FI92465B

FI92465B - Menetelmä endo-osteaalisten materiaalien käsittelemiseksi

Info

Publication number: FI92465B
Application number: FI931657A
Authority: FI
Inventors: Risto Tapani Lehtinen
Original assignee: Risto Tapani Lehtinen
Priority date: 1993-04-14
Filing date: 1993-04-14
Publication date: 1994-08-15
Also published as: AU6430794A; FI92465C; DE69425372T2; EP0696923B1; WO1994023770A1; DE69425372D1; DE696923T1; HK1011940A1; FI931657A0; JPH08508661A; EP0696923A1; US5733564A; CA2160565A1; CN1120811A

Description

92465

MENETELMÄ ENDO-OSTEAALISTEN MATERIAALIEN KÄSITTELEMISEKSI

Tämä keksintö liittyy bisfosfonaattien käyttöön leikkauksissa käytettävien endo-osteaalisten materiaalien, myös implantaattien, käsittelemiseksi ennen niiden asettamista ihmisen ruumiiseen. Keksintö koskee erityisesti tietyn 5 bisfosfonaattimäärän lisäämistä endo-osteaalisten materiaalien steriiliin säilöntäliuokseen.

Viime vuosina on intensiivisesti tutkittu ihmisruumiiseen sisään asetettavia keinotekoisia endo-osteaalisia materiaaleja, erityisesti implantaatteja, kuten keinotekoisia 10 niveliä, luuhun asetettavia murtumafiksaatiolevyjä, lonkka-ja hammasimplantaatteja. Merkittäviä saavutuksia on tehty materiaaleilla, jotka antavat sekä korkean mekaanisen vahvuuden että hyvän biologisen affiniteetin.

Leikkausmenettelytavat, joissa asetetaan endo-osteaaleja 15 proteeseja sekä implantaatteja (ruuvi-implantaatteja, levyimplantaatteja, neulaimplantaatteja jne.) luukudokseen, ovat laajasti käytössä ortopedisessä ja dentaalisessa kirurgiassa somatologisen tekniikan etenemisen ansiosta.

Endo-ostaaliset proteesit voidaan karkeasti jakaa kahteen 20 ryhmään: toisaalta ne, joilla on metallinen substraatti ja .·. toisaalta keraamit ja lasi-keraamit (biokeraamit) . Metalli silla proteeseilla on erinomaisia lujuusominaisuuksia mutta aika heikko biologinen yhteensopivuus. Titaani ja sen lejeeringit ovat useimmin käytetyt metalliset proteesit 25 sekä ortopedisessä että dentaalisessa kirurgiassa. Osseoin-tegraation ja luunsitomisprosessin tehostamiseksi metalli-nen substraatti normaalisti plasmaruiskupinnoitetaan esimerkiksi apatiitilla tai hydroksiapatiitilla luunsitomisprosessin edistämiseksi. Esimerkkeinä endo-osteaalisista 30 proteeseista voidaan mainita Tricon-M ja Allopro polvipro-teesit, Ortoloc sääriluuproteesi ja Monk, DF-80 ja Authopor lonkkaproteesit. Tavallisesti käytetyistä metallisubstraat-ti-implantaateista hammasalalla voidaan mainita puhtaat t 92465 2 titaani-implantaatit (Nobelpharma, Swede-VentR, IMZ). Pinnoitettujen metallisten substraatti-implantaattien joukosta voidaan mainita BonefitR, titaanisubstraatti, jolla on titaaniplasmapinnoite; Steri-OssR, hydroksiapatiittipinnoi-5 tettu metallilejeerinkisubstraatti ja Calcitec, hydrok-siapatiittipinnoitettu titaanisubstraatti. Keraamiset implantaatit pohjautuvat esimerkiksi monikiteiseen alumiinioksidiin, Al203 (Frialit). Lasikeraameihin ja biokeraa-meihin kuuluu erilaisia lasi-, keraami- ja lasikeraamiseok-10 siä, joilla on kykyä sitoutua luuhun.

Ihmisen ruumiiseen asetettavat endo-osteaaliset materiaalit on ennen käyttöä säilytettävä tarkasti steriilisissä olosuhteissa. Säilytys voi tapahtua kuivissa olosuhteissa tai steriilisessä liuoksessa. Kaikki käytössä olevat hammasim-15 plantaatit pakataan steriilisiin lasipulloihin. Nämä pullot ovat joko tyhjiä tai sisältävät fysiologisen suolaliuoksen. Hammasimplantaatit pakataan normaalisti pieniin ampulleihin muutamaan millilitraan steriilistä natriumkloridiliuosta. Lonkkaproteesit pakataan steriilisiin säiliöihin, kaikki 20 osat erillisiin säiliöihin ilman nestettä.

Proteesien ja implantaattien säilytys ennen niiden käyttöä ei ole ongelmallista vain steriilisyyden osalta. On tunnettua, että implantaatin bio-yhteensopivuus on läheisesti riippuvainen materiaalin pintaominaisuudesta. On sen takia 25 erittäin tärkeää, että pintakerros on huolellisesti kontrolloitu ja spesifioitu atomitasolla. Kaksi alunperin samasta materiaalista valmistettua implantaattia voi saada täysin erilaiset bioaktiiviset ominaisuudet riippuen siitä, *: kuinka materiaali on käsitelty. Kahden samanlaisen implan- • 30 taatin sterilointi voi esimerkisi vaihdella ja siten johtaa kokonaan erilaiseen bio-yhteensopivuuteen kahdelle samanlaiselle implantaatille. On ymmärretty ongelma, joka liittyy implantaattipinnan kontaminaatioriskiin ja joka johtaa implantaattipinnan inaktivoimiseen, ja on esitetty ehdotuk-35 siä ongelman ratkaisemiseksi. US-patentissa 4,712,681 kuvataan menetelmä keinotekoisten implantaattien pakkaami- li 92465 3 seksi steriilistä ja kontaminaatiovapaasti, jolloin implan-taatti pakataan sisempään kapseliin, joka on tehty samasta materiaalista kuin itse implantaatti. US 4,763,788 esittää melkein samanlaisen ratkaisun kontaminaatio-ongelmaan; se 5 edustaa US-patentissa 4,712,681 esitetyn kaksoiskapselin modifikaatiota.

Implantaattipinnan herkkyys ympäristössä oleville partikkeleille on siten todettu vaikeudeksi, joka on ratkaistava.

Tämä keksintö pohjautuu oivallukseen hyödyntää herkkyysil-10 miötä ja saattaa endo-osteaalisen materiaalin pinta läheiseen yhteyteen sellaisten aineiden kanssa, joilla on positiivinen vaikutus endo-osteaalisen materiaalin bio-yhteen-sopivuuteen. Käytännössä tämä suoritetaan siten, että lisätään bio-yhteensopivuutta edistävä aine liuokseen, 15 jossa endo-osteaalinen materiaali tullaan säilyttämään ennen sen käyttöä.

Keksinnön erään suoritusmuodon mukaisesti vaikuttava määrä bisfosfonaattia lisätään liuokseen, jota on käytettävä säilytysliuoksena endo-osteaalisten materiaalien kuten 20 keinotekoisten nivelien, lonkkaproteesien, murtumafiksaa-tiolevyjen sekä dentaalisten ja muiden implantaattien säilytykseen. Tällä tavalla varastoitujen endo-osteaalisten proteesien käyttö mahdollisesti yhdistettynä systeemisen biofosfonaattiterapian kanssa voi hyvin todennäköisesti 25 johtaa paljon alhaisempaan epäonnistumisfrekvenssiin verrattuna tilanteeseen, jossa mitään bisfosfonaattia ei ole lisätty endo-osteaalisen proteesin säilöntäliuokseen.

Bisfosfonaatit ovat synteettisiä orgaanisia yhdisteitä, jotka rakenteellisesti muistuttavat pyrofosfaattia siten, 30 että pyrofosfaatin P-O-P-sidos on korvattu P-C-P-sidoksel-la. Päinvastoin kuin pyrofosfaatit, bisfosfonaatit ovat resistenttejä entsymaattiselle hydrolyysille luukudoksessa. Bisfosfonaatit ovat tehokkaita luun resorption estäviä aineita ja niitä on menestyksellisesti käytetty eri syistä 4 92465 johtuvan hyperkalsemian hoitoon. Suuri määrä bisfosfonaat-teja on tutkittu, mutta ainoastaan klodronaatti, eti-dronaatti ja pamidronaatti ovat saaneet laajempaa kliinistä käyttöä.

5 Bisfosfonaattien pääasiallinen teho on niiden kyky estää luun resorptiota, mutta päinvastoin kuin vaikutus minera-lisaatiossa, mekanismi on solujen muodostama (Fleisch H,

Drugs 1991; 42:919-44). Nämä erilaiset vaikutukset vaihte-levat huomattavasti riippuen yksittäisen bisfosfonaattiyh-10 disteen rakenteesta. Kiertävien bisfosfonaattien puoliintumisaika on hyvin lyhyt, suuruusluokkaa minuuteista tunteihin. Annetusta annoksesta 20 - 50 % imeytyy luuhun ja loput erittyy virtsaan. Puoliintumisaika luussa on huomattavasti pitempi ja riippuu itse luun aineenvaihduntanopeudesta.

15 Katsaus, joka käsittää 126 julkaisua kliinisistä tutkimuksista (Mian M et ai., Int J Clin Pharmacol Res. 1991; 11:107-14), jotka koskevat klodronaatin käyttöä luun sairauksien terapiassa 1930 potilaalla, ja joiden tarkoituksena oli arvioida tämän lääkkeen lyhytaikaisen ja pitkäaikai-20 sen annon siedettävyys ja vaikutukset, antaa ymmärtää, että klodronaattiterapialla ei ole mitään merkittäviä sivuvaikutuksia ja se varmistaa sen siedettävyyden ja turvallisuuden .

«

Monista bisfosfonaattiperheeseen kuuluvista yhdisteistä 25 klodronaattia on laajasti käytetty pahanlaatuisen hyperkalsemian ja luunliukenemisen hoidossa (Bonjour J P ja Rizzoli R, Calcif Tissue Int 1990; 46 Suppl: 20-25). Kaikki jul-.. kaistut raportit viittaavat siihen, että klodronaatti pystyy normalisoimaan plasman kalsiumin valtaosassa hyper-30 kalsemisista, rehydraatiosyöpäpotilaista, joissa luun resorptio on hallitseva häiriintynyt kalsiumvuoto (Fleisch H, Drugs 1991; 42: 919-44).

.. Erilaisten fosfonaattiyhdisteiden on myös patenttikirjalli- suuden mukaan raportoitu olevan käyttökelpoisia poikkeavan

II

92465 5 kalsiumfosfaatin (luumineraalin) mobilisaation ja saostumi-sen hoidossa nisäkkäillä. Viitataan US-patentteihin 3,678,164; 3,662,066; 3,553,314; 3,553,315; 3,584,124; 3,584,125 ja 3,641,246. US-patentti 3,683,080 kuvaa klod-5 ronaatin ja erilaisten muiden fosfonaattien käyttöä pehmytkudoksen epänormaaliseen kalsifikaatioon ja niveltulehdus-tilanteisiin. US 4,234,645 esittää, että klodronaatti on käyttökelpoinen erilaisten kollageenisairauksien hoidossa.

Kuten yllä on todettu, bisfosfonaattien kyky inhiboida 10 erilaisten sairauksien yhteydessä esiintyvä luuresorptio on hyvin dokumentoitu. Kuitenkaan ei ole koskaan ehdotettu näiden yhdisteiden käyttöä kudoksen muodostumisen edistämiseksi kirurgisten toimenpiteiden jälkeen, jotka liittyvät endo-osteaalisiin proteeseihin kuten lonkkaproteeseihin, 15 sisäisessä jäykässä fiksaatiossa käytettyihin levyihin ja erilaisiin implantaatteihin; alaleuan kudoskuolion kuoren poiston jälkeiseen luumätään tai luutransplantaatioon. Erityisesti hammasimplantaattikirurgiassa potilaita, joilla on huomattava alaleuan atrofia on hammaskuopat vaikeaa 20 hoitaa tavallisella implantaattitekniikalla. Havaitaan usein liikkuvia kiinnityksiä implantaatin rajaliitoksessa. Noin puolet rekisteröidyistä epäonnistumisista tapahtui paranemisen aikana (Adell R et ai., Int J Oral Maxillofac . Surg 1990, 5: 347-359). Vakavasti resorboituneeseen reunaan 25 käytetyt autogeeniset luunsiirteet resorboituvat tavallisesti huomattavassa määrin (Baker R D et ai., J Oral Surg 1970; 37:486-89).

Klodronaatin vaikutus hydroksiapatiittiin on laajasti ;· tutkittu. Vaikka klodronaatin vaikutus hydroksiapatiittiin 30 on hyvin dokumentoitu, klodronaatin tai muiden bisfosfonaattien käyttöä hydroksiapatiittipinnoitettujen tai muulla tavoin pinnoitettujen endo-osteaaliproteesien ja implantaattien suojaukseen ei ole koskaan ehdotettu. Bisfosfonaattien käyttöä sellaisten proteesien ja implantaat-. 35 tien pinnoittamattoman metallipinnan aktivoimiseksi ei ole myöskään ehdotettu.

6 92465 Tämä keksintö liittyy menetelmään kirurgiassa käytettävien endo-osteaalisten materiaalien käsittelyyn steriilistä ja biokompabiliteettia edistävää varastointia varten. Keksinnölle on tunnusomaista endo-osteaalisen materiaalin sulke-5 misesta sisään vesiliuokseen, joka sisältää tehokkaan määrän kaavan (I) mukaista yhdistettä

OH ^ (pH

0=P-C-^>=0 (I)

OH Y OH

10 jossa X on H, OH, Cl, F tai metyyliryhmä ja Y on Cl, OH, -(CH2)2-N(CH3)-(CH2)4-CH3, -(CH2)n-CH3 tai -(CH2)n-NH2, jossa n on nolla tai kokonaisluku alueella 1-8, -NHZ, jossa Z on pyridinyyli tai sykloheptyyli, SZ', jossa Z' on pyridinyyli tai kloorisubstituoitu fenyyli tai Y on pyridinyylisubsti-15 tuoitu alempi alkyyliketju; tai sen myrkytön, farmaseuttisesti hyväksyttävä suola tai esteri, jonka jälkeen endo-osteaalinen materiaali joko - poistetaan liuoksesta, kuivataan ja steriloidaan, tai - suljetaan se bisfosfonaattiliuosta sisältävään astiaan ja 20 steriloidaan.

Termin "endo-osteaalinen materiaali" on ymmärrettävä sisältävän kaikenlaiset ihmisruumiiseen asetettavat endo-osteaa-liset proteesit ja niiden osat, esimerkiksi keinotekoiset nivelet, lonkkaproteesit, luun murtumafiksaatiolevyt ja 25 implantaatit, erityisesti hammasimplantaatit.

Erityisen arvokkaita kaavan (I) mukaisia yhdisteitä tämän keksinnön tarkoitukseen ovat klodronaatti, jossa X ja Y molemmat ovat Cl? pamidronaatti, jossa X on OH ja Y on -(CH2)2-NH2? alendronihappo, jossa X on OH ja Y on 30 -(CH2)3-NH2; neridronihappo, jossa X on OH ja Y on -(CH2)5-NH2; risedronihappo, jossa X on OH ja Y on 3-pyridinyylimetyyli; tiludronatti, jossa X on H ja Y on 4- kloorifenyylitio; YM-175 eli (sykloheptyyliamino)mety-

II

9246S

7 leenibisfosfonihappo, jossa X on H ja Y on sykloheptyy-liamino; BM-210995 eli l-hydroksi-3-(metyylipentyyliami-no)-propylideenibisfosfonihappo, jossa X on OH ja Y on -(CH2)2-N(CH3)-(CH2)4-CH3; ja etidronaatti, jossa X on metyyli 5 ja Y on OH. Suositeltavin yhdiste keksinnön mukaiseen tarkoitukseen on klodronaatti tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat tai esterit.

Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja esterit, jotka ovat käyttökelpoisia tämän keksinnön hyväksikäytössä, 10 voidaan kuvata kaavalla (II)

OM X OM

1 Ϊ 1 0=P-C-P=0 (II) III v ;

OM Y OM

15 jossa X ja Y ovat kuten yllä ja M on vety, farmaseuttisesti hyväksyttävä kationi, edullisesti alkalimetallikationi kuten natrium tai kalium, tai alkyyli tai aryyliosa, esimerkiksi alkyyli, jossa on 1 - 4 hiiliatomia tai fenyyli.

Sopiva määrä käsittelyliuokseen lisättävää bisfosfonaattia 20 vaihtelee 0.5 ja 100 mg/ml välillä, edullisesti 1 ja 10 mg/ml välillä.

Käsittely voidaan esimerkisi suorittaa seuraavasti: Kun endo-osteaaliset proteesit on valmistettu ne suljetaan sisään liuokseen, jossa on 1 - 6 mg/ml bisfosfonaattia 25 ajaksi joka vaihtelee 20 minuutin ja 7 vuorokauden välillä. Sen jälkeen endo-osteaaliset proteesit voidaan kuivata ja steriloida gammasäteilytyksellä ja varastoida kuivassa olotilassa ennen niiden käyttöä. Vaihtoehtoisesti endo-osteaaliset proteesit voidaan varastoida samassa tai saman-30 tapaisessa bisfosfonaattiliuoksessa kuin se, missä niitä oli upotettu. Tässä tapauksessa steriloidaan bisfosfonaat-tiliuos gammasäteilytyksellä.

Bisfosfonaattikäsittely soveltuu yhtä hyvin sellaisille 8 92465 endo-osteaalisille proteeseille, joilla on keraaminen pinta kuin sellaisille, joilla ei ole keraamista pintaa.

Keksinnön mukainen idea on varmistettu sekä eläinkokeilla että kliinisillä kokeilla. Kahden erillisen dinatriumklo-5 dronaatti-tutkimuksen mukaan, joiden menetelmiä ja tuloksia esitetään tarkasti jatkossa, näytetään klodronaatin vaikutus luunmuodostukseen.

Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin klodronaatin vaikutus luun regeneraatioon kanin sääriluussa. Kehitettiin kokeel-10 linen malli, joka käsitti vapaan luun transplantaation sääriluuhun. Tulokset paljastivat, että klodronaatilla oli positiivinen vaikutus donoriontelon luun regeneraatioon ja vapaisiin luusiirteisiin, jotka oli transplantoitu ti-taaniruuvia käyttäen. Klodronaattikäsitellyt sääriluut 15 vaskularisoituivat nopeammin ja täydellisemmin kuin kontrollin sääriluut.

Tulokset humaanikokeissa, joissa potilailla oli ylimääräinen implantaatti, joka poistettiin tietyn ajan jälkeen, osoittivat, että klodronaattilääkitetyillä potilailla 20 tapahtui nopeampaa luunmuodostusta kuin ei-lääkitetyssä kontrolliryhmässä.

Hydroksiapatiitti- ja bisfosfonaattimolekyylit muodostavat pinnan eivätkä kemiallista sidosta. Pinnassa on tilaa kal-siumatomeille. Kalsiumpitoisuus on siten korkea. Hydrok-25 siapatiitin ja bisfosfonaatin koostumus, joka muodostaa kerroksen endo-osteaalisen proteesin tai muun implantaatin pinnalla on avuksi leikkauksen jälkeisessä luun regeneraa-tiossa.

Bisfosfonaattien vaikutus implantaattien suojaamiseksi on 30 parhaillaan vahvistumassa meneillään olevilla kokeilla.

Käytetään hydroksiapatiittipinnoitettuja IMZ-implantaatte-ja, jotka on kyllästetty klodronaatissa vähintään 48 tuntia. Kontrolleina käytetään samoja implantaatteja, mutta

II

9 92465 ilman klodronaattikyllästystä. Kokeessa käytetään lampaiden alaleukoja (Eläinlääketieteellinen korkeakoulu, Helsinki). Käytetään 20 lääkekäsiteltyä, eli klodronaattikyllästettyä (10 kappaletta pitoisuudella 6 mg/ml ja 10 kappaletta 60 5 mg/mls 11a) ja 10 ei-lääkekäsiteltyä lampaiden alaleukoihin asetettua hydroksiapatiittipinnoitettua implantaattia.

Läheisen rakenteellisen ja farmakologisen yhteyden klod-ronaatin ja sen kaavan (I) mukaisten analogien välillä on perusteltua otaksua, että muut kaavan (I) mukaiset yhdis-10 teet myös ovat tehokkaita endo-osteaalisten proteesien ja implantaattien biokompabiliteetin edistämiseksi niiden varastoinnin aikana.

KOKEET

I. Klodronaatin vaikutus luun reqeneraatioon kaneissa 15 Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, oliko klodronaa-tilla positiivinen vaikutus sääriluun vaskularisaatioon ja luun muodostumiseen kanilla, jossa luuta oli transplantoitu titaaniruuvin avulla.

Materiaalit 1a menetelmät 20 Käytettiin kuuttatoista luurangoltaan täysin kehittynyttä (3.5 - 3.9 kg) Uuden Seelannin valkoista uroskania. Eläimet jaettiin kahteen ryhmään. Jokaiseen ryhmään kuului kahdeksan eläintä (16 sääriluuta). Yksi ryhmä sain 25 mg/kg klodronaattidinatriumia (BonefosR, Leiras Oy, Suomi) i.m.

25 kaksi kertaa viikossa. Toinen ryhmä (kontrolli) oli käsittelemätön .

Kanit nukutettiin injisoimalla i.m. 2.8 mg KetalarR:ia (Parke-Davis, Espanja) ja 2.0 ml RompunR:ia (Bayer, Saksa).

Molempien sääriluiden proksimaaliset päät paljastettiin ja 30 poistettiin luukalvo leikkausalueelta. Poistettiin luupo- 92465 10 ralla pala kuoriluuta, jonka läpimitta oli 4 mm. Palan läpi ruuvattiin 0.6 mm:n titaani-implantaattiruuvi (Filpin,

Filpol Dental, Irlanti). Pala, joka oli lävistetty implan-taatilla, ruuvattiin paikalleen 3 mm donoriontelon yläpuo-5 lella. Viitataan kuvioon 1, joka esittää kanin sääriluuta, jossa A tarkoittaa implantaattia, T transplantaattia ja F donorionteloa. Kuvion ylempi piirros esittää poikkileikkausta ja alempi piirros sääriluuta nähtynä päältä päin.

Eläimet jaettiin kahteen ryhmään: suoritettiin mikroangiog-10 rafia kahdeksalla eläimellä ja muilla kahdeksalla eläimellä tehtiin histologisia värjäysnäytteitä. Implantaatin ja donoriontelon tarkan paikan määrittämiseksi tehtiin rönt-gentarkastuksia käyttämällä kahta sääriluiden ympäri menevää teräslankaa, joilla oli solmuja. Viitataan kuvioon 2, 15 joka esittää sääriluun röntgenkuvia sivulta leikkaus-alueella. Suuret kirjaimet A, T ja F tarkoittavat samaa kuin kuviossa 1.

Histologinen arviointi

Histologista arviointia varten tapettiin kahdeksan eläintä 20 eri aikoina implantaation jälkeen: 14 vuorokauden jälkeen (2 kania), 21 vuorokauden jälkeen (4 kania) ja 35 vuorokauden jälkeen (2 kania). Kontrollien ja klodronaattikäsitel-- tyjen eläinten määrä oli joka kerta sama.

Sääriluut fikseerattiin 5 %:lla fosfaattipuskuroidulla 25 formaliinilla ja tehtiin värjäys toluiinisinisellä ja hematoksyliini-eosiinivärjäystä (HE). Näytteet tutkittiin .. valomikroskoopilla ja noteerattiin haitalliset vaikutukset tai tulehduksen merkit.

Mikroangiografia 30 Kahdeksan eläintä (4 kontrollia, 4 käsiteltyä) tapettiin 21 vuorokauden jälkeen pentobarbitaalin i.v. annoksella.

li 92465 11

Ennen niiden kuolemaa paljastettiin vatsavaltimo ja -laskimo ja 18-asteinen angiokatetri työnnettiin sisään ja kiinnitettiin paikalleen. Käytettiin 20 ml:n ruiskua, joka sisälsi heparinisoitua suolaliuosta vatsavaltimon infuusi-5 oon. Infuusiota jatkettiin, kunnes käsitellystä vatsalaski-mosta poistui kirkas laskimovirtaus. Sitten injisoitiin 100 ml:n ruisku, joka oli täytetty oranssinvärisellä sili-konikumiyhdisteellä (Micro-FilR, Canton Biomedical, Boulder CO, USA,) kunnes vatsalaskiraosta poistui oranssinvärinen 10 virtaus. Kun yhdiste oli kiinnittynyt 4 tunnin ajan poistettiin sääriluut. Näytteet kuivattiin sitten peräkkäin valmistajan puhdistustekniikan mukaisesti.

Leikkausveitsellä tehtiin poikkileikkauksia siirteiden keskiosiin dissektiomikroskooppitutkimusta ja diavaloku-15 vausta varten. Laskettiin läpinäkyvien värikuvien avulla absoluuttinen lukumäärä sellaisia suonia, jotka läpäisivät transplantaatin ja transplantaattia vastaanottavan kappaleen liitoskohdan (Eppley B et ai., J Oral Maxillofac Surg 1988; 46: 391-98).

20 Suonien laskeminen suoritettiin näytteestä, jossa havaittiin eniten suonia. Suonet laskettiin kahtena ajnkohtana samojen havaitsijoiden toimesta ja tuloksista laskettiin keskiarvo. Jos vaihtelu kahden arvon välillä oli yli 10 % suoritettiin kolmas laskeminen ja laskettiin kolmen laske-25 misen keskiarvo. Molempien ryhmien suonien laskemistulokset vertailtiin käyttämällä parillista t-testiä; P arvot alle 0.05 katsottiin merkittäviksi.

Tulokset

Kliiniset havainnot paljastivat, että kaikki haavat paran-30 tuivat rauhallisesti.

Angiogeneesin arviointi

Kun laskettiin suonet oli valtaosa niistä selvästi nähtä- » 9246b 12 vissä. Oli kuitenkin vaikeaa laskea luun ja transplantaatin ja luun ja donoriontelon liitoskohtien pienet suonet. Koska saman havaitsijan kahdessa arvossa oli vaihteluja tehtiin kolmas laskeminen viiden näytteen osalta.

5 Donoriontelot

Donorionteloita läpäisevien suonien lukumäärä oli suurempi kaneilla, joita oli käsitelty klodronaatilla kuin kontrollin. Tulokset on annettu taulukossa I alla ja ero on tilastollisesti merkittävä (P < 0.05).

10 Taulukko 1

Donorionteloa läpäisevien suonien lukumäärä (x) x S.D. Sääriluut, lkm

Kontrolli 12.3 4.6 8 15 Klodronaattikäsitelty 26.3 4.0 8

Suonimäärän erot voidaan myös nähdä kuvioiden 3 ja 4 esittämissä valokuvissa. Kuvio 3 esittää klodronaattikäsitellyn kanin näytettä 21 vuorokauden jälkeen. Implantaatti ja transplantaatti sijaitsevat kuvan keskellä. Donoriontelo • 20 nähdään transplantaatista oikealle. Voidaan nähdä, että monta suonta läpäisee donoriontelon ja transplantaatin. Kuviossa 4 nähdään käsittelemättömän kanin näyte 21 vuorokauden jälkeen. Ainoastaan pieni lukumäärä suonia läpäisi transplantaatin.

25 Transplantaatit

Klodronaattikäsiteltyjen eläinten sääriluiden transplantaa-teissa tapahtui nopeampi ja täydellisempi vaskularisaatio kuin kontrollin sääriluissa. Ero oli tilastollisesti merkittävä (P < 0.05). Tulokset on esitetty taulukossa II.

Il 92465 13

Taulukko II

Transplantaatteja läpäisevien suonien lukumäärä (x) x S.D. Sääriluut, lkm 5 Kontrolli 4.75 1.7 8

Klodronaattikäsitelty 13.0 4.0 8

Suonet läpäisivät donoriontelon lähempänä keskipistettä lääkitetyissä kaneissa kuin kontrolliryhmässä. Lääkitetyis-sä kaneissa suonien lukumäärä oli suurempi näytteen toisel-10 ta puolelta kuin sen vastakkaiselta puolelta.

Histologiset havainnot

Mitään merkkejä haitallisesta kudosreaktiosta tai tulehduksesta ei havaittu, kun näytteet tutkittiin valomikroskoo-pilla.

15 Donoriontelo

Kontrollinäytteet 14 vuorokauden jälkeen osoittivat heikon kollageenimuodostuksen ja ontelon keskiosassa puuttui osittain histologisesti näkyviä elementtejä. Klodronaatti-käsitellyt näytteet osoittivat enemmän kollageenimuodostus-20 ta kuin kontrollinäytteet. Mitään tyhjiä tiloja ei havaittu. Kolmen viikon kohdalla kontrollinäytteet osoittivat vain heikon luunmuodostuksen ontelon ulommilla reunoilla. Ontelon sisempi osa oli pääosin täytetty kollageenilla ja havaittiin selvästi terävä erottaminen ontelon ja luun 25 välillä. Klodronaattikäsitellyt donoriontelot olivat melkein kokonaan uuden luun täyttämiä. Kolmen viikon näytteissä havaittiin vielä kollageenia uuden luun välillä.

9246b 14

Viiden viikon kontrollin ontelot olivat osittain täytetty uudella luumassalla ja kairatun ontelon ja luun välinen viiva havaittiin ontelon useimmissa kohdissa. Klodronaatti-käsitellyt ontelot olivat täydellisesti uuden luun täyttä-5 miä ja porausviiva oli nähtävissä, mutta resoluutio oli käynnistynyt donoriontelon ja vanhan luun välillä. Kuvio 5 esittää viiden viikon kontrolli-onteloa. Luunmuodostusta on nähtävissä ontelon keskiosassa ja porausviivoissa. Kairatun ontelon ja luun välinen viiva on näkyvissä ontelon 10 useimmissa kohdissa. Uuden luun muodostus osteoblasteineen esiintyy satunnaisesti porausviivassa ja myös ontelon keskiosassa. Kuvio 6 esittää viiden viikon klodronaattikä-siteltyä onteloa. Ontelo oli kokonaan täytetty uudella luumassalla ja porausviiva on vielä näkyvissä, mutta siinä 15 on yhteen sulautumista donoriontelon ja luunkuoren välillä. Kuviot 7 ja 8 esittävät voimakkaampia suurennoksia kuviosta 6. Kuviossa 7 on havaittavissa kiinteää uutta luuta ja osteoblasteja. Kuviosta 8 ilmenee, että luunkuori ja uusi luu olivat melkein kokonaan sulautuneet yhteen.

20 Transplantaatit

Transplantaatin päällä sijaitseva pehmytkudos ja luukalvo sisälsivät enemmän kollageenia klodronaattikäsitellyn ryhmän kohdalla kuin kontrollieläimissä kaikissa vaiheissa. Neljäntoista vuorokauden kontrollinäytteet osoittivat 25 nekroottista luuta sisääntunkeutuvalla kollageenilla.

Käsitellyt transplantaatit alkoivat resorboitua ulompien reunojensa kohdalla. Kuvio 9 esittää neljän viikon klodronaattikäsitellyn kanin sääriluuta sivulta. Uusi luu peittää transplantaatin. Luukalvo on ehjä mutta ohuempi • * 30 kuin se, joka sijaitsi leikkaamattoman alueen päällä. Implantaatti ja transplantaatti ovat näytteen keskellä. Transplantaatista oikealle sijaitsee donoriontelo ja sen johdosta muodostuu uutta luuta kanin normaalisti tyhjään huokoiseen luuhun.

35 Kahdenkymmenenyhden vuorokauden transplantaatit olivat li 92465 15 osittain resorboituneet. Käsitellyissä sääriluissa havaittiin uutta luuta resorboiduissa alueissa. Mitään luun-muodostusta ei havaittu kontrollitransplantaateissa. Im-plantaatin ympärillä oleva luunmuodostus oli kiinteä korti-5 kaaliluun kohdissa klodronaattikäsitellyssä ryhmässä. Kuvio 10 esittää klodronaattikäsiteltyä 21-vuorokauden näytettä. Transplantaatti oli osittain resorboitunut ja korvattu uudella luumassalla. Isot kirjaimet A ja T edustavat im-plantaattia ja vastaavasti transplantaattia, kuten kuviossa 10 1, ja E edustaa uutta luuta transplantaatin ja kortikaali- sen sääriluun vieressä.

35:n vuorokauden näytteissä esiintyi uuden luun muodostusta melkein kauttaaltaan käsiteltyjen sääriluiden transplantaa-teissa. Ainoastaan kiinteää luuta oli näkyvissä kontrollin 15 transplantaateissa.

Diskussio

Transplantaattien regeneraatio tapahtuu transplantaatin mikrovaskularisaation kautta. Rottasikiötutkimuksessa Ray (Ray R D, Clin Orthop 1977; 87: 43-48) osoitti, että rot-20 tasikiön vaskularisaatio kestää 3-4 viikkoa. Katsauksessa Burchardt (Burchardt H, Clin Orthop 1983; 174: 28-42) toteaa, että huokoinen luu eroaa kortikaaliluun siirteistä revaskularisaation nopeuden suhteen. Hän esitti, että huokoisen luun siirteiden revaskularisaatio voi tapahtua 25 tunneissa isäntäsuonien päittäisten anastomoosien takia. Revaskularisaatio saattaa olla täydellinen kahden viikon sisällä (Ray R D; referenssi kuten yllä). Verisuonet läpäisevät kortikaaliluun siirteen vasta kuudentena vuorokautena (Ray R D; referenssi kuten yllä). Valittiin kaksikym-30 mentäyksi vuorokautta implantaation jälkeiseksi luun re-genoroitumisajaksi Eppleyn ja hänen kollegojensa raportoimien tulosten perusteella (Eppley B et ai., J Oral Maxifollfac Surg 1988; 46: 391-98). He totesivat, että kanien luusiirteiden vaskularisaatio saavutti maksimin 21:n 35 vuorokauden jälkeen.

16 92465 Tämän tutkimuksen tulokset vahvistavat aikaisempien raporttien tulokset (Bonjour J P; molemmat referenssit annettu yllä) kontrolliryhmän osalta. Lääkekäsiteltyjen kanien vaskularisaatio tapahtui nopeammin kuin kontrolliryhmän.

5 Histologiset tulokset osoittavat selvästi, että klodronaat-tikäsittely johtaa parempaan luuhun. Tutkimuksen tulokset viittaavat siihen, että bisfosfonaatit, erityisesti klod-ronaatti, ovat käyttökelpoisia implantaatti- ja transplan-taattipotilailla, joilla on suuri luun regeneroinnin epäon-10 nistumisriski.

II. Humaanikokeita

Materiaalit 1a menetelmät Tämän tutkimuksen kohteena oli 20 hampaatonta potilasta. He tulivat kaikki Turun Yliopiston Hammaslääketieteen laitok-15 selle implantaattitoimenpidettä varten. Turun Yliopiston Lääketieteen tiedekunnan eettinen toimikunta sai tehtäväksi arvioida, joutuivatko henkilöt riskille alttiiksi projektissa. Eettisen toimikunnan yksimielisen päätöksen mukaan henkilöt eivät tässä toiminnassa joudu millekään riskille 20 alttiiksi. Potilaat antoivat luvan ylimääräisen implantaa-tin eksplantaatiolle. Kymmenen potilasta sai 1600 mg:n päivittäisen klodronaattidinatriumin annoksen, kunnes ylimääräinen implantaatti poistettiin (lääkitetty ryhmä) ja kymmenen potilasta sai plasebon. Lääkitys ja vastaavasti 25 plasebon antaminen käynnistyi viikko ennen leikkausta ja jatkui kolme viikkoa leikkauksen jälkeen.

Leikkaustekniikka Käytettiin rutiinimenetelmää viidellä Astra-implantaatilla. Kuva 11 esittää ihmisen alaleukaa edestä päin, jossa on 30 neljä Astran implantaattia, jossa A tarkoittaa implantaat-tia, E on poistettu implantaatti ja luu ja N on alaleuka-hermo. Hermotoiminnan häiriöiden välttämiseksi implantaatit

II

9246b 17 asetetaan tavallisesti alaleukahermon päiden välille. Leikkauksessa asetettiin ylimääräinen 4 mm:n ruuvi alaleuan keskiviivan kohdalle.

Uudisluun muodostuminen 5 Erillisessä leikkauksessa poistettiin 4 mm:n ylimääräinen implantaatti trepaaniporalla neljän viikon jälkeen (10 potilasta, yhtä monta molemmista ryhmistä) ja 12 viikon jälkeen (10 potilasta, yhtä monta molemmista ryhmistä). Näytteet suljettiin akryylilohkojen sisälle ja jaettiin ne 10 kahteen palaan keskiviivaa pitkin. Toisesta palasta tehtiin histologinen tutkimus. Toisesta palasta tehtiin SEM-elekt-ronimikroskooppitutkimus. Tehtiin SEM/EDXA (energy dispersive x-ray analysis) elektronimikroskooppitutkimus luun ja implantaatin välisessä tilassa ja kolmessa pisteessä luus-15 sa. Neljässä eri pisteessä, joista kaksi sijaitsi ylemmässä kortikaaliluussa, yksi implantaatin keskellä ja yksi sen pohjassa laskettiin natrium-, kalsium-, fosfori-, magnesium- ja titaaniarvot. Suhteet kalsium/fosfori ja kal-sium/magnesium laskettiin 12 pisteessä.

20 Tulokset

Kliininen käsittely

Kaikki haavat paranivat hyvin. Kahdella potilaalla oli ongelmia alemman hammasproteesinsa kanssa parantumisen aikana. Ne hoidettiin poistamalla osa hammasproteesista.

25 Mitään sivuvaikutuksia ei havaittu. Yhdellä potilaalla oli kipuja ortopedisessä lonkkaproteesissaan. Nämä hävisivät klodronaattilääkityksen jälkeen.

Histologiset tutkimukset

Yhden kuukauden näytteet 30 Koska kaikki leukaluut olivat huomattavasti resorboituneet 9246b 18 ja koska poistetun implantaatin pituus oli 4 mm biopsiaan otettu luu oli kortikaalinen kaikissa näytteissä. Histolo-giset tulokset on esitetty kuvioissa 12 ja 13, jotka molemmat paljastavat kuviossa 11 E-merkityn luu-implantaat-5 tinäytteen. Kuvio 13 on voimakkaampi suurennus kuviosta 12. Mitään huokoista luuta ei näkynyt. Implantaattien peittämä pehmeä ien oli terve.

Histologinen tutkimus ei paljastanut enempää uutta luuta lääkitetyissä alaleuoissa kuin kontrolleissa. Mitään tuleh-10 duksen merkkejä ei havaittu. Implantaatin ja luun välinen tila oli pääosin täytetty kollageenilla. Samoissa pisteissä oli läheinen kontakti luun ja implantaatin välillä. Tämä on luonnollista, koska käytettiin kierteitettyjä Astran im-plantaatteja.

15 SEM-tulokset

Taulukko III osoittaa SEM-tuloksia ihmisen alaleuoissa 4 viikkoa ylimääräisen Astra-implantaatin istuttamisen jälkeen. SEM-kuva (10 000 x) on sama kuin kuviot 11 ja 12. Tarkat pisteet, joissa mineraalipitoisuudet on mitattu on 20 merkitty pienillä numeroilla kuviossa 14. Näiden standardi-pisteiden keskiarvot on annettu taulukossa III.

Taulukko III

CaO P205 Ca0/P205 Mg Na 25 kontrolli 56 30 1.8 1.2 8.2 ·* lääkitetty 72 40 1.8 0.9 2.8

Arvot on annettu painoprosentteina.

Diskussio

II

9246b 19

Histologiset ja SEM kuvat olivat samankaltaisia molemmissa ryhmissä. Mitään eroja ei havaittu valo- ja SEM-cross-over-kuvissa. Yhden kuukauden näytteissä P205 ja CaO ovat molemmat olennaisesti korkeampia lääkitetyissä alaleuoissa 5 kuin kontrollissa. Tämä tarkoittaa sitä, että nopea luun-muodostus on alkanut, luunsyöjäsolut ovat resorboineet luuta. Luunmuodostus on voimakkaampi lääkitetyillä potilailla kuin kontrollilla.

Claims

92465

1. Menetelmä kirurgiassa käytettävien endo-osteaalisten materiaalien käsittelemiseksi steriilistä ja biokompabili-teettia edistävää varastointia varten tunnettu endo-osteaa-lisen materiaalin sulkemisesta sisään vesiliuokseen, joka 5 sisältää tehokkaan määrän kaavan (I) mukaista yhdistettä OH X OH I I I 0=P---C---P=0 (I) III OH Y OH jossa X on H, OH, Cl, F tai metyyliryhmä ja Y on Cl, OH, 10 -(CH2)2-N(CH3)-(CH2)4-CH3, -(CH2)n-CH3 tai -(CH2)n-NH2, jossa n on nolla tai kokonaisluku alueella 1-8, -NHZ, jossa Z on pyridinyyli tai sykloheptyyli, SZ', jossa Z' on pyridinyyli tai kloorisubstituoitu fenyyli tai Y on pyridinyylisubsti-tuoitu alempi alkyyliketju; tai sen myrkytön, farmaseutti-15 sesti hyväksyttävä suola tai esteri, jonka jälkeen endo-osteaalinen materiaali joko - poistetaan liuoksesta, kuivataan ja steriloidaan, tai - suljetaan se bisfosfonaattiliuosta sisältävään astiaan ja steriloidaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, : että mainittu endo-osteaalinen materiaali pannaan suljet tuun astiaan, joka sisältää steriilisen liuoksen kaavan (I) mukaisesta bisfosfonaatista tai sen myrkyttömästä, farmaseuttisesti hyväksyttävästä suolasta tai esteristä liuo-25 tettuna sopivaan liuottimeen.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mainittu endo-osteaalinen materiaali sisältää metalli-tai metallilejeerinkisubstraatin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä tunnettu siitä, 30 että mainittu endo-osteaalinen materiaali sisältää titaani- tai titaanipohjäisen lejeeringin substraatin, joka on I! 9246b pinnoitettu luuta sitovalla kerroksella.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että mainittu substraatti on pinnoitettu hydroksiapatiittia sisältävällä kerroksella.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että endo-osteaalinen materiaali on keraami- tai lasikeraa-miproteesi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että bisfosfonaattiyhdiste valitaan ryhmästä, johon kuuluu 10 klodronaatti, pamidronaatti, etidronaatti, alendronihappo, neridronihappo, risedronihappo, tiludronaatti, (syklohep-tyyliamino)metyleenibisfosfonihappo, l-hydroksi-3-(metyyli-pentyyliamino)-propylideenibisfosfonihappo ja mainittujen yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ja este-15 rit.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että yhdiste on klodronaatti tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola tai esteri.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä tunnettu siitä, 20 että yhdiste on dinatriumklodronaatti.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä tunnettu siitä, että yhdiste on dinatriumklodronaatti ja endo-osteaalinen materiaali on hammasimplantaatti, jolla on titaani-tai titaanipohjäisen lejeeringin substraatti ja mainittu 25 substraatti on pinnoitettu hydroksiapatiittia sisältävällä kerroksella. 92465