, cellulosaderivat, ett bindemedel säsom gelatin eller polyvinylpyrrolidon och ett smörjmedel säsom magnesiumstearat, kalciumstearat, polyetylenglykolvaxer och liknande, och därefter komprimeras till att forma tabletter. Om dragerade tabletter krävs, kan kärnorna, framställda som 20 beskrivet ovan, drageras med en koncentrerad sockerlösning, som kan innehälla t.ex. gummiarabicum, gelatin, talk, titan-dioxid och liknande. Alternativt kan tabletter drageras med ett lack upplöst i ett lättflyktigt lösningsmedel eller blandning av organiska lösningsmedel. Färgämnen kan tillsät-25 tas dessa drageringar i avsikt att lätt särskilja mellan tabletter innehällande olika aktiva ämnen eller olika mängder av de aktiva ämnena.

För framställning av mjuka gelatinkapslar (pärlformade slutna 30 kapslar) bestäende av gelatin och till exempel glycerol eller liknande slutna kapslar, kan den aktiva substansen blandas ihop med en vegetabilolja. Härda gelatinkapslar kan innehälla granuler av den aktiva substansen i kombination med fasta, pulverformiga bärare säsom laktos, sackaros, sorbitol, manni-35 toi, stärkelser (t.ex. potatisstärkelse, majsstärkelse eller amylopektin) och cellulosaderivat av gelatin.

93442 16

Flytande beredningar för oral tillämpning kan vara i form av siraper eller suspensioner, till exempel lösningar innehäl-lande fran omkring 0,2 % till omkring 20 vikts-% av den häri beskrivna aktiva substansen, balansen utgörande socker och 5 blandningar av etanol, vatten, glycerol och propylenglykol.

Om sä önskas kan sadana flytande beredningar innehalla färg-ämnen, smakämnen, sackarin och karboxymetylcellulosa som förtjockare.

10 Lämpliga dagliga doser av uppfinningens föreningar i tera- peutisk behandling av människor är 100 till 1200 mg vid peroral administrering.

Uppfinningens föreningar kan erhällas genom följande metod: 15 Föreningen med formeln

HS

” X

HN COOH

CO

25 I

R

väri R är -CH(CH3)2 eller -C(CH3)3 eller en optisk isomer därav 30 kan erhällas genom reaktion av en förening med formeln

HS

35 xk,

H2N COOH

eller en optisk isomer därav med ett acylerande ämne med formeln RCOX 40 väri R har ovan angiven betydelse och -COX är en reaktiv grupp, med förmäga att reagera med en aminogrupp under bild-ning av en amiddel.

17 93442

Det acylerande ämnet kan tili exempel vara en anhydrid

O

II

5 (RC)20 eller, alternativt, en syrahalid, en amid, en aktiverad syra eller ester, tiolsyra, silikatestrar, acyloxyboran, metylse-lenolester, tiolester, acylazid, a-ketonitril eller en triha-10 loketon.

Föreningarna med den skyddade svavelatomen, som är utgängsma-terial i processerna A och C ovan erhälls genom skydd av S-atomen i cystein (racemisk eller optisk isomer) följt av N-15 acylering av det S-skyddade cysteinet.

Exempel 1. Framställning av N-isobutyryl-L-cystein En suspension av 35,2 g (0,20 mol) av L-cysteinhydroklorid monohydrat i 100 ml av en blandning av 80 % av tetrahydrofu-20 ran (THF) och 20 % vatten rördes om under kväve vid rumstem-peratur och behandlades med 44,0 g (0,40 mol) natriumisobuty-rat. Reaktionsblandningen (vit slurry) kyldes tili 0 - 5°C och, under kväve, tillsattes 35 ml (0,21 mol) isobutyrylan-hydrid droppvis. Den resulterande rörliga suspensionen rordes 25 om i 6 h vid rumstemperatur, fick stä over natten och värmdes slutligen under äterloppskokning i 4 h. Reaktionsblandningen kyldes pä isbad och 18 ml koncentrerat klorväte tillsattes. Den organiska fasen drevs av, vilket gav en färglös oija. 01-jan tvättades med hexan och behandlades därefter med eter 30 vilket gav 12,9 g av rubricerade förening som en vit fast substans, smp 103 - 104°C (omkristalliserad ur butylacetat), [α]£ = +23,4° (c 5,0, HjO, pH = 7,0), lH-NMR (CDC13) : Ö 1,2 (6H, d, CH3) , 1,4 (1H, t, SH), 2,5 (1H, sept, CH) , 3,1 (2H, m, CH2) , 4,9 (1H, dt, NCH) , 6,7 (1H, d, NH) , 10,6 (1H, S, OH).

35 13C-NMR (CDCIj) : δ 19, 19,5; 26,5; 36; 54, 172, 178. ms: 335 (M+ + 2TMS, efter silylering).

93442 18

Exempel 2. Framställninq av N-isobutvrvl-D-cvstein Föreningen framställdes enligt det i exempel 1 beskrivna för-farandet (utgäende frän D-cysteinsaltet) och uppvisade iden-tiska fysikaliska data. [α]ρ = -23,4° (c 5,0, H20) .

5

Exempel 3. Framställninq av N-pivaloyl-L-cystein Tili en lösning av 17,6 g (0,10 mol) av L-cysteinhydroklorid monohydrat i 50 ml av en blandning av 80 % av tetrahydrofuran (THF) och 20 % vatten, under kväve, tillsattes 24,8 g (0,20 10 ml) natriumpivaloylat under omrörning. Den tjocka slurryn kyldes pä ett isbad och 21,3 ml (0,105 mol) pivaloylanhydrid tillsattes droppvis under 15 minuter. Efter tillsats av 50 ml av en blandning av 80 % av THF och 20 % av vatten, omrördes blandningen i 2 timmar i rumstemperatur och aterloppskokades 15 därefter i 0,5 h. Efter kylning pä isbad, tillsattes 8,5 ml koncentrerat klorväte. Den organiska fasen drevs av och rä-produkten tvättades flera gänger med hexan och löstes därefter upp i 150 ml kloroform. Efter filtrering och avdrivning av lösningsmedlet omkristalliserades räprodukten ur etylace-20 tat, vilket gav 8,2 g av den rubricerade föreningen som en vit fast substans, smp. 140°C, [α]“ = +39° (c = 5,0, H20, pH = 7,0). ‘H-NMR (CDC13) : δ 1,2 (9H, s, CH3) , 1,4 (1H, t, SH), 3,1 (2H, m, CH2) , 4,9 (1H, dt, NCH) , 6,7 (1H, d, NH) , 10,6 (1H, s, OH). 13C-NMR (CDCI3) : δ 26, 27, 39, 53, 163, 180. ms: 349 (M+ + 25 2TMS, efter silylering).

Exempel 4. Framställninq av N-pivaloyl-D-cystein Föreningen framställdes enligt det i exempel 3 beskrivna för-farandet (utgäende frän D-cysteinsaltet) och uppvisade iden-30 tiska fysikaliska data. [a]^ = -39,0° (c 5,0, H20, pH = 7,0).

Exempel 5. Framställninq av N-isobutyl-D.L-cvstein Föreningen framställdes enligt det i exempel 1 beskrivna för-farandet (utgäende frän (det racemiska) D,L-cysteinsaltet) 35 och uppvisade identiska fysikaliska data. [α]β = 0° (c 5,0, H20) .

19 93442 r

Exempel 6. Framställning av N-pivalovl-D.L-cvstein Föreningen framstäiIdes enligt det i exempel 3 beskrivna for-farandet (utgäende frän (det racemiska)-D,L-cysteinsaltet) och uppvisade identiska fysikaliska data. [α]“ = 0° (c 5,0, 5 H20, pH = 7,0).

Exempel 7 För framställning av tabletter gjordes följande beredningar.

10 Formulerinq A

aktiv beständsdel 50 g laktos 85 g potatisstärkelse 40 g polyvinylpyrrolidon 5 g 15 cellulosa Avicel 18 g magnesiumstearat 2 g

Formulerinq B

aktiv beständsdel 100 g 20 laktos 90 g potatisstärkelse 50 g polyvinylpyrrolidon 5 g cellulosa Avicel 23 g magnesiumstearat 2 g 25

Av ovanstäende beredningar av formuleringarna A och B gjordes tabletter innehällande 50 mg respektive 100 mg aktiv subs-tans. Om sä önskas, kan de erhdllna tabletterna filmdrageras med t.ex. metylcellulosa i ett organiskt lösningsmedel.

30

Formulerinq C 1 ml innehäller: aktiv beständsdel 30,0 mg 35 sorbitol 150,0 mg glycerol 100,0 mg dinatriumedetat 0,5 mg

Metagin 0,6 mg 93442 20

Propagin 0,3 mg apelsinessens 0,05 mg citronessens 0,05 mg etanol 20,0 mg 5 natriumhydroxid 10,0 mg renat vatten till 1 ml

Metaboliska experiment

Ett syfte med föreliggande uppfinning är att ge molekyler, 10 som efter oralt intag skulle ge höga koncentrationsniväer av fria tioler i plasma och slutligen i lungan. Därför utfördes experiment i avsikt att undersöka biologisk stabilitet och biotillgänglighet hos föreningarna med formel I och att jäm-föra dessa med N-acetyl-L-cystein.

15

In vitro diurförsök N-acetyl-L-cystein hydrolyserades snabbt för att ge L-cystein i homogenat av lever, tarmslemhinna och lunga av ratta. N-isobutyryl-L-cystein och N-pivaloyl-L-cystein hydrolyserades 20 inte i nägon mätbar utsträckning in vitro.

Hydrolysen av N-acetyl-L-cystein skedde huvudsakligen i den cytosoliska celldelen.

25 Sammanfattningsvis hydrolyserades det hydrofila n-acetylderi-vatet av L-cystein i den lösliga cellfraktionen, förmodligen av acyl-CoA-transferaser. De grenade derivaten, N-isobutyryl-och N-pivaloyl-L-cystein hydrolyserades inte i nägon celldel.

30 In vivo diurförsök

Tiolerna injicerades i tarmarna pä. anesteticerade rdttor. Blodprov togs ut olika tider efter injektionerna, och plas-matioler analyserades. Koncentrationerna av tiolerna i plasma var: N-isobutyryl-L-cystein 13,0 + 2,9 μΜ (n = 9), N-pivalo-35 yl-L-cystein 11,8 + 2,9 μΜ (n - 9) och N-acetyl-L-cystein 0,7 μΜ (endast ett experiment utfört). De angivna värdena re-presenterar medel ± SEM, om icke annat anges.

21 93442

Resultaten visar, att koncentrationsniväerna av tiol i plasma är relaterade till den biologiska stabiliteten in vitro. Följaktligen var en lätt hydrolyserbar förening som N-acetyl-L-cystein knappt spärbar i plasma efter intratestinal injek-5 tion, medan N-isobutyryl-L-cystein, vilken inte hydrolysera-des in vitro, nädde avsevärda koncentrationer.

Data erhällna med friviliiga människor

Plasmakoncentrationer och urinavsöndring i friska, frivilliga 10 människor mattes efter oralt intag av N-acetyl-L-cystein och N-isobutyryl-L-cystein, 1,23 mmol av vardera. Toppkoncentra-tionerna av de fria tiolerna i plasma var <1 μΜ respektive 10 μΜ. Procentandelarna av de oförändrade, i urin exkreterade doserna var 2 % och 74 %.

15

Summerina av metaboliska experiment

De ovan beskrivna experimenten har visat att N-acetyl-L-cystein är biologiskt instabil, och att detta leder till en läg biotillgänglighet efter oralt intag. Modifiering av acyldelen 20 förbättrade dramatiskt den biologiska stabiliteten liksom biotillgängligheten. Sälunda nädde N-isobutyryl-L-cystein höga koncentrationer i plasma och kommer förmodligen även att na lungan i mycket högre utsträckning än N-acetyl-L-cystein.

25 Ef fektmätninqar

Exponering för rent syre leder till lungödem. Mekanismen är den, att det ökade syretrycket leder till ofullständig reduktion av syre och följaktligen till bildning av aktiverade sy-respecies som superoxid, peroxider och hydroxylradikaler.

30 Vissa av dessa aktiverade syrespecies är identiska med dem, som bildas under lunginflammation.

Andra forskare har visat att N-acetyl-L-cystein intravenöst infunderat delvis skyddar mot syreinducerat ödem i rättor. Vi 35 har bekräftat dessa upptäckter och har även visat att N-isobutyryl-L-cystein ger ett skydd, som är nägot bättre vid ad-ministrering pä samma sätt. Det visades ovan att, koncentra-tionen av N-isobutyryl-L-cystein i human plasma efter oralt 93442 22 intag nädde en högsta ^concentration vid 10 μΜ. Det tycks där-för fullt möjligt att erna skydd mot oxidativt tryck och kanske mot inflammation i lunga genom oralt intag av nya tio-ler.

5

Slutsatser

Metaboliska studier visade att N-isobutyryl-L-cystein och N-pivaloyl-L-cystein var mycket stabilare än det terapeutiskt använda N-acetyl-L-cystein. Koncentrationsniväerna i plasma 10 av de nya föreningarna efter oralt intag var mycket högre än niväerna av N-acetyl-L-cystein. Den orala toxicitetsmodellen visade att de nya föreningarna skyddade mot lungskada minst lika effektivt som N-acetyl-L-cystein efter intravenös admi-nistrering. Resultaten indikerar, att de nya föreningarna 15 kommer att vara mycket effektivare än N-acetyl-L-cystein mot oxidativ stress i lunga när de ges oralt.

Claims

93442

1. Menetelmä tulehduksenvastaisen kysteiinijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on kaava I *

5 HS X HN COOH I 10 | CO R 15 jossa R on -CH(CH3)2 tai -C(CH3)3, tai sen fysiologisesti hyväksyttävän suolan tai optisen isomeerin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että saatetaan reagoimaan yhdiste, jolla on kaava 20 HS X H2N COOH 25 tai sen optinen isomeeri kaavan RCOX 30 mukaisen asylointireagenssin kanssa, jossa kaavassa R on edellä ilmoitettu ja -COX on reaktiivinen ryhmä, joka pystyy reagoimaan aminoryhmän kanssa muodostaen amidiryhmän, minkä jälkeen saatu yhdiste muutetaan haluttaessa optiseksi isomee-rikseen tai fysiologisesti hyväksyttäväksi suolakseen. 35

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -t u siitä, että R on -CH(CH3)2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet -40 t u siitä, että optinen isomeeri on D-isomeeri. 93442