FI88400C - Foerfarande foer framstaellning av renin inhiberande peptider - Google Patents

Description

1 88400

Menetelmä renilniä inhiboivien peptidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien reniiniä inhiboivien peptidien valmistamiseksi. Nämä uudet reniinin inhibiittorit ovat käyttökelpoisia reniinistä riippuvan kohonneen verenpaineen diagnosoimiseksi ja sen säätämiseksi.

Reniini on endopeptidaasi, joka katkaisee spesifisesti substraattinsa (angiotensinogeenin) erityisen peptidisidok-sen, joista substraateista mainittakoon esimerkkinä hevosesta peräisin olevan substraatin N-päätteen ketju:

Reniini *

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser- IA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 joka on esitetty julkaisussa L.T. Skeggs et ai, J. Exper. Med. 106, 439 (1957). Ihmisestä peräisin olevan reniinin substraatin ketju on erilainen, mikä jokin aikaa sitten esi-tettiin julkaisussa D. A. Tewkesbury et ai., Biochem. Bio-phys. Res. Comm. 99, 1311 (1981). Se voidaan esittää seuraa-vasti: M | : ·’ Reniini : *

:.0 -Val-Ile-His- IB

11 12 13 jossa nuolen ( + ) vasemmalla puolella oleva ketju on edellä olevassa kaavassa IA esitetyn mukainen.

• · * • · · '···* Reniini pilkkoo angiotensinogeenin siten, että muodostuu an- giotensiini I:tä, joka muuttuu verenpainetta voimakkaasti *:·♦♦ lisääväksi angiotensiini IIrksi. Lukuisten, angiotensiini I:n muunnosreaktioon osallistuvaa entsyymiä inhiboivien aineiden tiedetään olevan käyttökelpoisia kohonneen verenpai- 2 88400 neen hoidossa. Samoin reniinin inhibiittorit ovat käyttökelpoisia kohonneen verenpaineen hoidossa.

Lukuisia reniiniä inhiboivia peptidejä on julkaistu. Täten US-patenttijulkaisussa 4 424 207 ja EP-hakemusjulkaisuissa 45 665 ja 104 041 esitetään tietyt peptidit, joiden asemassa 10-11 oleva dipeptidi käsittää isosteerisen sidoksen. Lukuisia, reniiniä inhiboiviksi aineiksi esitettyjä statiinin johdannaisia on julkaistu, katso esimerkiksi EP-hakemusjulkaisut 77 028, 81 783 ja 114 993 sekä US-patenttijulkaisut 4 478 826, 4 470 971 ja 4 479 941. Reniiniä inhiboivien peptidien on myös esitetty käsittävän ketjun päissä esiintyviä disulfidisyklejä, katso esimerkiksi US-patenttijulkaisut 4 477 440 ja 4 477 441. Reniinin substraatin 10-11-asemassa sijaitsevat aromaattiset ja alifaattiset aminohappojäännökset on julkaistu US-patenttijulkaisussa 4 478 827. C-päät-teen amidisyklit on julkaistu US-patenttijulkaisussa 4 485 099. Tiettyjä tetrapeptidejä on julkaistu EP-hakemusjulkaisuissa lii 266 ja 77 027. Ennen esillä olevan keksinnön valmistusta EP-hakemusjulkaisussa 118 223 esitetään lisäksi tietyt, reniiniä inhiboivat peptidianalogit, joissa peptidisidos 10-11 on korvautunut yhdestä neljään hiiliatomin välisellä sidoksella tai hiilityppisidoksella. Tämän lisäksi julkaisussa Holladay et ai., "Synthesis of Hydroxy-ethylene and Ketomethylene Dipeptide Isosteres", Tetrahedron Letters, Voi. 24, No. 41, sivut 4401-4404, 1983 esitetään lukuisia, edellä mainitussa US-patenttijulkaisussa 4 424 207 esitettyjen, stereo-ohjautuvien "ketometyleeni"- ja "hydrok-sietyleeni”-dipeptidien isosteeristen funktionaalisten ryh- mien valmistusmenetelmässä esiintyviä välituotteita.

Lisäksi EP-hakemusjulkaisuissa 45 161 ja 53 017 esitetään sellaiset amidijohdannaiset, joita voidaan käyttää angioten-siinin muunnosreaktioon osallistuvia entsyymejä inhiboivina aineina.

EP-hakemusjulkaisuista 45665, 81783, 77018 ja 77029, US-pa-tenttijulkaisuista 4 470 971 sekä patenttihakemuksesta FI- 3 88400 834345 tunnetaan reniini-inhibiittoreita, jotka 9-asemassa sisältävät substituoitumattoman histidiiniryhmän, kun taas jäljempänä esitetyt keksinnön mukaiset reniini-inhibiittorit, joilla on kaava A, sisältävät 9-asemassa N-alkyylihis-tidiiniry hirtän.

Tämä keksintö koskee näin ollen menetelmää reniiniä inhiboivien peptidien valmistamiseksi, joilla peptideillä on kaava

X-Ag-B7-C8-Dg-E1o“Pn*Gi2"Z A

jossa X on vety tai tavanomainen peptidikemiassa käytetty amino- tai hydroksisuojaryhmä; jossa Ag puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XL1 tai XL2 Ή /*· Λ

CH R4 CH O

I I I II

CH O . -N—CH—C- / Ml O C- ::: / ::: xlx xl2 • ·' jossa B7 puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava i-t i xLb o : -N-M- ; R4 • · * xi* ’*’· jossa C8 puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XLlf XL2 tai XL2a, 4 88400 Λ Rt Λ

ck ΐ4 T I *2° I

CH Ο -N—CH—C- -N—CHo—C— / Ml o c- / XL3 XL2 X^a jossa Dg on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XL3 Λ

ΐ4 f2 B

-N-CH-C- xl3 jossa E^-F^ on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XL6, XL6a tai XLsb

R-iCH, H O RiCH2 H

; HO H H R1]L H R21 O

XLga

R,CH2 H O

V'' N11 JL

.»Λ/ x H -Rll XLgb jossa * tarkoittaa asyiranetriakeskusta, joka on joko R- tai i S-konfiguraatiossa; jossa G12 puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XL4 tai XL4a 5 88400

Ra Rq Ro H

\ / ν' r4 ch o Λ

I I II -*r V

-N—CH—C- H O ' XL4 XL4a jossa Z on -N(R4)R14 jossa Rx on (a) vety, (b) C1-C5-alkyyli, (c) fenyyli tai (d) C3-C7-sykloalkyyli; jossa R2 on (a) vety tai (b) -CH(R3) Rujossa R3 on (a) vety tai (b) C1-C5-alkyyli; jossa R4 aina esiintyessään on sama tai eri ryhmä ja on (a) vety tai (b) C1-C5-alkyyli; '···' jossa R4 ryhmässä D9 on C^-Cg-alkyyli; ·...·* jossa R6 on : (a) vety, : (b) Cj^-Cg-alkyyli, :V: (c) - (CH2)p-aryyli, (d) -(CH2)p-Het tai : (e) C3-C7-sykloalkyyli; .·"· jossa R7 on lH-imidatsol-4-yyli; jossa R8 on ·:·: (a) vety, (b) Cj^-Cg-alkyyli, jossa R31 on (a) vety, (b) C-L-Cg-alkyyli tai (c) fenyylimetyyli; 6 Θ8400 jossa R14 on (a) vety, (b) C^C^-alkyyH tai (c) pyridinyyli-C^Cg-alkyyli; jossa R20 on (a) vety tai (b) C^-Cg-alkyyli; jossa R21 on (a) -NH2 tai (b) -OH; jossa m on yksi tai kaksi; jossa p on 0-2; jossa M on (a) -CO- tai (b) -CH2-; jossa aryyli tarkoittaa fenyyliä tai naftyyliä; ja jossa -Het on indolyyli, Nln-formyyli-indolyyli tai imidat- solyyli; tai näiden yhdisteiden karboksi-, amino- tai muusta reaktiivisesta ryhmästä suojatun muodon valmistamiseksi tai näiden yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuo-· lojen valmistamiseksi.

Näitä yhdisteitä voidaan verrata ihmisen reniinisubstraat- tiin seuraavasti: 6 7 8 9 10 11 12 13 -His Pro Phe His Leu Vai Ile His-

X Ag B7 Cg D9 E10 G12 Z

! Kaavan A mukaiset peptidit voidaan keksinnön mukaisesti val mistaa siten, että aminohappojäännösten sopivien asyylijohdannaisten annetaan reagoida peräjälkeen keskenään, joko erillisinä tai kahdesta tai useammasta jäännöksestä muodos- * tuvana yksikkönä, kunnes mainittu yhdiste on saatu valmiste- • tuksi.

7 88400 Tässä selityksesä kuvataan myös (kaavat ja kaaviot esitetty selityksen loppuosassa): (a) menetelmä kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa menetelmässä: (1) kaavan XIVA/B (katso esimerkiksi kaavion D, tapaus III A vaiheet VIHA ja IXA), jossa Rj^ on edellä esitetyn määritelmän mukainen ja R on isopropyyli, isobutyyli, fenyylimetyyli tai Cj-Cy-sykloalkyyli ja BOC on t-butoksikarbonyyli, mukainen yhdiste käsitellään alkaalimetallin hydroksidilla asetonitriilin laimean vesiliuoksen läsnäollessa; (2) vaiheessa (1) saatu tuote käsitellään t-butyylidimetyy-lisilyylikloridilla dimetyyliformamidissa olevan imidatsolin läsnäollessa; minkä jälkeen (3) vaiheen (2) t-butyylidimetyylisilyyliesteri hydrolysoidaan selektiivisesti ja tehdään happamaksi, jolloin saadaan kaavan IA mukainen yhdiste; (b) menetelmä kaavan (XIVA/B) mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa asymmetriakeskuksen * konfiguraatio on joko R tai S; ja jossa R, Rx ja BOC ovat edellä esitettyjen ··· määritelmien mukaiset (katso esim. kaavion D, tapaus IIIA, vaiheet VIA ja VIIA); jossa menetelmässä: (1) kaavan XIIA/B, jossa konfiguraatio asymmetriakeskuksessa : ·*: * on joko R tai S, ja jossa R ja Rj^ ovat edellä esitettyjen • määritelmien mukaiset, mukainen yhdiste pelkistetään alumiini- .y. amalgaamalla tai vedyllä vedyn liittämisreaktion katalyytin läsnäollessa, jolloin saadaan kaavan XIVA mukainen yhdiste; ja (2) vaiheen (1) tuote käsitellään di-t-butyylikarbonaatilla, :'j*; jolloin saadaan kaavan XIVA/B mukainen yhdiste; (c) menetelmä kaavan XIIA/B mukaisen yhdisteen valmistamisek- • · .···. si, jossa kaavassa konfiguraatio asymmetriakeskuksessa * on joko R tai S, ja jossa R ja Rj ovat edellä esitettyjen määri-v.‘ telmien mukaiset (katso esim. kaavion E, tapaus IIIB, vaiheet XB ja XIB) , jossa menetelmässä: (l) kaavan XB/C, jossa konfiguraatio asymmetriakeskuksessa * on joko R tai S, ja jossa R ja Rx ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mukaisen yhdisteen annetaan reagoida o-metaanisul- ft 88400 fonyylikloridin kanssa dikloorimetaanissa olevan trietyyliamii-nin läsnäollessa; ja (2) vaiheen (1) tuotteen annetaan reagoida alkaalimetallin atsidin kanssa, jolloin saadaan kaavan XIIA/B mukainen yhdiste; (d) menetelmä kaavan XIIA/B mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa asymmetriakeskuksen* konfiguraatio on joko R tai S, ja missä R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset (katso esim. kaavion D, tapaus IIIA, vaiheet IVA ja VA), jossa menetelmässä: (1) kaavan XA/D, missä asymmetriakeskuksen* konfiguraatio on joko R tai S, ja missä R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mukaisen yhdisteen annetaan reagoida fosforia sisältävän halogenointireagenssin kanssa; ja (2) vaiheen (1) tuotteen annetaan reagoida alkaalimetallin atsidin kanssa, jolloin saadaan kaavan XIIA/B mukainen yhdiste; (e) menetelmä kaavan XA/B/C/D mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa asymmetriakeskuksen* konfiguraatio on joko R tai S; ja jossa R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset (katso esim. kaavion D, tapaus HIA, vaiheHIA), jossa menetelmässä: (1) kaavan IXA/B/C/D, jossa asymmetriakeskuksen* konfiguraatio on joko R tai S, ja jossa R sekä R^ ovat edellä esitettyjen mää-. ritelmien mukaiset, mukainen yhdiste käsitellään hapolla, jolloin saadaan vastaava, kaavan XA/B/C/D mukainen yhdiste; (f) menetelmä kaavan IXC/D mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, '· jossa kaavassa sekä R että R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, ja jossa ja Q2 ovat erilaisia ja ovat vety tai hyd-roksi (katso esim. kaavion F, tapaus IIID/D, vaihe IIB), jossa menetelmässä kaavan VIIIB, missä R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mukainen yhdiste käsitellään tertiäärisen amiinin oksidilla osmiumtetroksidin läsnäollessa, jolloin saa-daan kaavan IXC/D mukainen yhdiste; (g) menetelmä kaavan IXA/B mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, . -· jossa kaavassa R, R^ ja Q2 ovat edellä esitettyjen määritel- ____: mien mukaiset (katso esim. kaavion C, tapaus ΠΙΑ/Β, vaihe Ha) , jossa menetelmässä kaavan VIHA, missä R ja R^ ovat edellä esitet- 9 88400 tyjen määritelmien mukaiset, mukainen yhdiste käsitellään ter-tiäärisen amiinin oksidilla osiumtetroksidin läsnäollessa, jolloin saadaan kaavan IXA/B mukainen yhdiste; (h) menetelmä kaavan VIIIB mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset (katso esim. kaavion F, tapaus C/D, vaihe IB), jossa menetelmässä (1) kaavan II, jossa R on edellä esitetyn määritelmän mukainen, mukainen yhdiste käsitellään litiumdi-isopropyyliamidi11 a, jonka jälkeen reaktioseokseen lisätään heksametyylifosforiamidia, ja (2) vaiheen (1) tuote alkyloidaan kaavan VTT mukaisella yhdisteellä, jossa kaavassa R^ on edellä esitetyn määritelmän mukainen, jolloin saadaan kaavan VIIIB mukainen yhdiste; ja (i) menetelmä kaavan VIHA mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa kaavassa R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset (katso esim. kaavion C, tapaus IIIA/B, vaihe IA), jossa menetelmässä (1) kaavan II, missä R on edellä esitetyn määritelmän mukainen, mukainen yhdiste käsitellään litiumdi-isopropyyliamidilla, jonka jälkeen reaktioseokseen lisätään heksametyylifosforiamidia, ja (2) tuote alkyloidaan kaavan V mukaisella yhdisteellä, jossa kaavassa R^ on edellä esitetyn määritelmän mukainen, jolloin .·*·. saadaan kaavan VIIIA mukainen yhdiste.

Esimerkkeinä farmaseuttisesti hyväksyttävistä, hapoilla saata- * · vista additiosuoloista mainittakoon: asetaatti, adipaatti, ·;·· alginaatti, aspartaatti, bentsoaatti, bentseenisulfonaatti, • · · *-'·* bisulfaatti, butyraatti, sitraatti, kamforaatti, kamforisulfo-naatti, syklopentaanipropionaatti, diglukonaatti, dodekyylisul-faatti, etaanisulfonaatti, fumaraatti, glukohaptanoaatti, glyseroli fosfaatti, hemisulfaatti, heptanoaatti, heksanoaatti , hydroklo-ridi, hydrobromidi, hydrojodidi, 2-hydroksietaanisulfonaatti, , laktaatti, maleaatti, metaanisulfonaatti, 2-naftaleenisulfonaatti, . nikotinaatti, oksalaatti, palmoaatti, pektinaatti, persulfaatti, - 3-fenyylipropionaatti, pikraatti, pivalaatti, propionaatti, sukki- ·;··: naatti, tartraatti, tiosyanaatti, tosylaatti ja undekanoaatti.

10 88400

Erilaisten, hiilivetyjä sisältävien ryhmien hiiliatomien lukumäärä esitetään etuliitteellä, joka osoittaa tässä ryhmässä olevien hiiliatomien pienimmän ja suurimman mahdollisen lukumäärän, toisin sanoen etuliite (C^-Oj) tarkoittaa sellaista ryhmää, joissa on kokonaisluvusta "i" kokonaislukuun "j" hiiliatomia, rajat mukaan lukien. Täten merkinnällä (C-,^-C4) -alkyy-li tarkoitetaan yhdestä neljään hiiliatomia, rajat mukaan lukien, käsittävää alkyyliä, eli metyyliä, etyyliä, propyyliä, butyyliä sekä näiden isomeerimuotoja.

Esimerkkejä niistä (C3-C7)-sykloalkyyleistä, joihin sisältyy alkyylillä substituoitu sykloalkyyli, ovat syklopropyyli, 2-metyylisyklopropyyli, 2,2-dimetyylisyklopropyyli, 2,3-dietyy-lisyklopropyyli, 2-butyylisyklopropyyli, syklobutyyli, 2-me-tyylisyklobutyyli, 3-propyylisyklobutyyli, syklopentyyli, 2,2-dimetyylisyklopentyyli ja sykloheksyyli.

Orgaanisen kemian asiantuntijalle lienee yleisesti ottaen selvää, ettei -Het-ryhmänä määritelty heterosykli sitoudu types-tä, joka on renkaassa ja osana kaksoissidoksessa.

Esimerkkejä farmaseuttisesti hyväksyttävistä kationeista ovat: farmakologisesti hyväksyttävät metallikationit, ammonium, amiinikationit tai kvaternääriset ammoniumkationit. Erityisen suositeltavia metallikationeja ovat alkalimetalleista saatavat kationit, esimerkiksi litiumista, natriumista ja kaliumista saatavat kationit, sekä maa-alkalimetalleista, kuten magnesiumista ja kalsiumista, saatavat kationit, vaikkakin myös muista metalleista, kuten alumiinista, sinkistä ja raudasta saatavat kationit kuuluvat tämän keksinnön piiriin. Farmakologisesti hyväksyttäviä amiinikationeja ovat primaarisista, sekundaarisista ja tertiaarisista amiineista saatavat kationit.

Oheiset uudet peptidit sisältävät sekä luonnollisia että synteettisiä aminohappojäännöksiä. Nämä jäännökset merkitään aminohappojen tavanomaisia lyhenteitä käyttäen [katso esim. teos Roberts et ai, Basic Principles of Organic Chemistry, sivut 703-705 (New York 1965)] mikäli toisin ei mainita.

11 88400

Kaikkia tämän keksinnön mukaisia, reniiniä inhiboivia yhdisteitä voidaan antaa tavanomaisina muotoina, jotka on esitetty esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 424 207. Samoin esim. US-patenttijulkaisussa 4 424 207 esitetyt määrät ovat sovellettavissa tämän keksinnön mukaisiin yhdisteisiin.

Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden annokset ovat mieluiten suun kautta annettavia annoksia ihmisiä hoidettaessa, kun tavoitteena on edullinen vaikutus verenpaineeseen reniiniä inhiboimalla. Tällöin näitä yhdisteitä annetaan 1-4 kertaa päivittäin annoksina, joiden suuruus on 0,1-1000 mg/kg. Samoin muiden antotapojen ekvivalentteja annostuksia käytetään.

Tarkka annossuuruus riippuu potilaan iästä, painosta ja kunnosta sekä antotiheydestä ja -tavasta. Alan asiantuntija hallitsee nämä vaihtelut tai ne voidaan helposti määrittää.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voivat olla farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloinaan, joko niinä suoloina, jotka voidaan valmistaa vapaista emäksistä alalla hyvin tunnettuja menetelmiä käyttäen, tai niinä suoloina, joiden kanssa hapot muodostavat farmakologisesti hyväksyttäviä konjugaattiemäksiä.

Yllättävästi ja odottamattomasta tämän keksinnön mukaisia yh-T - ; disteitä annetaan mieluiten farmakologisesti hyväksyttävinä, .* .*. hapoilla muodostuvina additiosuoloina. Näiden suolojen voima- kas, verenpainetta alentava aktiivisuus säilyy, kun niitä annetaan suun kautta sekä rotille, joille on annettu ruiskeena . . reniiniä, että apinoille, joiden natriumpitoisuutta oli voi- makkaasti alennettu, kuten jäljempänä esitetyistä esimerkeistä ’ B3 ja B4 todetaan. Suositeltavimpia, suun kautta annettavia, farmakologisesti hyväksyttäviä suoloja ovat mm. sitraatti- ja ·"*: aspartaattisuolat, vaikkakin kaikkia farmakologisesti hyväk syttäviä suoloja voidaan käyttää tässä keksinnössä, edellä ‘ *’ mainitut suolat mukaan lukien. Suolat voivat olla hydratoi- tuneena.

12 88400 Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet valmistetaan kaavioissa esitetyillä tavoilla, sekä osissa Valmistaminen ja Esimerkit yksityiskohtaisemmin esitetyillä tavoilla.

Seuraava kuvaus nojautuu kaavasivuilla ja kaavioissa A-Q esitettyihin rakenteisiin. Näissä kaavoissa kaikki muuttujat ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mikäli toisin ei mainita.

Yleisesti ottaen nämä reniiniä inhiboivat polypeptidit voidaan valmistaa joko polymeerin avulla toteutettavilla tai liuosfaa-sina toteutettavilla peptidisynteesin toimenpiteillä, jotka ovat analogisia jäljempänä kuvattujen meentelmien tai alalla jo tunnettujen menetelmien kanssa. Esimerkiksi Na-t—butyylioksikarbo-nyylillä (BOC) substituoitujen aminohappojohdannaisten, joissa on tarvittaessa sopivia, sivuketjut suojaavia ryhmiä, karbok-syyliryhmä voidaan kondensoida sopivasti suojatun funktionaalisen aminoryhmän, peptidin tai polymeeriin sidotun peptidin kanssa käyttäen tavanomaisia kytkentämenetelmiä, kuten disykloheksyyli-karbodi-imidiä (DCC) ja 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT) mety-leenikloridissä tai dimetyyliformamidissa. Ne synteesitoimen-piteet, joilla uudet ryhmät saadaan ohessa kytkettyä, on myös kuvattu esimerkiksi US-patenttijulkaisuissa 4 424 207; 4 470 971; 4 477 440; 4 477 441; 4 478 826; 4 478 827; 4 479 941; ja 4 485 099, jotka erityisesti liitetään tähän julkaisuun tällä ' viittauksella. Katso myös julkaistut eurooppalaiset patentti-: hakemukset 45 161; 45 665; 53 017; 77 028; 77 029; 81 783; 104 041; 111 266; 114 993 ja 118 223.

Sen jälkeen, kun kytkeytymisreaktio on kulunut täydellisesti loppuun, Να-BOC-ryhmä voidaan poistaa selektiivisesti metyleeni-kloridiin valmistetulla 45%:isella trif luorietikkahapolla/2% : isella anisolilla (v/v). Tuloksena olevan trifluoriasetaattisuolan neutralointi voidaan toteuttaa 10%:isella di-isopropyylietyyli-amiinilla, joka on liuotettu .metyleenikloridiin. Polymeerin ‘ avulla suoritettavan peptidisynteesin tapauksessa tämä vaiheit-tain kytkemismenetelmä voidaan automatisoida joko osittain tai kokonaan saamaan aikaan toivottuja peptidi-polymeerin välituot- n 88400 teitä. Tämän jälkeen peptidi-polymeerin välituote voidaan käsitellä vedettömällä fluorivetyhapolla, jolloin suojaava ryhmä saadaan poistettua ja peptidi saadaan irrotettua polymeerikan-tajastaan samanaikaisesti. Huomattavana poikkeuksena edellä mainittuun ovat Nin-formyyli-indolyylillä substituoidut peptidit, joissa Nin-formyyli-indolyyli-osa on stabiili trifluori-etikkahapolle (TFA) ja fluorivetyhapolle (HF), mutta se voidaan poistaa NH3:lla tai NaOH:lla. Koska FTrp on hieman epästabiili emäksille synteesitoimenpiteissä, mahdollisesti alentuneita saantoja aiheuttaen, niin liuosfaasina suoritettavassa synteesissä saattaa olla toivottavaa liittää FTrp:n sisältävä ryhmä myöhään syntetoitavaan ketjuun, jotta se ei joutuisi tällaisiin olosuhteisiin.

Nin-formyyli-Trp voidaan liittää helposti tämän keksinnön mukaisiin yhdisteisiin, koska Ncx-BOC-N111-formyyli-Trp-OH:ta on kaupallisesti saatavana. Nin-formyyli-ryhmä voidaan kuitenkin liittää indolyylillä substituoituihin aminohappojohdannaisiin tai vastaaviin yhdisteisiin HCl:n ja muurahaishapon kanssa tapahtuvalla reaktiolla, kuten kirjallisuudessa on esitetty, katso julkaisut A. Previero et ai., Biochim. Biophys. Acta 147, 453 (1967); Y.C.S. Yang et ai., Int. J. Peptide Protein Res. 15, 130 (1980).

; Edellä olevat menetelmät (h) ja (i) , jotka on esitetty kaa- - viossa F, tapaus IIIC/D, vaiheena IB ja kaaviossa C, tapaus IIIA/B, vaiheena IA, vastaavasti, kaavan VIIIB ja VIHA mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, vastaavasti; sekä edellä . . esitetyt menetelmät (f) ja (g), jotka on esitetty kaaviossa F, / tapaus IIIC/D, vaiheena IIB ja kaaviossa C, tapaus IIIA/B, vaiheena IIA, vastaavasti, kaavojen IXC/D ja IXA/B mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi, vastaavasti, määräävät välituot-teiden (Ilf jossa R11X on H tai t-butoksikarbonyyli, R110 on OH tai suojaryhmä ja TBDMS on t-butyylidimetyylisilyyli) ja lo-• pullisten reniiniä inhiboivien peptidianalogien asymmetriakes- kukset.

Toisin sanoen, (2S)-stereokemia määräytyy stereoselektiivisessä alkylointivaiheessa I ja asemien C-4 ja C-5 suhteellista stereo- 14 88400 kemiaa säätelee joko trans- (VIHA) tai cis- (VIIIB) kaksois-sidoksen cis-hapettuminen vaiheessa II. Lisäksi kaikki neljä mahdollista, kaavojen IXA, IXB, IXC ja IXD mukaista isomeeriä voidaan eristää, tunnistaa ja manipuloida siten, että saadaan toivottuja, kaavan 1^ mukaisia yhdisteitä, kuten tapauksissa III, eli A/B, C/D, A, B, C ja D, osoitetaan.

Tämän keksinnön mukaiset menetelmät kyseessä olevien yhdisteiden valmistamiseksi käsittävät samoin joko yhden vaiheen tai monen vaiheen yhdistelmän, kuten edellä kuvatuissa tapauksissa III, IV, V, VI, VII, VIII ja IX esitetään.

Kaavan XX, missä A, tai C_ on XL,, mukaisten yhdisteiden valmis- box taminen toteutetaan kaavan XX.T, missä X, R. ja R, ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mukaisen yhdisteen kanssa toteutettavalla, sopivalla kytkentäreaktiolla. Kaavan XX^T mukainen yhdiste voidaan valmistaa alalla tunnetuin menetelmin.

Kaikissa tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä lähtöaineet ovat joko tunnettuja tai ne voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä .

Tämän keksinnön mukaisten välituotteiden ja menetelmien erot ja edut verrattuna edellä mainituissa viitteissä esitettyihin ovat vaivatta ilmeiset alaa tuntevalle henkilölle, kun ajatellaan toivottujen analogien suuressa mitassa tapahtuvaa tuotantoa, joka esitetään US-patenttijulkaisussa 4 424 207. Esimerkiksi reniiniä inhiboivissa analogeissa olevien ryhmien XL^ kaikki asymmetriakeskukset* (merkitään tähdellä) määräytyvät kaavojen IXA/B taiIXC/D, missä R ja R^ ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mukaisten uusien yhdisteiden synteeseissä kahdessa ensimmäisessä vaiheessa, kuten tapauksessa IIIA/B tai IIIC/D, vaiheissa I ja II esitetään. Toisin sanoen 2(S)-stereo-kemia määräytyy vaiheen I stereoselektiivisessä alkyloinnissa. Tämän jälkeen suhteellista stereokemiaa edellä mainittujen, kaavan IXA/B/C/D mukaisten yhdisteiden asemissa C-4 ja C-5 säätää vaiheessa II tapahtuva, kaksoissidoksensa suhteen joko trans-yhdisteen, kuten kohdassa VIIIA esitetään, tai cis-yhdisteen, kuten kohdassa VIIIB esitetään, cis-hapettuminen.

is 88400

Eräs tämän keksinnön täysin odottamattomista eduista ilmenee tapauksestani, joka A tai B, ja erityisesti sen vaiheesta VIII. Siinä kaavan XIVA/B, missä R, ja BOC ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, mukaisten yhdisteiden hydro-lyysi tapahtuu ilman, että R-ryhmää kantava hiili raseraoituu. Tämän seikan odottamattomuus voidaan nähdä siten, että kaavan XA/B mukainen yhdiste hydrolysoidaan, substituenttien R ja R^ ollessa edellä esitettyjen määritelmien mukaiset. Vertailun vuoksi esimerkkinä mainittakoon, että kaavan XA/B mukaisen, bentsyylikarbamaatilla suojatun laktonin alkoholi hydrolysoituu siten, että tuloksena on R-ryhmää kantavan hiilen epätoivottu rasemoituminen.

Lopuksi, kaikki kaavan IXA/B/C/D mukaiset isomeerit voidaan eristää, tunnistaa ja niitä voidaan manipuloida toivottujen välituotteiden 1^ saamiseksi, substituenttien R, R^ ja BOC ollessa edellä esitettyjen määritelmien mukaiset ja TBDMSrn tarkoittaessa t-butyylidimetyylisilyyliä, jotka välituotteet 1^ voidaan sisällyttää sopiviin peptideihin, kuten edellä mainitussa US-patenttijulkaisussa 4 424 207 esitetään, ja joita välituotteita 1^ voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisten, uusien isosteeristen peptidien valmistamiseen.

Kun välituote I sisällytetään peptidiin, on huomattavaa, ettei odottamattomasti kaavan 1^ mukaisessa yhdisteessä oleva, happea suojaava TBDMS-ryhmä irtoa, mikäli typpeä suojaava BOC-ryhmä on läsnä, ja mikäli se poistetaan trifluorietikka-··.. hapolla N-pään ryhmästä. Suojaavan BOC-ryhmän tällainen selek tiivinen poistaminen on edullista kaavassa 1^ olevan typen (N) / yksinkertaiseksi kytkemiseksi muiden yhdisteiden karbonyyliin tavanomaisia kytkentäolosuhteita käyttäen, tai ohessa esitetysti muiden peptidien karbonyyliin. Näin ollen tämän keksinnön ja - '·' kaavan 1^ mukaiset, suojaavana ryhmänään TBDMS-ryhmän sisäl- : : tävät yhdisteet eivät ole ilmeisiä alan aikaisempien julkai- sujen perusteella.

Yleisesti ottaen histidiinin alkyloimiseksi, tässä keksinnössä käyttökelpoisia alkylointimenetelmiä on löydettävissä julkai- ie 88400 susta Cheung S.T. et al, Can. J. Chem., Vol 55, sivut 906-910 (1977). Nyt ollaan kuitenkin todettu, että tämän julkaisun mukaisissa menetelmissä kriittistä on se, että reaktio-olosuhteet histidiinin alkyloimiseksi ovat anhydriset. Lisäksi ollaan edelleen todettu, että tämän toimenpiteen aikana reak-tioseokseen lisätään mieluummin puskuroitua vesiliuosta, esimerkiksi natrium- tai kaliumvetysulfaatin vesiliuosta, sen sijaan, että reaktioseokseen lisättäisiin suoraan vettä. Erityisesti, viitteessä esitetyllä tavalla 5S-amino-2S-isopropyyli-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyylisilyloksi-oktanoyyli -L-iso-leusyyli-2-pyridyyli-metyyliamidi muunnetaan yhdisteeksi N-tert-butyylioksikarbonyyli-N-metyyli-Nln-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-2S-isopropyyli-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyylisily-loksi-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi, joka muunnetaan yhdisteeksi N-metyyli-Nln-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleu-syyli-2-pyridyylimetyyliamidi, joka muunnetaan yhdisteeksi N-tert-butyyli-oksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-N-metyyli-Nin-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyylioktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyyli-metyyliam.idi; ja yhdisteeksi N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-N-metyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi, minkä tarkoituksena ei kuitenkaan ole olla tätä keksintöä rajoittava.

Samalla tavalla, asianmukaisia lähtöaineita käyttäen, valmistetaan seuraava yhdiste:

Boc-Pro-PheNMHis-LVA-IleAMP.

Tämän menetelmän yksityiskohtaisempi kuvaus on löydettävissä jäljempänä olevassa osassa Valmistaminen XX2qIIj (C68). Tämä esimerkki on analoginen sen esimerkin kanssa, joka on löydettävissä julkaisusta Cheung, S.T. et ai, Can. J. Chem. Voi. 55 sivut 906-910 (1977), mutta kuitenkin ollaan todettu, että tässä menetelmässä vedettömät reaktio-olosuhteet ovat välttämättömät, mitä ei mainita tässä Cheung:in et ai. julkaisussa.

17 88400

Muut yhdisteet valmistetaan jäljempänä olevissa osissa Valmistaminen XX^IV (C 7 O) ; Valmistaminen XX?()VI3 (C72); Valmistaminen XX2qVI^ (C73); Valmistaminen XX^VI^ (C74); ja Valmistaminen XX2qVI (C75) esitetysti. Katso myös julkaisu U.N. Reinhold, J. Med. Chem. 11:258-260 (1968).

Edellä olevaan kuvaukseen tarvittavat, lähtöaineiden, reagoivien aineiden, reaktio-olosuhteiden ja välttämättömien suojaavien ryhmien vaihtelut muiden tällaisten N-alkyloitujen yhdisteiden saamiseksi ovat tunnot luja alaa tavanomaisest i tuntevalle kemistille, tai ne on helposti löydettävissä kirjallisuudesta.

Suositeltavimpia tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä, joissa Dg sisältää N-alkyloidun histidiinin, ovat:

Tba-Phe-NMHis-Leu- 'P -^CHOHCl^Val-1le-ΛΜΡ FGA-Phe-NMUis-Leu-Y-ZCHOHCM^Val-ile-AMP Boc-FTrp-Pro-Phe-NMHis-Leu-4'-/CHOHCH27Val-Ile-AMP POA-His-Leu-Val-Ile-AMP Boc-Phe-NMHis-LVA-MBA Boc-Phe-NMHis-LVA-IBA Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-Sta-Ile-NUp Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-PRP-NM2 . Ac-Pro-Phe-NMHis-PRP-NM2 ja Ac-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP.

*···" Yleisesti ottaen asianmukainen N alkyloimalla valmistettujen, ; edellä mainittujen yhdisteiden lisäksi todettiin odottamatto-masti, että parantunut entsymaattinen stabiilisuus saadaan ai-: * : kaan reniiniä inhiboivilla polypeptidianalogei1 la, jotka on muunnettu sellaisella fragmentilla, missä on XLb ja R^ on metyyli.

• · · • · · ψ · • * 18 88400

Ryhmän α-Me-Pro sisältävät yhdisteet valmistetaan jäljempänä olevissa osissa Valmistaminen XX30I7 (C76) - XX30I (C83) esitetyllä tavalla. Katso myös julkaisu Seebach, D.f et ai., J. Am. Chem. Soc., Vai 105 sivut 5390-5398 (1983).

Näiden polypeptidien odottamattoman edullinen stabiilisuus johtuu tämän fragmentin prolyyliosassa olevasta a-metyyli-ryhmästä.

Yhdisteet, jossa asemat B7-C8 ovat ryhmänä Prö^iCHjO)Phe eli joissa ProPhe-osassa oleva ryhmä -CO-NH on korvautunut ryhmällä -CH2-0- (lyhennettynä PEP), valmistetaan kaavioissa P ja Q esitetyillä tavoilla. Tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden synteesiin tarvittavat, α-aminoistaan sopivasti suojatut lähtöaineet, ovat tunnettuja tai ne voidaan valmistaa tunnetuilla menetelmillä. Katso julkaisut "The Peptides: Analyses, Synthesis, Biology", Voi. 1-5, toim. E. Gross ja J. Meienhofer, Academic Press, NY, 1979-1983; "Peptides: Synthesis - Physical Data", Vol. 1-6, toim.

W. Voelter ja E. Schmid-Siegmann, G. Addison-Wesley Publishing Co., Inc. Reading Mass., 1983; "Chemistry and biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins", Vois. l-7, toim. B. Weinstein, Marcel Dekker, Inc, NY, 1971-1983; "The Practice of Peptide Synthesis", M. Bondanszky ja A.

is 88400

Bondanszky, Springer-Verlag, Berlin, 1984; "Peptide Synthesis", 2. Dainos, M. Bondanszky, Y. Klausner, ja M. Ondetti, Wiley, NY, 1976.

Yleisesti ottaen, yksittäisiä aminohappoja toisiinsa liittävät amidisidokset muodostetaan esimerkiksi N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidin (DCC) kanssa tapahtuvalla kondensaatioreaktiolla lisäaineiden, kuten 1-hydroksibentsotriatsolin (1-HOBT) kanssa tai ilman niitä, liuottimissa, kuten metyleenikloridissa ja/tai dimetyyliformamidissa (DMF). Tämän keksinnön mukaisen, PEP:n sisältävän peptidin synteesin eteneminen on esitetty kaaviossa P, tapauksena P-I.

Nämä peptidit voidaan myös valmistaa käyttäen Merrifield:in tavanomaisia, kiinteänä faasina suoritettavia menetelmiä. Sopivat suojaavat ryhmät, reagenssit ja liuottimet sekä liuoksena että kiinteänä faasina suoritettaviin menetelmiin on löydettävissä julkaisusta "The Peptides: Analysis, Synthesis, and

Biology", Vois. 1-5, toim. E. Gross ja T. Meienhofer, Academic Press, NY, 1979-1983.

Suojattu aminohappo Boc-ProjVCf^O/Phe-OH valmistetaan kaaviossa Q tapauksena Q-I esitetyllä tavalla. L-Drolinoli asyloidaan (R)-2-bromi-3-fyenyyli-propionihapolla käyttäen kytkevänä ainee-·· na DCCrtä ja liuottimena metyleenikloridia. Tuloksena oleva amidi käsitellään O-10°C:n lämpötilassa tetrahydrofuraanissa olevalla natriumhydridillä, jolloin saadaan sellainen bisyklinen laktoni, jossa kukin kiraalikeskus on S-konfiguraatiossa. Tämän * laktonin hydrolyysi 6-normaalisella HClrllä 100°C:n lämpötilassa tuottaa aminohapon H-Prof/Ct^O/Phe-OH hydrokloridisuolan.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voivat olla joko vapaana tai yhdestä tai useammasta jäljellä olevasta (joita ei aikaisemmin : : oltu suojattu) peptidi-, karbonyyli-, amino- tai hydroksiryhmäs- tään tai muista reaktiivisista ryhmistään suojatussa muodossa. Suojaavat ryhmät voivat olla mitä tahansa peptidikemiassa tunnettuja suojaavia ryhmiä. Esimerkkejä typen ja hapen suojaa- * vista ryhmistä on esitetty julkaisuissa T.W. Greene, Protecting 20 8 8 400

Groups in Organic Synthesis, Wiley, New York, (1981); J.F.W. McOmie, toim. Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press (1973); sekä J. Fuhrhop ja G. Benzlin, Organic Synthesis, Verlag Chemie (1983). Typen suojaavia ryhmiä ovat mm. t-butok-sikarbonyyli (Boc), bentsyylioksikarbonyyli, asetyyli, ailyyli, ftallyyli, bentsyyli, bentsoyyli, trityyli ja muut vastaavat. Suojaavien ryhmien muuntelun tarve tässä keksinnössä saattaa kuitenkin olla rajoittunut, kuten edellä esitetään, suojaavan ryhmän poistamsien ollessa selektiivistä, kuten kaavan I mukaisessa yhdisteessä olevan BOC:n tapauksessa, TBDMS-ryhmään verrattuna, jota TBDMS-ryhmää voidaan käyttää hydroksin suojaamiseen tässä samassa yhdisteessä. Täten, vaikka tämän keksinnön mukaisen yksikön sisältämän isoteerisen ryhmän, jolla yksiköllä on kaava 1^, missä asymmetriakeskuksen* konfiguraatio on joko R tai S ja missä R ja ovat edellä esitettyjen määritelmien mukaiset, sisällyttäminen valittuihin peptideihin saatiin ensimmäisenä suoritetuksi US-patenttijulkaisussa 4 424 207, niin kuitenkaan tällaisen yhdisteen 1^ odottamaton edullisuus tällaisessa sisällyttämisessä ei ilmene edellä mainituista viitteistä. Toisin sanoen kaavan 1^ mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää sekä polymeerikantajän avulla toteutettavien (US-patenttijulkaisu 4 424 207, palstat 11-17 osassa Esimerkit) että liuoksena toteutettavien peptidisynteesien edullisissa synteesitekniikoissa. Ne voidaan muuntaa tämän keksinnön mukaisiksi reniinin inhibiittoreiksi tavanomaisilla, alalla tunnetuilla menetelmillä. Esimerkiksi karboksyylihaposta muodostuva ryhmä voidaan kondensoida sopivasti suojattujen aminohappojen tai peptidien aminopään kanssa tavallisia kytkemisolosuhteita käyttäen, kuten esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imidillä (DCC)/1-hydroksibentsotri-atsolilla (HOBT). Tuloksena olevien peptidien suojaava BOC-ryh-mä voidaan poistaa selektiivisesti 50-prosenttisella trifluori-etikkahapolla (TFA) mety.leenikloridissa CF^Cl^, ja tuloksena oleva aminopää voidaan kondensoida sopivasti suojatun aminohapon tai peptidin karboksyyliryhmän kanssa jälleen tavanomaisia kyt-kentäolosuhteita käyttäen. Tämän jälkeen tuloksena olevien suo-’ jattujen peptidien suojaavat ryhmät irroitetaan käytetyille suo-jääville ryhmille sopivissa olosuhteissa, ja käyttäen tarvittaessa laimeaa happoa, 50-prosenttista trifluorietikkahappoa, (esim.

21 8 8 400 laimeaa etikkahappoa) tai fluoridi-ionia (esim. HF tai nBu^N+F~) alkoholin suojaavan TBDMS-ryhmän poistamiseksi. Näissä konden-sointireaktioissa käytettyjen aminohappojen tai peptidien valinta riippuu lopullisen, toivotun, reniinin inhibiittorin rakenteesta. Nämä voivat olla US-patenttijulkaisussa 4 424 207 esitettyjen mukaisia, mutta suositeltavimpia inhibiittoreita ovat tämän keksinnön mukaiset uudet inhibiittorit.

Yleisesti ottaen tämän keksinnön mukaiset menetelmät voidaan toteuttaa seuraavalla tavalla.

Kaavan II mukaiset amidit valmistetaan kaaviossa A tapauksena I esitetysti asyloimalla L-2 pyrrolidiinimetanoli sopivan hapon aktivoidulla johannaisella. Tässä reaktiossa käyttökelpoisia, aktivoituja johdannaisia ovat happohalogenidit tai -anhydridit, joita voidaan toivottaessa käyttää tertiäärisen amiinin, kuten trietyyliamiinin, pyridiinin tai p-dimetyyliaminopyridiinin, ekvivalenttimäärien kanssa reaktiossa syntyneen hapon sitomiseksi. Vaihtoehtoisesti tämä asylointi voidaan toteuttaa kon-densoivilla aineilla, kuten 1,1'-karbonyylidi-imidatsolilla tai disykloheksyylikarbodi-imidillä. Tässä keksinnössä käyttökelpoisia aproottisia liuottimia ovat esimerkiksi THM, DMF, dioksaanieetteri, ja pyridiini. Mikäli typen selek- tiivinen asylointi ei onnistu, niin N,O-diasyloidut tuotteet valmistetaan tapauksen 1^ mukaisesti, ja ne hydrolysoidaan toisessa vaiheessa emäksellä, esimerkiksi natrium- tai kalium-hydroksidilla, kuten tapauksessa 12 esitetään; liuottimessa, ; .·. kuten etanolissa, vedessä tai asetonitriilissä, jolloin saa-*1 . daan kaavan II mukaisia yhdisteitä.

Kaavojen V ja VII mukaisten yhdisteiden valmistaminen, joka - " esitetään kaaviossa B tapauksena II, toteutetaan yleisesti V * ottaen seuraavassa kuvattujen vastaavien vaiheiden mukaisesti:

Vaihe I Asetyleenisten alkoholien (III) pelkistäminen (E)-ole-fiineiksi (IV) toteutetaan joko nestemäisessä ammoniakissa alkaalimetalIin kanssa (Na, Li) tapahtuvana reaktiona /Ä.J.

22 88400

Birch, Quarterly Reviews, IV, 69 (195 0_)_/ tai alumiinihydridin, esimerkiksi litiumalumiinihydridin kanssa tapahtuvana reaktiona jossakin liuottimessa, kuten dietyylieetterissä, THF:ssä tai diok-saanissa.

Vaiheet II ja IV Allyylialkoholit muunnetaan vaivattomasti vastaaviksi bromideiksi, ilman toisiintumisreaktiota, jollakin fosforireagenssi11a, kuten trifenyylifosfiini/hiilitetrabromi-seoksella tai trifenyylifosfiini/N-bromisukkinimidiseoksella tai fosforitribromidilla. Näissä reaktioissa käyttökelpoisia liuottimia ovat asetonitriili, metyleenikloridi tai bentseeni.

Vaihe III Asetyleeniset alkoholit (III) pelkistetään vaivattomasti (Z)-alkeeneiksi (VI) vedyllä ja muunnetulla, kalsiumkarbonaatin pinnalle kiinnitetyn palladiumin muodostamalla katalyytillä (Lindlar-katalyytti). Tässä reaktiossa käyttökelpoisia liuottimia ovat metanoli tai etanoli. Tässä reaktiossa voidaan käyttää kinoliinia, jonka avulla tätä selektiivistä pelkistymistä (Z)-olefiiniksi voidaan säädellä.

Kaavan III mukaista lähtöainetta tapauksessa II, jolloin on isopropyyli, voidaan saada kaupallisesti saatavasta 4-metyyli-l-pentyynistä perättäisillä, etyylimagnesiumbromidin ja formaldehydin kanssa tapahtuvilla reaktioilla, kuten tapauksessa II esitetään, näille reaktioille sopivia olosuhteita käyttäen, jotka olosuhteet ovat tavallisesti tunnettuja analogisten reaktioiden perusteella.

Kaavan III, missä on fenyyli, mukainen lähtöaine voidaan kuitenkin valmistaa menetelmillä, jotka on esitetty julkaisuissa W.J. Bailey ja E. Fugiwara, J. Am. Chem. Soc. 77, 165 (1955); sekä G. Dupont, et ai., Bull. Soc. Chim. France, 816 (1954), kuten tapauksena II^ esitetään.

Yleisesti ottaen tapauksessa III eri vaiheina I-IX esitetyt reaktiot voidaan kuvata siten, että ne soveltuvat kaikkiin, 23 88400 samalla roomalaisella numerolla varustettuihin vaiheisiin kirjaimista A, B, C ja D välittämättä. Täten kirjaimilla A, B, C ja D merkittyjen yhdisteiden, sekä myös samoin merkittyjen vaiheiden väliset eroavaisuudet eivät vaikuta seuraavassa kuvattujen vastaavien vaiheiden olosuhteisiin.

Vaihe I Yhdisteen II dianioni valmistetaan ympäristön lämpötilassa (18-25°C, haudelämpötila) THF:ssä litiumdi-isopropyyliami-din kahdella ekvivalenttimäärällä. Tämän jälkeen se käsitellään -78°C:n (haudelämpötila) lämpötilaan jäähdytetyn heksametyyli-fosforiamidin kahdella ekvivalenttimäärällä ja käsitellään alky-loivalla aineella, joko V tai VII. Tämä reaktio toteutetaan olennaisesti tavalla, joka esitetään julkaisussa D.A. Evans, et ai., Tetrahedron Letters 21, 4233 (1980), ja sillä saadaan pääasiallisesti (2S )-tuotetta.

Vaihe II Kaksoissidoksen cis-hydroksylointi toteutetaan osmium-tetroksidilla katalysoidulla hapetusreaktiolla, käyttäen hapet-timena trimetyyliamiinin oksidia. Tähän tarkoitukseen voidaan myös käyttää muita tertiääristen amiinien oksideja, kuten N-metyylimorfoliinin oksidia. Isomeerit erotetaan tässä vaiheesssa pylväskromatografisesti.

Vaihe III Kaavan IX mukainen L-2-pyrrolidiinimetanolin amidi '··’ hydrolysoidaan happokatalysoidulla N —>0-asyylin siirtoreaktiol-la, jolloin saadaan laktonit (X). Tässä reaktiossa voitaisiin : myös käyttää lukuisia mineraalihappoja ja vesipitoisia liuottimia.

- ; ; Vaihe IV Alkoholin muuntaminen irtoavaksi ryhmäksi stereokemian invertoituessa on välttämätöntä. Erityisen sopivia tähän muunnos-\ : reaktioon ovat fosforiin perustuvat reagenssit, esimerkiksi

Ph3P/CX4, Ph3P/Br2, Ph3P/NBS ja (Me2N) 3P/CC14 . Liuottimia, kuten CC14 (ylimäärin), CF^C^, CH-jCN tai PhH, voidaan käyttää.

’· · Yleiskatsaus löytyy julkaisusta B.R. Castro, Org. Reactions 29, ·:1: 1 (1983).

* 24 88400

Vaihe V Syrjäytysreaktio toteutetaan alkalimetalliatsidin (LiN^, Na^, KN^) yhdellä tai useammalla ekvivalenttimäärällä liuottimessa, kuten DMF:ssä tai DMSOrssa. Alueella 30-90°C olevat reaktiolämpötilat ovat välttämättömät.

Vaihe VI Tämän atsidin pelkistäminen voidaan toteuttaa alumiini-amalgaamalla tai mieluiten katalyyttisellä hydrauksella. Lukuisia eri katalyyttejä, kuten Pc/C, Pt02 ja Raney-Ni, voidaan käyttää. Tässä käytetään Lindlar-katalyyttiä, joka on muunnettu, kalsiumkarbonaatin kannattaman palladiumin muodostama katalyytti. Sopivia liuottimia ovat esimerkiksi metanoli tai etanoli.

Vaihe VII Aminoryhmä muunnetaan t-butoksikarbonyylin (BOC) johdannaiseksi tavanomaisissa olosuhteissa. Tavanomaiset olosuhteet käsittävät typpi-ilmakehän ja ympäristön lämpötilan ja sellaisen reaktioajan, joka vaaditaan reaktion osoittamiseen täydelliseksi ohutkerroskromatografisesti silikageelillä käyttäen 5-prosenttista MeOH-CH2Cl2~seosta ja ninhydriini-väriruiskutus-ta. Sen annetaan reagoida 25°C:n lämpötilassa di-t-butyyli-dikarbonaatin kanssa liuottimessa, kuten THF:ssä tai dioksaanissa.

Vaihe VIII Laktoni hydrolysoidaan ilman epimerointia alkalimetal-lin hydroksidilla laimeassa asetonitriilin vesiliuoksessa. Tuloksena oleva seos voidaan tiivistää ja pakastekuivata, jolloin saadaan vedetön alkalimetallin suola. Vaihtoehtoisesti tämän suolan kylmä vesiliuos voidaan tehdä happamaksi laimealla KHSOillä. Tuloksena oleva happo voidaan eristää suodattamalla tai sopivalla liuottimena uuttamalla. Vaiheessa IX voidaan käyttää joko yhdisteen XV mukaista suolaa tai happoa. 1

Vaihe IX Yhdisteiden XV ja t-butyylidimetyylisilyylikloridin sekä imidatsolin välinen reaktio 25°C:n lämpötilassa sekä tämän reaktion tavanomaisissa olosuhteissa, tuottaa t-butyylidimetyyli-' silyylin eetterin ja esterin. Tämä esteri hydrolysoidaan selektiivisesti metanolissa K^O^rlla ja tuloksena oleva kaliumsuola *. tehdään happamaksi laimealla KHSO^tllä, jolloin saadaan hapot (I).

25 88400

Vaihe X Yhdisteiden XB ja XC metaanisulfonaatti-(mesylaatti)-johdannaiset valmistetaan tavanomaisissa olosuhteissa: metaanisulfo-nyylikloridilla ja trietyyliamiinilla CH2Cl2:ssa 0°C:n lämpötilassa.

Vaihe XI Mesylaattien muuntaminen (XVIB ja C) atsideiksi (XIIB ja C) toteutetaan samalla tavalla kuin vaiheessa V.

Alla mainittujen yhdisteiden vieressä oleva, hakasuluissa mainittu numero tarkoittaa sitä, että fysikokemiallisia tietoja tästä yhdisteestä esitetään taulukossa B.

Tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä, joissa E10F11 on STA, ovat mm. H-Trp(CHO)-Pro¥(CH2NH)-D-Phe(α-Me)-His-Sta-Ile-NH2 [26], H-Trp(CHO) -Pro¥(CH2NH)Phe(0!-Me) -His-Sta-Ile-NH2 [27] ,

Ac-Trp(CHO)-Pro¥(CH2NH)-D-Phe(α-Me)-His-Sta-Ile-NH2 [28], ja Ac-Trp(CHO) -Pro1^ (CH2NH) -Phe (a-Me) -His-Sta-Ile-NH2 [29] .

Nyt voidaan todeta, että tämän keksinnön mukainen, reniiniä inhiboiva peptidi käsittää sekä ryhmän N-alkyyli-His, mieluiten N-me-tyyli-His, tämän reniiniä inhiboivan peptidin 9-asemassa että ryhmän l-formyyli-Trp 6-asemassaan, ja lisäksi yhdisteen, jossa (1)

Ag on l-formyyli-Trp ja (2) D9 on N-alkyyli-His, mieluiten N-metyy-li-His.

Esimerkkejä niistä edellä yleisesti kuvatuista yhdisteistä, joissa on ryhmien N-alkyyli-His ja l-formyyli-Trp yhdistelmiä, ovat muun muassa:

AcFTrpProPheNMHisLeu* (CH [OH] CH2) VaiIleNH2,

AcFTrpProPheNMHisLeu'fr(CH[OH]CH2)VallleAMP [30] ja BocFTrpProPheNMHisLeu*(CH[OH]CH2)ValIleAMP [31].

Kaavan Ix mukainen yhdiste voidaan muuntaa uusien yhdisteiden saamiseksi käyttäen EP-hakemusjulkaisuissa 45161 ja 53017 sekä US-patenttijulkaisussa 4 424 207 esitettyjä tai alalla muuten tunnettuja menetelmiä, jotka uudet yhdisteet valmistetaan kytkemällä sopivia aminohappoja kaavan I mukaisen yhdisteen C-päähän tai N-päähän. Näillä aminohapoilla voi olla joko D- tai L-konfi-i guraatio, niiden ketjun pituus voi vaihdella, riippuen kaavan Ix mukaisen yhdisteen N- tai C-päähän lisättyjen aminohappojen lukumäärästä ja näiden

26 B 8 4 O O

vierekkäisten aminohappojen kaikki monikerrat voidaan sisällyttää tähän keksintöön, jolloin saadaan aikaan sellaisia isosteerisiä polypeptidejä, joilla on todettu olevan re-niiniä inhiboivia ominaisuuksia luonnollisen peptidiketjun, eli ProPheHis, puuttuessa, joka peptidiketju on esitetty US-patenttijulkaisussa 4 424 207 isosteerisen ryhmän vasemmalla puolella.

Kaavan mukainen isosteeri voidaan sisällyttää peptidi-analogeihin joko US-patenttijulkaisussa 4 424 207 kuvatuilla ja ohessa kuvatuilla menetelmillä tai yleisesti alalla tunnetuilla, peptidisynteesissä käytetyillä menetelmillä.

Vaikka todettiinkin, että stabiilisuuden aikaansaamiseksi eri polypeptidien amidiosan typpi voidaan alkyloida (katso aikaisempi teksti), niin kuitenkin nyt havaitaan, että yllättäviä ja odottamattomia tuloksia saadaan metyloimalla tämä N-atomi, kuten nähdään edellä mainitussa D9:ssä olevasta kaksiarvoisesta ryhmästä XL3, R4:n ollessa C1-C5-alkyyli. Tämän tyyppisiä suositeltavimpia yhdisteitä ovat seuraavat:

Ensinnäkin XL3 tarkoittaa Να-alkyloitua histidiiniä ja kaikkein mieluiten se on Na-metyloitu histidiini.

Suositeltavimpia tämän keksinnön mukaisia ryhmiä, joilla on tämä piirre, ovat (1) Boc-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP ja I (2) Boc-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP, näistä ensimmäisen ollessa kaikkein suositeltavin.

Fragmentin XLx sisältävät yhdisteet voidaan saada 2-hydrok-: sihappojen johdannaisina. 2-hydroksihappojen useita syn- teesimenetelmiä on löydettävissä julkaisuista R. Nishizawa, et ai., J. Med. Chem., 20:510 (1977); R. Gamboni, et ai.,

Tet. Letters, 26:203 (1985); H.C. Brown, et ai., J. Am.

Chem. Soc., 106:1531 (1984); M. Enomoto, et ai., Tet. Let-. .·; ters, 26:1343 (1985), sekä ohessa mainituista viitteistä.

27 88400

Joitakin 2-hydroksihappoja, kuten L-fenyylimaitohappoa, on kaupallisesti saatavana. Menetelmä esimerkissä C61 esiintyvän S-3-(l-naftyyli)maitihapon valmistamiseksi käsittää Na-N02:n lisäämisen 2,5-normaalisessa rikkihapossa (H2S04) olevaan L-3-(l-naftyyli)amiiniin. Tällöin tapahtuu kaksinkertainen invertoituminen ja saadaan S-3-(l-naftyyli)maitohappoa. Niissä tapauksissa, joissa aminohappojen lähtömateriaalia ole saatavana, voidaan käyttää julkaisussa R. Nishizawa, et ai., J. Med. Chem., 20:510 (1977) esitettyä menetelmää R,S-2-hydroksihapon tuottamiseksi. Tämän jälkeen tämä rasee-minen happo voidaan erottaa isomeereikseen kytkemällä se kiraaliseen amiiniin, kuten L-prolinoliin, tai käyttämällä L-prolinolin silyylieetterin avulla tapahtuvaa kromatografista isomeereihin erottamista, jota seuraa amidisidoksen hydrolyysi, jolloin saadaan toivottua kiraalista 2-hydroksi-happoa. 2-hydroksiryhmän asetylointi Ac20:lla ja pyridiinil-lä tuottaa O-asetyylihappoa, joka voidaan kytkeä DCC:llä tai DEPC:llä ja Et3N:llä metyleenikloridissa (CH2C12) välituotteisiin, kuten His(Tos)-Leu^tCHiOH)CH2] Val-Ile-AMP. Tämän jälkeen tosyylin suojaava ryhmä voidaan poistaa HOBT:llä ja MeOH:lla. Tämän 2-hydroksihapon voidaan myös antaa reagoida THF:ssä NaH:n kahden ekvivalentin kanssa, ja sitten karbamo-yylikloridin tai -isosyanaatin kanssa, jolloin saadaan välituotteita, kuten esimerkiksi dietyylikarbamoyylikloridin välituote (CH3CH2) ^-CO-I^-OH. Se voidaan tämän jälkeen kytkeä peptidin välituotteeseen, kuten välittömästi edellä esitetään. Sen lisäksi, että saadaan aikaan uusia aminohappojen korvikkeita, odotettavaa on myös kyky vastustaa kymotrypsii-nin aiheuttamaa hydrolyysiä, kuten esitetään julkaisussa T.A. Steitz, R. Henderson ja D. Blow, HJ. Mol. Biol., 46:337-348 (1969).

Muita tämän keksinnön piiriin kuuluvia yhdisteitä ovat mm. Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-Statiini-NH2 ja Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-LVA-NH2 .

Tämän keksinnön mukainen kaikkein suositeltavin yhdiste on kokonaisuuden Boc-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP sitraattisuola.

28 88400

Suositeltavimpien suoritusmuotojen kuvaus

Seuraavat valmistukset ja esimerkit havainnollistavat tätä keksintöä. Mikäli toisin ei mainita, nämä valmistukset havainnollistavat tapauksessa II esitettyjä vastaavia vaiheita sekä tapausten II ja III lukuisissa kirjaimin varustetuissa vaiheissa esitettyjä vastavia vaiheita. Esimerkiksi Valmistaminen I vastaa tapauksen II vaihetta I, mutta Valmistaminen IA vastaa tapauksen IIIA/B vaihetta IA.

Tässä julkaisussa:

Ph on fenyyli DCC on disykloheksyylikarbodi-imidi BOC on t-butoksikarbonyyli TBDMS on t-butyylidimetyylisilyyli TFA on trifluorietikkahappo M tai mol on mooli C on astetta Celsiusta ml on millilitra THF on tetrahydrofuraani TLC on ohutkerroskromatografia EtOAc on etyyliasetaatti

Lindlar-katalyytti on muunnettu, 5 % kalsiumkarbonaatin pinnalle kiinnitettyä palladiumia sisältävä katalyytti, saatu yhtiöstä Engelhard Industries, ja käytetään pelkistämiseen. DMF on dimetyyliformamidi : p-TSA-suola on para-tolueeni-sulfonihapon suola MS on massaspektroskopia IR on infrapunaspektri . . NMR on ydinmagneettinen resonanssi HPLC on korkean suorituskyvyn nestekromatografia *·' ' Skellysolve B on yhtiön Merck luettelossa Merck Index, 10. :Y: painos, esitetyn määritelmän mukainen g on gramma min on minuutti Me on metyyli AMP on 2- (aminometyyli)pyridinyyli

Sta on statiini, kuten kaavoissa esitetään

Tos on p-tolueenisulfonyyli BOM on bentsyylioksimetyyli 29 88400 BZ on bentsyyli

Kiilan muotoinen viiva tarkoittaa sidosta, joka ulottuu paperin tason yläpuolele, paperille piirretyn yhdisteen tason suhteen

Katkoviiva tarkoittaa sidosta, joka ulottuu paperin tason alapuolelle, paperille piirretyn yhdisteen tason suhteen Seliitti (piimää) on suodatuksen apuaine RIP tarkoittaa yhdistettä, jolla on kaava H-Pro-His-Phe-His-Phe-Phe-Val-Tyr-Lys-OH.2(CH3C(0)0H),XH20, ja joka on tunnettu reniiniä inhiboiva peptidi.

Samoin ohessa, erityisesti taulukossa A käytetään lyhenteitä:

Abs tarkoittaa sitä, että kyseinen ryhmä puuttuu; BOC tai Boc on t-butoksikarbonyyli; DPhe on D-Phe; DNal2 on 3(2-naftyyli)-D-alanyyli; FTrp on Nin-formyyli-Trp [lyhennetään myös: Trp(CHO)]; IBA on isobutyyliamino; LVA on Leu^iCH(OH)CH2)Vai, jonka C4 (hydroksia kantava hiiliatomi) on S-konfiguraatiossa; MBA on (S)-(-)-2-metyylibutyyliamino;

Me on metyyli;

Naii on 3-(1-naftyyli)alanyyli;

Nal2 on 3 -(2-naftyyli)alanyyli; NMHis on N-metyyli-histidiini (josta käytetään myös lyhen-nettä N (CH3) His) ; NOA1 on (1-naftyylioksi)asetyyli; NOA2 on (2-naftyylioksi)asetyyli; PEP on Prö^tC^O)Phe eli ryhmä, jossa ProPhe-osassa -CO-NH-on korvautunut ryhmällä -CH2-0-; PGA on pyroglutamoyyli; :*·.· PLA on (S)-3-fenyylilaktoyyli; POA on fenoksiasetyyli; PRP on Phe*(CH2NH)Phe; TBA on t-butyyliasetyyli.

: Kemialliset synteesit on merkitty etuliitteellä C. Biologi set esimerkit on merkitty etuliittteellä B.

30 88400

Cl. Valmistaminen, tapaus 1^ (S)-1-(3-metyyli-l-oksobutyyli)-2-(3-metyyli-l-oksobutyy1i)-oksi-metyylipyrrolidiini THF:ään (200 ml) valmistettu L-2-pyrrolidiinimetanolin (15,17 a, 0,15 mol) ja pyridiinin (25,55 ml, 0,33 mol) liuos, jota sekoitetaan, jäähdytetään jäähauteessa typpi-ilmakehässä ja siihen lisätään pisaroittain 45 minuutin aikana isovaleryvlikloridia (40,23 ml, 0,33 mol). Jäähaude ooistetaan 15 minuutin kuluttua ja seosta pidetään ympäristön lämpötilassa 18 tunnin ajan ja suodatetaan. Kiintoaines pestään kuivalla eetterillä ja suo-dos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan eetteriin, pestään peräjälkeen kylmällä, 0,1 N HCl:llä, suolaliuoksella, kylläisellä NaHCO.rlla ja suolaliuoksella; kuivataan McrSO,:!lä 3 4 ja haihdutetaan, jolloin saadaan viskoosia öljyä.

Tälle materiaalille sovelletaan sellaista TLC-järjestelmää, joka käsittää silikaqeeliä olevan kiinteän faasin ja 2,5-orosent-tisesta MeOH-CHCl^-seoksesta muodostuvan liikkuvan faasin, käyttäen täplien näkyväksi tekemiseen fosfomolybdeenihaoposuihku-tusta. Tuote puhdistetaan tislaamalla. Kiehumispiste 134-139°C/0,15 mm.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle : C'» δδ,87; H, 10,10; N, 5,20. Todettu: C, 66,72; H, 10,00; M, 5,24.

_ 25 o Määritykset / a7^ = -55 ; TR, NMR, M.?. ovat yhtäpitäviä yh disteen ( S )-1-(3-metvyli-l-oksobutyyli)-2-(3-metyvli-l-okso-butyyli)-oksimetvy1ioyrrolidiini kaavan kanssa.

C2. Valmistaminen, tapaus (S)-1-(3-metyyli-l-oksobutyyli)-2-(hydroksimetyyli )pyrrolidiini II, missä R on isopropyyli ____

Valmistustavassa 1^ saadun raakatuotteen asetonitriiliin (750 ml) valmistettuun, sekoitettuun liuokseen lisätään 1,03 N KOH:ta (200 ml) ja pidetään ympäristön lämpötilassa 18 tuntia. TLC, joka toteutettiin 2,5-prosenttisella MeOH-CHCl3~seoksella sili-kaqeelin päällä, käyttäen värjäämiseen fosfomolybdeenihappo- 31 88400 tai kaliumpermanganaattisuihkutusta, osoitti lähtömateriaalin puuttumisen. Tämän jälkeen se haihdutetaan vakuumissa asetonit-riilin poistamiseksi; jäljelle jäävä vesiliuos tehdään kylläiseksi NaCl:llä ja uutetaan kolmasti Cf^C^^Ha. Uutteet pestään laimealla NaCl-liuoksella, kuivataan Na2SO^:llä ja haihdutetaan. Jäännös sekoitetaan pieneen määrään bentseeniä ja haihdutetaan, jolloin saadaan 28 g raakatuotetta, joka tislataan lyhyellä kolonnilla ilmajäähdytystä käyttäen 0,05 millimetrin paineessa, jolloin saadaan 1,44 g (S)-1-(3-metyyli-l-oksobutyyli)-2-(hydroksimetyyli)pyrrolidiiniä, kiehumispiste 114-118°C ja 23,7 g samaa yhdistettä, kiehumispiste 118-125°C.

Tämän materiaalin tunnusomaiset piirteet määritettiin M?-, IR-ja NMR-määrityksin ja niiden todettiin olevan yhtäpitävät yhdisteen (S ) -1- ( 3-metyyl.i-l-oksobutyyli ) - 2- (hydroksimetyyli ) pyrro-lidiinin kaavan kanssa. Sen /äj^^-arvo on -56,0°C.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle cigH^9N°3: c» 64,83; H, 10,34; N, 7,56. Todettu: C, 65,09; H, 10,42; N, 7,43.

C3. Valmistaminen, tapaus II^ l-hydroksi-5-metyyli-2-heksyyli III, missä R^ on isoprooyyli :* Eetterissä (121,7 ml, 0,365 mol) olevan 3M etyylimagnesiumbromi- din ja eetterin (120 ml) muodostamaan sekoitettuun liuokseen . ·. lisätään typpi-ilmakehässä ja ympäristön lämpötilassa pisaroit- tain 1 tunnin 45 minuutin aikana 4-metyyli-l-pentyyniä (30,0 g, 0,365 mol) ja tätä seosta pidetään ympäristön lämpötilassa 18 tuntia. Gilman-kokeella, joka osoittaa reaktion täydellisen loppuunkulumisen, saadaan heikosti positiivinen tulos. Tämän jälkeen pienessä pullossa olevaa paraformaldehydiä (21,9 g, 0,730 mol) kuumennetaan 195-200°C:n lämpötilassa ja muodostuvaa ‘ · : formaldehydikaasua johdetaan hitaan typpivirran avulla reaktio- seokseen 1 tunnin 50 minuutin ajan. Tämän lisäyksen jälkeen seosta sekoitetaan 50 minuuttia, jäähdytetään jäähauteessa ja siihen lisätään NH4Cl:n kylläistä vesiliuosta (330 ml) ja - · : eetteriä (300 ml). Orgaaninen kerros erotetaan ja pestään ve- della ja suolaliuoksella. Piimään läpi tapahtuva suodattaminen saattaa olla välttämätöntä tässä vaiheessa emulsioiden rikkomi- 32 88 400 seksi. Samoin saattaa olla hyödyllistä pestä seos 10-prosent-tisella natriumbisulfiitin vesiliuoksella reaktion aikana muodostuneiden formaldehydin polymeerien hajottamiseksi. Vettä sisältävät kerrokset uutetaan eetterillä ja yhdistetyt eetteri-faasit kuivataan MgSO^illä ja haihdutetaan. Jäännös haihdutetaan 1 millimetrin paineessa, jolloin saadaan 33,3 g 1-hydroksi-5-metyyli-2-heksyyniä, kiehumispiste 46-47°c.

Tämän materiaalin tunnusomaiset piirteet määritettiin IR-, MS-ja NMR-määrityksin.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C7H120: C, 74,95; H, 10,79;

Todettu: C, 73,96; H, 10,91. Tunnusomaisten piirteiden todettiin olevan yhtäpitävät yhdisteen l-hydroksi-5-metyyli-2-heksyynin kaavan kanssa.

C4. Valmistaminen I

(E)-l-hydroksi-5-metyyli-2-hekseeni IV, missä R^ on isopropyyli Edelläolevalla valmistustavalla II valmistettu alkyyni (40,45 g, 0,361 mol) liuotettiin THF:ään (400 ml) ja lisättiin 35 minuutin aikana THFrään (1500 ml) valmistettu LiAlH^:n (27,5 g, 0,723 mol) suspensioon typpi-ilmakehässä. Seosta lämmitetään varovaisesti 3 tunnin ajan. TLC, joka toteutettiin silikagee-lin päällä 20-prosenttista EtOAc-sykloheksaani-seosta käyttäen ja tekemällä täplät näkyviksi ^-tavalla, osoitti reaktion täydellisen etenemisen loppuun. Tämän jälkeen se jäähdytetään jää-hauteessa ja käsitellään F^Otlla (27,5 ml, lisätään hitaasti), 15-prosenttisella NaOHtlla (27,5 ml) ja vedellä (82,5 ml). Sekoittamista jatketaan noin 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen kiintoaines otetaan talteen suodattamalla ja pestään Et^Oilla. Yhdistetyt Et20-liuokset haihdutetaan ja jäännös tislataan 8,2 millimetrin paineessa, jolloin saadaan 33,7 g (E)-1-hydroksi-5-metyyli-2-hekseeniä, kiehumispiste 67-68°c.

Tämän materiaalin tunnusomaiset piirteet määritettiin NMR-, IR-ja MS-analyysein.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle Ο,^Η^Ο: C, 73,63; H, 12,36.

Todettu: C, 73,35; H, 12,49.

33 88 400

Tunnusomaisten piirteiden todettiin olevan yhtäpitävät yhdisteen (E)-l-hydroksi-5-metyyli-2-hekseenin kaavan kanssa.

C5. Valmistaminen II

(E)-l-bromi-5-metyyli-2-heksaani V, missä R^ on isopropyyli Bentseeniin (250 ml) valmistettu alkohdlin (16,14 g, 0,142 mol) ja trifenyylifosfeenin (40,85 g, 0,156 mol) sekoitettu liuos jäähdytetään jäähauteessa ja siihen lisätään annoksittain N-bromisukkinimidia (27,72 g, 0,156 mol) 50 minuutin aikana, pitäen reaktioseoksen lämpötila 4-8°C:ssa. Seosta pidetään tässä hauteessa 27 minuuttia ja ympäristön lämpötilassa 5 tuntia 30 minuuttia. TLCrtä, joka toteutetaan silikageelin päällä ja 5-prosenttisella MeOH-CHCl-j-seoksella käyttäen kaliumperman-ganaattisuihkutusta täplien tekemiseksi näkyviksi, voidaan käyttää lähtömateriaalin puuttumisen osoittamiseen, ja täten reak-tioajan lyhentämiseen. Tuloksena oleva suspensio sekoitetaan pentaaniin (200 ml) ja jäähdytetään jäähauteessa. Kiintoaines otetaan talteen suodattamalla ja se pestään hyvin pentaanilla. Yhdistetty suodos haihdutetaan alennetussa paineessa. Tuote on hyvin haihtuvaa. Haihdutusvaiheessa on noudatettava suurta huolellisuutta, jotta tuotehävikeiltä vältytään. Jäännös sekoitetaan pieneen määrään pentaania ja jäähdytetään jäähauteessa, jolloin kiinteät sivutuotteet edelleen saostuvat ja ne poistetaan suodattamalla. Suodos pestään kylmällä 5-prosenttisella ‘ Na2S203:lla, kahdesti 0,5 N NaOH:lla ja suolaliuoksella, kui- : vataan MgSO^rllä ja haihdutetaan. Jäännös tislataan noin 20 millimetrin paineessa, jolloin saadaan 0,57 g esitislettä ja 20,85 g (E)-l-bromi-5-metyyli-2-hekseeniä, kiehumispiste 84-87°C. Tämän materiaalin kokonaissaanto on 40,3-55,8%.

Tämän tuotteen tunnusomaiset piirteet selvitetään IR-, NMR- ja MS-analyysein.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C^H^Br: C, 47,48; '·_ H, 7,40; Br, 45,12. Todettu: C, 46,58; H, 7,62; Br, 44,82.

Tunnusomaisten piirteiden todettiin olevan yhtäpitävät yhdisteen (E)-l-bromi-5-metyyli-2-hekseenin kaavan kanssa.

34 88400

C6. Valmistaminen IA

(S)-1-/T2S,4E)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-4-oktenyyli7- 2-(hydroksimetyyli)oyrrolidiini VIHA, missä R·^ on isooropyvlj Kuivaan THF:ään (75 ml) valmistettu di-isooropyyliamiinin (30,09 ml, 0,2147 mol) sekoitettu liuos jäähdytetään typpi-ilmakehässä hiilihappojään ja asetonin muodostamassa hauteessa ja siihen lisätään 29 minuutin aikana 1,6 M n-butyylilitiumia (134,0 ml, 0,2144 mol). Seosta pidetään tässä hauteessa 9 minuuttia (vähäistä saostumista voidaan todeta), jonka jälkeen siihen lisätään THF:ään (75 ml) valmistettu, Valmistustavassa ^ saadun (S)-1-(3-metyyli-l-oksobutyyli)-2-hydroksimetyylipyrrolidi inin (19,84 g, 0,1071 mol) liuos 7 minuutin aikana. Saostuma liukenee. Seosta pidetään hauteessa 6 minuuttia ja ympäristön lämpötilassa 3 tuntia 52 minuuttia (jälleen havaitaan heikkoa saostumista); tämän jälkeen siihen lisätään heksametyylifosfo-riamidia (37,34 ml, 0,214 mol) ja jäähdytetään hiilihappojään ja asetonin muodostamassa hauteessa. Seokseen lisätään 30 minuutin aikana THF:ään (40 ml) valmistettu (E)-l-bromi-5-metyyli-2-hekseenin (20,85 g, 0,1177 mol) liuos, joka hekseeni saatiin valmistuksesta II, ja seosta oidetään hiilihappojään hauteessa 5 tuntia. Silikageelillä ja 50-prosenttisella EtOAc-Skellysolve B-seoksella toteutettua TLC:tä voidaan käyttää lähtöaineen puuttumisen osoittamiseen. Haude Doistetaan ja seosta sekoitetaan jäähdyttämättä 30 minuuttia: tämän jälkeen se kaadetaan kylmään veteen (noin 600 ml) ja uutetaan kolmasti Et20:lla. Uutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan MgS04:Hä ja haihdutetaan vakuumissa, jolloin saadaan 33,9 g raakaa (S)-1-/T2S,4E)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-4-oktenyyli7- 2-(hydroksimetyyli)pyrrolidiiniä. Se kromatografoidaan silikageelillä (noin 2 kg) käyttäen eluointiin 50-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta, jolloin tuotetta saatiin 22,74 g meripihkan kaltaisena öljynä.

Tämän materiaalin tunnusomaiset piirteet selvitettiin MS-, IR-ja NMR-määrityksin. Sen /"07^25-arvo on -35,5°c.

35 88400 Nämä tunnusomaiset piirteet pitävät yhtä yhdisteen (S)-l-/T2S,4E)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-4-oktenyyli7-2-(hydroksimetyyli)-pyrrolidiinin kaavan kanssa.

C7, Valmistaminen IIA

(S)-l-/T2S,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-(hydroksimetyyli)pyrrolidiini (isomeeri A) IXA, missä R^ on isooropyyli; sekä (S)-l-/T2S,4R,5R)-4,5-dihydroksi-2-isooropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-(hydroksi-metyyli)pyrrolidiini (isomeeri B) IXB, missä on isopropyyli Seos, joka koostuu valmistustavalla IA saadusta (S)-1-/(2S,4E)- 2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-4-oktenyyli7-2-(hydroksimetyyli)-pyrrolidiinistä (22,74 g, 0,0808 mol), trimetyyliamiinioksidin dihdyraatista (12,17 g, 0,1095 mol), t-butanolista (170 ml), tislatusta vedestä (48,5 ml), pyridiinistä (6,5 ml) ja 2,5-oro-senttisesta OsO^istä t-butanolissa (3,18 ml), ja jota sekoitetaan, lämmitetään 45 minuutin aikana palautusjäähdytyksen lämpötilaan ja sitä palautusjäähdytetään 3 tuntia. Reaktiojärjestelmän läpi johdetaan hidas N2~virta reaktiossa muodostuneen trimetyyliamiinin poistamisen helpottamiseksi. Lähtömateriaalin puuttumisen osoittamiseen voidaan käyttää TLCrtä, jossa liikkuvana faasina on 35-prosenttinen asetoni-CH2Cl2~seos ja jossa *·· värjäämiseen käytetään fosfomolybdeenihaDDoruiskutusta. Seos .·*·. jäähdytetään ympäristön lämoötilaan, siihen lisätään 20-prosent- tista NaHSO^tn vesiliuosta (67 ml) ja se haihdutetaan vakuumissa t-butanolin poistamiseksi. Jäljelle jäävä vesiseos tehdään kyl-. Iäiseksi NaCltllä ja uutetaan neljästi Etoilla. Uutteet oes- • · tään kahdesti suolaliuoksella, kuivataan MaSO.rllä ja haihdute- taan, jolloin saadaan 27,94 g raakatuotetta. Tämä materiaali kromatografoidaan silikageelillä, jolloin saadaan 11,45 g iso-meeriä A, 5,56 g isomeerien seosta ja 7,79 g isomeeriä B. Kun : : seos kromatografoidaan uudestaan, saadaan edelleen 1,77 g iso- * * meeriä A ja 1,81 g isomeeriä B. Isomeerin A kokonaissaanto . (vaiheet 1A-IIA) on 27,5-38,3%. Isomeerin B kokonaissaanto (vaiheet ΙΑ-ΙΤΛ) on 20,7-27,8%.

·:··· Isomeerin A tunnusomaiset piirteet selvitettiin NMR- ja MS-mää-rityksin; yhdisteelle C17H33N04 laskettu M+. 315^2409, todettu 36 88400 315,2440. Sen Zä7D25-arvo on -78,5°C (EtOH).

Nämä tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät edellä isomeerinä A esitetyn yhdisteen kaavan kanssa.

Isomeerin B tunnusomaiset piirteet selvitettiin NMR- ja MS-mää-rityksin. Yhdisteelle Ci7H33N04 laskettu M+: 315,2409, todettu 315,2421. Sen Z«7D25-arvo on -13,7° (EtOH). Vaikka TLC-analyysi osoittaa isomeerin B olevan puhdasta, niin kuitenkin HPLC-ana-lyysi (Brownlee Labs. kolonni Spheri 10, mitat 4,6 mm ID x 25 cm, täytetty käänteisfaasille RP 18, virtausnopeus 2 ml/min, liikkuva faasi 50-prosenttista H20-MeOH-seosta 0,5 minuutin ajan, jonka jälkeen käytettiin gradienttiajoa 50-prosenttisesta H20:sta seokseen 30% H20-MeOH 15 minuutin ajan) osoittaa myöhempien fraktioiden sisältävän epäpuhtauksia (retentioaika 9,8 min). Isomeerin B retentioaika on 9,4 min. Tämä epäpuhtaus voidaan erottaa seuraavan vaiheen (IE) kiteytyksellä, mutta tässä prosessissa ilmeisesti menetetään jonkin verran toivotusta tuotteesta. HPLCrllä puhdistetun isomeerin B Zä7D25-arvo on -6,l°c (EtOH). Tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät edellä isomeerinä B esitetyn yhdisteen kaavan kanssa.

C8. Valmistaminen IIIA

(2S,4S , 5S ) -4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktoni XA, missä R ja ovat isopropyyli __

Dioksaanissa (275 ml) olevaan (S)-l-/f2S,4S,5S)-4,5-dihydroksi- 2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-(hydroksimetyyli )-pyrrolidiinin (isomeeri A valmistuksesta IIA) (11,45 g, 0,0363 mol) liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään 2N H2S04:ää (275 ml) ja seosta palautus jäähdytetään typpi-ilmakehässä 4 tunnin ajan. Lähtömateriaalin puuttuminen voidaan osoittaa TLC-määrityksellä silikageelillä, liikkuvan faasin ollessa 35-prosenttinen asetoni-CH2Cl2-seos, käyttäen värin muodostukseen fosfomolybdeenihappo-suihkutusta, jolloin reaktioaikaa saadaan lyhennettyä. Seos jäähdytetään ympäristön lämpötilaan, tehdään kylläiseksi NaCl:llä ja uutetaan kolmasti Et20:lla. Uutteet pestään peräjälkeen suolaliuoksella, tehdään kylläiseksi NaHCO^illa ja suolaliuok- 37 88400 sella, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan Et20:hon ja tämä liuos suodatetaan pienen Magnisol-kiekon läpi ja kiteytetään Et20-pentaani-seoksesta, jolloin saadaan 5,02 q lämpötila-alueella 95,5 - 96,5°C sulavaa; 1,02 g lämpötila-alueella 96-97°C sulavaa ja 0,094 g lämpötila-alueella 95-96°C sulavaa {2S,4S,5S)-4,5-dihydroksi-2-isooropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonia.

Edellä kuvatun reaktion tuotteen tunnusomaiset piirteet selvitettiin NMR-, IR- ja MS-määrityksin; yhdisteelle C12H22°3 las“ kettu analyysi: C, 67,25; H, 10,35. Todettu: C, 67,33; H, 10,29. Sen /α7ρ25-arvo on +13°C (EtOH) .

Sen NMR-määritys (200 MHz, CDCl^): δ 0,91-1,04 (oktetti, 12, CH3), 1,26 (septetti, 1, C-6HB), 1,55 (septetti, 1, C-6HA), 1,85 (m, 1, C-7H), ^2,14 (m, 4, C-2a, 3H, OH), 2,68 (d,d,d, 1, C-2H), 3,63 (desetti, 1, C-5H), 4,30 (d,d,d, 1, C-4H).

Nämä tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät yhdisteen (2S,4S,5S)- 4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihappo γ-laktonin kaavan kanssa.

·;· C9. Valmistaminen IVA käyttäen CCl^:ää (2 S,4 S,5 R)-5-kloori-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon γ-laktoni XIA, missä R ja Rj^ ovat isopropyyli _ . i CCl:ään (75 ml) valmistettuun (2S,4S,5S)-4,5-dihydroksi-2-iso- propyyli—7-metyylioktaanihapon, jota saatiin Valmistuksessa : 11A, (3,8 g, 0,0177 mol), liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään trifenyylifosfiinia (6,98 g, 0,0266 mol) ja sitä palautusjäähdytetään typpi-ilmakehässä 9 tuntia. Lähtömateriaalin puuttu-:misen osoittamiseen voidaan käyttää TLC-määritystä silikagee-: : Iillä, Ilkkuvan faasin ollessa 20-prosenttinen EtOAc-Skellysolve B-seos, käyttäen fosfomolybdeenihapporuiskutusta. Liuosta pidetään ympäristön lämpötilassa 8 tuntia, laimennetaan 250 ml:n tilavuuteen Et20:lla (tähän tarkoitukseen voidaan käyttää pen-taania, jolloin trif enyylifosf iinioksidin täydellisempi pois-•v: taminen on mahdollista) ja se suodatetaan. Kiintoaines pestään huolellisesti Etoilla (tähän tarkoitukseen voidaan käyttää pen- 38 88400 taania, jolloin trifenyylifosfiinioksidin täydellisempi poistaminen on mahdollista) ja yhdistetyt suodokset haihdutetaan, jolloin saadaan 10,41 g puolikiinteää jäännöstä. Tämä kromato-grafoidaan silikageelillä (600 g) 5-prosenttista EtOAc-heksaa-ni-seosta käyttäen, jolloin saadaan 3,91 g (2S,4S,5S)-5-kloori- 4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihapon γ-laktonia. Analyysiä varten tämä yhdiste kiteytettiin kylmästä pentaanista, sulamispiste 49,5-50°C.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle ^2^1^^21 C, 61,92; H, 9,10; Cl, 15,23. Todettu: C, 62,32; H, 9,12; Cl, 15,34.

/ä7D^ + 35 (EtOH). Rakenne varmennettiin IR-, NMR- ja MS-määrityksin.

TLC-määrityksellä, jossa käytettiin silikageeliä ja 50-prosent-tista Cf^C^-heksaani-seosta, todettiin, että tässä materiaalissa on kontaminanttina eliminaatiotuotetta, joka ei ole todettavissa 5-prosenttisella EtOAc-heksaani-järjestelmällä.

Nämä yhdisteet voidaan erottaa kromatografisesti käyttäen 50-prosenttista Cf^C^-heksaani-seosta· Tuote voidaan kiteyttää pentaanista 0°C:n lämpötilassa tai sen alapuolella. Kuitenkin seuraava reaktio (Valmistus VA) voidaan toteuttaa tässä kuvatulla tavalla saatua tuotetta käyttäen.

CIO. Valmistus VA (käyttäen lähtöaineena Valmistuksessa IVA

saatua tuotetta ja CCl^:ää)_ (2S,4.S ,5S)-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon γ-laktoni XIIA, missä R ja ovat isopropyyli_

Dimetyylisulfoksidiin (50 ml) valmistettuun, Valmistuksesta IVA peräisin olevan (2S,4S,5R)-5-kloori-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin (3,86 g, 0,0166 mol) liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään CCl^rää käyttäen natriumatsidia (3,23 g, 0,0498 mol) ja lämmitetään typpi-ilmakehässä öljyhau-teessa 85-90°C:n lämpötilassa 39 tuntia. Lähtöaineen katoamista voidaan seurata TLC-määrityksin silikageelillä, käyttäen ke-hitinliuoksina sekä 50-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta että 70-prosenttista Cf^C^-heksaani-seosta (ensimmäisellä liuotin- 39 88400 järjestelmällä tuotteena oleva atsidi liikkuu aavistuksen verran hitaammin kuin lähtöaineen ja sivutuotteen muodostama seos, ja jälkimmäisellä liuotinjärjestelmällä atsidi ja sivutuote liikkuvat jokseenkin yhdessä, mutta hitaammin kuin lähtöaine). Tässä ajassa (39 tuntia) reaktio etenee loppuun. Täplien näkyväksi tekemiseen käytetään fosfomolybdeenihapporuiskutusta. Seos jäähdytetään, kaadetaan 250 millilitraan jäävettä ja uutetaan neljästi 50 millilitran suuruisilla annoksilla EtOAcrtä. Uutteet pestään vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan MgSO^:llä ja tiivistetään vakuumissa, jolloin saadaan 3,88 g raakatuotetta.

Se kromatografoidaan silikageelillä (250 g) käyttäen 4-prosent-tista EtOAc-heksaani-seosta, jolloin saadaan 2,62 g tuotetta.

Tämän tuotteen tunnusomaiset piirteet selvitettiin IR- ja NMR-määrityksin. Sen /§7arvo on +29,38 (EtOH).

Tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät (2S,4S,5S)-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin kaavan kanssa.

Cll. Valmistaminen IVA (käyttäen CBr^rää) (2S,4S,5R)-5-bromi-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- ' hapon Y-laktoni XIA, missä R ja R^ ovat isopropyyli_

Asetoninitriiliin (3 ml) valmistettua, Valmistuksesta IIIA peräi-' sin olevan (2S,4S,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyliok- .·.·. taanihapon γ-laktonin (0,214 g, 1 mmol) ja hiilitetrabromidin (0,431g, 1,3 mmol) liuosta, jota sekoitetaan, jäähdytetään typpi-ilmakehässä hauteessa, jonka lämpötila pidetään noin 10°C:ssa ja tähän lisätään annoksittain 20 minuutin aikana trifenyylifos-fiinia (0,341 g, 1,3 mmol); sakkaa muodostuu runsaasti ja aseto-- '· nitriiliä (5 ml) lisätään sekoittamisen helpottamiseksi. Seosta . ’ pidetään ympäristön lämpötilassa l tunnin 30 minuutin ajan, sitä palautus jäähdytetään 3 tuntia 40 minuuttia ja pidetään edelleen huoneen lämpötilassa 18 tuntia. TLC-määrityksellä, joka toteutetaan silikageelillä ja 20-prosenttisella EtOAc-heksaani-seok-sella, todetaan, että lähtöainetta ja tuotetta on läsnä yhtä suurina määrinä. Seokseen lisätään jälleen hiilitetrabromidia (0,332 g) ja trifenyylifosfiinia (0,262 g), ja seosta pidetään 40 88400 ympäristön lämpötilassa 1 tunnin 45 minuutin ajan ja sitä palautus jäähdytetään 1 tunti 30 minuuttia. Jäähtynyt seos sekoitetaan Et20:hon ja suodatetaan. Suodos haihdutetaan ja jäännös kromato-grafoidaan silikaqeelillä (100 g) 7,5-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta käyttäen. Täten saatu tuote kiteytetään Et20-pentaani-seoksesta, jolloin saadaan 0,063 g (2S,4S,5R)-5-bromo-4-hydroksi- 2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonia, sulamispiste 61-62,5°C.

Analysoitava näyte kiteytettiin kylmästä pentaanista ja sen sulamispiste oli 63,5-64,5°C ja / ct7D^-arvo + 39°C (EtOH) . Rakenne varmistettiin IR-, NMR- ja MS-määrityksin.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle ci2H21Br02: c> 51,99; H, 7,64; Br, 28,83. Todettu: C, 51,92; H, 7,49; Br, 28,77.

C12. Valmistaminen IVA (käyttäen N-bromisukkinimidiä) (2S,4S ,5R)-5-bromi-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon γ-laktoni XIA, missä R ja R^ ovat isopropyyli_

Bentseeniin (3 ml) valmistettua, Valmistuksesta IIIA peräisin olevan (2S,4S,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani-hapon γ-laktonin (0,214 g, 1 mmol) ja trifenyylifosfiinin (0,289 g, 1,1 mmol) liuosta, jota sekoitetaan, jäähdytetään jäähauteessa ja siihen lisätään 5-10 minuutin aikana N-bromisukkinimidiä (0,196 g, 1,1 mmol). Seosta pidetään edelleen kylmässä 30 minuuttia ja sitten ympäristön lämpötilassa 4 tuntia.

Se laimennetaan Et20:lla ja suodatetaan. Suodos haihdutetaan : ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä (100 g) käyttäen 7,5-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta. Täten saatu tuote, (2S,4S,5R)-5-bromi-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani-hapon γ-laktoni, kiteytettiin kylmästä pentaanista, jolloin saa-; tiin 0,061 g lämpötila-alueella 62,5-63,5°C sulavaa fraktiota ja 0,054 g lämpötila-alueella 60-62,5°C sulavaa fraktiota.

C13. Valmistus VA (lähtien Valmistuksen IVA tuotteesta ja käyt-tän CBr,:ää tai N-bromi-sukkinimidiä) -4- (2S,4S,5S)-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon γ -laktoni XIIA, missä R ja R^ ovat isopropyyli_

Kuivassa DMSOrssa (3 ml) olevaan NaN^in (98,5 mq, 1,52 mmol) 41 88400 liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään valmistuksesta IVA saatua (2S,4S,5R)-5-bromi-4-hydroksi-2-isopropyyli-8-metyylioktaani-hapon γ-laktonia (CBr^rää käyttäen) tai valmistuksesta IVA saatua γ-laktonia (N-bromisukkinimidiä käyttäen) (0,105 g, 0,379 mmol) ja lämmitetään typpi-ilmakehässä 80°C:n lämpötilassa 15 tuntia 20 minuuttia. Reaktion päättyminen nähdään TLC-määri-tyksellä silikageeliä ja 70-prosenttista CF^C^-heksaaniseosta käyttäen. Seos sekoitetaan kylmään veteen ja uutetaan EtOAc:llä. Uutteet pestään vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (50 g) käyttäen 4-prosenttista EtOAc-heksaaniseosta, jolloin saadaan 56 mg (2S,4S,5S)-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihapon γ-laktonia, joka näin ollen on identtistä Valmistuksessa VA saadun materiaalin kanssa (Valmistuksessa VA lähdettiin Valmistuksesta IVA käyttäen CCl^:ää).

C14. Valmistus VIA

(25.45.55) -5-amino-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon γ-laktoni XIIIA, missä R ja ovat isopropyyli_

Seosta, joka koostuu mistä tahansa edellä kuvatusta Valmistuksesta VA peräisin olevasta atsidista (2,85 g, 0,0119 mol), etanolista (150 ml) ja Lindlar-katalyytistä (1,0 g), hydrataan ilmanpaineessa 5 tuntia. Reaktiota ja lähtömateriaalin katoa- ...: mistä seurataan TLC-määrityksin silikageeliä ja 4-orosenttista

EtOAc—heksaaniseosta käyttäen, jolloin täplät tehdään näky-•w>· viksi fosfomolybdeenihapporuiskutuksella, ja 5-prosenttisella :*·*: MeOH-Cf^C^-seoksella, kun tuotteen muodostumista seurataan.

• j*: Katalyytti poistetaan suodattamalla seos piimaa-suodattimen läpi ja suodos haihdutetaan vakuumissa. Jäljelle jääneen etanolin poistamiseksi jäännös liuotetaan bentseeniin kahdes-. . ti, aina kummankin lisäyksen jälkeen haihduttaen, jolloin saa-...* daan 2,64 g öljymäistä tuotetta.

:··." Tätä materiaalia jatkokäsiteltiin ja sen tunnusomaiset piirteet -:··· määritettiin IR- ja NMR-spektrein, jotka olivat yhtäpitävät (25.45.55) -5-amino-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani-hapon γ-laktonin kaavan kanssa.

« 88400

C15. Valmistus VIIA

(2S,4 S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopro-pyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktoni XIVA, missä R ja Rj^ ovat isopropyyli________ THFrssä (80 ml) olevaan, Valmistuksesta VIA peräisin olevan (2S,4S ,5S )-5-amino-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani-hapon Y-laktonin (2,57 g) liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään 15 minuutin aikana di-t-butyyli-dikarbonaatin (6,5 g, 0,0298 mol) liuosta, joka oli valmistettu THF:ään (50 ml). Tätä seosta pidetään typpi-ilmakehässä ympäristön lämpötilassa 15,5 tuntia. Reaktion loppuminen nähdään TLC-määrityksillä, joissa käytetään silikageeliä, 5-prosenttista MeOH-Cf^C^-seosta ja nin-hydriiniruiskutusta. Valmistuksesta VIA peräsin oleva γ-laktoni saattaa olla välttämätöntä pestä kylläisellä natriumbikarbonaatilla käsittelyn aikana pienten happomäärien poistamiseksi, joka happo muodostaa anhydridin kanssa reagoimattoman amiinisuolan. Vaihtoehtoisesti valmistettuun reaktioseokseen voidaan lisätä pieni määrä NaHCO^rn vesiliuosta. Seos haihdutetaan vakuumissa, jolloin saadaan 7,67 g puolikiinteää jäännöstä. Tämä kromato-grafoidaan (tuote eluoituu fraktioina (35 ml) 108-190. Tämä materiaali voidaan tehdä näkyväksi TLC-levyllä ninhydriiniruis-kutuksella.) käyttäen silikageeliä (400 g) ja 8-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta, jolloin saadaan 3,48 g kiinteää tuotetta, sulamispiste 143-144,5°C.

Tuote voidaan kiteyttää EtOAc-Skellysolve B-seoksesta. Analyyttisen näytteen sulamispiste on 144,5-146°c.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle ci7H3^N04: c» 65,14; H, 9,97; N, 4,47. Todettu: C, 65,26; H, 9,92; N, 4,34.

IR-, NMR- ja MS-määritykset olivat yhtäpitävät (2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli- — o c oktaanihapon γ-laktonin rakenteen kanssa. Sen /a7p -arvo on -41°C.

43 88 400

C.16. Valmistus VIIIA

(2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli_ 7-metyylioktaanihapon kaliumsuola XVA, missä R ja ovat iso- propyyli__________

Asetonitriilissä (215 ml) oleva, edellä kuvatusta valmistuksesta VIIA saadun (2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin (4,31 g, 0,0138 mol) liuos, jota sekoitetaan, sekoitetaan veteen (170 ml), jolloin muodostuu saostuma, jonka jälkeen tähän seokseen lisätään 1 N KOHria (15,1 ml). Seosta pidetään ympäristön lämpötilassa typpi-ilmakehässä 18 tuntia. (Seoksessa läsnäolevaa lähtömateriaalia voidaan seurata TLC-määrityksin silikageelillä ja 10-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella, käyttäen ninhydriini-värjäystä). Se haihdutetaan vakuumissa asetonitriilin poistamiseksi. Jäännös, joka on 5,64 g (2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino )-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon ka-liumsuolaa, liuotetaan absoluuttiseen EtOH:hon, siihen lisätään pieni määrä bentseeniä ja se haihdutetaan. Tämä jäännös joko sekoitetaan bentseeniin ja haihdutetaan uudestaan, jolloin saadaan vaahtoa, tai sitä lyofilisoidaan 3 vuorokautta, jolloin saadaan jäännöksenä valkeata jauhetta, jota käytetään suoraan seuraavassa Valmistuksessa IXA. Tässä tapauksessa etanoli-bentseeni-käsittelyä käytetään viimeisten vesijäämien poista-miseen.

:"*t C17. Valmistus IXA (Vaihe 1) j·.·. (2 S , 4 S , 5 S ) - 5- (t-butoksikarbonyyliamino )-4-( t-but yy lid ime tyyli - : silyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon t-butyylidime- - . tyylisilyyliesteri___

Kuivassa DMF:ssä (85 ml) olevaan, Valmistuksessa VIIIA saadun raakatuotteen, (2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hyd-• roksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon kaliumsuolan liuok- '·' ' seen, jota sekoitetaan, lisätään imidatsolia (4,70 g, 0,069 mol) ja t-butyylidimetyylisilyylikloridia (5,2 g, 0,0345 mol). Seos-— ta pidetään ympäristön lämpötilassa typpi-ilmakehässä neljä vuorokautta. Reaktiota voidaan seurata TLC-määrityksin käyt-' : täen silikageeliä, 10-prosenttista EtOAc-heksaaniseosta ja nin- 44 88400 hydriiniruiskutusta. TLC-määrityksen perusteella tämä reaktio-seos sisältää ainoastaan yhtä tuotetta. Täplän Rp on 0,6.

Seos sekoitetaan kylmään veteen (250-300 ml) ja uutetaan neljästi heksaanilla. Uutteet pestään kahdesti kylmällä vedellä, kerran suolaliuoksella, kuivataan Na2SO^:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan 8,23 g väritöntä kumia.

NMR-määritys oli yhtäpitävä (2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli-amino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihapon t-butyylidimetyylisilyyliesterin rakenteen kanssa.

C18. Valmistus IXA (vaiheet 2 ja 3) (2S,4S,5S)-5-t-butoksikarbonyyliamino-4-t-butyylidimetyyli-silyloksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihappo IA, missä R ja ovat isopropyyli_

MeOH:ssa (110 ml) olevaan, Valmistuksesta IXA (vaihe 1) peräisin olevan (2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyyli-dimetyyli-silyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon t-butyylidimetyyli-silyyliesterin liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään typpi-ilmakehässä ^CO^n (2,1 g, 0,015 mol) vesiliuosta (10 ml) ja tätä seosta pidetään ympäristön lämpötilassa 50 minuuttia. Tällöin muodostuu välittömästi saostuma ja lähtöaineen puuttuminen voidaan osoittaa TLC-määrityksin silikageelillä ja 10-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella ninhydriiniruis-kutusta käyttäen, jolloin lyhyempi reaktioaika voidaan todeta riittäväksi. Tämän jälkeen seos haihdutetaan vakuumissa MeOH:n poistamiseksi. Jäännökseen lisätään jääkylmää suolaliuosta (40 ml) ja EtOAcrtä (50 ml), se jäähdytetään jäähauteessa ja tehdään happamaksi (pH 2-3) 0,5 M KHSO^rllä. Kerrokset erotetaan ja vesikerros uutetaan kahdesti EtOAcrllä (50 ml). Uutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan, jolloin saadaan 5,93 g kumia. Tämä materiaali tuottaa kaksi täplää TLC-määrityksessä silikageelillä ja 10-prosentti-sella MeOH-C^C^-seoksella, käyttäen täplien värjäämiseen ninhydriiniruiskutusta. Nopeampi täplä edustaa toivottua tuotetta (2S,4S,5S)-5-t-butoksikarbonyyliamino-4-t-butyylidimetyyli-silyloksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihappoa. Hitaamman täplän 45 88 400 alkuperää ei varmuudella tunneta. Tämä kromatografoidaan silika-geelillä (300 g) käyttäen liikkuvana faasina 3-prosenttista MeOFF-CF^Cl^-seosta, jolloin saadaan 4,81 g (78,2%) tuotetta.

Tämän valmistuksen kokonaissaanto (vaiheet IIA-IXA) on 18,4 -48%.

IR-, MS- ja NMR-määrityksin selvitetyt tunnusomaiset piirteet, sekä /ä7D^-arvo -33°C (EtOH) ovat yhtäpitävät ( 2S , 4S , 5S )-5-t-butoksikarbonyyliamino-4-t-butyylidimetyyli-silyloksi-2-isopro-pyyli-7-metyylioktaanihapon rakenteen kanssa.

Cl9. Valmistus IIIB

(2S,4R,5R ) -4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon Y-laktoni XB, missä R ja ovat isopropyyli_

Dioksaanissa (250 ml) olevaan, Valmistuksessa IIA saadun 1- /T2S,4R,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-l-oksobutyyli7-(S)- 2- (hydroksimetyyli)pyrrolidiinin (isomeeri B) liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään 2 N F^SO^sää (240 ml) ja palautusjäähdytetään varovaisesti 3,5 tuntia. Lähtömateriaalin häviäminen voidaan todeta TLC-määrityksin käyttäen silikageeliä, 35-prosent-tista asetoni-CF^C^-seosta ja fosfomolybdeenihapporuiskutusta. Seos jäähdytetään ympäristön lämpötilaan, kyllästetään NaClrllä ja uutetaan kolmasti Et20:lla. Uutteet pestään suolaliuoksella, ---* tehdään kylläiseksi NaFFCO^rlla ja suolaliuoksella, kuivataan

MgSO^rllä ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös sekoitetaan pie-·...· neen määrään bentseeniä ja haihdutetaan. Tuloksena oleva mate-; V riaali liuotetaan Et20:hon, suodatetaan pienen Magnisol-kiekon : : läpi ja kiteytetään Et20-pentaaniseoksesta, jolloin saadaan kol- :":": me erää tuotetta, (2S,4R,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7- metyylioktaanihapon γ-laktonia. (Kiteytys toteutetaan siten, : että Et20 haihdutetaan höyryhauteessa ja Et20 korvataan hitaasti pentaanilla. Tuote, jonka sulamispiste on korkeampi, alkaa ki-’. teytyä lämpimästä liuoksesta haihduttamisen aikana. Se kitey- tetään tavallisesti uudestaan yhteen tai kahteen kertaan.) ·;·*: Tässä valmistuksessa saatiin 3,04 g lämpötila-alueella 93,5- \ 95,5°C sulavaa; 0,78 g alueella 94-95,5°C sulavaa ja 0,219 g alueella 94-95°C sulavaa (2S,4R,5R)-4,5-dimetyyli-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonia. Kiteyttämällä emäliuokset 46 88400

Et20-pentaani-seoksesta tai pentaanista saatiin 0,663 g lämpötila-alueella 73,5-82°C; 0,104 g alueella 70-72,5°C; 0,424 g alueella 69-73,5°C ja 0,200 g lämpötila-alueella 65,5-69°C sulavaa tuotetta.

Tuotteen tunnusomaiset piirteet selvitettiin IR-, NMR- ja MS-määrityksin.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle ci2H22°3: c» 67,25; H, 10,35. Todettu: C, 67,30; H, 10,53.

Sen /ot7j-j -arvo on -28°C. Sen NMR-spektri (200 MHz, CDCl^) oli: 61,86 (sekstetti; 1; J = 10,3, 12,4, 12,4); C-3HB, 2,15 (d,d,d; 1; J = 6,2, 9,0, 12,5;C-3HA), 2,64 (d,d,d; 1; J = 5,1, 9,0, 12,3; C-2H), 4,22 (d,d,d; 1; J = 5,4, 6,1, 10,3; C-4H).

Tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät (2S,4R,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin rakenteen kanssa.

C20. Valmistus XB

(2S ,4R,5R)-4-hydroksi-2-isopropyyli-5-metaanisulfonyylioksi-7-metyylioktaanihapon γ-laktoni XVIB, missä R ja R-j^ ovat isopro- pyy11_ C^C^zssä (155 ml) oleva, edellä kuvatusta Valmistuksesta IIIB saadun (2S,4R,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani-hapon Y-laktonin (7,28 g, 0,0340 mol) sekoitettu liuos jäähdytetään jäähauteessa typpi-ilmakehässä ja siihen lisätään tri-etyyliamiinia (7,10 ml, 0,0510 mol) ja sitten siihen myös lisätään pisaroittaan 10 minuutin aikana metaanisulfonyylikloridin (2,9 ml, 0,0374 mol) liuos, joka on valmistettu CH2Cl2:ään (20 ml). Seosta pidetään jäähauteessa 30 minuuttia. (Tätä reaktiota voidaan seurata TLC-määrityksin silikageelillä, käyttäen värjäämiseen fosfomolybdeenihapolla ruiskuttamista.

CH2Cl2:lla lähtöaineen ja tuotteen Rf-arvot ovat 0,07 ja 0,23; 20-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella ne ovat 0,27 ja 0,24, vastaavasti.) Se sekoitetaan jääveteen (75-100 ml). Kerrokset erotetaan ja vesikerros uutetaan kahdesti CH2Cl2:lla. Orgaaniset kerrokset pestään 1 N HCl:llä, NaHCO^:n vesiliuok- 47 8 8400 sella ja laimealla NaCl:lla, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan vakuumissa, jolloin saadaan 10,37 g tuotetta.

Tuotteen tunnusomaiset piirteet on selvitetty NMR-määrityksin, jotka ovat yhtäpitävät (2S,4R,5R)-4-hydroksi-2-isopropyyli-5-metaanisulfonyylioksi-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin rakenteen kanssa.

C21. Valmistus XIB

(2S ,4R,5S)-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon Y-laktoni XIIB, missä R ja R^ ovat isopropyyli_

Dimetyylisulfoksidissa (130 ml) olevaan natriumatsidin (6,63 g, 0,102 mol) sekoitettuun liuokseen lisätään mesylaatin, edellä esitetyssä Valmistuksessa XB saadun (2S,4R,5R)-4-hydroksi-2-iso-propyyli-5-metaanisulfonyylioksi-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin liuos, joka on valmistettu DMSO:hon (25 ml), ja tätä seosta pidetään 85°C:n lämpötilassa typpi-ilmakehässä 22 tuntia. Reaktion täydellinen eteneminen loppuun nähdään TLC-määrityksin si-likageelillä, käyttäen 10-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta ja värjäämiseen fosfomolybdeenihapolla ruiskuttamista. Seos jäähdytetään, kaadetaan jääveteen (750 ml) ja uutetaan neljästi EtOAc:llä (150 ml). Uutteet pestään vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan MgSO^:llä ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös kromato-..." grafoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 8-prosenttista

EtOAc-heksaani-seosta, jolloin saadaan 7,31 g tuotetta, (2S,4R,5S)-: : 5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-lak- : töniä.

Tämän tuotteen tunnusomaiset piirteet selvitettiin IR- ja NMR-analyysein, ja nämä tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät . . (2S,4R,5S)-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- ; hapon γ-laktonin rakenteen kanssa.

·:·*: C22. Valmistus VIB

(2S , 4R, 5S )-5-amino-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani- hapon γ-laktoni XIIIB, missä R ja R-^ ovat isopropyyli_ 95-prosenttisessa EtOHrssa (350 ml) olevaan, edellä kuvatussa Valmistuksessa XIB saadun tuotteen, (2S,4R,5S)-5-atsido-4-hydroksi- 48 88400 2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin liuokseen lisätään Lindlar-katalyyttiä (2,4 g) ja hydrataan ilmanpaineessa menetelmällä, joka on analoginen julkaisussa E.J. Corey et ai., Synthesis 590 (1975) kuvatun menetelmän kanssa. Järjestelmään imetään vakuumi, ja se täytetään vedyllä 25, 55, 90 ja 265 minuutin kuluttua. Sekoittamista jatketaan yhteensä 4 tuntia 55 minuuttia. Reaktion täydellinen kuluminen loppuun nähdään TLC-analyysein silikageelillä ja 10-prosenttisella EtOAc-hek-saani-seoksella, käyttäen värjäykseen fosfomolybdeenihapolla ruiskuttamista. TLC-määrityksessä tuotteella saadaan yksi täplä (R^ 0,3) silikageelille 5-prosenttisella MeOH-CHCl^-seoksella ja ninhydriinillä ruiskutuksella. Katalyytti poistetaan suodattamalla seos piimään läpi ja suodos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös liuotetaan pieneen määrään tolueenia ja haihdutetaan EtOH:n poistamiseksi.

C23. Valmistus VIIB

(2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktoni XIVB, missä R ja R^ ovat iso-

Er.°PYYll__ THF:ssä (50 ml) olevaa, edellä esitetyssä Valmistuksessa VIB saadun tuotteen, (2S,4R,5S)-5-amino-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin sekoitettua liuosta jäähdytetään varoen jäillä ja vedellä täytetyssä hauteessa ja tähän lisätään di-t~butyylidikarbonaattia (13,3 g, 0,0610 mol) ja THF:ää (10 ml). Seosta pidetään ympäristön lämpötilassa typpi-ilmakehässä 18 tuntia. (Lähtömateriaalin läsnäolon osoittamiseen voidaan käyttää TLC-määrityksiä silikageelillä ja 5-pro-senttisella MeOH-CHCl-seoksella, käyttäen värjäämiseen ninhydriinillä ruiskuttamista.) Siihen lisätään edelleen di-t-butyyli-dikarbonaattia (3,32 g) ja sekoitetaan 6 tuntia. Seokseen lisätään veteen (10 ml) valmistettua NaHCO^zn (0,84 g, 0,01 mol) liuosta, pidetään ympäristön lämpötilassa 2 tuntia ja haihdutetaan vakuumissa. Jäännös sekoitetaan pieneen määrään suolaliuosta ja uutetaan kolmasti EtOAc:llä. Uutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan. Jäännös kroma-tografoidaan silikageelillä käyttäen 2-prosenttista EtOAc-CH2Cl2-seosta. Täten saatu tuote, (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli- 49 88400 amino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktoni liuotetaan pentaaniin, suodatetaan pienen Magnisol-kiekon läpi ja kiteytetään, jolloin saadaan 6,73 g lämpötila-alueella 87,5-89°C sulavaa; 0,98 g lämpötila-alueella 87-89°C sulavaa ja 0,498 g lämpötila-alueella 87-88,5°C sulavaa tuotetta.

Kiteytyvä seos saattaa olla edullista jäähdyttää kiteytymisen ollessa lähes täydellistä ympäristön lämpötilassa (liian varhainen jäähdyttäminen saattaa johtaa geelin muodostumiseen). Kiteet voidaan pestä pienellä määrällä kylmää pentaania.

Tässä valmistuksessa saadun tuotteen tunnusomaiset piirteet selvitetään IR-, NMR- ja MS-analyysein.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C, 65,14; H, 9,97; N, 4,47. Todettu: C, 65,52; H, 10,10; N, 4,36.

/n7D25 -62° ( EtOH) .

Tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät (2S,4R,5S)-5-(t-butoksi-karbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin rakenteen kanssa.

Valmistuksissa, jotka alkavat vaiheella IIIB ja jotka jatkuvat vaiheina XB, XIB, XIIB, XIIIB ja VIIB, saadaan saannoksi 11%.

: C24. Stabiilisuuskoe (vaihe VIIB) (2S,4R,5S)-5-( t-butoksikarbonyy li amino) - 4-hydroksi-2-isopropyyli-; 7-metyylioktaanihapon γ-laktoni - Diastereomeerien stabiilisuu- # den määrittäminen alkaalisen hydrolyysin olosuhteissa_

Asetonitriilissä (5 ml) olevaan, Valmistuksesta VIIB saadun (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin (100 mg, 0,319 mmol) sekoitet-' tuun liuokseen lisätään vettä (4 ml) ja 1 N KOH:ta (0,35 ml).

—: Sitä pidetään ympäristön lämpötilassa typpi-ilmakehässä 5 tun-

..... nin ajan. Reagoimattoman lähtömateriaalin jäämiä todettiin ·_ TLC-määrityksessä silikageelillä ja 10-prosenttisella EtOAr- heksaaniseoksella. Seokseen lisätään ylimääräinen pisara 1 N

so 88400 KOHrta ja sitä pidetään ympäristön lämpötilassa edelleen kaksi tuntia. Tämän jälkeen se haihdutetaan vakuumissa CH^CNrn Doistamiseksi ja jäännös pakastekuivataan. TLC-määritys osoittaa, että tuloksena oleva hiutaleinen valkea jauhe sisältää edelleen lähtömateriaalin jäämiä. Se sekoitetaan dioksaaniin (5 ml), siihen lisätään 2 N H RO :ää o 2 4 (5 ml), sekoitetaan ja lämmitetään 70 C:een lämpötilassa 2 tuntia 10 minuuttia. TLC-määritys silikaqeelillä ja 5-prosenttisella MeOH-CHCl^-seoksella osoittaa, että tuote on samaa (2S,4R,5R)-5-amino-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihapon γ-laktonin autenttisen näytteen kanssa. Seos neutraloidaan kiinteällä NaHCO^rlla, tehdään kylläiseksi NaCl:llä ja uutetaan, jolloin saadaan 70 mq tuotetta. Tämän materiaalin THF:ssä olevaan sekoitettuun liuokseen lisätään di-t-butyylidikarbonaattia (140 mq) ja pidetään ympäristön lämpötilassa 18 tuntia. SilikaqeelilLä ja 20-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella toteutetun TLC-määrityksen perusteella tuote on samaa kuin (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyLiam i no )-4-hydroksi-2-isooropyyli-7-metaanioktaanihapon γ-laktonin autenttinen näyte. Seos haihdutetaan ja jäännös kroma-tografoidaan silikageelillä (75 g) 15-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta käyttäen. Näin saatu tuote kiteytetään oen-taanista, jolloin saadaan 32 mg lämpötila-alueella 87-88,5°C sulavaa tuotetta. Näin saadusta tuotteesta ja (2R,4R, 5S)-5- (t-butoks ikarbonyyliamino)-4-hydroks i-2-isopropyyli-7-metyyliok-taanihapon γ-laktonin autenttisesta näytteestä muodostetun seoksen sulamispiste ei laske. IR-spektri on sama kuin autenttisella näytteellä.

Tämä edellä esitetty koe osoittaa yhdisteen XIVB (2S)-substi-..· tuentin stabiilisuuden vaiheen VITIB alkalisen hydrolvysin : olosuhteissa.

51 88400

C25. Valmistus VIIIB

(2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopro-pyyli-7-metyylioktaanihapon kaliumsuola XVB, missä R ja R^ ovat isopropyyli__

Asetonitriilissä (63 ml) olevaan. Valmistuksessa VIIB saadun (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopro-pyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonin (1,262 g, 4 mmol) sekoitettuun liuokseen lisätään tislattua vettä (50 ml) ja 1 N KOH:ta (4,4 ml). Seosta pidetään typpi-ilmakehässä 20 tuntia ja haihdutetaan vakuumissa asetonitriilin poistamiseksi. Jäljelle jäävä vesiliuos pakastekuivataan, jolloin saadaan tuotetta, (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon kaliumsuolaa, joka on hienoa valkoista kiintoainetta.

Tätä reaktiota voidaan seurata TLC-määrityksin silikageelillä ja 20-prosenttisella EtOAc-heksaaniseoksella, käyttäen värjää-miseen ninhydriinillä ruiskuttamista. Lähtömateriaalin jäämiä on läsnä 3 tunnin kuluttua, ja ne puuttuvat 20 tunnin kuluttua.

C26. Valmistus IXB (vaihe 1) (2S ,4R,5S)-5-t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon t-butyylidimetyylisilyyliesteri IB, missä R ja R ^ ovat isopropyyli ____

Seokseen, joka käsittää kuivaa DMF:ää (30 ml) ja Valmistuksessa !'.! VIIIB saatua tuotetta, (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)- 4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon kaliumsuolaa, - ja jota sekoitetaan, lisätään imidatsolia (1,63 g, 24 mmol) ja -·· · t-butyylidimetyylisilyylikloridia (1,81 g, 12 mmol) ja sitä pidetään typpi-ilmakehässä ympäristön lämpötilassa 20 tuntia. Silikageelillä, 10-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella ja : ·.·. ninhydriiniruiskutuksella toteutetussa TLC-määrityksessä saa- daan kaksi tuotetäplää, Rf 0,7 ja 0,18. Vaikuttaa siltä, että ‘ . hitaammin liikkuva materiaali on esterialkoholi. Näin ollen tätä reaktiota tulisi jatkaa yli 20 tuntia, ehkä 2-4 vuorokautta. Seos kaadetaan kylmään veteen (90-100 ml) ja uutetaan :neljästi heksaanilla. Uutteet pestään kahdesti vedellä ja ker-taalleen suolaliuoksella, kuivataan Na2SO^:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan 2,26 g väritöntä öljyä.

52 88400 C27. Valmistus IXB (vaiheet 2 ja 3) (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyyli-silyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihappo IB, missä R ja ovat isopropyyli ______

MeOH:ssa (30 ml) olevaan, Valmistuksessa IXB (vaihe 1) saadun tuotteen, (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyyli-dimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon t-bu-tyylidimetyylisilyyliesterin (2,26 g) sekoitettuun liuokseen lisätään veteen (2,8 ml) valmistettu kaliumkarbonaatin (0,62 g, 4,4 mmol) liuos. Liuos muuttuu maitomaiseksi ja valkea saostuma muodostuu. Seosta pidetään ympäristön lämpötilassa 1 tunnin 15 minuutin ajan (silikageelillä, 10-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella ja ninhydriiniruiskutuksella toteutetun TLC-määrityksen perusteella reaktio on edennyt täydellisesti loppuun) ja se haihdutetaan vakuumissa MeOH:n poistamiseksi. Suspendoituneen kiintoaineen sisältämä jäännös jäähdytetään jäähauteessa, siihen lisätään pieni määrä kylmää suolaliuosta ja EtOAc:tä, sekoitetaan ja tehdään happamaksi pH-alueella 3,5-4 0,5 M KHS04:llä. Tämän prosessin aikana kiintoaine liukenee. Kerrokset erotetaan ja vesikerros uutetaan kahdesti EtOAcrllä. Uutteet pestään kahdesti suolaliuoksella, kuivataan MgSC^rllä ja haihdutetaan, jolloin saadaan kiinteä jäännös (1,51 g). Silikageelillä toteutetun TLC-määrityksen (ninhydriiniruiskutus) perusteella näytteessä on kahta tuotetta. 5-prosenttisella MeOH-CHCl^-seoksella niiden R^-arvoik-si saadaan 0,39 ja 0,19; 40-prosenttisella EtOAc-CH2Cl2~seok-sella Rf-arvot ovat 0,8 ja 0,2. Tämä materiaali kromatogra-foitiin silikageelillä 5-prosenttista MeOH-CH2Cl2~seosta käyttäen. Saatiin kaksi tuotetta. Kolonnista ensimmäiseksi eluoi-tunut materiaali kiteytettiin hyvin pienestä määrästä kylmää EtOAc:tä, jolloin saadaan 0,077 g lämpötila-alueella 106-108,5°C sulavaa; 0,364 g alueella 94,5-106,5°C sulavaa ja 0,293 g alueella 103,5-106,5°C sulavaa (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyy li amino )-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihappoa. Analyyttisen näytteen sulamispiste oli 107-108,5°C. Sen tunnusomaiset piirteet määritettiin IR-, NMR- ja MS-spektrein; /¾7^^J-arvo on -42° (EtOH).

53 88400

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C23H47N05S^: C, 61,98; H, 10,63; N, 3,14. Todettu: C, 61,89; H, 10,78; N, 3,01.

Tunnusomaiset piirteet ovat yhtäpitävät (2S,4R,5S)-5-(t-butoksi-karbonyyliamino )-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon rakenteen kanssa.

Kolonnista toisena eluoituä materiaalia saatiin 0,36 g valkeana jauheena, sulamispiste 131-132°C.

IR- ja NMR-analyysien perusteella tämä materiaali on hydroksi-happoa. Erillisissä kokeissa, joissa Valmistuksen IXB (vaihe 1) kaikki toimenpiteet suoritettiin, 3 vuorokauden pituisella reaktioajalla saatiin ainoastaan nopeammin liikkuvaa tuotetta. Tällöin ainoana tuotteena on (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli-amino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihappoa.

C28. Valmistus III

(Z)-l-hydroksi-5-metyyli-2-hekseeni VI, missä R^ on isopropyyli Metanolissa (100 ml) olevaan l-hydroksi-5-metyyli-2-heksyynin (7, 7,19 g, 0,0641 mol) liuokseen lisätään MeOH:hon (5,4 ml) valmistettu kinoliinin 5-prosenttinen liuos ja Engelhard Lind-lar-katalyyttiä (3,6 g). Tämä seos hydrataan alkuperäisen pai-neen ollessa 200 kPa. Vedyn kuluminen on hyvin nopeaa ja reak-*-··“ tio pysäytetään nopeasti 5 minuutin kuluttua, jotta seos voisi "...· jäähtyä. Kun pelkistyminen päättyy vedyn noin yhden ekvivalent-: V timäarän kuluttua loppuun, seos suodatetaan piimään läpi ja : : haihdutetaan vakuumissa. Tästä jäännöksestä ja Et20:sta val- mistettu liuos pestään kylmällä 0,1 N HCl:llä (tehty kylläiseksi NaClrllä), suolaliuoksella, kylläisellä NaHCO^rlla ja suolaliuok-.·. ; sella, kuivataan MgSO^zllä ja haihdutetaan. Tämä jäännös yhdis- ..." tetään siihen tuotteeseen, joka saadaan pelkistettäessä 1,0 g (8,9 mmol) alkyyniä, ja tislataan, jolloin saadaan 0,5 g esi-tislettä ja 6,44 g (Z)-l-hydroksi-5-metyyli-2-hekseeniä, jonka kiehumispiste 6 millimetrin paineessa on 61-62°c. Rakenne varmistettiin IR-, UV-, NMR- ja MS-spektrein.

88400

Analyysi, joka on .laskettu yhdisteelle C^H^O: C, 73,63; H, 12,36. Todettu: C, 73,78; H, 12,53.

C29. Valmistus IV

(Z)-l-bromi-5-metyyli-2-hekseeni VII, missä on isopropyyli Bentseeniin (100 ml) valmistettu sekoitettu liuos, joka sisältää Valmistuksessa III saatua (Z )-l-hydroksi-5-metyyli-2-hek-seeniä (9, 6,25 g, 0,0548 mol) ja trifenyylifosfeenia (15,8 g, 0,0603 mol), jäähdytetään 4°C:n lämpötilaan jäähauteessa ja siihen lisätään 15 minuutin aikana annoksittain N-bromisukkin-imidiä (10,7 g, 0,0603 mol); lisäyksen aikana seoksen lämpötila pidetään 4-8°C:ssa; lisäyksen lopussa alkaa muodostua kiintoainetta. Jäähaude poistetaan 15 minuutin kuluttua ja seosta pidetään ympäristön lämpötilassa 2 tuntia 15 minuuttia.

Se laimennetaan Et20:lla ja jäähdytetään jäähauteessa. Tämä kylmä seos suodatetaan ja kiintoaine pestään Et20:lla. Yhdistetty suodos haihdutetaan ja jäännös sekoitetaan pentaaniin ja suodatetaan. Kiintoaine pestään pentaanilla ja yhdistetty suodos haihdutetaan. Tästä jäännöksestä ja Et20:sta valmistettu liuos pestään 5-prosenttisella ^2320^:113, kahdesti 0,5 N NaOH:lla ja suolaliuoksella, kuivataan MgSO^llä ja haihdutetaan. Jäännöstä tislataan 23 millimetrin paineessa, jolloin saadaan 0,42 g lämpötila-alueella 73-74°C kiehuvaa ja 6,89 g lämpötila-alueella 74-75°C kiehuvaa tuotetta, (Z)-l-bromi-5-metyyli-2-hekseeniä. Rakenne varmistettiin NMR-määrityksellä.

C30. Valmistus IB

(S)-1-/T2S,4Z)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-4-oktenyyli7-2- pyrrolidiinimetanoli VIIIB, missä on isopropyyli_ THF-ään (26 ml) valmistettu di-isopropyyliamiinin (9,1 ml) sekoitettu liuos jäähdytetään hiilihappojään ja asetonin muodostamassa hauteessa typpi-ilmakehässä, ja siihen lisätään 10 minuutin aikana 1,6 N n-butyylilitiumia (44,2 ml). 22 minuutin kuluttua tähän lisätään THF:ssä (26 ml) oleva, edellä kuvatussa Valmistustapauksessa valmistetun (S)-1-(3-metyyli-l-okso- butyyli)-2-pyrrolidiinimetanolin (6,54 g ) liuos 7 minuutin aikana. Seosta pidetään jäähdyttävässä hauteessa 5 minuuttia ja ympäristön lämpötilassa 3 tuntia. Tämän jälkeen siihen lisä- 55 88400 tään heksametyylifosforamidia (12,3 ml), jäähdytetään hiili-happojään ja asetonin muodostamassa hauteessa ja siihen lisätään THF:ään (13 ml) valmistettu (Z)-l-bromi-5-metyyli-2-hek-seenin (6,87 g) liuos 10 minuutin aikana. Seosta pidetään hauteessa 3 tuntia 20 minuuttia ja sitä seisotetaan jäähdyttämättä edelleen 25 minuuttia. Tämän jälkeen se kaadetaan kylmään veteen (200 ml) ja uutetaan Et20:lla. Uutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan MgSO^:llä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (500 g) 50-prosenttista EtOAcrtä käyttäen, jolloin saadaan 7,0 g tuotetta, (S)-1-/T2S,4Z)-2-iso-propyyli-7-metyy1i-l-okso-4-oktenyyli 7-2-pyrrol idiinimetanoi ia, jonka /§7D^^-arvo on -50,8° (EtOH). Rakenne varmistettin IR-ja NMR-spektrein.

MS, joka on laskettu yhdisteelle ^H3^N02(M+): 281,2355.

Todettu: 281,2357.

C31. Valmistus IIB

(S)-l-/T2S,4S,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-pyrrolidiinimetanoli, isomeeri C IXC, missä R ja R^ ovat isopropyyli; ja (S)-l-7l2S,4R,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-pyrrolidiinimetanoli, isomeeri D

IXD, missä R ja R^ ovat isopropyyli_

Seokseen, joka käsittää Valmistuksessa IB saatua (S)-1-/T2S,4Z)- ...: 2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-4-oktenyyli7-2-pyrrolidiinimeta- nolia (2,81 g, 0,01 mol), trimetyyliamiini-N-oksidin dihydraat-tia (1,50 g, 0,0136 mol), pyridiiniä (0,8 ml), vettä (6,0 ml) : * · ja t-butanolia (21,1 ml), ja jota sekoitetaan, lisätään typpi- ilmakehässä t-butanoliin (0,393 ml) valmistettua osmiumtetrok- sidin 2 ,5-prosenttista liuosta, lämmitetään hitaasti (1 tunti 15 minuuttia) palautusjäähdytyksen lämpötilaan ja palautusjääh-. . dytetään 7 tuntia. Sitä pidetään ympäristön lämpötilassa 18 tuntia, sekoitetaan 20-prosenttiseen NaHSO^rn vesiliuokseen (10 ml) ja haihdutetaan vakuumissa t-butanolin poistamiseksi.

f: Jäljelle jäävä seos tehdään kylläiseksi NaClrllä ja uutetaan ·;··· Et^Orlla. Uutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (250 g) 40-100-prosenttista asetoni-CH2ci2~seosta käyttäen.

56 88 400

Kolonnista ensimmäisenä eluoituva yhdiste on talteen saatua lähtömateriaalia ja sitä on 0,21 g. Toinen yhdiste on tuntematonta sivutuotetta ja sitä on 0,12 g. Kolmatta yhdistettä (A) saadaan 0,06 g ja se on alempi glykoli-isomeeri, jonka /ä7D^-arvo on -76,6° (EtOH). Rakenne varmistettin IR- ja NMR-määrityksin.

MS, joka on laskettu yhdisteelle C^7H33NC>4 (M+) : 315,2409.

Todettu: 315,2421.

Neljättä yhdistettä saadaan 1,07 g, ja se on (S)-1-/T2S,4S,5R)- 4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-pyrrolidiini-metanolin isomeeri C, jonka /ä7D -arvo on -45,1° (EtOH). Rakenne varmistettiin IR- ja NMR-määrityksin.

MS, joka on laskettu yhdisteelle C^H^NO^ (M+) : 315,2409.

Todettu: 315,2427.

Viidettä yhdistettä (B) saadaan 0,09 g, ja se on toinen alempi isomeeri, jonka /Ö7D -arvo on -27,0 (EtOH). Rakenne varmistettiin IR- ja NMR-määrityksin.

MS, joka on laskettu yhdisteelle C^^H^^NO^(M+): 315,2409.

Todettu: 315,2414.

Kuudentena yhdisteenä saadaan 0,93 g öljyä, joka kylmästä Et20-pentaaniseoksesta kiteytettynä tuottaa 0,291 g (S)-l-/T2S,4R,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-1-okso-oktyyli7-2-pyrrolidiinimetanolin isomeeriä D, sulamispiste 71-73°C. Analyyttisen näytteen sulamispiste oli 70-73,5°C, /ä7D25-arvo +44° (EtOH). Rakenne varmennettiin IR-, NMR- ja MS-analyysein.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C^H^NO^: C, 64,73: H, 10,54; N, 4,44. Todettu: C, 64,74; H, 10,27; N, 4,37.

57 88400

C32. Valmistus IIIC

(2S,4S , 5R ) -4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktoni XC, missä R ja ovat isopropyyli_

Dioksaanissa (26 ml) olevaan, edellä olevassa Valmistuksessa IIB valmistetun isomeerin C, (S)-l-/T2S,4S,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-2-pyrrolidiinimetanolin (1,10 g, 0,00349 mol) liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään 2 N ^SO^rää (26 ml) ja seosta pidetään typpi-ilmakehässä noin 100°C:n lämpötilassa 4 tuntia 20 minuuttia. Tämän jälkeen se jäähdytetään, tehdään kylläiseksi NaCl:lla ja uutetaan Et20:lla. Uutteet pestään suolaliuoksella, tehdään kylläiseksi NaHCO^tlla ja suolaliuoksella, kuivataan MgSC>4:llä ja haihdutetaan. Tästä jäännöksestä ja Et20:sta tehty liuos suodatetaan Magnisol-suo-dattimen läpi ja tuote kiteytetään kylmästä Et20-pentaani-seok-sesta, jolloin saadaan 0,325 g lämpötila-alueella 70,5-72,5°C ja 0,243 g lämpötila-alueella 70,5-71,5°C sulavaa (2S,4S,5R)- 4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonia. Analyyttinen näyte kiteytetään pentaanista ja sen sulamispiste on 70,5-72,5°C; /ä7D25-arvo on +12° (EtOH). Rakenne varmistettiin MS-analyysillä. IR-spektrissä (Nujol) oli vyöhykkeet kohdissa 3427 (OH) ja 1737 (C=0) cm-^. NMR-spektri (200 MHz, CDCl-j) oli seuraava: δ 1,97 (d,d,d: J=7,0, 8,5,13,1; C-3HA) , 2,30 (d,d,d; J = 5,2, 10,4, 13,3; C = 3HB), 2,68 (d,d,d; J = . 5,4, 7,0, 10,2; C-2H), 4,33 (d,d,d; J = 3,2, 5,3 8,4; C-4H).

C33. Valmistus HIP

(2S,4R,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon : .* γ-laktoni XD, missä R ja R^ ovat isopropyyli_ ;.· ; Dioksaanissa (18 ml) olevaan, Valmistuksessa IIB saadun isomee- : : rin D, (S)-l-/T2S,4R,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli- l-okso-oktyyli7-2-pyrrolidiinimetanolin (0,792 g) liuokseen, jota sekoitetaan, lisätään 2 N H2S04:ää ja lämmitetään typpi-ilmakehässä. 4,5-tuntia kestäneen varovaisen palautus jäähdyttämisen jälkeen tämä väritön liuos jäähdytetään, tehdään kylläi-‘ * seksi NaClrllä ja uutetaan Et20:lla. Uute pestään suolaliuok-sella, tehdään kylläiseksi NaHCO^lla ja suolaliuoksella, kui-. vataan MgSO^rllä ja haihdutetaan. Jäännös kiteytetään kylmästä

Et20-pentaani-seoksesta, jolloin saadaan 0,393 g lämpötila- 58 88400 alueella 58-60°C sulavaa ja 0,085 g lämpötila-alueella 56-58,5°C sulavaa (2S,4R,5S)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonia. Analyyttinen näyte kiteytettiin uudestaan pentaanista ja sen sulamispiste oli 58-60°C, ja /ä7D^5-arvo -44°C (EtOH). Rakenne varmennettiin IR-, NMR- ja MS-analyysein.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C12H22°3; C' *>7,25; H, 10,35. Todettu: C, 67,23; H, 10,21.

Tämä yhdiste muunnetaan tapauksessa IIID esitetyllä vaiheella IVD kloridiksi XID, joka muunnetaan tapauksessa IIID esitetyllä vaiheella VD atsidiksi XIIB, joissa kaikissa R ja R^ on isopropyyliryhmä.

C34. Valmistus XC ja XIC

(2S , 4S , 5R )-5-atsido-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaani-hapon γ-laktoni XIIA, missä R ja R^ ovat isopropyyli, lähtien (2S,4S,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyYlioktaanihaoon γ-laktonista_ CH-C1 :ssä (4,5 ml) oleva, edellä esitetyssä Valmistuksessa L·.

IIIC saadun (2S,4S,5R)-4,5-dihydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihapon γ-laktonin (214 mg, 1 mmol) liuos, jota sekoitetaan, jäähdytetään typpi-ilmakehässä jäähauteessa, ja siihen lisätään ensin trietyyliamiinia (0,21 ml, 1,5 mmol) ja sitten siihen lisätään pisaroittain 5-10 minuutin aikana metaanisulfo-nyylikloridin (0,085 ml, 1,1 mmol) liuos, joka on valmistettu CH2Cl2:ään. Seosta pidetään jäahauteessa 40 minuuttia, jonka jälkeen se pestään kylmällä vedellä, laimealla HCl:llä, kylläisellä NaHCO^: Ha ja laimealla NaCl:llä, kuivataan Na2RC>4:llä ja haihdutetaan. Jäännöksenä saadaan 0,32 g mesylaattia XVic, missä R ja R^ ovat isopropyyli, ja tämä oli puhdasta silika-geelillä ja 20-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella toteutetun TLC-määrityksen perusteella (R^ = 0,28). Rakenne varmis_ tettiin IR- ja NMR-analyysein.

DMSOrssa (4 ml) olevaan NaN3:n (195 mg, 3 mmol) seokseen, jota sekoitetaan, lisätään DMSO:ssa (5-10 ml) olevan mesylaatin 59 88400 (0,31 g, 1 mmol) liuos, ja tätä seosta pidetään typpi-ilmakehäs-sä 80-85°C:n lämpötilassa 7 tuntia ja ympäristön lämpötilassa 8 tuntia. Tämän jälkeen se sekoitetaan jääveteen ja uutetaan EtOAcrllä. Uutteet pestään vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan MgSO^:llä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan sili-kageelillä (75 g) 4-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta käyttäen. Öljynä saatua tuotetta on 0,207 g. Tämän materiaalin NMR-spektri on olennaisesti samanlainen kuin autenttisen näytteen NMR-spektri joka autenttinen näyte saatiin edellä esitetyssä Valmistuksessa IVA muodostuneessa (2S,4S,5R)-5-kloori-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktonista. Sen /öj^^-arvo on +29,6° (EtOH). Näyte tästä atsidista muunnetaan (2S , 4S,5S)-5-(t-butoksi-karbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyylioktaanihapon γ-laktoniksi, kuten Valmistuksessa VIIA esitetään, ja tämän γ-laktonin sulamispiste on 144-146°C ja /ä7D^-arvo -41°. Tämän materiaalin IR-spektri oli identtinen autenttisen näytteen IR-spektrin kanssa.

Tämä yhdiste on identtinen edellä esitetystä isomeeristä A ja Valmistuksessa VA saadun atsidin kanssa.

Edellä Valmistustaoauksina I, II ja III esitetyllä tavalla voidaan valmistaa sellaisia yhdisteitä, joissa R määritellään iso-butyyliksi tai fenyylimetyyliksi ja R^ määritellään fenyyliksi.

"III Näin ollen tämän keksinnön mukaisilla menetelmillä voidaan hel-" posti valmistaa sellaisia kaavan 1^ mukaisia uusia yhdisteitä, joissa R on isopropyyli, isobutyyli tai fenyylimetyyli; R^ on - ·' isopropyyli tai fenyyli; R on OH tai suojaava ryhmä: ja R^ on : H tai t-butoksikarbonyyli .

Tässä voidaan viitata sellaisiin synteettisiin menetelmiin, joissa tavallisesti suoritetaan isosteerisiä korvaantumisreaktioita.

Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 4 424 207 tai alalla ylei-• ^ sesti tunnetut menetelmät.

Näin ollen ohessa esitetään ainoastaa esimerkkinä reaktiovaiheet • kaavan XX mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi.

60 88400

C35. Esimerkki IA

N-/T2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-{t-butyylidimetyyli-silyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusii- nin bentsyyliesteri, katso tapaus IV, vaihe I_ DMFrssä (25 ml) oleva L-isoleusiinin bentsyyliesterin, p-TSA-suola, (1,77 g, 4,49 mmol) sekoitettu liuos jäähdytetään typpi-ilmakehässä jäähauteessa ja siihen lisätään N-metyylimorfoliinia (0,54 ml, 4,94 mmol). Tätä seosta pidetään jäähauteessa tunnin ajan, jäähdytetään edelleen suolaa sisältävässä jäähauteessa ja siihen lisätään DMFrssä (10 ml) oleva, Valmistuksessa IXA (vaiheet 2 ja 3) edellä esitetysti saadun (2S,4S,5S )-5-(t-butoksikarbonyyliamino )-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyv1i-7-metyylioktaanihaDon (2,0 g, 4,49 mmol) liuos ja 1-hydroksi-bentstriatsolia (0,91 g, 6,73 mmol) ja tämän jälkeen 7 minuutin aikana DMFrssä (25 ml) oleva disykloheksyylikarbodi-imidin (1,02 g, 4,94 mmol) liuos. Seosta pidetään jäähauteessa noin 3 tuntia, jonka jälkeen sen annetaan lämmetä hitaasti ympäristön lämpötilaan. Yhteensä 24 tunnin pituisen reaktioajan jälkeen seos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös sekoitetaan EtOAcrhen ja suodatetaan. Suodos jäähdytetään jäähauteessa ja pestään jääkylmällä 1 N HClrllä, kylmällä 1 N NaOHrlla, vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan MgSC>4rllä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (250 g) käyttäen eluointiin 10-prosenttista EtOAc-Skellysolve B-seosta. Täten saadaan 2,28 g tuotetta, N-/T2S,4S,5S)- 5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusiinin bentsyyli-esteriä, jonka /«7D25-arvo on -22,7° (EtOH); se on olennaisesti puhdasta HLPC-määrityksen perusteella, jossa HPLC-määrityksessä käytettiin RP-18 Spheri 10-kolonnia ja isokraattista ajoa 10-prosenttisella H20-CH3CN-seoksella virtausnopeuden ollessa 2 ml/minuutissa. Rakenne varmistettiin IR- ja NMR-spektrein.

MS oli m/z 649 /m + H+7.

C36. Esimerkki IB

N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi) -2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusii- . . nin bentsyyliesteri__ DMFrssä (5 ml) oleva L-isoleusiinin bentsyyliesterin, p-TSA- e1 88400 61 suola, (0,393 g, 1 mmol) sekoitettu liuos jäähdytetään jää-hauteessa typpi-ilmakehässä, siihen lisätään N-metyylimorfolii-nia (0,121 ml, 1,1 mmol) ja seisotetaan 45 minuuttia. Tämän jälkeen seosta jäähdytetään edelleen suolaa sisältävässä jää-hauteessa ja siihen lisätään (2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli-amino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-oktaanihappoa (0,446 g, 1 mmol), hydroksibentstriatsolia (0,203 g, 1,5 mmol) ja siihen lisätään pisaroittain 3-5 minuutin aikana DMFrssä (5 ml) oleva disykloheksyylikarbodi-imidin (0,227 g, 1,1 mmol) liuos. Seosta pidetään suola-jäähauteessa useita tunteja sen lämmetessä 0°C:een. Tämän jälkeen haude korvataan jäähauteella, jonka annetaan lämmetä hitaasti ympäristön lämpötilaan. 20 tunnin kuluttua seos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös sekoitetaan EtOAcihen ja suodatetaan. Suodos jäähdytetään jäähauteessa ja se pestään nopeasti jääkylmällä 1 N HCl:llä, 1 N NaOH:lla, vedellä ja suolaliuoksella, kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silika-geelillä (100 g) 10-prosenttisen EtOAc-heksaani-seoksen toimiessa eluenttina. Täten saadaan 0,59 g tuotetta, N-/T2S,4R,5S)- 5-(t-butoksikarbonyyliamino )-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-okso-oktyyli7~L-isoleusiinin bentseeni-esteriä. Sen rakenne varmistettiin IR- ja NMR-spektrein. MS-spektrissä oli /M + H*7 kohdassa m/z 649: /M + K*7 kohdassa 687.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C,cH. N O SiK: 687,4170.

jo 64 c o

Todettu: 687,4239.

- : : C37. Esimerkki IIB

: V: N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-hydroksi-2-isopro- pvvli-7-metvvli-l-okso-oktvvli7-L-isoleusiinin bentsyyliesteri .·. : THF:ään (5 ml) valmistettu N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli- amino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L.-isoleusiinin (0,40 g, 0,616 mmol) sekoitettu • liuos jäähdytetään jäähauteessa typpi-ilmakehässä ja siihen lisä- tään THF:ään (1,23 ml) valmistettu tetrabutyyliammoniumfluoridin . IM liuos. Seoksen annetaan lämmetä ympäristön lämpötilaan.

- Silikageelillä ja 10-prosenttisella EtOAc-heksaani-seoksella 62 88400 toteutetun TLC-määrityksen perusteella seoksessa on yhä läsnä lähtömateriaalia yhden tunnin kuluttua. Seokseen lisätään edelleen tetrabutyyliammoniumfluoridia (0,62 ml) ja seosta pidetään ympäristön lämpötilassa 22 tuntia. Tämän jälkeen se sekoitetaan veteen ja uutetaan EtOAc:llä. Uutteet pestään suolaliuoksella, kuivataan MgSO^tllä ja haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (75 g) käyttäen eluenttina 1-prosenttista MeOH-Ct^C^-seosta. Näin saadaan 0,21 g vähäisen sivutuotemäärän jälkeen eluoituvaa tuotetta, N-^T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbo-nyyliamino)-4-hydroksi-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusiinin bentsyyliesteriä. Rakenne varmennettiin IR- ja NMR-spektrein. MS-spektrissä oli /M + H*7 kohdassa m/z 535; /M + K+7 kohdassa m/z 573.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C3q K: 573,3306.

Todettu: 573,3329.

C38. Esimerkki IIA

N-/T2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyyli-silyloksi ) - 2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusiini , kaavan XXIV mukainen yhdiste A, missä R ja R^ ovat isopropyyli-

Katso tapaus IV, vaihe II_

Etanolissa (100 ml) oleva seos, joka käsittää edellä esitetyssä esimerkissä IA valmistetun N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli-amino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusiinin bentsyyliesteriä (2,08 g, 3,21 mmol) ja 10-prosenttista Pd/C-katalyyttiä (1,0 g), siirretään vetyilmakehässä hydrausyksikköön, joka on yhteydessä ilmakehään. Seosta sekoitetaan voimakkaasti 40 minuutin ajan. Vetyä () kuluu 104 ml ja reaktio pysähtyy. Sekoittamista jatketaan 45 minuuttia. Tämän jälkeen sekoittaminen lopetetaan ja seoksen annetaan seistä tunnin ajan. TLC-määrityksen (15-prosenttinen EtOAc:SSB-seos ja 5-prosenttinen MeOHrCf^C^-seos) perusteella reaktio on edennyt täydellisesti loppuun. Seos suodatetaan ja pestään metanolin ja metyleenikloridin seoksella. NMR-spektri on yhtäpitävä toivotun tuotteen, N-/T2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino) -4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli/-L-isoleusiinin kanssa.

63 8 8 4 00

C39. Esimerkki III

Kaavan XXI mukainen yhdiste, missä ja ovat isopropyyli;

Katso tapaus IV, vaihe III_

Fenyylialaniini-metyyliesterin vetykloridi (0,64 g, 0,00295 mol, 1 ekvivalentti) liuotetaan DMF:ään (18 ml) typpi-ilmakehässä ja jäähdytetään jäävedellä täytetyssä hauteessa. Tähän liuokseen lisätään N-metyylimorfoliinia (0,33 g, 0,36 ml, 0,00325 mol, 1,1 ekvivalenttia). Reaktioseosta sekoitetaan jäävesi-hauteessa edelleen tunnin ajan. DMF:ssä (9 ml) oleva, edellä esitetyssä esimerkissä IIA valmistetun N-/T2S,4S,5S)-5-(t-butoksi-karbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-isoleusiinin (1,65 g, 0,00295 mol) liuos lisätään tähän reaktioseokseen, jota jäähdytetään edelleen suolaa sisältävässä jäähauteessa. Tämän jälkeen seokseen lisätään 1-hydroksi-bentsotriatsolia (0,60 g, 0,00443 mol), ja tämän jälkeen siihen lisätään kuuden minuutin aikana DMF:ssä (18 ml) olevaa disykloheksyylikarbodi-imidiä (0,67 g, 0,00325 mol, 1,1 ekvivalenttia). Seoksen sekoittamista jatketaan. Jäähdyttävän hauteen ja siinä olevan reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Seoksen sekoittamista jatketaan huoneen lämpötilassa. Yhteensä 18 tuntia kestäneen sekoittamisen jälkeen reaktioseos suodatetaan ja haihdutetaan. Fenyyli-alaniinia olleen lähtöaineen puuttuminen ja tuotteen läsnäolo nähdään TLC-määrityksin, joissa ajoliuoksena käytettiin 5-pro-senttistä MeOHrCF^C^-seosta tai 15-prosenttista EtOAc :Cf^C^-·...· seosta, ja käyttäen ensimmäisessä määrityksessä värjäämiseen nin-hydriiniä ja toisessa määrityksessä fosfomolybdeenihappoa. Tä-I ‘ män jälkeen reaktioseos suodatetaan ja haihdutetaan. Jäännös : : : sekoitetaan etyyliasetaattiin, suodatetaan uudestaan ja suodos jäähdytetään jäähauteessa. Suodos pestään kerran kylmällä 1 N HClrllä ja tämän jälkeen peräjälkeen kylmällä 1 N NaOHrlla, H20:H-a ; ja suolaliuoksella. Pesussa käytetyt vesiliuokset pestään vas-I.. tavirtaan EtOAc:llä. Tämän jälkeen orgaaniset fraktiot kuivataan MgSO^:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan kirkasta kumia, joka on toivottua tuotetta oleva toinen kahdesta isomeeristä, ·:*' kaavan XXIA mukainen yhdiste, jossa R ja R^ ovat isopropyyli.

Tämä isomeeri valmistettiin ja HPLC-, TLC- ja MS-analyysit osoittivat tämän isomeerin olevan yhtäpitävän kaavan XXI mukaisen toivotun tuotteen kanssa, jossa kaavassa R ja R^ ovat iso- propyyli.

m 88400

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C3gHggN307SiK = 758,4542. Todettu /m. + k7+ kohdassa m/z = 758,4601.

C40. Esimerkki IV

N-/N-/T 2r,4S,5S)-4-hydroksi-7-metyyli-2-(1-metyylietyyli)-1-okso-5-/7N-(fenoksiasetyyli)-L-fenyylialanyyli7amino7oktyyli7-L-isoleusyyli7-L-fenyylialaniinin metyyliesteri . Kaavan XX^ mukainen yhdiste, jossa R ja ovat isopropyyli; Katso tapaus V Vaihe I

Kaavan H2N-XXII, missä R ja R^ ovat isopropyyli, mukaisen yhdis- teen valmistaminen_

Kaavan XXI mukainen, edellä olevassa Esimerkissä III valmistettu suojattu amiini (0,07 g, 0,097 mmol) liuotetaan metyleeniklori-diin (1 ml) typpi-iImakehässä. Tähän liuokseen lisätään tri-fluorietikkahappoa (1 ml) ja sitä sekoitetaan tämän jälkeen huoneen lämpötilassa yhden tunnin ja 10 minuutin ajan. Reaktion täydellinen kuluminen loppuun todetaan TLC-määrityksin, joissa käytetään silikageeliä ja 15-prosenttista EtOAc :CH2Cl2-seosta. Reaktioseos haihdutetaan kumimaiseksi jäännökseksi, joka tämän jälkeen käsitellään Et20:lla. Jäännös liukenee, sitä hiutalei-sen materiaalin pientä määrää lukuunottamatta, joka suodatetaan -· piimaasuodattimen avulla, ja liuos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan jälleen Et20:hon, pestään NaHCO^rn vesiliuoksella, pestään vastavirtaan Et20:lla, kuivataan ja haihdutetaan kiinteäk-: si kumimaiseksi jäännökseksi.

Jäännöksen NMR- ja MS-spektrit olivat yhtäpitävät kaavan H2N-XXII, jossa R ja R1 ovat isopropyyli, mukaisen toivotun yhdisteen kanssa.

/m. + k7+ kohdassa m/z 658. Laskettu: 658,4017. Todettu: 658,4032.

65 88400

Vaihe II

Reaktiotapauksen V vaiheen II valmistus, jossa saadaan kaavan B mukaista peptidiä, seuraavassa V'B_

Etanolissa (22 ml) oleva, kaavan V'A mukaisen esterin, esitetty tapauksena V, (0,5 g, 0,00128 mol) seos laitetaan ilmakehän kanssa yhteydessä olevaan hydrausyksikköön. Vetyä (35,2 ml) kuluu 10-prosenttisen Pd/C-katalyytin (0,2 g) läsnäollessa 5 minuutin aikana. Vetyä kuluu edelleen 0,5 ml seuraavan 10 minuutin aikana ja sitten vedyn reaktio päättyy. Seos poistetaan yksiköstä 30 minuutin kuluttua ja reaktion täydellinen eteneminen loppuun nähdään TLC-määrityksestä, jossa käytettiin 20-prosenttista EtOAc-heksaani-seosta. Katalyytti suodatetaan, ja sen jälkeen kun liuotin on haihdutettu pyöröhaihduttimessa, jäljelle jää ilmeisesti kiteinen jäännös. Uudelleen kiteyttäminen metanolin vesiliuoksesta tuottaa kiintoainetta, jonka sulamispiste on 128-129,5°C.

MS- ja IR-spektrien perusteella tämän kiintoaineen rakenne on yhtäpitävä tapauksessa V1 esitetyn yhdisteen V'B rakenteen kanssa. /a7D25-arvo = +39°.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C^H^NO^: C, 58,21; H, 5,73; N, 4,68. Todettu: C, 67,91; H, 5,73; N, 4,56.

Vaiheessa II esitetyn tuotteen valmistaminen

Edellä esitetyssä esimerkissä IV, tapaus V, vaihe I valmistettu, kaavan f^N-XXII mukainen amiini (0,07 g, 0,000113 mol) liuote-; ·" taan metyleenikloridiin (8 ml) typpi-ilmakehässä ja jäähdytetään jäähauteessa. Tähän liuokseen lisätään välittömästi edellä val-V." mistettua kaavan V'B mukaista yhdistettä (0,037 g, 0,000124 mol). Reaktioseokseen lisätään HOBTrta (1-hydroksibentsotriatsoli) (0,017 g, 0,000124 mol, 1,1 ekvivalenttia) ja sitten siihen lisätään dikloorimetaaniin (2 ml) valmistettu DCC:n (disyklo-‘ . heksyylikarbodi-imidi) (0,026 g, 0,000124 mol, 1,1 ekvivalenttia) liuos. Tätä seosta sekoitetaan kylmissä hauteessa. Noin neljä tuntia kestäneen sekoittamisen jälkeen suoritettu TLC-: määritys 5-prosenttisella MeOH-CH2Cl2- seoksella, käyttäen vä- ·; ·· rin muodostamiseen ninhydriiniä ja lämpöä, osoittaa kaavan 66 88400 ί^Ν-ΧΧΙΙ mukaisen amiinin kadonneen. Seoksen sekoittamista kylmässä hauteessa jatketaan. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu kylmässä hauteessa 20,5 tuntia, reaktioseos suodatetaan, pestään peräjälkeen jääkylmällä NaHCO^rn vesiliuoksella, F^Orlla ja laimealla suolaliuoksella. Pesuun käytetyt vesiliuokset pestään vastavirtaan EtOAcrn kanssa. Yhdistetyt orgaaniset fraktiot kuivataan MgSO^:llä ja haihdutetaan kumi-maiseksi jäännökseksi. Tätä kumimaista jäännöstä saadaan 0,0638 g, ja HPLC-, TLC- ja MS-analyysit osoittavat sen olevan toivottua, tapauksen V vaiheessa II saatavaa tuotetta.

MS: todettu /~m. + H7+ kohdassa m/z = 901, ja laskettu: 901,24.

Vaihe III

Edellä vaiheena II esitetyssä tapauksessa V valmistettu tuote (0,063 g, 0,0000687 mol) liuotetaan THF:ään (0,67 ml) typpi-ilmakehässä. Tähän liuokseen lisätään H^Orta (0,67 ml). Tämän jälkeen tämä liuos jäähdytetään jäähauteessa ja siihen lisätään jääetikkaa (2 ml). Täydellinen liuos poistetaan jäähdyttävästä hauteesta ja sitä sekoitetaan huoneen lämpötilassa. Noin 20 tuntia kestäneen sekoittamisen jälkeen muodostuu saostuma. Emäliuos poistetaan ja sakka liuotetaan lisäämällä siihen mety-leenikloridia, metanolia ja CH^CN:iä, ja sillä suoritetaan TLC-analyysi 5-prosenttista MeOH:CF^Cl^'ta käyttäen. Lähtöaineena toiminutta "tuotetta" osoittautuu olevan läsnä ainoastaan jääminä. Reaktioseos haihdutetaan ja sitä pidetään vakuumissa 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. 5-prosenttisella MeOHiCH^Cl^-seoksella toteutettu TLC-määritys osoittaa, että lähtöaineena toiminutta tuotetta on läsnä huomattavia määriä, joten seokseen lisätään edelleen THF:ää (1 ml), i^CCta (1 ml) ja jääetikkaa (3 ml) typpi-ilmakehässä, ja seosta sekoitetaan edelleen 20 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten seos haihdutetaan ja sitä pidetään vakuumissa 2 tuntia huoneen lämpötilassa, jolloin tuloksena on kiinteä jäännös, joka pestään, suodatetaan kolmasti 0,5 millilitran suuruisilla EtOAc-annoksilla. Tämän jälkeen tuloksena oleva materiaali kuivataan vakuumiuunissa. Tämän tuotteen HPLC- ja MS-määritykset olivat yhtäpitävät kaa- 67 88 400 van XXl mukaisen, toivotun tuotteen kanssa. /m. + H/+ kohdassa m/z laskettu 786,98, todettu 787.

C41 Esimerkki V

N_/n_/T2S*, 4S*,6S* )-4-hydroksi-7-metyyli-2-(1-metyylietyyli-l-okso-6-/7N-(fenoksiasetyyli)-L-histidyyli7amino7heptyyli7-L-isoleusyyli)-L-fenyylialaniinin metyyliesterin monoasetaatti; Katso tapaus VI, yhdiste XX^, missä R ja ovat isopropyyli Vaihe I

Tapauksessa VI vaiheen I reaktanttina esitettyä suojattua his-tidiiniä (0,66 g, 0,000177 mol, 1,1 ekvivalenttia) sekä edellä olevan esimerkin IV vaiheessa I valmistettua, kaavan f^N-XXH mukaista yhdistettä liuotetaan metyleenikloridiin (3,1 ml) typpi-ilmakehässä. Tämä liuos jäähdytetään kylmässä hauteessa -12°C:n lämpötilaan. Tähän jäähtyneeseen liuokseen lisätään 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT; 0,024 g, 0,000177 mol, 1,1 ekvivalenttia) ja l-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidin vetykloridia (0,034 g, 0,000177 mol, 1,1 ekvivalenttia). Sekoittamista jatketaan kylmässä 3 tunnin ajan. Jäähdyttävän hauteen ja siinä olevan reaktioseoksen annetaan lämmetä ja tätä seosta sekoitetaan yön yli huoneen lämpötilassa. Seoksen pH on noin 5. Yli yön kestäneen sekoittamisen jälkeen seoksesta tehty TLC-analyysi 5-prosenttisella MeOH:CH2Cl2~seoksella, ·· käyttäen värjäämiseen ninhydriinillä ruiskuttamista, tuntui osoittavan, että kaavan H2N-XXII mukainen yhdiste oli hävinnyt. Reaktioseos haihdutetaan ja jäännös ositetaan EtOActn ja jää-.1" kylmän 5-prosenttisen NaHC03:n välille. Orgaaninen faasi ero- ; tetaan ja se pestään vielä kertaalleen kylmällä 5-prosenttisel-la NaHCO^rlla. Se pestään edelleen kahdesti kylmällä 5-prosent-- tisella sitruunahapolla, ja kerran H20:lla sekä kerran suola liuoksella. Pesuun käytetyt vesiliuokset pestään vastavirtaan EtOAc: llä. Yhdistetyt orgaaniset fraktiot kuivataan MgS04:llä :: ja haihdutetaan amorfiseksi jäännökseksi. Sen TLC- ja MS-ana- " - lyysit olivat yhtäpitävät tapauksen VI vaiheessa I esitetyn toivotun tuotteen kaavan kanssa.

: Vaihe II

·; H^N-XXIII, missä R ja Rj^ ovat isopropyyli

Edellä olevan esimerkin V vaiheessa I valmistettu tuote (0,23 g, 68 88400 0,000208 mol) liuotetaan metyleenikloridin (2 ml) typpi-ilma-kehässä. Liuos jäähdytetään jäähauteessa. Tähän liuokseen lisätään trifluorietikkahappoa (TFA; 2 ml) pisaroittain 3 minuutin aikana. Seosta sekoitetaan kylmässä hauteessa 2 tuntia. Emäliuos poistetaan, laimennetaan metyleeniklori-dilla ja käsitellään riittävällä määrällä NaHC03:a seoksen saamiseksi emäksiseksi. Tästä käsitellystä emäliuoksesta tehty TLC 7-prosenttista MeOHiCF^C^-seosta käyttäen osoittaa reaktion olevan olennaisesti loppuun kulunut. Haihduttaminen ja kuivaaminen vakuumissa, huoneen lämpötilassa, mitä seurasi tavanomainen jatkokäsittely, tuotti amorfista kiintoainetta.

TLC-, NMR- ja MS-analyysit ovat yhtäpitävät toivotun tuotteen, joka on kaavan H2N-XXIH mukaista yhdistettä, jossa R ja R^ ovat isopropyyli, kanssa.

MS: todettu /m. + H7+ kohdassa m/z = 763. Laskettu yhdisteelle C42H62N6°7 762·97·

Vaihe II

H^N-XXIII. jossa R ja R^ ovat isopropyyli, uusinta Edellä olevan esimerkin V vaiheessa I valmistettu tuote (0,119 g, 0,000124 mol) liuotetaan jälleen metyleenikloridiin (1,5 ml). Tähän liuokseen lisätään pisaroittain 5 minuutin aikana trifuori-etikkahappoa (TFA; 2 ml). Reaktioseosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa yhden tunnin 25 minuutin ajan. 7,5-prosenttisella ' MeOH:CH2Cl2~seoksella toteutettu TLC osoittaa, että reaktio on : edennyt täydellisesti loppuun. Seos haihdutetaan ja se haihdu tetaan uudestaan tolueenista. Jäännös liuotetaan EtOAcihen ja : pestään peräjälkeen, kulloinkin kertaalleen NaHCO^:11a, H20:lla ja suolaliuoksella. Sen jälkeen, kun pesuun käytetyt vesiliuok-: set on pesty vastavirtaan EtOAc:llä, yhdistetyt fraktiot kuiva taan MgS04:llä ja haihdutetaan. Tästä tuotteesta tehty NMR-spektri osoittaa, että se on samaa kuin välittömästi edellä vaiheessa II saatu tuote 6, 88400

Vaihe III

Edellä olevassa vaiheessa II valmistettu kaavan f^N-III mukainen yhdiste (0,09 g, 0,000120 mol) liuotetaan CH2C1 :iin (2 ml) typpi-ilmakehässä. Tähän liuokseen lisätään fenoksietikkahagooa (0,02 g, 0,000133 mol, 1,1 ekvivalenttia). Tuloksena olevaa reaktiossosta jäähdytetään jäärmetanoli-hauteessa. Tähän seokseen lisätään 1-hydroksi-bentsotriatsolia (HOBT; 0,02 g), ja tämän jälkeen siihen lisätään 1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidin vety-kloridia (WSCI.HC1; 0,025 g, 0,000133 mol, 1,1 ekvivalenttia). Seosta pidetään jäähauteessa noin 45 minuuttia. Sitten hauteessa olevan jään annetaan sulaa ja sekä hauteen että reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa yön yli, jonka jälkeen se sisältää kiintoaineen suspension. Lähtöaineena toimivan amiinin, joka on kaavan H2N-III mukainen yhdiste, katoaminen voidaan osoittaa kahdella TLC-määrityksellä, joissa toisessa eluenttina oli 7,5-prosenttinen MeOH: CF^C^-seos ja toisessa 7,5 prosenttinen MeOH : CH2Cl2-seos ja 0,5-prosenttinen NH^OH , joissa kummassakin värjäämiseen käytettiin ninhydriiniä. Reaktioseos haihdutetaan, jonka jälkeen jäännökseen lisätään EtOAc:tä ja kylmää 5-prosent-tista NaHCO^ea. Tämä kiinteä materiaali ei liukene, mutta se voi kuitenkin olla toivottua tuotetta DMSOrssa toteutetun NMR-spektrin perusteella.

.***. Erotuksella, pesulla ja pesussa käytettyjen vesiliuosten takai-···. sinhuuhtelulla saadaan yhdistetyt fraktiot, jotka kuivataan ja -I" haihdutetaan, jolloin saadaan sellaista materiaalia, joka 7,5- prosenttisella MeOH: Cf^C^-seoksella toteutetulla TLC-määrityk-; sellä tuottaa useita täpliä. Liukenematon materiaali erotet- ·' tiin jälleen, pestiin kahdesti EtOAcrllä ja kuivattiin ilmassa.

Vaihe IV

: : : Välittömästi edellä olevassa vaiheessa III saatua liukenematonta ‘ - materiaalia (0,074 g, 0,0000825 mol), jääetikkaa (0,5 ml) ja absoluuttista etanolia (1 ml) sekoitetaan keskenään, ja tähän lisätään 10-prosenttista Pd/C-katalyyttiä (0,1 g), ja seos lai-: : : tetaan ilmakehän kanssa yhteydessä olevaan hydrauslaitteeseen vety-ylimäärän kanssa ja sekoitetaan 6 tuntia. Sitten sekoit- 70 B 8 4 00 taja pysäytetään ja reaktioseoksen annetaan seistä huoneen lämpötilassa viikonlopun yli. Tämän jälkeen sekoittaja käynnistetään uudestaan ja sekoittamista jatketaan edelleen 7 tunnin ajan. Reaktioseos poistetaan hydrauslaitteesta, katalyytti erotetaan suodattamalla ja loppu haihdutetaan kumimai-seksi kiinteäksi jäännökseksi.

Tavanomaisen jatkokäsittelyn jälkeen saatiin 0,03363 g kiintoainetta .

Tämän kiintoaineen MS-spektri on yhtäpitävä kaavan XX2 mukaisen tuotteen kanssa, jossa kaavassa R ja R^ ovat isopropyyli. Toisin sanoen N-/N-/T2S*,4S*,6S*)-4-hydroksi-7-metyyli-2-(1- metyylietyyli-l-okso-6-/7N-(fenoksiasetyyli)-L-histidyyli7-amino7heptyyli7-L-isoleusyyli)-L-fenyylialaniinin metyyli-esterin monoasetaattia saadaan 0,03363 g.

Tämän yhdisteen MS ilman -CH^C(O)-OH-suolaa on laskettu yhdisteelle C.oHcnNc0Q: 776,95. Todettu: /R. + H7+ kohdassa m/z = 777, ja KI:n lisäyksen jälkeen, /R+K7+ = 815,4192.

C42. Esimerkki VI

Kaavan XX^, missä R ja R^ ovat isopropyyli, mukainen yhdiste;

Katso tapaus VII_

Vaihe I

Esimerkin V vaiheessa II (katso tapaus VI) valmistettu, kaavan H2N-XXIII mukainen yhdiste (0,096 g, 0,000121 mol) liuotetaan CH2Cl2:iin (5 ml) typpi-ilmakehässä, ja tähän liuokseen lisätään tapauksen VII vaiheessa I reaktanttina esitettyä, kaavan XXV mukaista happoa (0,035 g, 0,000133 mol, 1,1 ekvivalenttia). Reaktioseosta sekoitetaan niin kauan, että saadaan liuos, jonka jälkeen sitä jäähdytetään jää:MeOH-hauteessa. Liuokseeen lisätään 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT) (0,018 g, 0,000133 mol, 1,1 ekvivalenttia), jonka jälkeen siihen lisätään myös 1-etyyli- 3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-karbodi-imidin vetykloridia (WSCI.HC1; 0,025 g, 0,000133 mol). Sekoittamista jatketaan kylmässä hauteessa noin 2 tuntia ja sitten hauteessa olevan jään annetaan sulaa ja sekä hauteen että reaktioseoksen anne- 71 88400 taan lämmetä huoneen lämpötilaan. Koko yön kestäneen sekoittamisen jälkeen seos sisältää geelimäisen saostuman. 7-pro-senttisella MeOHiCH^Cl^-seoksella ja ninhydriinillä toteutettu TLC-analyysi osoittaa, ettei jäljellä ole lainkaan lähtöaineena toiminutta amiinia, jolla on kaava f^N-XXIII. Seos haihdutetaan, jäännös käsitellään EtOAc:llä ja kylmällä NaHCO^n vesi-liuoksella. Seos suodatetaan ja suodatettu materiaali pestään kulloinkin kerran EtOAcilla ja sitten Kiinteä tuote kuivataan vakuumiuunissa huoneen lämpötilassa, jolloin saadaan 0,014 g tuotetta. Ylimääräiset 0,03 g tuotetta saadaan tästä seoksesta toistamalla erottaminen ja pesussa käytettyjen vesi-liuosten takaisinpesu, jonka jälkeen nämä fraktiot yhdistetään ja tämä materiaali kuivataan edelleen ja haihdutetaan. DMSOissa toteutettu NMR-spektri on yhtäpitävä tapauksen VII vaiheessa I saadun tuotteen toivotun rakenteen kanssa.

Vaihe II

Kaavan XX^, missä R ja ovat isopropyyli, mukainen yhdiste;

Katso tapaus VII, vaihe II__ Välittömästi edellä vaiheessa I valmistettu tuote (0,1 g, 0,0000992 mol) liuotetaan jääetikkaan (0,6 ml) typpi-ilmake-hässä, ja tähän lisätään absoluuttista etanolia (1,2 ml).

Sen jälkeen, kun katalyytti, 10-prosenttinen Pd/C (0,1 g) on lisätty, tuloksena oleva liuos laitetaan ilmakehän kanssa >·"_ yhteydessä olevaan hydrausyksikköön. Sen jälkeen, kun seosta "I on sekoitettu typpi-ilmakehässä 25 tunnin ajan, seos poiste- *·; taan yksiköstä ja katalyytti suodatetaan pois, liuos haihdu- ; tetaan ja sitten se haihdutetaan edelleen kahdesti tolueenis- . ta. Haihdutus jäännöstä pidetään vakuumissa huoneen lämpöti- lassa, jolloin saadaan 0,0806 g valkeata jauhetta, joka HPLC-määrityksen perusteella on puhdasta.

Tämän jauheen MS on yhtäpitävä kaavan XX^ mukaisen toivotun tuotteen kanssa.

MS /m. + H7+ kohdassa m/z, todettu: 888, laskettu: 888,13.

72 88400

Resoluutioltaan korkean spektrin saamiseksi jauheeseen lisättiin KI:tä. Teoriassa yhdisteelle C,ηΗ_,,Ν_,0οΚ = 926,5157, 49 73 7 8 todettu 926,5168.

C43. Esimerkki VII

Kaavan XX^, missä R ja R^ ovat isopropyyli, mukainen yhdiste;

Katso tapaus VIII_

Vaihe I

Esimerkissä IIA valmistettu ja tapauksena TV esitetty, kaavan XXIV mukaista yhdistettä, jossa R ja R^ ovat isopropyyli (0,5 g, 0,000895 mol), 4-amino-l-bentsyylipiperidiiniä (ylimäärin, 0,29 g) ja 1-hydroksibentsotriatsolia HOBT (0,14 g, 0,001 mol) liuotetaan CF^C^ieen (5 ml) typpi-ilma-kehässä ja jäähdytetään jäähauteessa. Tämän jälkeen tähän liuokseen lisätään annoksittain noin minuutin aikana 1-etyyli- 3-(3-dimetyyliaminopropyyli)karbodi-imidin vetykloridia (EDC.HC1; 0,19 g, 0,001 mol). Seosta sekoitetaan kylmässä hauteessa puoli tuntia, jonka jälkeen sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Sekoittamista jatketaan edelleen neljän tunnin ajan. Seoksella, joka käsitti· 1% etikkahappoa ja 10% MeOHrta CF^C^issä, toteutettu TLC-määritys osoittaa, että seoksessa on yhä läsnä kaavan XXIV mukaista lähtöainetta. Sekoittamista jatketaan huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Uusittu TLC-määritys osoittaa edelleen lähtömateriaalin läsnäolon. EDC.HCl:ää (0,02 g) lisätään edelleen ja seosta sekoitetaan edelleen tunnin ajan huoneen lämpötilassa. TLC:n tulos on edelleen sama. Reaktioseos haihdutetaan vakuumissa. Jäännös lisätään etyyliasetaattiin (50 ml) ja uutetaan 4-pro-senttisella NaHCO^/jääseoksella (25 ml) kahteen kertaan. Vesi-kerrokset uutetaan jälleen etyyliasetaatilla (25 ml) ja yhdistetyt kerrokset pestään kahdesti 5-prosenttisella sitruuna-: happo/jääseoksella (10 ml) ja sitten kerran suolaliuoksella (10 ml). Tuote jatkokäsitellään tavalliseen tapaan, jolloin saadaan 0,30 g kiintoainetta.

Vaihe II (1) ·'. Välittömästi edellä olevassa vaiheessa I valmistettu, puhdistettu tuote (0,30 g) liuotetaan CF^C^^een (1,5 ml). Tämä 73 88400 liuos jäähdytetään jäähauteessa ja siihen lisätään pisaroit-tain 2 minuutin aikana trifluorietikkahappoa. Seosta sekoitetaan 5°c:n lämpötilassa 10 minuuttia ja sitten sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Sekoittamista jatketaan puolitoista tuntia. Tämän jälkeen seos haihdutetaan typpivirralla tunnin aikana. 5-prosenttisella MeOH/Cf^C^-seoksella toteutetun TLC-määrityksen perusteella jäljellä ei ole lainkaan lähtöaineena käytettyä puhdistettua tuotetta. Jäännös lisätään kylmään etyyliasetaattiin (15 ml) ja se pestään sitten 4-pro-senttisella NaHCO^rlla (6 ml) ja jäällä, sitten jälleen 4-prosenttisella NaHCO^lla (3 ml) ja jäällä. Vesikerrokset yhdistetään ja ne uutetaan kylmällä etyyliasetaatilla (15 ml). Sitten yhdistetyt etyyliasetaattikerrokset kuivataan Na^O^illä ja haihdutetaan.

NMR on yhtäpitävä toivotun tuotteen kanssa, jossa tuotteessa on läsnä TBDMS-substituentti, mutta jossa ei ole BOC-substituenttia.

Vaihe II (2) Välittömästi edellä vaiheessa II (1) saatu tuote (0,233 g, 0,00037 mol) liuotetaan CH2Cl2:een (3 ml). Sitten tähän liuokseen lisätään vaiheen II (2) reagoivana aineena toimivaa, esitetyn kaavan mukaista suojattua histidiiniä (0,165 g, 0,000402 mol) ja tämä seos jäähdytetään jäähauteessa. Jäähdytettyyn seokseen lisätään pisaroittain 5 minuutin aikana disykloheksyyli_ ;;; karbodi-imidiä (0,093 g, 0,00045 mol), joka on sekoitettu CH„Cl.,:een. Sitten reaktioseosta sekoitetaan kylmässä hauteessa puoli tuntia. Reaktioseosta sekoitetaan yön yli huoneen lämpö-tilassa. TLC-määrityksessä nähdään hyvä "tuote" eikä lainkaan ; jäljellä olevaa lähtömateriaalia. Kiinteä tuote erotetaan jäähdytetystä seoksesta ja suodos haihdutetaan. Suodokseen lisätään EtOAcrtä ja seos jäähdytetään. Sakkaa ei muodostu. Tavanomainen jatkokäsittely tuottaa 0,32 g tuotetta.

Tuotteen MS on yhtäpitävä tapauksen VIII vaiheessa II esitetyn MS:n kanssa. MS /m. + h7+· Todettu: 1022, laskettu: 1022.

74 88400

Vaihe III

Vaiheessa III (2) reagoivana aineena käytettävä (katso tapaus VIII), kaavan XXV mukainen yhdiste valmistetaan ensin seuraavasti : α-Tert-butyylioksikarbonyylifenyyliaianiini-bentsyyliesterin p-tolueenisulfonaatti (2,15 g, 0,005 mol) liuotetaan Cf^C^teen (20 ml) typpi-ilmakehässä. Tähän liuokseen lisätään huoneen lämpötilassa dimetyyliaminopyridiiniä (ainoastaan noin 0,6 g, 1 ekvivalentti) ja sitten tämä liuos jäähdytetään jäähauteessa. Tähän kylmään liuokseen lisätään t-butyyliasetyylikloridia (1,0 g, 0,0075 mol) ja sitten lisätään myös Ct^Cl^issä (5 ml) olevan dimetyyliaminopyridiinin loppuosa (yhteensä 1,53 g, 0,0125 mol) 15 minuutin aikana. Ensimmäisten pisaroiden aikana seos muuttuu maitomaiseksi, mutta lisäyksen päättyessä saadaan kirkas liuos. Liuosta sekoitetaan kylmässä hauteessa neljän ja puolen tunnin ajan. 5-prosenttisella MeOH/CE^C^-seoksella toteutettu TLC-määritys osoittaa, että läsnä on jonkin verran lähtömateriaalia, t-fenyylialaniini-bentsyyliesterin p-tolueenisulf onaattia , mutta myös hyvän "tuotteen". Täten liuos poistetaan jäähauteesta ja sitä sekoitetaan ympäristön lämpötilassa tunnin ajan. Sitten reaktioseos laimennetaan CF^C^illa (20 ml), pestään kahdesti vesi-jää-seoksella (10 ml), kerran 8-prosenttisella NaHCO^/jää-seoksella (10 ml) ja sitten 1 M KHSO^/jää-seoksella (10 ml) ja lopuksi kerran suolaliuoksella (10 ml). Tuote kuivataan MgSC^rllä ja haihdutetaan yön yli, jolloin saadaan 2,03 g öljyä.

Tämän tuotteen NMR on yhtäpitävä toivotun tuotteen kanssa, ja sitä käytetään lisäpuhdistamatta hydrausreaktiossa, joka hyd-raus tuottaa seuraavalla tavalla kaavan XXV mukaisen yhdisteen.

Edellä esitetyssä reaktiossa saatu yhdiste (2,0 g, 0,0059 mol) ' liuotetaan etanoliin (150 ml), jossa on 5-prosenttista Pd/C- katalyyttiä (0,35 g). Vetyä lisätään Parrrilla siten, että Pi on noin 33, sen ollessa 10 minuutin kuluttua 29. 30 minuu tin kuluttua Pi on yhä noin 193 kPa. Reaktioseos poistetaan laitteistosta. 5-prosenttisella MeOH/Cf^C^-seoksella toteutettu TLC-määritys osoittaa, ettei jäljellä ole lähtömateriaa- 75 8 8 4 00 lia. Katalyytti erotetaan suodattamalla, jäljelle jäävä seos haihdutetaan ja kuivataan vakuumiuunissa yön yli, jolloin saadaan 1,36 g kiintoainetta.

NMR on yhtäpitävä kaavan XXV mukaisen yhdisteen NMR-spektrin kanssa. Uudelleenkiteyttämällä saadaan puhdasta tuotetta, jonka sulamispiste on 167-168°C. aD (MeOH) = 6° ja analyysi, joka saadaan laskemalla on: C, 68,41; H, 8,04; N, 5,32.

Todettu: C, 67,22; H, 7,91; N, 5,23.

Vaihe III (1)

Edellä olevassa tapauksessa VIII esitetyssä vaiheessa II (2) valmistettu tuote (0,3 g) liuotetaan nyt : ϋη (1,5 ml).

Tämä liuos jäähdytetään jäähauteessa. Jäähtyneeseen liuokseen lisätään pisaroittain noin viiden minuutin aikana trifluoriet ik-kahappoa (1,5 ml). Seosta sekoitetaan kylmässä hauteessa puolen tunnin ajan. Sitten seos poistetaan jäähauteesta ja sitä sekoitetaan ympäristön lämpötilassa jälleen 1 tunnin 15 minuutin ajan. Sen jälkeen, kun seos on haihdutettu typpivirralla, se laitetaan pakastimeen koko yöksi. Jäännös ositetaan 4-pro-senttisen NaHCO^/jää-seoksen (noin 10 ml) ja EtOAc:n (20 ml) välille. Kerrokset erotetaan ja vesikerros uutetaan EtOAcrllä, orgaaniset kerrokset yhdistetään ja kuivataan, jolloin saadaan 0,176 g tuotetta.

.Vaihe III (2) Välittömästi edellä esitetyssä vaiheessa III (1) saatu tuote (0,176 g, 0,000191 mol) liuotetaan Cl^C^tiin (5 ml), joka . 1 sisältää edellä valmistettua, kaavan XXV mukaista, nyt reagoi- ;· vana aineena toimivaa tuotetta (0,055 g, 0,00021 mol). Liuos jäähdytetään jäähauteessa, ja siihen lisätään noin viiden minuutin aikana (2 ml) valmistettu disykloheksyyli- : '·: karbodi-imidin (0,047 g, 0,00023 mol) liuos. Seosta sekoite- : : · taan kylmässä hauteessa 15 minuutin ajan, jonka jälkeen se poistetaan jäähauteesta. Sekoittamista jatketaan ympäristön lämpötilassa yön yli. Pullon reunoille kerääntyy kumimainen kalvo. TLC:llä todetaan pääasiallisesti lähtömateriaalia, joka 76 B8400 on tunnistettavissa edellä olevan vaiheen III (1) tuotteeksi. Seokseen lisätään jälleen CF^C^ria (5 ml). TLC-määrityksellä todetaan yhä jonkin verran lähtömateriaalia, mutta siinä nähdään myös uutta tuotetta. Tapauksessa VIII esitettyä reagoivaa lisäainetta (0,011 g) lisätään ja samoin lisätään edellä esitetysti ylimääräistä disykloheksyylikarbodi-imidiä (0,009 g). Seosta sekoitetaan neljä tuntia huoneen lämpötilassa. TLC-määrityk-sellä todetaan edelleen jonkin verran lähtömateriaalia, kuten edellä. Kumimaista saostumaa on edelleen läsnä. Seokseen lisätään edelleen CH^C^^ia, mutta suodattaminen epäonnistuu. Seos liuotetaan trikloorimetaaniin (noin 100 ml), ja haihdutetaan. Jäännös lisätään noin 100 millilitraan EtOAcrtä, pestään kylmällä 4-prosenttisella NaHCO^lla (8 ml) ja kuivataan Na^SO^tllä. Haihduttamisella ja 1-prosenttisen NH^OHrn ja 5-prosenttisen MeOH:n seoksella CHCl^ssa toteutetulla kromatografiällä sili-kageeliä käyttäen saadaan tuotetta (0,081 g ja 0,043 g), jonka MS /m. + h7+ : todettu: 1053, laskettu 1053, mikä on yhtäpitävä tapauksen VIII vaiheessa III saatuna tuotteena esitetyn yhdisteen kanssa.

Vaihe IV

Kaavan XX mukainen yhdiste, jossa R ja R^ ovat isopropyyli Yhdiste (0,08 g), joka on välittömästi edellä esitetyssä vaiheessa III valmistettua tuotetta ja joka esitetään tapauksena VIT, lisätään dimetyylitormamidi in (2 ml). Sitten tähän liuokseen lisätään 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBT; 0,032 g) ja seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 24 tuntia. Jäljellä oleva lähtömateriaali tuottaa TLC-määrityksessä ainoastaan heikon täplän, mutta levyllä nähdään hyvä "tuote". Seos haihdutetaan typpi virralla neljän tunnin aikana. Jäännökseen lisätään EtOAc:tä (25 ml) ja jääkylmää laimeata NaHCO^ria (4 ml). Vesikerros poistetaan ja orgaaninen kerros uutetaan jälleen laimean NaHCC>3:n uudella annoksella (4 ml), sitten veden ja jään seoksella ja lopuksi suolaliuoksella. Orgaaninen kerros kuivataan Na2SO^:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan kaavan XX^, missä R ja R^ ovat isopropyyli, mukaista tuotetta. Tuote hierotaan EtOAc:hen, jolloin puhdasta tuotetta saadaan kumimaisen kiinteänä aineena 0,055 g, joka puhdistetaan edelleen kromatografisesti silikageeliä käyttäen.

77 88400

Edellä esitetty vaihe IV toistetaan käyttäen liuottimena THF/ DMF-seosta (6 ml/3 ml). Molempien vaiheiden IV reaktiot tuottivat toivottua, kaavan XX^ mukaista tuotetta. TLC-, HPLC-ja MS-määritykset ovat yhtäpitävät tämän kaavan kanssa.

MS /m. + H7+ laskettu: 898. Todettu: 899; ja /m. + K/+ laskettu: 937,5681. Todettu: 937,5660.

C44. Esimerkki VIII

Yhdiste, jolla on kaava XX,-, missä R ja ovat isopropyyli;

Katso tapaus IX; Vaihe I_____

Etanolissa (25 ml) olevaan, edellä esitetyssä esimerkissä IA valmistetun N-/T2S,4S,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-b-isoleusiinin bentsyyliesterin (0,5 g, 0,77 mol) sekoitettuun liuokseen lisätään Pd/C-katalyyttiä typpi-ilma-kehässä. Tämä esteri hydrataan ilmakehän kanssa yhteydessä olevassa hydrauslaitteistossa (Pi = 52 arvolla 1:35 mm), kunnes Pf on 44 arvolla 2:25 mm. Katalyytti erotetaan suodattamalla ja suodos haihdutetaan vakuumissa, sekoitetaan etanoliin, ja suodatetaan tämän jälkeen piimaakiekon läpi. Tämä seos haihdutetaan jälleen, jolloin saadaan 0,41 g happoa, N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidimetyy-lisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-l-okso-oktyyli7-L-iso-leusiinia.

5-prosenttisella MeOH/Ci^C^-seoksella toteutetun TLC-määrityk-sen ja NMR-määrityksen tulokset ovat yhtäpitävät saadun, toivo-. . . tun tuotteen kaavan kanssa.

Vaihe II

Cf^Cl^een valmistettuun seokseen, joka on jäähdytetty (jää-•propanolihauteessa) 0-10°C:n lämpötilaan, ja joka käsittää happoa, eli välittömästi edellä vaiheessa I valmistettua ·: N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyliamino)-4-(t-butyylidi- metyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-1-okso-oktyyli 7-L-isoleusiinia (0,056 g, 0,1 mmol), 1-fenyylialaniini-metyyli-esterin hydrokloridia (0,0215 g, 0,1 mmol), 1-hydroksibentso- r 78 88400 triatsolia (HOBT; 0,017 g, 0,13 mmol), N-metyylimorfoliinia (0,011 ml, 0,11 mmol), lisätään l-etyyli-3-(3-dimetyyliamino-propyyli)karbodi-imidin hydrokloridia (0,022 g, 0,12 mmol). Seosta sekoitetaan kylmässä hauteessa neljä tuntia, sitten sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan ja sitä sekoitetaan edelleen puolentoista tunnin ajan. Seosnäyte haihdutetaan typpi-ilmakehässä, ja uutetaan tämän jälkeen EtOAc:stä jääkylmällä NaHCO^rlla ja jäillä, kylmällä 10-prosenttisella sitruunahapolla ja sitten jäävedellä, ja siitä tehdään TLC-analyysi, jolla todetaan "tuotteen" läsnäolo, ja kun liikkuvana faasina käytetään 0,5-prosenttisen HOAc:n ja 5-prosenttisen MeOH:n seosta CH2Cl2:ssa, niin todetaan, ettei läsnä ole lainkaan lähtöaineena toiminutta isoleusiinia. Täten reaktioseos haihdutetaan typpivirralla. Uuttamista varten kumimaisen saostuman sisältävään jäännökseen lisätään 5 ml EtOAc:tä, ja uuttaminen toteututetaan lisäämällä seokseen 1 ml kylläistä NaHC03:ia ja 1 ml jää-vesi-seosta, jolloin saadaan kaksi kirkasta kerrosta. Vesikerros poistetaan ja orgaaninen kerros pestään 1 millilitralla 10-prosenttista sitruunahappoa ja 1 millilitralla jää-vesi-seosta, ja tämän jälkeen seos pestään jälleen 1 millilitralla kylläistä NaHCO^-liuosta ja 1 milli-litralla jää-vesi-seosta ja lopuksi 1 millilitralla jäävettä ja sitten suolaliuoksella. Pesussa käytetyt vesiliuokset yhdistetään ja uutetaan etyyliasetaatilla (noin 3 ml), mutta siitä ei löydetä lainkaan tuotetta. Täten tuloksena oleva materiaali kuivataan MgS04:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan 0,04 g tapauksessa IX esitetyn vaiheen II tuotetta.

Tämän tuotteen NMR on yhtäpitävä sen yhdisteen kanssa, jonka yhdisteen kaava on tapauksen IX vaiheessa II saadun tuotteen mukainen.

Vaihe II toistetaan seuraavia reagenssimääriä käyttäen: 0,30 g, 0,537 mmol happoa, N-/T2S,4R,5S)-5-(t-butoksikarbonyyli-amino)-4-(t-butyylidimetyylisilyloksi)-2-isopropyyli-7-metyyli-1-okso-oktyyli7-L-isoleusiinia; 0,115 g, 0,533 mmol L-fenyylialaniini-metyyliesterin hydrokloridia; 0,064 g, 0,64 mmol N-metyylimorfoliinia; 79 8 8 400 0,09 g, 1,67 mmol hydroksibentsotriatsolia; ja 0,123 g, 0,64 mmol etyyli-dimetyyliamino-propyyli-karbodi- imidiä.

Tuotteen (0,43 g) NMR-spektri on jälleen yhtäpitävä tapauksen IX vaiheessa II saatuna tuotteena esitetyn yhdisteen NMR-spek-trin kanssa.

Vaihe III

Metyleenikloridissa (0,3 ml) ja typpi-ilmakehässä oleva tuote (0,072 g, 0,1 mmol), jonka kaava on tapauksen IX vaiheessa II saadun tuotteen mukainen, jäähdytetään jäähauteessa. Siihen lisätään pisaroittain trifluorietikkahappoa (0,3 ml). Reaktio-seosta sekoitetaan sen lämmetessä huoneen lämpötilaan, ja sitten sitä sekoitetaan ympäristön lämpötilassa yhteensä noin kaksi tuntia. Tuloksena oleva seos haihdutetaan typpivirralla ja se laitetaan pakastimeen koko yöksi. TLC vaikuttaa olevan yhtäpitävä toivotun tuotteen kanssa, jossa tuotteessa toisin sanoen ei enää ole suojaavaa BOC-ryhmää, mutta jossa ilmeisesti vielä on läsnä TBDMS-ryhmä. Tähän lisätään noin 10 ml etyyliasetaattia ja sitten se pestään kahdesti 1 millilitralla 5-prosenttis-ta NaHCO^/jää-seosta, sitten kertaalleen suolaliuoksella. (Etyyliasetaattia käytetään erotussuppilon pesemiseen, joten etyyliasetaattia on lopulta läsnä 20 ml). Tuloksena oleva -· materiaali kuivataan MgSC>4:llä ja haihdutetaan, jolloin tuotet- ta saadaan 50 mg, ja sitä kuivataan edelleen typpivirralla, jonka jälkeen se edelleen sisältää noin 50 mg tuotetta, joka '* on tapauksen IX vaiheessa III valmistettua yhdistettä.

Vaihe III toistetaan käyttämällä seuraavia reagenssimääriä: 0,35 g yhdistettä, jonka kaava on tapauksen IX vaiheessa II saadun tuotteen mukainen; ; 1,5 ml metyleenikloridia; ja 1,5 ml trifluorietikkahappoa.

Tuotteen (0,28 g) NMR-spektri oli yhtäpitävä tapauksen IX vaiheessa III saatuna tuotteena esitetyn kaavan kanssa.

80 8 8 400

Vaihe IV

Ch^Cl^ssa (2 ml) ja typpi-ilmakehässä olevaa, vaiheen III tuotteena esitetyn kaavan mukaista yhdistettä, jota valmistettiin välittömästi edellä olevassa vaiheessa II lähtien 72 milligrammasta yhdistettä, jäähdytetään jäähauteessa. Suojattua histidiiniä lisätään pisaroittain Cf^C^reen valmistettuun disykloheksyyli-karbodi-imidin (20 mg) liuokseen. Reaktioseosta sekoitetaan kylmässä hauteessa 15 minuutin ajan. Muodostuu sakkaa. Sekoittamista jatketaan huoneen lämpötilassa puolen tunnin ajan. Reaktioseos laitetaan pakastimeen koko yöksi. Sen jälkeen, kun tämän seoksen on annettu lämmetä huoneen lämpötilaan, sitä sekoitetaan edelleen puoli tuntia. 5-prosenttisella MeOH/CH^Cl^-seoksella; 0,5-prosent-tisella HOAcrllä, 5-prosenttisella MeOH/Cf^C^-seoksella toteutetuilla TLC-määrityksillä todetaan, ettei tapauksen IX vaiheessa III tuotteena esitetyn kaavan mukaista yhdistettä ole läsnä, ja ettei jäljellä ole lainkaan suojattua histidiiniä. Sen jälkeen, kun liuos on jälleen jäähdytetty, saostuma erotetaan suodattamalla ja saostuma pestään kylmällä Cfr^C^illa. Suodos haihdutetaan, jonka jälkeen lisätään 3-4 ml etyyliasetaattia, sitten seos jäähdytetään ja hieno saostuma suodatetaan. Suodos haihdutetaan vakuumissa ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimi-seen 1-prosenttista MeOH/Ct^C^-seosta, jolloin saadaan 0,036 g tuotetta.

NMR on yhtäpitävä tapauksen IX vaiheessa IV tuotetun tuotteen kaavan kanssa.

Vaihe IV toistetaan seuraavia reagenssimääriä käyttäen: 0,28 g, 0,00039 mol vaiheessa III valmistettua, kaavan XXIX2 mukaista yhdistettä 3 millilitrassa kuivaa 0,076 g, 0,00041 mol etyyli-dietyyliamino-propyyli-karbodi-imidin hydrokloridia; ja 0,165 g, 0,00041 mol suojattua histidiiniä.

Saadaan 420 mg toivottua, kaavan XXIX^ mukaista yhdistettä.

81 88400

Sen seuraava MS-analyysi on yhtäpitävä tapauksen IX vaiheessa III saadun yhdisteen kaavan kanssa.

Rotaatio a = -40° ja MS: /M+h7+ 1011, laskettu: 1011.

Vaihe V (1)

Yhdiste (0,23 g, 0,228 mmol), jonka kaava on tapauksen IX vaiheessa IV saadun tuotteen mukainen, ja joka on sekoitettu CF^C^iiin (1,25 ml) jäähdytetään jäähauteessa. Tähän liuokseen lisätään pisaroittain trifluorietikkahappoa (1,25 ml), ja liuosta sekoitetaan puoli tuntia, jonka jälkeen se poistetaan jäähauteesta. Sen jälkeen, kun reaktioseoksen on annettu seistä 45 minuuttia ympäristön lämpötilassa, se haihdutetaan typpivirralla ja pestään kahdesti 4-prosenttisella NaHCO^/-jää-seoksella (5 ml), ja sitten kerran suolaliuoksella. Vesi-kerrokset yhdistetään ja uutetaan noin 25 millilitralla etyyliasetaattia. Etyyliasetaattikerros pestään suolaliuoksella ja yhdistetään ensimmäiseen etyyliasetaattiliuokseen, joka kuivataan MgSO^:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan seuraavassa reaktiovaiheessa V (2) käytettävää tuotetta (0,175 g).

Vaiheet V (2) ja (3) CH^Cl^^sa (5 ml) oleva vaiheen V (1) tuote, johon lisätään suojattua L-fenyylialaniinia (0,052 g, 0,211 mmol), jäähdy-tetään jäähauteessa. Reaktioseokseen lisätään annoksittain : minuutin aikana etyylidietyyliaminopropyylikarbodi-imidin hydrokloridia, ja seosta sekoitetaan kylmässä hauteessa 40 minuuttia. Seoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan, ; ja sekoittamista jatketaan kahden ja puolen tunnin ajan.

- . TLC-määritys osoittaa, että jäljellä on ainoastaan hieman suojattua L-fenyylialaniinia, mutta lähtöaineena toimivaa, edellä esitetyn vaiheen V (1) tuotteena olevaa yhdistettä vaikuttaa edelleen olevan jäljellä suuria määriä. Sen jälkeen, ' kun seosta on edelleen sekoitettu huoneen lämpötilassa kaksi tuntia, lähtöainetta on edelleen TLC:n perusteella läsnä pal- ____: jon. Reaktioseos jäähdytetään uudestaan ja siihen lisätään jälleen ekvivalenttimäärä suojattua L-fenyylialaniinia ja sa- 82 8 8 4 0 0 moin jälleen ekvivalenttimäärä etyylidietyyliaminopropyylikarbo-di-imidin hydrokloridia, ja seosta sekoitetaan kylmässä hauteessa 15 minuuttia. Sen jälkeen, kun seos on ollut jääkaapissa koko yön, sen annetaan lämmetä huoneen lämpötilassa jälleen puolen tunnin ajan. Nyt TLC-määrityksessä todetaan hyvin vähän lähtö-materiaalia. Edelleen kahden tunnin kuluttua lähtöainetta ei ole enää jäljellä.

Reaktioseos haihdutetaan vakuumissa lämmittämättä. Jäännös lisätään etyyliasetaattiin (50 ml), jäähdytetään jäähauteessa, pestään 4-prosenttisen NaHCO^rn (10 ml) ja jääveden seoksella, sitten 5-prosenttisella sitruunahappo/jäävesiseoksella (10 ml), sitten jäävedellä (5 ml) ja lopuksi suolaliuoksella (5 ml). Materiaali kuivataan MgSO^rllä ja haihdutetaan, jolloin saadaan 0,21 g tuotetta. Edellä suoritetussa pesussa käytetyt vesiker-rokset yhdistetään, uutetaan etyyliasetaatilla (noin 35 ml), kuivataan MgS0^:llä, mutta tuotetta saadaan ainoastaan hyvin vähän. Materiaali puhdistetaan kromatografisesti silikageelil-lä (50 ml), käyttäen eluoimiseen MeOH/CH^Cl^-seosta, jonka MeOH- pitoisuus vaihtelee 3 prosentista lo prosenttiin.

__ — _+ MS /M + H7 1042; /m. + K/ 1080.5204.

MS on yhtäpitävä tapauksen IX vaiheessa V tuotteena esitetyn yhdisteen kanssa.

Vaihe VI

Yhdiste, jonka kaava on tapauksen IX vaiheessa V saadun tuotteen kaavan mukainen, ja jota käsitellään välittömästi edellä esitetyn vaiheen V, tapaus IX, mukaisesti valmistetun TBDMS-ryhmän poistamiseksi, (0,05 g, 0,0001 mol) liuotetaan THF:ään. Tähän liuokseen lisätään HOBT:tä (0,04 g, 0,0003 mol) ja tuloksena olevaa reaktioseosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa. Viiden tunnin kuluttua seos haihdutetaan typpivirralla ja jäännös laitetaan 10-prosenttiseen MeOH/Ct^C^-seokseen 5-prosenttisella MeOH/CH2Cl2-seoksella toteutettavaa TLC-määritystä varten, jolla määrityksellä nähdään, että välittömästi edellä olevan vaiheen V

83 88400 mukaisesti valmistettua lähtöyhdistettä on yhä läsnä. Reaktio-seosta sekoitetaan yön yli. Siihen muodostuu jonkin verran sakkaa. Toistettu TLC-määritys osoittaa edelleen lähtöyhdisteen läsnäolon. Sekoittamista jatketaan huoneen lämpötilassa. 10-prosenttisessa MeOH/CH2Cl2-seoksessa olevalla näytteellä toteutettu toinen TLC-määritys 10-prosenttista Me0H/CH2Cl2~seosta käyttäen osoittaa edelleen lähtöyhdisteen läsnäolon. Seokseen lisätään edelleen HOBT:tä (0,02 g) 1 millilitrassa THF:ää ja sitä sekoitetaan jälleen yön yli. Aikaisempien määritysten mukaisesti toteutetulla TLCrllä ei todeta lähtoyhdistettä.

Seos haihdutetaan nyt typpivirralla. Jäännös ositetaan kylmän etyyliasetaatin (noin 50 ml) ja kylmän 4-prosenttisen NaHCO^-.n (10 ml) välille. Yhdistetyt vesikerrokset uutetaan kahdesti 25 millilitralla etyyliasetaattia ja yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestään noin 10 millilitralla suolaliuosta, kuivataan Na2S0^:llä ja haihdutetaan, jolloin saadaan noin 110 mg yhdistettä, jolla on tapauksessa IX esitetty kaava XX^. Puhdistaminen kroma-tografisesti silikageelillä ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittäminen MS-analyysillä on yhtäpitävää kaavan XX^ mukaisen toivotun yhdisteen kanssa. MS /m. + H/ + 888.

Tämän keksinnön ja kaavan XX mukainen yhdiste voidaan syntetisoida US-patenttijulkaisussa 4 424 207 esitetyn synteesitavan mukai-* « ..*· sesti hartsia käyttämällä, jolloin helpotetaan peptidisidoksen t [ ’ isosteeristä korvautumista, ja tätä yhdistettä voidaan käyttää : : reniiniä inhiboivana peptidinä. Näin ollen seuraavatkin esi- merkit, sisällytetään tähän julkaisuun.

Yleisesti ottaen synteesitoimenpiteet hartsia käyttäen käsittävät . - seuraavat vaiheet: \ Optinen kiertyminen mitataan Perkin Elmer-polarimetrillä, malli f*: 243. Kiinteänä faasina tapahtuva synteesi toteutetaan automaat- tisella kiinteän faasin peptidisynteesin syntetisaattorilla Syn Thor 1000. HPLC-määritykset toteutetaan Beckman-kromato- m*4* 84 88400 grafilla, jossa on Beckman:in kahdella aallonpituudella toimiva ilmaisin, malli 165. Määrityksissä käytetään aallonpituuksia 220, 254 ja 280 nm, ja ne toteutetaan eluentin, joka on 0,1 % CF-CO H:ta sisältävää H?0-CH,CN-seosta, virtausnopeudella 1,5 ml/ 3 2 ά s min lineaarista gradienttia käyttäen, jossa gradientissa CH^CNrn pitoisuutta nostetaan, ja käyttäen kolonnina synchropak RP-P-kolonnia, 4 x 250 mm, täyte 5,1 ^u. Aminohappoanalyysit toteutetaan Dionex D-500-aminohappoanalysaattorilla, mitä seuraa hydrolyysi 6 M HCl:ssä, josta kaasut on poistettu, llO°C:n lämpötilassa 24 tunnin ajan vakuumissa. ohutkerroskromatografiän (TLC) näytteet, 50-80 ^ug, laitetaan valmiiksi pinnoitetuille silikageelilevyille, 60 F-254-geeliä (Merck). Levyt kehitetään 10-12 cm:n matkalta seuraavilla liuotinjärjestelmillä: A. BuOH-HOAc-H^O-Py (15:3:12:10); B. BuOH-HOAc-H20 (4:1:1); C. CHCl3-MeOH-HOAc-H20 (10:10:1:10).

C45. Esimerkki IX

Boc-Phe-His-Leu Ψ(ΟΗΟΗ-ΟΗ2)Val-Ile-Phe-NH2 Να-tert-butyylioksikarbonyyli-fenyylialaniinia (0,52 g, 2 mmol), 5 millilitrassa DMF:ää olevaa hydroksibentsyylitriatsolia (HOBT; 0,24 g, 2 mmol) ja 5 millilitrassa CH2Cl2:ia olevaa di-sykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC, 0,4 g, 2 mmol) lisätään 0,6 grammaan p-metyylibentshydryyliaminihartsia (polystyreeni, 0,1 % divinyylibentseeniä; ristisidoksinen), joka oli aikaisemmin : neutraloitu CH2Cl2:ssa (3 x 20 ml) olevalla 10-prosenttisella

Et3N:lla. Tätä seosta ravistellaan mekaanisesti niin kauan, että ninhydriinikoe osoittaa reaktion päättymisen (substitutio 0,52 mmol/g). Kaikki reagoimattomat kohdat peitetään asetyloin-nilla, käyttäen 20 ml 0,2 M asetanhydridin ja CH2Cl2:n seosta, 4-dimetyyliaminopyridiinin katalyyttisten määrien (0,5 g) läsnäollessa ja 30 minuuttia sekoittaen. Aminohapot Boc-Ile,

Boc-Leu ψ(CHOH-CH^)Vai, ja Boc-Phe kytketään edellä esitetyllä tavalla, mutta käyttäen kuitenkin kutakin reagenssia 1 mmol, ’ ja tällöin noudatetaan taulukkoa I ja kussakin vaiheessa käyte- tyn liuottimen tilavuus on 20 ml. Aminohapon Boc-His(Tos) kytkeminen vaatii aktivointia Le BOP:illa. Synteesin päättymisen 85 88400 jälkeen hartsi kuivataan vakuumissa; hartsin paino on kohonnut 0,48 g (94 %). Koko hartsi käsitellään HF-anisoliseoksella (10:1) 1,0 tunnin ajan 0°C:n lämpötilassa. Haihduttamisen jälkeen jäännös pestään Et20:lla, uutetaan CH3C02H:lla (2 x 10 ml) ja suodatetaan. Suodos haihdutetaan, jäännös liuotetaan 5-prosenttiseen HOAc/H^O-seokseen ja lyofilisoidaan, jolloin tuloksena on 345 mg raakamateriaalia. Tämä materiaali liuotetaan 10 millilitraan 50-prosenttista HOAc/H20-seosta ja kaadetaan 2 x 96 cm:n Sephadex G-15-kolonniin, joka oli tasapainotettu 50-prosenttisella HOAc:n vesiliuoksella. Kolonnia eluoitiin 50-prosenttisella HOAc-liuoksella ja eluaatti kerättiin 5,2 millilitran fraktioiksi. Peptidimateriaali ilmaistiin siten, että eluaattia seurattiin aallonpituudella 280 nm, ja suurimmat piikit tuottavat fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin 20 millilitraksi, laimennettiin H20:lla (60 ml) ja lyofilisoitiin jolloin saatiin 209 mg. Tämä puhdistetaan edelleen liuottamalla se 50-prosenttiseen CH3CN-H20-seokseen (0,1% TFA) ja kaatamalla se 2,5 x 110 cm:n VYDAC-Cl8-kolonniin, täyte 30^u, joka oli tasapainoitettu H O/CH^CN-seoksella 70:30 (0,1% TFA). Kolon-nia eluoitiin virtausnopeudella 4,5 ml/minuutissa alkaen 30-prosenttisella CH3CN:llä ja päättyen kahdeksan tunnin kuluttua liuotinjärjestelmään, joka sisälsi 60% CH3CN:iä (0,1% TFA). Eluaattia seurataan aallonpituudella 206 nm ja siitä kerätään 20 millilitran fraktioita. Suurimman piikin tuottavat frak-·;;; tiot yhdistetään, CH3CN haihdutetaan ja laimennetaan H20/- '···' HOAc-seoksella (10:1) ja lyof ilisoidaan, jolloin saadaan 120 mg puhdasta materiaalia (Phe-His-Leuf(CHOH-CH2 ) Val-Ile-Phe-NH2 ) .

; Synchropak RP-P-kolonnilla, ulottuvuksiltaan 4,6 x 250 mm, ja • : : 0,1% TFA:ta sisältävällä H^-CH^CN-seoksella toteutetussa : HPLC-määrityksessä, eluentin virtausnopeudella 1,5 ml/min ja CH3CN:n pitoisuuden kasvaessa lineaarisesti 15 minuutin aikana : 30 prosentista 60 prosenttiin, saatiin ainoastaan yksi piikki.

Yhden täplän TLC:R^ (A) 0,31, R^ (B) 0,45. Aminohappoanalyysi: Phe, 2,0; His, 0,97; Ile, 1,01.

30 mg peptidiä Phe-His-Leuf(CHOH-CH2)Val-Ile-Phe-NH2 liuotetaan . 5 millilitraan H2o:ta ja 3 millilitraan DMF:ää. Tämän liuoksen 86 88400 pH asetetaan arvoon 7,5 lisäämällä siihen 0,1 N NaOH:ta, ja sitten siihen lisätään yhdistettä (Boc)20 (0,1 g), ja sekoitetaan kolme tuntia pitäen pH:n arvossa 7,5. (Boc)20-ylimää- rä uutetaan heksaanilla ja vesikerros tehdään happamaksi, pH-arvoon 2,5, lisäämällä 0,1 N HCl:ia. Tämä liuos lyofilisoi-daan ja puhdistetaan HPLC:llä edellä esitetysti, paitsi että kolonnia eluoidaan virtausnopeudella 4,5 ml/min alkaen 50-pro-senttia CH^CNiia sisältävällä liuotinjärjestelmällä ja päättyen kahdeksan tunnin kuluttua järjestelmään, joka sisältää 85% CH^CNiia (0,1% TFA). HPLC-analyysissä saatiin yksi piikki.

Yhden täplän TLC: R^ (A) 0,41, R^ (B) 0,48. Aminohappoanalyysi: Phe, 1,99; His, 1; Ile, 0,98. Massaspektri on yhtäpitävä edellä mainitun yhdisteen Boc-Phe-His-Leu4' (CHOH-CH2 ) Val-Ile-Phe-NH2 kanssa.

Taulukko I

Tavanomaiset, kiinteänä faasina tapahtuvan synteesin toimenpiteet

Pysäytys Reagenssi Toisto Aika (minuuttia) 1 CH2C12 5 0,8 2 CF3<X>2H/CH2C12( 1:1)2% anisoli 2 5,0;25,0 3 CH2C12 4 0,8 4 DIPEA/CH2C12 3 4,0 5 CH2C12 3 0,8 6 DMF 2 0,8 7a Boc-aminohappo/HOBT DMF:ssä 1 90,0 7B DCC CH2Cl2:ssa 1 8 DMF 2 0,8 9 CH2C12 2 0,8 10 EtOH 2 2,0

C46. Esimerkki X

Tba-Phe-His-Leu4'(CHOH-CH2)Val-Ile-Phe-NH2 Tämä peptidi valmistettiin kahdella eri menetelmällä. Molemmilla menetelmillä saatiin identtiset tuotteet.

87 88400

Menetelmä A

30 mg puhdistettua peptidiä Phe-His-Leu^CHOH-CH2)Val-Ile-Phe-NH2 liuotetaan DMF:ään ja pH asetetaan arvoon 7,5. Kumpaakin t-butyylietikkahappoa HOBT ja DCC lisätään yksi ekvivalentti ja sekoitetaan. Reaktiota seurataan HPLC-määrityksin (Synchro-pak RP-P-kolonnin, mitat 4,6 x 250 mm, virtausnopeus 1,5 ml/ min liuotinjärjestelmällä H20-CH3CN, joka sisältää 0,1% TFA:ta ja käyttäen gradienttina CH^CN:n pitoisuutta 40 prosentista 80 prosentiin 20 minuutin aikana) ja sitä pidetään loppuun kuluneena, kun lähtöaineena toiminutta pentapeptidiä ei enää voida todeta. Tämä seos tehdään happamaksi, suodatetaan ja haihdutetaan pyöröhaihduttimella. Tämä jäännös kaadetaan 2,2 x 30 cm:n VYDAC-C^g (30^,u) kolonniin, joka on tasapainotettu h2o/ CHgCN-seoksella 35:65 (0,1% TFA). Kolonnia eluoidaan virtausnopeudella 4,5 ml/min alkaen 65-prosenttisella CH^CNrllä ja päättyen viiden tunnin kuluttua 85-prosenttiseen CH^CNrään (0,1% TFA). Eluaatista kerätään 8 ml:n fraktioita ja suurimman piikin antavat fraktiot yhdistetään, CH^CN haihdutetaan ja vesiliuos laimennetaan H20/HOAc-seoksella (10:1) ja lyofili-soidaan; saanto 15 mg. Synchropak RP-P-kolonnilla ja edellä kuvatulla menetelmällä toteutetussa HPLC-määrityksessä saatiin yksi piikki. Yhden täplän TLC-määritys R^ (A) 0,48, Rf (B) 0,64. Aminohappoanalyysi: Phe 1,98, His 1,0; Ile 1,0. Mas- saspektri oli yhtäpitävä edellä mainitun yhdisteen kanssa.

Menetelmä B

. Otsikon mukaista yhdistettä voidaan myös valmistaa siten, että ; H-Phe-His-LeulMCHOH-CH^Val-lle-Phe-NH-hartsiin (0,8 g, P- metyylibentshydryyliamiinihartsia) lisätään t-butyylietikka-happoa (0,22 g, 2 mmol) ja disykloheksyylikarbodi-imidiä (0,2 g, 1 mmol), kuten taulukossa I esitetään. Kun tämä on suoritettu hartsi kuivataan vakuumissa, koko panosta käsitellään 45 minuu-*. " tin ajan 0°C:n lämpötilassa 10 millilitralla HF-anisoli-seosta : (10:1). Haihduttamisen jälkeen jäännös pestään Et20:lla, uute- —: taan CF^CO^H^la (2 x 10 ml) ja suodatetaan. Suodos haihdute taan, jäännös liuotetaan 15-prosenttiseen HOAc/H20-seokseen ja . lyofilisoidaan, jolloin raakatuotetta saadaan 275 mg. Tämä materiaali liuotetaan 10 millilitraan 50-prosenttista HOAc/ 88 88 400 f^O-seosta ja kaadetaan 2 x 96 cm:n Sephadex G-15-kolonniin, joka on tasapainotettu 50-prosenttisella HOAc:n vesiliuoksella; kolonnia eluoidaan 50-prosenttisella HOAc:11a ja eluaatista kerätään 5,0 millilitran fraktioita. Peptidimateriaali ilmaistaan seuraamalla eluaattia aallonpituudella 280 nm ja suurimmat piikit tuottavat fraktiot yhdistetään, haihdutetaan 20 millilitraksi, laimennetaan H20:lla (60 ml) ja lyofilisoidaan, jolloin saadaan 115 g. Tämä puhdistetaan edelleen liuottamalla se 60-prosenttiseen CH3CN-H20-seokseen (0,1% ja kaatamalla tämä liuos 2,5 x 110 cm:n VYDAC-C^g-kolonniin, joka on tasapainotettu H20-CH^CN-seoksella 40:60 (0,1% TFA). Kolonnia eluoidaan virtausnopeudella 3,0 ml/min aloittaen 40-prosent-tisella CHgCN:llä ja päättäen 16 tunnin kuluttua liuotinjär-jestelmään, joka sisältää 85% CH3CN:ia (0,1% TFA). Eluaattia seurataan aallonpituudella 206 nm ja siitä kerätään 20 milli-litran fraktioita. Suurimman piikin tuottavat fraktiot yhdistetään, CH^CN haihdutetaan ja jäännös laimennetaan H2O/HOAC-seoksella (10:1) ja lyofilisoidaan, jolloin puhdasta materiaalia saadaan 63 mg. Synchropak RP-P-kolonnilla ja edellä kuvatulla menetelmällä toteutetulla HPLC-analyysillä saatiin yksi piikki, joka oli identtinen meentelmällä A valmistetun tuotteen kanssa. Aminohappo- ja TLC-analyysien tulokset osoittavat, että molemmilla menetelmillä syntyy samaa tuotetta.

Esimerkkejä ohessa julkaistavista reaktiovaiheista kaavan XX^ mukaisten yhdisteiden valmistamiseksi esitetään seuraavassa.

C47. Valmistus XX^qI Boc-Ile-Phe-OCH^

Boc-Ile + Phe-OCHj —> Boc-Ile-Phe-OCH^ 2,80 g (13,0 mmol) Phe-OCH^.HC1:ia lisätään 1,34 grammaan (13,2 mmol) Et^hkia ja 100 millilitraan CH2Cl2iia· Tähän lisätään 3,00 g (13,0 mmol) Boc-Ile:ia, 1,98 g (13,0 mmol) l-HOBT:ia ja lopuksi 2,68 g (13,0 mmol) DCC:ia. Sen jälkeen, kun tätä seosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 1 tunnin 40 minuutin ajan, DCU suodatetaan pois. Suodos uutetaan NaHC03:n vesi-liuoksella, 1 M sitruunahapolla ja jälleen NaHCC>3:n vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2SO^:n läpi ja liuotin poistetaan vakuumissa. Raakatuote kromatografoidaan sili- 89 88400 kageelillä käyttäen eluoimiseen EtOAc/heksaaniseosta 20 prosentista 40 prosenttiin kasvavana gradienttina. Tuote, Boc-Ile-Phe-OCH3, kiteytetään EtOAc-heksaaniseoksesta, jolloin saadaan 4,31 g (85%) tuotetta, jonka sulamispiste on 121- 12 2°c.

Analyysi, joka on laskettu yhdisteelle C21H32N2°5: C' 64-26' H, 8,22; N, 7,14. Todettu: C, 64,27; H, 8,32; N, 7,14.

C48. Valmistus XX1QII Boc-Sta-Ile-Phe-OCH3

Boc-Ile-Phe-OCH3 -> Boc-Sta-Ile-Phe-OCH3

Edellä esitetyssä valmistuksessa XX^qI saatua peptidiä Boc-Ile-Phe-OCH3 (0,713 g, 1,82 mmol) sekoitetaan huoneen lämpötilassa 10 millilitrassa TFA-Cf^C^-seosta (1:1 v/v) 30 minuuttia, jonka jälkeen TFA ja poistetaan vakuumissa ja jäännös uutetaan CH Chiliä ja NaHC03:n vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset (kokonaistilavuudeltaan noin 50 ml) suodatetaan Na2S04:n läpi pulloon, joka sisältää 0,500 g (1,82 mmol) Boc-Sta:ia ja 0,292 g (1,91 mmol) l-HOBT:ia. Tämän jälkeen lisätään DCC:tä (0,393 g, I, 91 mmol). Kun seosta on sekoitettu tunnin ajan huoneen lämpötilassa, DCU suodatetaan pois ja suodos uutetaan NaHC03:n vesi-liuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2SO^:n läpi, haihdutetaan ja kaadetaan silikageelillä täytettyyn kolonniin.

\y Tuote eluoidaan 4% MeOH:ia ja 96% CF^C^Jia sisältävällä seok-sella, jolloin saadaan 0,97 g (97%) tuotetta, Boc-Sta-Ile-Phe-OCH3.

: Laskettu yhdisteelle C29H47N30?: C, 63,36; H, 8,62; N, 7,64.

Todettu: C, 63,81; H, 8,70; N, 7,52.

FAB-massaspektri: /M+HJ kohdassa m/z 550.

C49. Valmistus XX1Q III : Boc-His (Tos ) -Sta-Ile-Phe-OCH3 •r·: Boc-Sta-Ile-Phe-OCH3 -> Boc-His(Tos)-Sta-Ile-Phe-OCH3

Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^q III saatua peptidiä Boc-Sta-Ile-Phe-OCH3 (0,40 g, 0,728 mmol) sekoitetaan 6 millilit-’-·· rassa TFA-CH2Cl2-seosta (1:1 v/v) huoneen lämpötilassa 30 mi- 90 8 8 400 nuuttia. Liuotin poistetaan vakuumissa ja jäännös uutetaan CH^C^illa ja NaHCO^rn vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2S04:n läpi pulloon, joka sisältää 0,42 g (1,02 mmol) peptidiä Boc-His(Tos), liuos haihdutetaan noin 25 millilitran tilavuuteen ja siihen lisätään 0,21 g (1,02 mmol) DCC:tä. Tätä seosta sekoitetaan 40 minuuttia, sitten siihen lisätään 1 pisara HOAcrta ja DCU suodatetaan pois.

Suodos uutetaan NaHCO^rn vesiliuoksella, orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^SO^in läpi ja liuotin poistetaan vakuumissa. Raakötuote puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä täytetyllä kolonnilla ja tuote eluoidaan 4-prosenttisen MeOHrn ja 96-prosenttisen CF^C^rn seoksella, jolloin saadaan 0,566 g (92%) peptidiä Boc-His(Tos)-Sta-Ile-Phe-OCH^.

Rf (8% MeOH-91,8% CH2Cl2-0,2% NH4OH): 0,64.

FAB-massaspektri: /M+h7+ kohdassa m/z 841.

1H-NMR(CDC13) : δθ,73-0,94, m; 1,42, s; 2,43,s; 2,93, d; 3,10 d; 3,70, s; 6,03, d; 6,56, d; 6,75-6,95, m.

C50. Valmistus XX1QIV Boc-His-Sta-Ile-Phe-OCH^

Seosta, joka käsittää 0,206 g (0,245 mmol) edellä esitetyssä

Valmistuksessa XX^q III saatua peptidiä Boc-His(Tos)-Sta-Ile-

Phe-OCH^, 0,187 g (1,22 mmol) l-HOBT:tä ja 15 millilitraa THF:ää sekoitetaan yön yli huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen liuotin poistetaan vakuumissa ja jäännös uutetaan CHCl^rlla ja NaHCO^rn vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2S04:n läpi, haihdutetaan ja puhdistetaan kromatografisesti silikageelillä täytetyllä kolonnilla. Tuote eluoidaan kolonnista 8-prosent- tisen MeOHrn ja 91,9% CH2Cl2:n seoksella, joka sisältää 0,1% : NH4OH:ia, jolloin saadaan 0,149 g (89%) tuotetta Boc-His-Sta-

Ile-Phe-OCH^, R = 0,5 liuottimena 8% MeOH - 91,8% CH2C12- 0,2% NH OH.

' 4

C51. Valmistus XX V Boc-Ile-AMP

Boc-Ile + 2-(aminometyyli)pyridiini —> Boc-Ile-AMP Seosta, joka käsittää 3,15 g (13,6 mmol) Boc-Ile:ia, 2,08 g (13,6 mmol) l-H0BT:ia ja 1,34 g (12,3 mmol) 2-(aminometyyli)- 91 88400 pyridiiniä 150 millilitrassa CH2Cl2:ia, sekoitetaan 10 minuuttia. Tähän lisätään 2,81 g (13,6 mmol) DCC:tä ja sekoitetaan huoneen lämpötilassa 35 minuuttia, jonka jälkeen DCU suodatetaan pois. Suodos uutetaan NaHCO^:n vesiliuoksella, orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^O^zn läpi ja haihdutetaan. DCU suodatetaan uudestaan pois, jonka jälkeen raakatuote kromatografoi-daan silikageelillä, käyttäen eluoimiseen 4-prosenttista MeOH-Cf^C^-seosta, jolloin saadaan 3,94 g (100¾) tuotetta. Tuote Boc-Ile-AMP kiteytetään EtOAc-heksaani-seoksesta, jolloin ensimmäisenä eränä saadaan 2,28 g lämpötilassa 102-103,5°C sulavaa tuotetta. Myös toinen ja kolmas erä otetaan talteen, yhteensä 1,50 g.

Laskettu yhdisteelle C^7H27N3°3: C' 8,47; n( 13,07.

Todettu: C, 63,37; H, 8,55; N, 12,86.

C52. Valmistus XX1QVI Box-Sta-Ile-AMP

Boc-Ile-AMP -> Boc-Sta-Ile-AMP

1,60 g (4,98 mmol) edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^V saatua peptidiä Boc-Ile-AMP sekoitetaan 20 millilitrassa TFA-CH2C12~ seosta (1:1 v/v) huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. TFA-CH2C12-seos poistetaan vakuumissa ja jäännös uutetaan täydellisesti CH2Cl2:Ha ja NaHCO^n ja suolan vesiliuoksella. Orgaaniset ker-rokset suodatetaan Na2SO^:n läpi ja liuotin poistetaan vakuu-missä. Jäännökseen lisätään 30 millilitraa CH2Cl2:ia, sitten siihen lisätään 1,43 g (5,23 mmol) Boc-Sta:ia ja tämän jälkeen *··“ 1,08 g (5,23 mmol) DCC:tä. Seosta sekoitetaan huoneen lämpö- : tilassa yön yli, siihen lisätään 30 mg aminohappoa Boc-Sta ja ·.; 30 mg DCC:tä. Seosta sekoitetaan jälleen tunnin ajan, ja sit- : ten DCU suodatetaan pois. Suodos uutetaan vedellä, orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^SO^n läpi ja haihdutetaan vakuumissa. Raakatuote kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimi-seen ensin 4-prosenttista MeOH-CF^Cl^-seosta, ja sitten 6-pro-senttista MeOH-CH2Cl2-seosta, joka sisältää 0,2% NH^OH:ta, jolloin saadaan 2,16 g (91%) tuotetta Boc-Sta-Ile-AMP. Laskettu '·"· yhdisteelle C25H42N405: C' 62-73- H> 8,85; N, 11,71.

. Todettu: C, 62,37; H, 8,82; N, 11,71.

92 88400 FAB-massaspektri: /m+H7+ kohdassa m/z 479.

C53. Valmistus XX1QVII Boc-His(Tos)-Sta-Ile-AMP

Boc-Sta-Ile-AMP -> Boc-His(Tos)-Sta-Ile-AMP

Peptidiä Boc-Sta-Ile-AMP (0,73 g, 1,52 mmol) sekoitetaan 10 millilitrassa TFA-CH^Cl -seosta (1:1 v/v) huoneen lämpötilassa b i.

30 minuuttia, jonka jälkeen TFA ja poistetaan vakuumissa.

Jäännös uutetaan täydellisesti Cf^C^rlla ja NaHCC>3:n ja suolan vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan ^2*50^ :n läpi ja liuotin poistetaan vakuumissa. Tähän jäännökseen lisätään 0,81 g (1,98 mmol) peptidiä Boc-His(Tos) ja 20 ml C^C^^i3· Sitten siihen lisätään 0,41 g (1,98 mmol) DCC:tä ja sitä sekoitetaan huoneen lämpötilassa kaksi ja puoli tuntia. DCU poistetaan suodattamalla ja suodos uutetaan NaHCO^rn ja suolan vesi-liuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2SO^:n läpi, haihdutetaan ja raakatuote kromatografoidaan silikageelillä, käyttäen eluoimiseen 8-prosenttista MeOH-Ci^C^-seosta, joka sisältää 0,2% NH^OH:ta. Uusintakromatografointi silikageelillä käyttäen eluoimiseen 6-prosenttista MeOH:n (kyllästetty NH^rlla) ja EtOAc:n seosta tuottaa 0,53 g (45%) tuotetta Boc-His(Tos)-Sta-Ile-AMP.

1H-NMR(CDC13): ¢0,70-0,97, m; 1,43, s; 1,84, s; 2,43, s; 2,93, d; 4,33, m; 4,57, d; 6,10,d; 6,9-8,5, m.

C54. Valmistus XXlQVIII O-asetyyli-L-fenyylimaitohappo L-(-)-3-fenyylimaitohappo -> O-asetyyli-L-fenyylimaitohappo

Seosta, joka sisältää 0,09 g (0,54 mmol) L-(-)-3-fenyylimaito-happoa, 0,2 ml pyridiiniä ja 0,2 ml asetanhydridiä, sekoitetaan huoneen lämpötilassa puolitoista tuntia, jonka jälkeen se uutetaan CH-Cl :11a ja 3 N HCl:lla. Orgaaniset kerrokset suodate-2 2 taan Na^SO^rn läpi ja liuotin poistetaan vakuumissa, jolloin saadaan 0,11 g (100%) tuotetta O-asetyyli-L-fenyylimaitohappoa.

Rf on 0,32, kun liuotin on 4% MeOH-95% CH2C12-1% HOAc.

1H-NMR(CDC13): 62,07, s, 3H; 3,10, 3,15,3,21, m, 2H; 5,25, m, 1H* 1,21,5, 5H; 8,66, bs, 1H.

93 88400

C55. Valmistus XX-^IX

O-tert-butyyliasetyyli-L-fenyylimaitohappo L-fenyylimaitohappo —> O-tert-butyyliasetyyli-L-fenyylimaito- happo_ 15 millilitraan Cf^C^ita sekoitetaan 0,100 g (0,602 mmol) L-fenyyli-maitohappoa, 0,128 g (1,26 mmol) Et^N:ia ja 0,0073 g (0,06 mmol) 4-dimetyyliaminopyridiiniä. Tähän lisätään 0,170 g (1,26 mmol) tert-butyylietikkahapon kloridia, seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 2 tuntia, sitten se uutetaan ja 1 N HCl:llä. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2SO^:n läpi ja liuotin poistetaan vakuumissa. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä, käyttäen eluoimiseen ensin 4-prosenttisen MeOH:n ja 96-prosenttisen Cf^C^tn seosta ja sitten 8-prosenttista MeOH-CF^C^-seosta, joka sisältää 0,2% HOAc:tä, jolloin saadaan 0,065 g (41%) tuotetta O-tert-butyyli-asetyyli-L-fenyylimaito-hapoa (Rf on 0,35, kun liuotin on 8-prosenttinen MeOH-Cf^C^-seos, joka sisältää 0,2% HOAcrtä).

1H-NMR(CDCl3): 60,81, s, 0,83, s; 2,12, s; 3,1, m; 5,15, m; 6,17, bs ; 7,19 s.

C56. Valmistus XX^Q

O-asetyyli-L-fenyylilaktyyli-His-Sta-Ile-Phe-OCH^

Boc-His-Sta-Ile-Phe-OCH^ -> O-asetyyli-L-fenyylilaktyyli-His- *:· Sta-Ile-Phe-OCH-j____

Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^IV saatua peptidiä Boc-His-Sta-Ile-Phe-OCH^ (0,149 g, 0,217 mmol) sekoitetaan 15 milli-litrassa TFA-CH2Cl2-seosta (1:1 v/v) huoneen lämpötilassa 30 . ’ minuuttia, jonka jälkeen TFA ja poistetaan vakuumissa.

"V Jäännös uutetaan CHCl3:lla ja NaHC03:n vesiliuoksella, orgaani- set kerrokset erotetaan ja suodatetaan Na2SO^:n läpi. Liuotin poistetaan vakuumissa ja jäännös liuotetaan 10 millilitraan CF^C^iia. Sitten tähän lisätään 0,50 g (0,239 mmol) O-asetyyli-: ; : L-fenyylimaitohappoa, jota saadaan edellä esitetyssä Valmistuk- ____: sessa XX^^III, ja sitten 0,049 g (0,239 mmol) DCC:tä. Reaktio- - seosta sekoitetaan yön yli. Tämän jälkeen saostunut DCU suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan, sekä kaadetaan sitten sili- 94 88400 kageelillä täytettyyn kromatografiakolonniin. Tuotteen eluoi-miseen käytetään liuotinjärjestelmää, joka sisältää 6% MeOH:ta, 93,9¾ CH2Cl2:ta ja 0,1¾ NH^OHrta, jolloin sen jälkeen, kun liuotin on poistettu vakuumissa, saadaan 0,122 g (73¾) tuotetta O-asetyyli-L-fenyylilaktyyli-His-Sta-Ile-Phe-OCH^.

R on 0,27 liuottimena 6¾ MeOH-93^ CH2Cl2-0,n NH4()H. FAB-massaspektri /m+H7+kohdassa m/z 777.

1H-NMR (CDC13): 00,76-0,92, m; 2,18, s, CH-jOO-; 3,70, s, -OCH3; 6,5-7,5, m.

HPLC: LiChrosorb C18, 40¾ CH3CN (0,2¾ TFA)/60¾ H20 (0,2¾ TFA); λ 225, k = 8,0.

C57♦ Valmistus XX1QII

0- tert-butyyliasetyyli-L-fenyyliaktyyli-His-Sta-Ile-AMP Boc-His(Tos)-Sta-Ile-AMP —> O-tert-butyyliasetyyli-L-fenyyli- laktyyli-His-Sta-Ile-AMP_

Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^VII saatua peptidiä Boc-His (Tos ) -Sta-Ile-AMP (0,172 g, 0,224 mmol) sekoitetaan huoneen lämpötilassa 15 millilitrassa TFA-CH2Cl2-seosta (1:1 v/v) 30 minuutin ajan. Sitten TFA ja CH2C12 poistetaan vakuumissa ja jäännös uutetaan CH2Cl2:lla ja NaHCO^n vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^SO^in läpi, suodos haihdutetaan 10 millilitraksi ja tähän lisätään 0,065 g (0,246 mmol) O-tert-butyyliasetyyli-L-f enyylimaitohappoa , jota saadaan edellä Val-mistuksessa XX^IX esitetyllä tavalla, ja sitten tähän seokseen : lisätään 0,051 g (0,246 mmo]) DCC:tä. 45 minuuttia kestäneen sekoittamisen jälkeen seokseen lisätään 0,38 g (2,46 mmol) 1- HOBT:ia. Reaktioseosta sekoitetaan 24 tuntia ja sitten se uutetaan CH2Cl2:lla ja NaHC03:n vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^SO^in läpi, suodos haihdutetaan ja DCU suodatetaan pois. Raakatuote kromatografoidaan (suodatetaan) silikageelillä, käyttäen eluoimiseen 8-prosenttisesta MeOH:sta 91,8-prosenttisesta CH^Cl^sta ja 0,2-prosenttisesta NH^OHtsta muodostuvaa seosta, jolloin saadaan 0,041 g (24¾) tuotetta O-··: tert-butyyliasetyyli-L-f enyy lilaktyy li -Hi s -Sta-Ile-AMP.

95 88400 FAB-massaspektri: ZM+ö7+ kohdassa m/z 762.

1H-NMR(CDC13): δ 0,63-0,81, m; 0,89, s; 5,15, m; 6,45, bd; 6,75-8,5, m; 7,24,s.

C58. Valmistus XX10III

O-asetyyli-L-fenyylilaktyyli-His-Sta-Ile-AMP

Boc-His-Sta-Ile-AMP —> O-asetyyli-L-fenyylilaktyyli-His-Sta-

Ile-AMP__

Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX10VII saatua peptidiä Boc-His(Tos)-Sta-Ile-AMP (0,035 g, 0,057 mmol) sekoitetaan 4 milli-litrassa TFA-CH2Cl2-seosta (1:1 v/v) huoneen lämpötilassa 20 minuutin ajan, jonka jälkeen TFA ja CH2Cl2 poistetaan vakuumis-sa. Jäännökseen lisätään 0,05 g (0,5 mmol) Et^Niia ja 20 ml CH2Cl2:ia. Seosta sekoitetaan useita minuutteja, jonka jälkeen Et^Nrn ja CH2Cl2:n ylimäärä poistetaan vakuumissa. Tähän jäännökseen lisätään edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^^VIII saatua O-asetyyli-L-fenyylimaitohappoa (0,0142 g, 0,068 mmol) ja 5 ml CH2Cl2:ia, ja tämän jälkeen 0,0142 g (0,068 mmol) DCCrtä ja 0,25 ml DMFriä. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 21 tuntia, jonka jälkeen CH2C12 ja DMF poistetaan vakuumissa. Jäännökseen lisätään CH2Cl2:ia ja DCU suodatetaan pois. Suodos uutetaan CH2Cl2:lla ja NaHC03:n vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na_SO,:n läpi, suodos haihdutetaan ja 2 4 kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 8-prosent-tisesta MeOH:sta, CH2Cl2:sta ja 0,3-prosenttisesta NH^OHrsta " muodostuvaa seosta, jolloin saadaan 0,0231 g (58%) tuotetta o-asetyyli-L-f enyylilaktyyli-His-Sta-Ile-AMP.

: Y Rf (8% MeOH«CH2Cl2-0,2% NH4OH): 0,36 Y.‘ 1H-NMR(CDC13): 60,62-1,0, m; 2,17, s; 4,56,d; 5,10, m; 6,43, bd; 7,26, s; 6,7-8,5, m.

HPLC: U Bondapak Phenyl-kolonni; 25% CH3CN(0,2% TFA)/75% H20 .-. (0,2% TFA), k1 = 4,0; A 225.

C59. Valmistus XX^QIV L-f enyylilaktyyli-His-Sta-Ile-AMP . Boc-His-Sta-Ile-AMP ——> L-fenyylilaktyyli-His-Sta-Ile-AMP

- 0,050 g (0,0812 mmol) edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^^VII

96 88400 saatua peptidiä Boc-His-Sta-Ile-AMP sekoitetaan 4 millilitrassa TFA-CH2Cl2-seosta (1:1 v/v) huoneen lämpötilassa 20 minuuttia, jonka jälkeen TFA ja CH2C12 poistetaan vakuumissa. Jäännökseen lisätään 0,5 ml DMFrää, ja tämän jälkeen 0,0247 g (0,243 mmol)

Et. Tähän lisätään 0,0148 g (0,0893 mmol) L-fenyylimaitohap-poa, 5 ml CH2Cl2:ia ja lopuksi 0,0184 g (0,0893 mmol) DCCrtä. Tunnin kuluttua seokseen lisätään uudestaan 0,0074 g L-fenyyli-maitohappoa ja 0,0092 g DCC:tä. Seosta sekoitetaan 3 tuntia, jonka jälkeen CH2C12 ja DMF poistetaan vakuumissa. Jäännökseen lisätään CH2Cl2:ia ja DCU suodatetaan pois. Suodos haihdutetaan ja se kaadetaan silikageelillä täytettyyn kolonniin. Tuote eluoidaan 8-prosenttisesta MeOH:sta, CH2Cl2:sta ja 0,3-pro- senttisesta NH.OHtsta muodostuvalla seoksella. Tuotteen sisäl-4 tävät fraktiot yhdistetään ja ne kromatografoidaan uudestaan kahden (sarjassa olevan) Warters-yhtiön C18-Sep Pak-kolonnin läpi käyttäen gradienttia H^O —> 10-prosenttinen MeOH-H20 —> 30-prosenttinen MeOH-H20 —> 66-prosenttinen MeOH-H20. (Tuote eluoituu 66-prosenttisesta MeOHrsta ja Haista muodostuvalla liuottimena). Tuotteen sisältämät fraktiot yhdistetään, MeOH poistetaan vakuumissa ja jäännös lyofilisoidaan, jolloin saadaan 0,0298 g (55%) tuotetta, U-71,095.

Rf (8% MeOH-CH2Cl2-0,2% NH4OH): 0,26.

1H-NMR (CDCl3-MeOH-d4): δ 0,65-0,96, m; 2,95, m; 4,5, m; 6,75-8,4, m; 7,25, s.

HPLC: yBondapak Phenyl-kolonni, 22% CH^CN (0,2% TFA)/78% H20 (0,2% TFA), k1 = 6,7; λ225.

Myös muita tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa analogisesti edellä esitettyjen menetelmien kanssa. Esimerkiksi ollaan todettu, että seuraavien yhdisteiden MS on yhtäpitävä esitettyjen rakenteiden kanssa:

Ph-0-CH2-C(0)(2S,4S,5S)-Leu-/C(OH)HCH27-Val-Ile-AMP HO-C(CH^Ph)H-C(O)-His-Sta-Ile-AMP Aco-C(CH2Ph)H-C(0)-His-Sta-Ile-AMP • POA-His(2S,4R,5S)-Leu-/C(OH)HCH27-Val-Ile-Phe-OCH3 POA-His(2S,4R,5S)-Leu-/C(OH)HCH”7-Val-Ile-AMP.

97 88400 C60. Valmistus XL,

-6C

Osa A

2 millilitrassa tetrahydrofuraania olevan BOC-leusinolin (462 mg, 2,43 mmol) sekoitettuun liuokseen lisätään -78°c:n lämpötilassa argoni-ilmakehässä 2,4 ml (2,4 mmol) tetrahydrofuraaniin valmistettua litium-bis(trimetyylisilyyli)amidin 1 M liuosta. 10 minuutin kuluttua tähän lisätään 0,3 ml (4,8 mmol) metyylijodidia ja tuloksena olevan seoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan. Sitten se kuumennetaan ja sitä palautusjäähdytetään tunnin ajan ja tämän jälkeen jäähdytetään. Seos ositetaan dikloorimetaanin (40 ml) ja NaHCO^rn kylläisen vesiliuoksen (30 ml) välille. Vesifaasi uutetaan kolmasti kulloinkin 30 millilitran suuruisilla annoksilla dikloorimetaania. Yhdistetyistä fraktioista saatu jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen 15-prosenttis-ta etyyliasetaattia heksaanissa, jolloin saadaan 405 mg (1,75 mmol, 83%) BOC-leusinolin metyylieetteria. ^HNMR (CDCl-j): 60,9 d (d, d x 3H, J = 6Hz), 1,44, 3,33.

Osa B

BOC-leusinolin metyylieetterin valmistuksen (Osa A) yhteydessä esitetyllä tavalla 1,3 millilitrassa tetrahydrofuraania olevan BOC-isoleusinolin (280 mg, 1,29 mmol) liuokseen lisätään 1,3 ml tetrahydrofuraaniin valmistettua litium-bis(trimetyylisilyyli)-amidin 1 M liuosta ja 0,4 ml (0,4 mmol) metyylijodidia, jolloin silikageelillä ja 15-prosenttista etyyliasetaattia heksaanissa käyttäen toteutetun kromatografoinnin jälkeen saadaan 245 mg ; : (1,06 mmol, 82%) BOC-isoleusinolin metyyliesteriä. ^H-NMR

(CDC13): 60,89, 0,91, 1,44, ja 3,41.

Osa C

Liuosta, joka käsittää 38,4 mg (0,086 mmol) BOC-leu-(CHOTBSCH2)-_ . val-OH:ta 0,35 millilitrassa 1 M boraania tetrahydrofuraanissa (0,35 mmol), sekoitetaan huoneen lämpötilassa 5 tunnin ajan.

'·' Tämän jälkeen siihen lisätään pisaroittain 0,35 ml 1 M NaOH:n *:·*: vesiliuosta. 30 minuutin kuluttua tuloksena oleva seos osite- taan dikloorimetaanin (40 ml) ja NaHCOrn kylläisen vesiliuoksen (5 ml) välille. Vesifaasi uutetaan neljästi kulloinkin 5 milli-litran suuruisilla annoksilla dikloorimetaania. Yhdistetty or- 98 88 400 gaaninen faasi kuivataan MgSC^ra, suodatetaan ja haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 20-prosenttista etyyliasetaattia heksaa-nissa, jolloin saadaan 24,7 mg (0,057 mmol, 66¾) alkoholia.

1H-NMR (CDC13): δ 0, 0,81 ja 4,35.

Osa D

BOC-leusinolin metyylieetterin valmistuksen (Osa A) yhteydessä esitetyllä tavalla 0,4 millilitrassa tetrahydrofuraania olevaan 24,7 milligrammaan (0,057 mmol) alkoholia (Osa C) lisätään 0,06 ml tetrahydrofuraaniin valmistettua litium-bis(trimetyylisilyyli) amidin 1 M liuosta ja 0,02 ml (0,32 mmol) metyylijodidia, jolloin saadaan 19 mg (0,043 mmol, 75¾) vastaavaa metyylieetteriä silikageelillä ja 10-prosenttisella eetterillä heksaanissa toteutetun kromatografoinnin jälkeen. 1H-NMR (CDCl-j): 60, 0,81, 1,36 ja 3,19.

C61. Valmistus NLA'*'

Osa A L-3-(1-naftyyli)maitohappo 50 millilitraan 2,5 N H^SO^oa valmistettuun L-3-(1-naftyyli-alamiinin) (0,154 g, 0,71 mmol) suspensioon lisätään NaNC^: a (0,2 g) pieninä annoksina 8 vuorokauden aikana. Tämän jälkeen reaktioseos uutetaan Et^Orlla, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2S04:n läpi ja haihdutetaan kuivaksi, jolloin saadaan 0,069 g (45%) tuotetta. Rf = 0,10.

Osa B O-Ac-L-3-(1-naftyyli)maitohappo

Seosta, joka käsittää 0,038 g (0,176 mmol) osassa A saatua yh-: distettä, 0,2 ml pyridiiniä ja 0,2 ml asetanhydridiä, sekoite taan huoneen lämpötilassa 3 tuntia. Tämän jälkeen reaktioseos uutetaan CH2Cl2:lla ja 1 N HCl:llä (2 x) ja orgaaniset kerrok-: set suodatetaan Na2S04;n läpi, haihdutetaan ja kromatografoi daan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 4-prosenttisen MeOH:sta, CH2C^2:S':a 3a 0,1-prosenttisesta HOAc:sta muodostuvaa seosta, jolloin saadaan 0,0383 g (84%) tuotetta.

NMR (CDC13) : 6 2,00, 3,3-3,9, 5,29-5,45, 7,37-8,16 ja 8,33.

> RF = 0,36.

99 8 8 400

Osa C

Seokseen, joka käsittää 0,084 g (0,147 mmol) peptidiä His-(Tos)-LeuΨ/CH(OH)CH27-Val-ILe-AMP 0,038 g (0,147 mmol) osassa B saatua yhdistettä, O-Ac-3-(1-naftyyli)-maitohappoa, 0,020 g (0,147 mmol) 1-HOBT:tä, 5 ml CH2Cl2:ia ja noin 5 pisaraa DMFrää, lisätään 0,030 g (0,147 mmol) DCCrtä. 35 minuutin kuluttua tähän lisätään jälleen 0,04 g l-HOBT:tä. Kun seosta on sekoitettu yön yli, liuottimet poistetaan vakuumissa ja jäännös uutetaan CHCl2-CH2Cl2-seoksella ja NaHCO^rn vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset haihdutetaan ja kromatografoidaan silikageelillä 8-prosenttista MeOH-CB^C^-seosta käyttäen. Tosyloitua materiaalia sisältävät fraktiot käsitellään uudestaan CH2Cl2:ssa ja THF:ssä olevalla 1-HOBT:llä ja kromatografoidaan uudestaan, jolloin tuotetta saadaan yhteensä 0,0527 g.

FAB-massaspektri: /m+H/ kohdassa m/z 812.

NMR (CDCL3): 62,01.

RF = 0,14.

Seuraavat valmisteet ovat esimerkkeinä tämän keksinnön mukaisista yhdisteistä.

C62. Valmistus XX,„H, --10—4

(2S,4S,5S)Leu-^-/CH(OTBDMS)CH27-Val-Ile-AMP

Analogisesti edellä kuvatuilla menetelmillä valmistettu, kaavan * Boc ( 2S , 4S , 5S) Ββυ-Ψ-/0Η (TBDMS ) CH27-Val-Ile-AMP mukainen peptidi (0,39 g, 0,000600 mol) liuotetaan CH2Cl2:een (2 ml) typpi-ilma-kehässä. Liuos jäähdytetään jäähauteessa. Tähän liuokseen li- : . . sätään pisaroittain 2 minuutin aikana trifluorietikkahappoa (2 ml). Jäähdytettyä liuosta sekoitetaan 10 minuuttia, jonka jälkeen se poistetaan jäähauteesta. Sekoittamista jatketaan huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan. 5-prosenttisella MeOH-- CH2Cl2-seoksella toteutettu TLC osoittaa reaktion olevan täydel- " linen. Seoksen annetaan seisoa huoneen lämpötilassa 45 minuu- • tin ajan, jolloin tavanomaisella jatkokäsittelyllä saadaan ....: 0,285 g tuotetta (2S, 4S, 5S)-Leu-ψ-/CH(OTBDMS)CH27-Val-Ile-AMPf jonka sulamispiste on 134-138°C.

loo 88400 C63. Valmistus XX^qH^

Boc-im-tosyyli-His( 2S, 4S, 5S)-Leu-ip-/CH (OTBDMS )CH27-Vai-Ile-AMP Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX1nH saatu yhdiste (2S,4S,5S)- __ J.U 4

Leu-ip-/CH(OTBDMS)CH27-Val-Ile-AMP (0,10 g, 0,000182 mol) liuotetaan Ct^Cl^iin (4 ml) typpi-ilmakehässä. Tähän liuokseen lisätään Boc-im-tosyyli-histidiiniä (0,075 g; 0,000182 mol, 1 ekvivalentti), ja tämän jälkeen siihen lisätään di-isopropyyli-etyyliamiinia (0,0565 g; 0,076 ml; 0,00043 mol; 2,4 ekvivalenttia) ja 2-kloori-l-metyylipyridiniumjodidia (0,056 g; 0,000219 mol; 1,2 ekvivalenttia). Tuloksena olevaa seosta kuumennetaan ja palautusjäähdytetään öljyhauteessa 50°C:n lämpötilassa 10 minuuttia, ja sitä pidetään palautusjäähdytyksen lämpötilassa 1 tunnin ajan. Seoksen annetaan jäähtyä ja sitä sekoitetaan huoneen lämpötilassa. Reaktioseoksesta laitetaan täplät kahdelle TLC-levylle ja levyt kehitetään 5-prosenttisella MeOH-CH2Cl2-seoksella, joka sisältää 0,5% NH^OHria. Väri kehitetään toisessa levyssä ninhydriinillä ja toisessa levyssä I2:lla. Reaktio on edennyt täydellisesti loppuun ja levyillä nähdään yksi ainoa, tuotteen muodostama täplä. Tavanomaisten jatko-käsittelytoimenpiteiden jälkeen saadaan 0,174 g tuotetta Boc-im-tosyyli-His(2S,4S,5S)-Leu-ψ-/0Η(TBDMS)CH27-Val-Ile-AMP. Tuotteen NMR on yhtäpitävä odotetun rakennekaavan kanssa.

:. C64. Valmistus xx^qH2

im-tosyyli-His-(2S,4S,5S)-Leu-ψ-/0Η(OH)CH27-Val-Ile-AMP

Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX1QH3 saatu suojattu peptidi Boc-im-tosyyli-His-(2S,4S,5S)-Leu-/CH(OTBDMS)CH27-Vai-Ile-AMP liuotetaan CH2Cl2:iin (1 ml) typpi-ilmakehässä ja jäähdytetään jäähauteessa. Tähän liuokseen lisätään pisaroittain trifluori-etikkahappoa (1 ml) yhden minuutin pituisen jakson aikana.

. Reaktioseos poistetaan kylmästä hauteesta ja sitä sekoitetaan huoneen lämpötilassa 1 tunnin ja 5 minuutin ajan. Reaktioseos kaadetaan 15 millilitraan NaHCO^zn kylläistä vesiliuosta, jota "" jäähdytetään jäähauteessa. Tavanomaisen uuttamisen ja puhdis- ·: tamisen jälkeen saadaan 0,089 g tuotetta im-tosyyli-His(2S,4S, 5S)-Leu-ψ-/0Η(OH)CH27-Val-Ile-AMP. HPLC on yhtäpitävä tuot-- teen rakenteen kanssa.

101 88400 C65. Valmistus XXj^H^

Vaihe A O-asetyylifenyylimaitohappo (Ac-PLA)

Fenyylimaitohappoa (0,75 g) liuotetaan pyridiiniin typpi-ilma-kehässä ja liuos jäähdytetään jäähauteessa. Siihen lisätään pisaroittain asetanhydridiä (2,0 ml) 1,5 minuutin aikana. Reaktioseos poistetaan jäähauteesta ja sitä sekoitetaan huoneen lämpötilassa 1 tunnin ja 50 minuutin ajan. 0,5% AcOH:ta sisältävällä 4-prosenttisella MeOH-CH2Cl2-seoksella toteutetulla TLC-määrityksellä nähdään, että reaktio on edennyt täydellisesti loppuun. 1 tunnin ja 50 minuutin kuluttua otsikon mukainen tuote uutetaan reaktioseoksesta ja se puhdistetaan tavanomaisin menetelmin, jolloin saadaan 0,741 g tuotetta. NMR on yhtäpitävä toivotun rakenteen kanssa.

Vaihe B Ac-PLA im-tosiyyli-His ( 2S ,4S,5S )-Leu-ψ-/ΟΗ ( OTBDMS ) CH27-

Val -Ile-AMP_~

Edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^qH2 saatu amiini im-tosyyli-His(2S,4S,5S)-Leu-ip-/CH(OH)CH27-Val-Ile-AMP (0,085 g, 0,000117 mol) liuotetaan Cf^Cl^een (5 ml) typpi-ilmakehässä. Tällöin muodostuu maitomainen liuos. Edellä esitetyn Valmistuksen XXl0Hi vaiheessa A saatu Ac-PLA (0,0244 g, 0,000117 mol; 1 ekvivalentti) lisätään ja seos huuhdellaan CH2Cl2:n pienellä ylimääräisellä annoksella, jolloin muodostuu kirkas liuos.

Tähän lisätään di-isopropyyli-etyyliamiinia (0,036 g; 0,049 ml; 0,000281 mol; 2,4 ekvivalenttia), jonka jälkeen siihen lisä-tään 2-kloori-l-metyylipyridiniumjodidia (0,036 g, 0,000141 mol; 1,2 ekvivalenttia). Seos kuumennetaan palautus jäädytyksen lämpötilaan, jossa sitä pidetään 1 tunnin 10 minuutin ajan.

: Seos poistetaan lämmönlähteestä ja sen annetaan jäähtyä huo- neen lämpötilaan. 0,5% NH^OH:a sisältävällä 5-prosenttisella MeOH: CH^^-seokse 11a toteutetulla TLC-määrityksellä, jossa ; väri kehitettiin I2:lla, nähdään, että reaktio on edennyt täy-I..' dellisesti loppuun. Uuttaminen ja puhdistaminen tavanomaisin \ menetelmin tuottaa 0,097 g tuotetta Ac-PLA im-tosyyli-His- ( 2S , 4S , 5S )-Leu-i|i-/CH ( OH) CH27-Val-Ile-AMP . NMR on yhtäpitävä *;·*: toivotun tuotteen kanssa.

« 102 8 8 400

C66. Valmistus XX1QH

Ac PLA-His-(2S,4S,5S)-Leu-ψ-/CH(OH)CH27-Val-Ile-AMP

Valmistuksessa XXjqH^ saatu suojattu peptidi Ac PLA im-tosyyli-His-(2S,4S,5S)-Leu-/CH(OH)CH27-Val-Ile-AMP (0,095 g, 0,000104 mol) liuotetaan THF:ään (5 ml) typpi-ilmakehässä ja sitten siihen lisätään DMF:ää (1 ml). Tuloksena olevaa seosta sekoitetaan niin kauan, että saadaan liuos. Tämän jälkeen tähän liuokseen lisätään HOBT:ia (0,14 g; 0,00104 mol; 10 ekvivalenttia) ja tuloksena olevaa seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 25 tuntia. TLC-määritys, jossa käytetään 0,5¾ NH4OH:ta sisältävää 5-prosenttista MeOH:Ct^C^-seosta, toteutetaan levyllä ja väri kehitetään I2:lla. TLC-määritys osoittaa reaktion olevan kulunut täydellisesti loppuun. Reaktioseos haihdutetaan pyöröhaih-duttajalla ja DMF poistetaan vakuumissa, jolloin saadaan 0,073 g tuotetta Ac-PLA-His ( 2S , 4S , 5S)-Leu-iJj-/CH (OH ) CH27-Val-Ile-AMP.

MS, teoriassa yhdisteelle C4iH6oN2°7-^+H7+: 762,4554.

Todettu: 762,4521.

Yhdiste XX-^Hj^ H-PLA-His-( 2S , 4S , 5S )-Leu-ij;-/CH (OH )CH27-Val-Ile-AMP valmistetaan siten, että edellä esitetyssä Valmistuksessa XX^qH saadun yhdisteen Ac-PLA-His-(2S,4S,5S)-Leu-ψ-/CH(OH)CH27-Val-Ile-AMP jääkylmään metanoliliuokseen lisätään vedetöntä ammoniakkia ja seoksen annetaan seistä ympäristön lämpötilassa 20 tuntia.

MS, teoriassa yhdisteelle C2gH^gN^Og/M+H7+: 720,4448.

Todettu: 720,4456.

‘ Samoin ollaan todettu, että kunkin seuraavan yhdisteen MS on yhtäpitävä esitetyn rakenteen kanssa:

: Ph-0-CH2-C(0)(2S,4S,5S)-Leu-/C(OH)HCH27-Val-Ile-AMP

: POA-His(2S,4R,5S)-Leu-/C(OH)HCH27-Val-Ile-Phe-OCH3 POA-His(2S,4R,5S)-Leu-/C(OH)HCH27-Val-Ile-AMP.

103 8 8 400

Myös muita tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan valmistaa analogisesti edellä kuvatuilla menetelmillä. Esimerkiksi seuraavat yhdisteet kuuluvat tämän keksinnön piiriin:

Ph-0-CH2-C(0){2S,4S,5S)-Leu-/C(0H)HCH27-Val-Ile-AMP

HO-C(CH2Ph)H-C(0)-His-Sta-Ile-AMP

AcO-C(CH2Ph)H-C(0)-His-Sta-Ile-AMP

POA-His(2S,4R,58)-Leu-/C(OH)HCH^-Val-Ile-Phe-OCH^ POA-His(2S,4R,5S)-Leu-^C(OH)HCH27-Val-Ile-AMP .

C67. Valmistus XX^I

N-tert-butYylioksikarbonyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyli- amidi XX2q1^______

Liuokseen, jota sekoitetaan ja joka käsittää 4,68 g (45,4 mmol) 2-aminometyylipyridiiniä (XX2qI2), 10,0 g (43,2 mmol) N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-isoleusiinia ja 5,84 g (43,2 mmol) 1-hydroksibentsotriatsolia 100 millilitrassa dikloorimetaania, lisätään 8,92 g (43,2 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidiä.

Kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 16 tuntia, se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^n kylläisen vesiliuoksen välille. Vesifaasi uutetaan edelleen kahdella dikloorimetaanin annoksella. Yhdistetty orgaaninen faasi kuivataan MgSO^rllä, suodatetaan ja sitten haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimi-seen 60-prosenttista etyyliasetaattia heksaanissa, jolloin saa-daan 137,3 mg (0,212 mmol, 94¾) peptidiä 5S-N-tert-butyylioksi-. ‘ karbonyyliamino-2S-isopropyyli-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyyli- "** silyloksi-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX2qI), jonka rakenne varmistettiin ^H-NMR-mäarityksellä.

C68. Valmistus XX II

Na-tert-butyylioksikarbonyyli-Na-metyyli-N1',T'-tosyyli-L-histidiini ... 1¾¾- •Öljyssä olevan 50-prosenttisen natriumhydridin 0,75 gramman suu-V ' ruinen annos (15,6 mmol) pestään kolmella 7 ml suuruisella n- pentaanin annoksella argonilmakehassä. Jäännös suspendoidaan 5 millilitraan kuivaa tetrahydrofuraania (tislattu natriumin ·. päältä). Tähän sekoitettuun seokseen lisätään 5 millilitrassa • *· · · 104 88400 tetrahydrofuraania oleva 1,59 g (3,88 mmol) Na-tert-butyylioksi-karbonyyli-Nlm-tosyyli-L-histidiini ΧΧ2οΙΙ2' ja sitten 2,0 ml (32 mmol) metyylijodidia. Kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 16 tunnin ajan, se kaadetaan hitaasti 20 mil-lilitraan kylmää NaHSO^:n 1 M vesiliuosta- Tetrahydrofuraani poistetaan pyöröhaihduttimella. Vesifaasi uutetaan 100 milli-litralla ja kahdella 50 millilitran annoksella etyyliasetaattia. Yhdistetty orgaaninen faasi pestään kahdella 50 millilitran suuruisella annoksella NaHSC>4:n 1 M vesiliuosta, jonka jälkeen se kuivataan MgSO^rllä. Liuos haihdutetaan, jolloin saadaan 1,18 g (2,79 mmol, 72¾) Na-tert-butyylioksikarbonyyli-N a-metyyli-Nlm-tosyyli-L-histidiiniä (XX^IIj), jonka rakenne varmistui 1H-NMR- ja MS-määrityksillä (laskettu yhdistee ne c19h25n3o6sk 462,1101; Todettu: 462,1114.

C69- Valmistus XX^^II

^ ^ Ct lm N-tert-butyylioksikarbonyyli-N -metyyli-M -tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-2S-isopropyyli-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyylisily-loksi-oktanoyyli-L-isoleusvvl·i-2-pvridvvl·imetvvliamidi (XX^qII) 2 millilitrassa dikloorimetaania olevaan sekoitettuun liuokseen, joka käsittää 82,7 mg (0,15 mmol) vapaata amiinia (saatu käsittelemällä edellä valmistettua, kaavan X^o1 multaista peptidiä trifluorietikkahapon ja dikloorimetaanin 1:1-seoksella, jonka jälkeen tämä. neutraloidaan NaHCO^:n vesiliuoksella), 77,7 mg (0,18 mmol) edellä saatua aminohappoa XX^qII^ ja 25^ul (0,18 mmol) trietyyliamiinia, lisätään 30^ul (0,20 mmol) dietyylifos-foryylisyanidia. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 14 tuntia, se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^in kylläisen vesiliuoksen välille. Vesifaasi uutetaan edelleen kahdella annoksella dikloorimetaania. Yhdistetty orgaaninen faasi kuivataan MgSO^rllä, suodatetaan ja sitten haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kromatografoidaan silikagee-lillä käyttäen eluenttina 20-prosenttista heksaania etyyliase- taatissa, jolloin saadaan 120,8 mg (0,127 mmol; 84%) peptidiä N-tert-butyylioksikarbonyyli-Na-metyyli-Nim-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-2S-isopropyyli.-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyylisily-loksi-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi X^O11' jonka rakenne varmistui ^-H-NMR-määrityksellä.

’05 88400

C70. Valmistus XX^qIV

N-tert-butyylioks ikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-Na-metyyli-Nlrn-tosyyli-L-hist idyyli-SS-amino^S-hydroksi^S-isopropyyli^-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli^-pyr idyylimetyyliamidi μ20π--- 2 millilitrassa dikloorimetaania olevaan sekoitettuun liuokseen, joka käsittää 92 mg (0,124 mmol) vapaata amiinia (saatu käsittelemällä edellä valmistettua, kaavan XX2QII mukaista peptidiä trifluorietikkahapon ja dikloorimetaanin 1:1-seoksella, ja neutraloimalla tämä seos NaHCO^n vesiliuoksella, jolloin saadaan kaavan XX^III mukainen yhdiste), 35,2 mg (0,133 mmol) N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniinia ja 21^ul (0,15 mmol) trietyyliamiinia, lisätään 25^ul (0,16 mmol) dietyylifosforyyli-syanidia. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 14 tuntia, se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^:n kylläisen vesiliuoksen välille. Vesifaasi uutetaan edelleen kahdella annoksella dikloorimetaania. Yhdistetty orgaaninen faasi kuivataan MgSO :llä, suodatetaan ja haihdutetaan. Tulok-sena oleva jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 2-prosenttista metanolia etyyliasetaatissa, jolloin saadaan 78,9 mg (0,08 mmol, 64¾) peptidiä N-tert-butyylioksi-karbonyyli-L-fenyylialaniini-Na-metyyli-Nlm-tosyyli-L-histi-dyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli- L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi XX IV, jonka rakenne 1 20 varmistui H-NMR-määrityksellä ja sen puhtaus analysoitiin : : käänteisfaasilla HPLC:n avulla. . Massaspektri /M+H7+ = 833;

Retentioaika HPLC-määrityksessä 13,1 minuuttia. Tässä HPLC- määrityksessä käytetyt olosuhteet on esitetty taulukon B koh- ; .·. dassa (b) .

C71. Valmistus XX2QV

N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-Na-metyyli-L-• histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli- ‘ oktanoyvli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX^qV)_ ·;··’· 1 millilitrassa metanolia olevaan, edellä valmistetun, kaavan ....: XX^qIV mukaisen peptidin (78,9 g; 0,08 mmol) sekoitettuun liuok- seen lisätään 108 mg (0,8 mmol) 1-hydroksi-bentsotriatsolia.

106 88400

Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 18 tuntia, se haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 5-prosent-tista metanolia (kyllästetty ammoniakilla) etyyliasetaatissa, jolloin saadaan 62,6 mg (0,075 mmol, 94¾) peptidiä N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialanyyli-Na-metyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-iso-leusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX2QV), jonka rakenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä ja jonka puhtaus analysoitiin HPLCrn avulla käänteisfaasia käyttäen.

C72. Valmistus XX_.VI, -20—3 N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyylibent- syyliesteri (XX^qVI^)_ 20 millilitrassa dikloorimetaania olevaan L-fenyylialaniiniin bentsyyliesterin (XX2qVI^) (2,22 mmol) (neutraloimalla 950 mg L-fenyylialaniinin bentsyyliesteriä ja p-tolueenisulfonihappoa) sekoitettuun liuokseen lisätään 480 mg (2,23 mmol) N-tert-butyyli-oksikarbonyyli-L-proliinia ja 300 mg (2,22 mmol) 1-hydroksi-bentsotriatsolia, ja tämän jälkeen 500 mg (2,42 mmol) disyklo-heksyylikarbodi-imidiä. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 20 tuntia, se suodatetaan.

Suodos laimennetaan 40 millilitralla dikloorimetaania, jonka jälkeen se pestään 20 millilitralla NaHCO^n kylläistä vesi-liuosta. Vesifaasi uutetaan kahdella 30 millilitran suuruisella annoksella dikloorimetaania. Yhdistämällä saatu orgaaninen faasi kuivataan MgSO^Jllä, suodatetaan ja sitten se haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 2-prosenttista metanolia dikloorimetaanissa, jolloin saadaan 975 mg (2,15 mmol, 97¾) dipeptidin N-tert-butyylioksikar-bonyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyylin bentsyyliesteriä ^XX20VI3^' ^on^a ra*cenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä.

C73. Valmistus XX2qVI_2 N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-prolyyli-L-fenyylialani ini 12¾¾ J_ 5 millilitrassa metanolia olevaan, edellä valmistetun, kaavan 107 88400 XX „ VI mukaisen bentsyyliesterin (543 mg; 1,20 mmol) sekoitet-20 3 tuun liuokseen lisätään 50 mg 5-prosenttista hiilen pinnalle sidottua palladium-katalyyttiä. Tuloksena olevaa suspensiota sekoitetaan vetyilmakehassä, huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Reaktioseos suodatetaan piimään läpi ja suodos haihdutetaan, jolloin saadaan dipeptidiä N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-propyyli-fenyylialaniini (XX2QVI2), jonka rakenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä.

C74. Valmistus XX^qVI^ N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyyli-Na-metyyli-Nlm-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-iso-propyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyli- amidi_Ux Viχ )________

Sekoitettuun liuokseen, joka on valmistettu 2 millilitraan di-kloorimetaania, ja joka käsittää 67 mg (0,09 mmol) vapaata amiinia (saatu käsittelemällä edellä valmistettua, kaavan XX2QII mukaista peptidiä trifluorietikkahapon ja dikloorimetaanin 1:1-seoksella, ja sitten neutraloimalla tämä NaHCO^tn vesi-liuoksella), 36 mg (0,1 mmol) edellä valmistettua, kaavan XX2q^*2 mukaista dipeptidiä ja 14 ^ul (0,1 mmol) trietyyliamiinia, lisätään 18 ^ul (0,12 mmol) dietyylifosforyylisyanidia. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 15 tuntia, se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^rn kylläisen vesiliuok-·;· sen välille. Vesifaasi uutetaan edelleen kahdella annoksella dikloorimetaania. Yhdistämällä saatu orgaaninen faasi kuiva-."·. taan MgSO :llä, suodatetaan ja haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen - ' 2,5-prosenttista metanolia etyyliasetaatissa, jolloin saadaan 67,3 mg (0,06 mmol, 69¾) peptidiä N-tert-butyylioksikarbonyyli-* * L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-Na-metyyli-Nim-tosyyli-L-histidyyli- 5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-: isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX2qVI^), jonka rakenne ’·,· ‘ varmistui ^H-NMR-määrityksellä, ja jonka puhtaus määritettiin ....: HPLC:n avulla käänteisfaasia käyttäen.

108 88400

C75. Valmistus XX^qVI

N-tert-butyylioksikarbonyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyyli-Na-metyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyylioktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi ΐΜζοϊϋ- 1 millilitrassa metanolia olevaan, edellä valmistetun ja kaavan XX2qVI mukaisen peptidin (67 mg, 0,062 mmol) sekoitettuun liuokseen lisätään 25 mg (0,185 mmol) 1-hydroksi-bentsotriatsolia.

Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 20 tuntia, se haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kro-matografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 5-prosent-tista metanolia (kyllästetty ammoniakilla) etyyliasetaatissa, jolloin saadaan 51,5 mg (0,055 mmol; 90¾) peptidiä N-tert-butyyli-oksikarbonyyli-L-prolyyli-L-fenyyli-alanyyli-Na-metyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX2qVI), jonka rakenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä ja jonka puhtaus analysoitiin HPLC:n avulla käänteisfaasia käyttäen. Massa-spektri /M+h7. = 930; HPLC:ssä retentioaika 16,5 minuuttia. Olosuhteet HPLC-määrityksessä on esitetty taulukon B kohdassa (b).

C76 . Valmistus XX^q 1^ (2R,5S)-2-tert-butyyli-l-atsa-3-oksabisyklo/3.3.07oktan-4-oni 1M30I7J_ : 20 millilitraan pentaania valmistettua seosta, joka käsittää 651 mg (5,65 mmol) L-proliinia, 3,0 ml (28 mmol) 2,2-dimetyyli-propanaalia ja lO^ul trifluorietikkahappoa, palautusjäähdytetään . Dean-Stark-lukkopullossa kolme vuorokautta. Reaktioseos haihdutetaan ja saatu jäännös tislataan haihduttamalla 0,1 mm Hg:n paineessa 70°C:n lämpötilassa, jolloin saadaan 955 mg (5,2 mmol, 92%) yhdistettä (2R,5S)-2-tert-butyyli-l-atsa-3-oksabisyklo/3.3.07°ktan-4-oni (XX I ), jonka rakenne varmistui 1 “ J U / H-NMR-määrityksellä.

109 88400 C77. Valmistus ΧΧ^^Ι^- (2R,5S)-2-tert-butyyli-5-metyyli-l-atsa-3-oksabisyklo/3.3.07-oktan-4-oni (ΧΧ,,,Ι,-) -3 O—o- 25 millilitraan tetrahydrofuraania valmistettuun, 0,88 ml (6,2 mmol) di-isopropyyliamiinia sisältävään sekoitettuun liuokseen lisätään -78°C:n lämpötilassa argonilmakehässä 3,8 ml (5,7 mmol) n-butyylilitiumin 1,5 M heksaaniliuosta. Tuloksena olevaa liuosta sekoitetaan 0°C:n lämpötilassa 10 minuuttia, jonka jälkeen se jäähdytetään uudestaan -78°C:n lämpötilaan. Tähän lisätään 5 millilitraan tetrahydrofuraania valmistettu liuos, joka sisältää 950 mg (5,2 mmol) edellä valmistettua, kaavan XX^qI^ mukaista yhdistettä. 30 minuutin kuluttua tähän lisätään 0,39 ml (6,3 mmol) metyylijodidia. 2 tunnin kuluttua reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneen lämpötilaan, jonka jälkeen se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^rn kylläisen vesiliuoksen välille. Orgaaninen faasi kuivataan MgSO^:llä, suodatetaan ja sitten haihdutetaan. Saatu jäännös tislataan haihduttamalla 0,06 mm Hg:n paineessa, 60°C:n lämpötilassa, jolloin saadaan 764 mg (3,87 mmol, 75%) yhdistettä (2R,5S)-2-tert-butyyli-5-metyyli-l-atsa-3-oksabisyklo-/3.3.07oktan-4-oni (XX^Ig), jonka rakenne varmistui ''"H-NMR-määrityksellä.

C78. Valmistus XX QI

N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-proliini (XX^q^jL *:* 10 millilitraan 15-prosenttista HBr:n vesiliuosta valmistettu, f: 764 mg (3,87 mmol) edellä valmistettua, kaavan XX^qI^ mukaista yhdistettä sisältävää liuosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 22 tuntia. Reaktioseos haihdutetaan ja saatu jäännös haihdu-. . tetaan kolmasti 25 millilitran suuruisesta annoksesta absoluut-tista etanolia. Tästä jäännöksestä, 3 millilitrasta dimetyyli-* ‘ formamidia ja 1 millilitrasta vettä valmistettuun sekoitettuun liuokseen lisätään 306 mg (7,65 mmol) NaOHrta 1 millilitrassa vettä, ja tämän jälkeen 1,173 g (4,76 mmol) 2-tert-butyylioksi- ·.· * karbonyylioksi-imiini-2-fenyyliasetonitriiliä. Tuloksena ole- ____: vaa liuosta kuumennetaan 50°C:n lämpötilassa 24 tuntia, jonka ____: jälkeen se jäähdytetään. Tämän jälkeen se ositetaan eetterin • ja veden välille. Vesifaasi tehdään happamaksi HCl:n vesiliuok- no 88400 sella, jonka jälkeen se uutetaan usealla annoksella dikloori-metaanla. Yhdistämällä saatu orgaaninen faasi kuivataan MgSC>4:llä, suodatetaan ja sitten haihdutetaan, jolloin saadaan 775 mg (3,38 mmol; 87%) valkoista kiintoainetta, N-tert-butyylioksi-karbonyyli-0-metyyli-L-proliinia (XX^qI^), jonka rakenne varmistui 1H-NMR-määrityksellä.

C79. Valmistus XX,nI, -30—4 N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-prolyyli-L-fenyyliala- nyylimetyyliesteri (XX^q1^J_ 5 millilitraan dikloorimetaania valmistettuun sekoitettuun seokseen, joka käsittää 118 mg (0,513 mmol) edellä valmistettua, kaavan XX^qI^ mukaista happoa, 123 mg (0,568 mmol) fenyyliala-niini-metyyliesterin hydrokloridia, 79^ul (0,57 mmol) trietyyli-amiinia ja 83,8 mg (0,62 mmol) 1-hydroksibentsotriatsolia, lisätään 117 mg (0,567 mmol) disykloheksyylikarbodi-imidiä. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 20 tuntia, se suodatetaan ja suodos laimennetaan eetterillä. Orgaaninen faasi pestään NaCl:n kylläisellä vesiliuoksella.

Sitten se kuivataan MgSO^rllä, suodatetaan ja haihdutetaan.

Saatu jäännös kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoi-miseen 2-prosenttista metanolia dikloorimetaanissa, jolloin saadaan 211 mg dipeptidiä N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-metyyliesteri (XX^qI4), jonka rakenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä.

C80. Valmistus XX^I^ N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-prolyyli-L-fenyyli- alaniini (XX^qI^)_ 3 millilitraan tetrahydrofuraania valmistettuun, 200 mg (0,51 mmol) edellä valmistettua, kaavan XX^^I4 mukaista dipeptidiä sisältävään sekoitettuun liuokseen lisätään 3 ml NaOHrn 1 M vesiliuosta. Tuloksena olevaa seosta sekoitetaan voimakkaasti kaksi ja puoli tuntia, jonka jälkeen se ositetaan eetterin ja •j veden välille. Vesifaasi tehdään happamaksi HCl:n vesiliuoksella ja sitten se uutetaan usealla annoksella dikloorimetaania. Yhdistämällä saatu orgaaninen faasi kuivataan MgS04:llä, suo- m 88400 datetaan, jonka jälkeen se haihdutetaan, jolloin saadaan 197 mg happoa N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-prolyyli-L fenyyliaianiini (XX3Q13), jonka rakenne varmistui 1H-NMR-määri-tyksellä.

C81. Valmistus XX-^I^ N-tert-butyylioksikarbonyyli-Nln-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-2S-isopropyyli-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyylisilyloksi- oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX^q^ )_ 2 millilitraan dikloorimetaania valmistettuun sekoitettuun liuokseen, joka käsittää 96,3 mg (0,175 mmol) vapaata amiinia (saatu käsittelemällä edellä valmistuksessa XX^qI saatua, kaavan XX2qI mukaista peptidiä trifluorietikkahapon ja dikloorimetaanin 1:1-seoksella, ja neutraloimalla tämä seos NaHCO^zn vesiliuoksella), 147 mg (0,36 mmol) kaavan XX2qII2 mukaista aminohappoa ja 73^,ul (0,52 mmol) trietyyliamiinia, lisätään 53^ul (0,35 mmol) dietyyli-fosforyylisyanidia. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 16 tuntia, se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^:n kylläisen vesiliuoksen välille. Vesifaasi uutetaan edelleen kahdella annoksella dikloorimetaania. Yhdistämällä saatu orgaaninen faasi kuivataan MgS04:llä, suodatetaan ja sitten haihdutetaan. Saatu jäännös kromatografoidaan silikagee-lillä käyttäen eluoimiseen 85-prosenttista etyyliasetaattia heksaanissa, jolloin saadaan 139,2 mg (0,148 mmol; 84%) pep-tidiä N-ter t-butyyl ioksikarbonyy li-Nln-tosyy li -L-histidyyli-5S-amino-2S-isopropyyli-7-metyyli-4S-tert-butyylidimetyyli-silyloksi-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi ^XX3qI2^' ^onka rakenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä.

.·.*. C82. Valmistus XX3q*^ N-tert-butyylioksikarbonyyli-α-metyyli-L-prolyyli-L-fenyyli-. . alanyyli-Nln-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-** isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyyli- *·* ” metyyliamidi (XX^QI^)_ ·;··; 2 millilitraan dikloorimetaania valmistettuun sekoitettuun liuok- seen, joka käsittää .110 mg (0,148 mmol) vapaata amiinia (saatu ·. käsittelemällä edellä valmistettua, kaavan XX^gI2 mukaista ’·*·’ peptidiä trif luorietikkahapon ja dikloorimetaanin 1:1-seoksella 112 88400 ja sitten neutraloimalla tämä seos NaHC03:n vesiliuoksella), 60 mg (0,16 mmol) dipeptidiä XX^I^, ja 25^ul (0,18 mmol) trietyyliamiinia, lisätään 29^ul (0,19 mmol) dietyylifosforyyli-syanidia. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 15 tuntia, se ositetaan dikloorimetaanin ja NaHCO^in kylläisen vesiliuoksen välille. Vesifaasi uutetaan edelleen kahdella annoksella dikloorimetaania. Yhdistämällä saatu orgaaninen faasi kuivataan MgSO^illä, suodatetaan ja sitten haihdutetaan. Tuloksena oleva jäännös kromatografoidaan silikagee-lillä käyttäen 5-prosenttista metanolia etyyliasetaatissa, jolloin saadaan 131,2 mg (0,12 mmol, 82%) peptidiä N-tert-butyyli-oksikarbonyyli-a-metyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyyli-Nln-tosyyli-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX^qI^), jonka rakenne varmistui 1H-NMR-määrityksellä.

C83. Valmistus XX_ I -30- N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyy-li-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyli amidi (XX2QI) 1,5 millilitraan metanolia valmistettuun sekoitettuun liuokseen, joka käsitti 90,1 mg (0,083 mmol) edellä valmistettua, kaavan XX30I1 mukaista peptidiä, lisätään 34 mg (0,25 mmol) 1-hydroksi-bentsotriatsolia. Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu huoneen lämpötilassa 14 tuntia, se haihdutetaan. Tuloksena ole-: va jäännös kromatografoidaan silikageelilla käyttäen eluoimiseen 7-prosenttista metanolia (kyllästetty ammoniakilla) etyyliasetaatissa, jolloin saadaan 70,2 mg (0,075 mmol, 91 %) peptidiä N-tert-butyylioksikarbonyyli-a-metyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyy-li-L-histidyyli-5S-amino-4S-hydroksi-2S-isopropyyli-7-metyyli-oktanoyyli-L-isoleusyyli-2-pyridyylimetyyliamidi (XX^qI), jonka rakenne varmistui ^H-NMR-määrityksellä ja jonka puhtaus analysoitiin HPLC:n avulla käänteisfaasia käyttäen.

C84. Peptidin Boc-PEP-His-LVA-Ile-AMP valmistus .Osa A

Aminohappoa Boc-Ile-AMP (0,32 g, 1,0 mmol) sekoitetaan 10 milli-litrassa TFA-CH2Cl2-seosta (1:1, v/v) 30 minuuttia. TFA ja 113 88400 CH2C12 poistetaan vakuumissa ja jäännöstä pidetään vakuumissa yön yli. Jäännös uutetaan EtOAc:llä ja 5 millilitralla NaHCO^rn kylläistä vesiliuosta. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2S04:n läpi ja haihdutetaan. Raakatuote kromatografoidaan silikagee-lillä käyttäen eluoimiseen 4-prosenttista MeOH-CF^C^-seosta (kyllästetty NH^OHrlla), jolloin saadaan 0,194 g (88 %) aminohappoa Ile-AMP.

Seokseen, joka käsittää 0,194 g (0,88 mmol) aminohappoa Ile-AMP, 0,134 g (0,88 mmol) 1-HOBT:tä, 0,391 g (0,88 mmol) peptidiä Boc-Leu>JVCH (OSit-BuMe2 ) CH2_7val-OH , ja 10 ml CH2Cl2:ta, lisätään 0,181 g (0,88 mmol) DCC:tä. Sen jälkeen, kun seosta on sekoitettu 5 tuntia, DCU suodatetaan pois ja suodos uutetaan CH2Cl2:lla ja kahdesti NaHCO^in kylläisellä vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na„S0,:n läpi, haihdutetaan ja kromatogra- 2 4 foidaan silikageelillä, käyttäen eluoimiseen 4-prosenttista MeOH-CH2Cl2-seosta, jolloin saadaan 0,428 g (75 %) peptidiä Boc-Leu<^-/CH(OSi-t-BuMe )CH2_7val-Ile-AMP.

TLC (4 % MeOH-CH2Cl3): δ 0,11, 0,83-0,95, 0,90, 1,43, 3,55, 4,5, 4,56, 6,10 ja 7,1-8,1.

Osa B

20 millilitraan TFA-CH2Cl2-seosta valmistettua, 0,428 g (0,660 ··· mmol) osassa A saatua yhdistettä sisältävää liuosta sekoitetaan 30 minuuttia. TFA ja CH CL poistetaan vakuumissa ja jäännös uute-- #. 2 * taan metyleenikloridilla ja kahdesti natriumbikarbonaatin kylläi- sellä vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na2S04:n I läpi ja haihdutetaan vakuumissa, jolloin saadaan 0,354 g (98 %) \'V yhdistettä ίβυψ/ΟΗ (OSitBuMe )CH ~Val-Ile-AMP, joka sisältää jäämiä

» » · "" L· Z

yhdisteestä Leut/VCH(OH)CH2_/Val-Ile-AMP .

. . TLC β % MeOH-CH2Cl2(NH4OH2.7: Rf = 0,53 (Rf = 0,17 epäpuhtaudelle).

Osa C

4 millilitraan CH2Cl2:ia valmistettua seosta, joka sisältää 0,150 g (0,273 mmol) osassa B saatua yhdistettä ja 0,161 g (0,393 mmol) yhdistettä Boc-His(Tos)-OH, lisätään 0,056 g 114 88400 (0,271 mmol) DCC:tä. Kolmen ja puolen tunnin kuluttua Ν,Ν'-di-sykloheksyyliurea (DCU) suodatetaan pois. Suodos haihdutetaan ja raakatuote kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimi-seen 4-prosenttista MeOH-C^C^-seosta (0,1 % NH^OH), jolloin saadaan 0,1942 g yhdistettä Boc-His (Tos)-LeuiJ>/CH (0Sit-BuMe2 )CH2_7-Val-Ile-AMP.

TLC jl % MeOH: 96 % CH2C12 (NH^jOHjV: Rf = 0,31.

Osa D

Seosta, joka käsittää 0,1942 g osassa C saatua yhdistettä ja 6 ml TFA-CH^C^-seosta (1:1) sekoitetaan huoneen lämpötilassa puolentoista tunnin ajan. TFA ja CH^Cl^ poistetaan sitten vakuumissa ja jäännös uutetaan CH2Cl2:lla ja kahdesti NaHCO^rn kylläisellä vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^O^rn läpi ja liuotin poistetaan vakuumissa, jolloin saadaan 0,1229 g yhdistettä H-His-(Tos)LVA-Ile-AMP.

TLC β % MeOH: 96 % CH2Cl2 (NH4OH_).7: Rf = 0,12.

Osa E

Seokseen, joka käsittää 0,0148 g (0,0259 mmol) osassa D saatua yhdistettä ja 0,0181 g (0,0518 mmol) yhdistettä Boc-(2S,5S)-Prot|j/CH2o7Phe-OH 2 millilitrassa CH2Cl2:ia, lisätään 0,0107 g (0,0518 mmol) DCC:tä, joka on liuotettu 1 millilitraan CH2Cl2:ia. Sen jälkeen, kun seosta on sekoitettu 2 tuntia, DCC:n ylimäärä sammutetaan noin puolella pisaralla HOAcrtä ja DCU suodatetaan pois. Suodos uutetaan CH2Cl2:lla ja kahdesti NaHCO^cn kylläisellä vesiliuoksella. Yhdistämällä saatu orgaaninen kerros suodatetaan Na^O^rn läpi, haihdutetaan ja tämä raakamateriaali kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 4-prosenttista MeOH/CH2Cl2~seosta, jolloin saadaan 0,0168 g yhdistettä Boc-PEP-His(Tos)LVA-Ile-AMP.

0,0168 edellisessä kappaleessa saatua tuotetta, 0,07 g 1-HOBT:tä, * 3 ml CH2Cl2:ia ja 1 ml THF:ää sekoitetaan yön yli huoneen lämpö tilassa. Tämän jälkeen liuottimet poistetaan vakuumissa ja 115 88400 jäännös uutetaan CH2Cl2:lla ja NaHCO^rn kylläisellä vesiliuoksella. Orgaaniset kerrokset suodatetaan Na^O^rn läpi, haihdutetaan ja kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluoimiseen 6-prosenttista MeOH/CH2Cl2-seosta (0,1% NH^OH), jolloin saadaan 0,0087 g yhdistettä Boc-PEP-His(Tos)LVA-Ile-AMP.

TLC (8% MeOH: 92% CH2C12> NH^OH): Rf=0,38.

HPLC: Brownlee C^g 10^,u kolonni, fosfaattipuskuri, pH 3,0, 80% B (CHgCN)-20% A (H20), k' = 4,8 Q225, virtausnopeus 1,5 ml/min); puhtaus 100%.

FAB-massaspektri: /M + H? + kohdassa m/z 903 (laskettu 903).

C85. Muut yhdisteet

Taulukossa A esitetyt, reniiniä inhiboivat yhdisteet valmistetaan edellä esitettyjen ja alalla muuten tunnettujen menetelmien mukaisesti. Näiden yhdisteiden fysikokemiallisia ominaisuuksia esitetään taulukossa B. Nämä tiedot on joissakin tapauksissa saatu taulukossa A esitetyn rakenteen trifluoriasetaattisuolalla.

Esimerkki B1

Reniiniä inhiboiva vaikutus Tämän keksinnön mukaisten uusien, reniiniä inhiboivien peptidien aktiivisuus määritetään seuraavalla tavalla: ·,Ihmisestä peräisin olevaa, 0,1-prosenttisessa EDTArssa lyofili-: soitua plasmaa saadaan yhtiöstä New England Nuclear, North

Billerica, Massachusetts 01862 nimellä "Plasma Renin Activity : .·. Control" (plasman reniinin aktiivisuustesti). Tämä lyofili-• - soitu plasma saatetaan alkuperäiseen muotoonsa, kokeen suorit-tamispäivänä, kylmällä steriilillä tislatulla vedellä ampullin . . mukana olevien ohjeiden mukaisesti. Alkuperäiseen muotoonsa / palautetun plasman "plasman reniinin aktiivisuus" (PRA) määri-"·' ‘ tetään valmiilla reagenssikitillä "GAMMA-Coat /_125l7 Plasma ·:**: Renin Activity Radioimmunoassay Kit", joka saadaan yhtiöstä ____: Clinical Assays, Division of Travenol Laboratories, Inc.,

Cambridge, Massachusetts 02139. Näiden reagenssikittien vaa- "« 88400 timat toimenpiteet toteutetaan olennaisesti näiden kittien mukana seuraavassa kirjallisuudessa esitetyllä tavalla. Ensimmäistä vaihetta (angiotensiini l:n entsymaattinen tuottaminen) on hieman muunnettu, jotta se soveltuisi reniinin inhibiittorei-den testaamiseen ja jotta kokeen suorittamiseen vaadittava plasman määrä saataisiin mahdollisimman pieneksi. Näin ollen alkuperäiseen muotoonsa saatetun, kokeessa käytettävän plasman jokaista millilitraa kohden lisätään sekoittaen 10^ul PMSF:ää (0,3 M fenyylimetyylisulfonyylifluoridi etanolissa) ja lOO^ul kehittävää maleaattipuskuria, joita molempia on reagenssipak-kauksessa. Sitten 250^ul tästä seoksesta siirretään kuhunkin kehitysvaiheessa käytettävään putkeen, joihin lisätään myös lO^ul reniinin mahdollista inhibiittoria, joka on liuotettu tai suspendoitu 1-prosenttiseen Tween 80:n vesiliuokseen. Tätä seosta inkuboidaan 90 minuuttia 37°C:n lämpötilassa vesihauteessa ravistaen. 37°C:n lämpötilassa inkuboituvien putkien lisäksi kaikista testattavista yhdisteistä valmistettu sokea-koe 4°C käsitellään samalla tavalla, tämän yhdisteen ja vasta-aineen välisen ristikkäisreaktiivisuuden selvittämiseksi. Näiden 4°C:n lämpötilassa inkuboituvien sokeakokeiden tilavuus ja koostumus on identtinen 37°C:ssa inkuboituvien näytteiden kanssa. 90 minuutin pituisen inkuboinnin jälkeen nämä putket laitetaan välittömästi jää-vesi-hauteeseen reaktion päättämiseksi.

lOO^ul 4°C:ssa inkuboitua sokeakoetta lisätään GAMMACOAT-putkeen RIPrssa. Näissä GAMMACOAT-putkissa vasta-aine immobilisoituu putken sisäseinämän alaosaan, jolloin vasta-aineen pipetoimi-selta vältytään. Lopuksi kuhunkin putkeen lisätään 1 ml merkki-puskurin reagenssia ja putken sisältö sekoitetaan. Kaikkien putkien annetaan tasapainottua kolmen tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Tämän tasapainotuksen jälkeen putkien sisältö dekan-toidaan. Sitten putket lasketaan gammalaskurilla. RIP:n tulok-- set arvioidaan Upjohn-tietokoneen päätteillä ohjelmalla Rodbard Radioimmunoassay Program, ja plasman reniinin aktiivisuus (PRA) ilmoitetaan yksikössä mg/ml/h. 4°C:ssa inkuboiduilla sokeako-keillä saadut plasman reniinin aktiivisuudet vähennetään asianmukaisista, 37°C:ssa inkuboiduilla näytteillä saaduista arvoista.

117 88400 PRA-arvoja niistä plasmaputkista, jotka inkuboitiin yhdisteen kanssa, verrataan 1-prosenttista Tween 80:tä sisältäneisiin vertailuputkiin, jolloin saadaan prosenttinen inhibitio. Nämä inhibition tulokset esitetään I^Q-arvoina, jotka saadaan piirtämällä kahden inhibiittorin pitoisuudet ja arvioimalla se pitoisuus, joka tuottaa 50-prosenttisen inhibition. I^-arvojen lisäksi lasketaan myös suhteelliset voimakkuudet. Suhteellinen voimakkuus määritetään vertaamalla RIP:n I^-arvoa yhdisteen IgQ-arvoon. Korostettakoon kuitenkin, että suhteelliset voimakkuudet lasketaan niistä 1,-Q-arvoista, jotka RlPrlle saadaan yhdisteen testaamisen suorituspäivänä, eikä RIP:n keskimääräisistä IgQ-arvoista.

Ollaan todettu, että määritettäessä reniinin potentiaalisten inhibiittoreiden aktiivisuutta, GAMMACOAT-PRA-kokeella voidaan sopivasti korvata RENAK-koe (saadaan yhtiöstä Hoffman-La Roche, ja sitä pidettiin aikaisemmin korkeiden reniinitilojen diagnostisena kokeena).

Esimerkki B2

Entsymaattinen stabiilisuuskoe

Tietyt tämän keksinnön mukaiset yhdisteet ovat stabiileja valituille luonnollisille entsyymeille alla kuvatussa kokeessa. Uskotaan, että stabiilisuus näille entsyymeille saa aikaan reniiniä inhiboivan aktiivisuuden tehokkaamman jakautumisen. Mainitun stabiilisuuden määrittämiseen valittiin tiettyjä ent-syymejä. Nämä oliva pepsiini, kymotypsiini, elastaasi ja karboksipeptidaasi.

W Pepsiini on kattava käsite happamien proteaasien seokselle, • ' joilla proteaaseilla on aktiivisuutta erittäin alhaisissa pH-arvoissa, ja joita vatsan limakalvo erittää suolistoon.

Se valittiin siitä syystä, että se on todennäköisesti ensim- • · · · mäinen proteolyyttinen entsyymi, jolle suun kautta annettuna ____: aktiivisen peptidin tulee olla stabiili. Pepsiinin pilkkoutu- miskohtia ovat tavallisesti Phe-, Tyr-, Leu- ja Trp-aminoha-pot C-pään puolelta.

118 88400

Ohutsuolistoon erittyvät haimanesteet sisältävät kymotrypsiiniä ja elastaasia. Näillä kahdella entsyymillä on proteolyyttisiä pilkkovia ominaisuuksia, joita suun kautta annettuna aktiivisen peptidin on vastustettava kulkiessaan suolistossa ennen absor-boitumistaan. Kymotrypsiini pilkkoo pääasiassa C-pään puolelta Phe-, Tyr- ja Trp-aminohappojäännöksiä. Elastaasi on spesifisempi varauksettomille, ei-aromaattisille jäännöksille, kuten Ala, Vai, Gly ja Ser.

Suolistoon vapautuvat haimanesteet sisältävät myös karboksi-peptidaaseja. Tämä peptidaasiluokka aloittaa pilkkomisen C-päästä ja poistaa jäännöksen kerrallaan. Karboksipeptidaasi A poistaa lähes jokaisen jäännöksen, mutta se on vähemmän spesifinen lysiinille ja arginiinille. Karboksipeptidaasi B (jonka on todettu kiertävän veressä, ja jota on myös löydetty suolistosta) pilkkoo spesifisesti lysiini- ja argiinijäännösten kohdalta. Tämän tyyppinen proteolyyttinen hajoaminen toteutettiin hiivaentsyymillä karboksipeptidaasi Y, eikä näiden kahden entsyymin seoksella. Karboksipeptidaasilla Y ei ole aminohappo-spesifisyyttä; se pilkkoo aminohappojäännöksiä peräkkäin alkaen peptidin C-päästä.

Rutiininomaisiin stabiilisuusanalyyseihin ei valittu trypsiiniä, koska se pilkkoo kaikkein spesifisimmin Lys- ja Arg-jäännösten C-pään puolelta. Tässä keksinnössä mieluiten suun kautta annettavissa RIP-analogeissa ei ole sellaisia aminohappoja, jotka ovat Lys- tai Arg-jäännöksestä C-pään puolella, joten trypsiini on sopimaton proteaasi tähän tutkimukseen.

Korostettakoon, että edellä luetellut spesifisyydet ovat näiden entsyymien primäärejä pilkkomiskohtia. Proteolyyttiset entsyymit voivat myös pilkkoa muista kuin näistä primääreistä pilk-: komiskohdista.

Nämä testatut entsyymit edustavat ainoastaan muutamaa niistä mahdollisista hajoamisreiteistä, joita peptidi kohtaa kulkiessaan suoliston läpi. Kaikkien suun kautta annettuna aktiivisten peptidien tulee olla stabiileja tässä tutkimuksessa käytetyille 119 88400 entsyymeille, mutta muut, vielä tutkimattomat entsyymit voivat kuitenkin edelleen hajottaa tämän peptidin. Kuitenkin mikäli peptidi osoittautuu stabiiliksi ohessa käytetyille peptidaa-seille, niin sen uskotaan olevan stabiili in vivo.

Stabiilisuuden osoittavia menetelmiä sovelletaan kaavan XX mukaisiin yhdisteisiin niiden yhdisteiden ja annostuksen määrittämiseksi, joita yhdisteitä ja annostuksia voidaan käyttää edellä mainituissa suositeltavimmassa, suun kautta tapahtuvassa antamisessa. Nämä menetelmät ovat seuraavat:

Peptidien entsymaattisessa hajottamisessa käytetyt olosuhteet, entsyymien pitoisuudet ja puskurijärjestelmät mukaan lukien, on lueteltu taulukossa 1.

Entsyymireaktiot toteutetaan 37°C:n lämpötilassa 0, 30 tai 60 minuutin ajan. Entsyymit inaktivoidaan upottamalla reaktio-astia kiehuvaan veteen 5 minuutiksi, lisäämällä reaktiotila-vuuden suhteen ekvivalentti annos liuotinta B (kuvattu jäljempänä), sulkemalla reaktioampulli ja jäädyttämällä se välittömästi hiilihappojäätä ja etanolia sisältävässä hauteessa. Ampulleja pidetään jäätyneinä kunnes ne olivat valmiit testattaviksi. Myöhemmissä kokeissa todettiin, että liuottimen B lisääminen on riittävää inaktivoimaan entsyymit, ja ettei näyt-:· teiden kuumentaminen ja jäädyttäminen ole välttämätöntä, joten nämä vaiheet poistettiin tästä menetelmästä. Samoin todettiin, ·". ettei 10-prosenttinen DMSO vaikuta entsyymiaktiivisuuteen ja , .·, täten sitä käytetään joidenkin vähemmän liukoisten peptidien ^ ^ liukenemisen helpottamiseen. Tavallisesti DMSO ei pidä kaikkein "V liukenemattomia peptidejä liuoksessa, mutta sen avulla nämä · peptidit pysyvät hienompana suspensiona.

HPLC-fragmentit * Peptidien fragmentoituminen analysoidaan HPLC-määrityksellä käänteisfaasia käyttäen. Erottaminen toteutetaan 25 cm x 0,46 mm suuruisella SynChrom RP-P-kolonnilla. Peptidifragmentit • * 4 120 88400 eluidaan käyttäen gradienttina suurenevia asetonitriilin pitoisuuksia. Liuotin A käsittää 50 mM Na^PO^ria (6,9 g/1), 1,0¾ H3P04-ia, IX asetonitriilia ja 99% vettä. Liuotin B käsittää 12,5 mM NaH2P04:ia (1,75 g/1), 0,25% H3PC>4:ia, 75% asetonitrii-liä ja 25% vettä. Säätäjänä käytetään Kontron Modell 200 Con-troller:ia, joka ohjelmoidaan siten, että liuottimeen syöttyy aluksi 10% liuotinta B ja että liuottimen B pitoisuus kasvaa 15 minuutin aikana lineaarisesti 50 prosenttiin. Liuottimessa liuottimen B pitoisuutta pidetään 50 prosentissa 10-20 minuutin ajan, jonka jälkeen liuottimen B pitoisuus pudotetaan 2 minuutin aikana 10 prosenttiin. Kolonnin annetaan tasapainottua vähintään 13 minuutin ajan ennen seuraavan näytteen injektoimista. Näytteet injektoidaan kolonnin automaattisella näytteen syöttäjällä Kontron Modell MSI660 Autosampler, joka on varustettu lOO^ulm näytekierukalla. Kolonnista ulos tulevaa virtaa seurataan Beckman-yhtiön kahdella aallonpituudella toimivalla detektorilla 165. Absorptio mitataan aallonpituuksilla 204 ja 280 nm.

Tietojenkäsittely

Signaali UV-absorptiosta aallonpituudella 204 nm syötetään Hewlett Packard Modell 3390A-integrattoriin. Sen peptidin, jonka eluutioaika on yhtäpitävä lähtöinhibiittorin eluutio-ajan kanssa, tuottaman piikin painoa käytetään määritettäessä lähtöaineena toimineen peptidin hajoamisesta. Prosenttiset muutokset lähtöaineella hetkellä 0 saadusta piikistä lasketaan 30 ja 60 minuutin pituisen inkubaatioajän jälkeen. Kaikkia testattuja peptidejä verrataan niihin tuloksiin, jotka saatiin yhdisteellä RIP, jota kussakin kokeessa pidetään vertailuna.

Esimerkki B3

Antaminen suun kautta - Rotat, joille on annettu reniiniä Arviointitekniikka in vivo rotissa, joille oli annettu reniiniä, :: oli sovellutus menetelmästä, joka on esitetty julkaisussa Blaine, .,· Schorn ja Boger; Hypertension G (Suoo 1): 1111-1118, 1984.

Tämän julkaisun menetelmää muunnettiin siten, että samanaikaisesti voitiin tutkia sekä suun kautta tapahtuvaa antamista, että 121 88400 suonen sisäisesti tapahtuvaa antamista. 200-350 gramman painoiset, urospuoliset Sprague-Dawley-rotat nukutettiin dial/uretaa-nilla (100 mg/kg i.p). Kaulaan, vatsan puolelle, tehtiin viilto keskiviivaa pitkin, henkitorvi avattiin ja molemmat kiertä-jähermot leikattiin. Yksi päänvaltimoista kanyloitiin PE 50 putkella ja liitettiin Statham P230-anturiin ja Grass-polygra-fiin, jolloin verenpainetta voitiin seurata jatkuvasti. Molemmat kaulalaskimot kanyloitiin PE 50 putkella suonen sisäisten injektointien ja infuusioiden helpottamiseksi. Joissakin kokeissa imeväisten ruokkimiseksi tarkoitettu putki (Davol no. 3641) katkaistiin 19 cm:n pituiseksi ja työnnettiin rotan vatsaan sen suun kautta. Putki suljettiin pihdillä, vatsan sisällön takaisinvirtaamisen estämiseksi. Yhdisteitä ja/tai välittäjäaineita annettiin suun kautta ainoastaan sellaisille eläimille, jotka eivät olleet saaneet ravintoa viimeisen 24 tunnin aikana. Leikkaustoimenpiteiden jälkeen hermosolmu (ganglio) salvattiin suonen sisäisesti mekamyyliamiinilla 1,25 mg/kg. Kun keskimääräinen verenpaine valtimossa oli asettunut suurin piirtein arvoon 60 mmHg, rotille annettiin osittain puhdistettua sian reniiniä (ICN Pharmaceuticals Inc., Cleveland OH) annostusnopeuden ollessa alussa suurin piirtein 0,11 GU/min 5 minuutin ajan, mitä seurasi tuki-infuusio nopeudella noin 0,028 GU/min. Reniinin infuusio riitti palauttamaan verenpaineen tasolle, joka oli todettu ennen kiertäjähermon katkaise-mistä ja ganglion salpaamista. Suurimmassa osassa kokeita ... verenpaine vakiintui 20 minuutin kuluttua reniinin infuusion aloittamisesta. 15 minuutin pituisen tarkkailujakson kuluttua yhdistettä tai sen välittäjäainetta annettiin suonen sisäisesti • ·’ tai annettiin suun kautta vatsaan. Verenpainetta seurattiin • · · M : yhteensä 105 minuutin ajan lääkeaineen tai välittäjäaineen an- ν'.’ tamisen jälkeen.

Esimerkki B4

Antaminen suun kautta - Natriumtasoltaan alennetut apinat *. Arviointitekniikka in vivo apinoissa, joiden natriumtaso oli alennettu, oli sovellutus menetelmästä, joka on esitetty julkaisussa Pals et ai, Clin. and Exper. Hypertension A7(l): 105-; 121, 1985. Urospuoliset cynomolqus-apinat (paino 4-6 kg) si- 122 88400 joitettiin kädellisten nisäkkäiden pakkotuoleihin. Parin vuorokauden pituisen sopeuttamisjakson kuluttua kukin apina nukutettiin ja polyvinyylistä valmistetut johtoputket istutettiin steriileissä olosuhteissa vatsavaltimoon ja rintakehän onttolaski-moon suoliluun ulkoisen valtimon ja laskimon kautta, vastaavasti. Johtoputket kulkivat ihon alla istutusalueesta päälakeen ja otettiin ulos. Apinoiden annettiin toipua leikkauksesta vähintään viikon. Tämän viikon aikana apinoita ruokittiin apinoille tarkoitetulla natriumköyhällä ravinnolla "Standard SKF Monkey Diet deleting sodium" (ICN Nutritional Biochemicals, Cleveland, OH), jota annettiin sellaisia määriä, että kaliumtaso saatiin arvoon 1 meg/kg vuorokautta kohden, ja niille annettiin suonen sisäisesti myös 0,9-prosenttista suolaliuosta, joka riitti tuottamaan natriumtasoksi 1 meg/kg vuorokautta kohden. Natriumtaso saatiin alenemaan siten, että päivittäinen suonen sisäisesti annettu suolaliuos jätettiin pois ja se korvattiin antamalla apinoille suonen sisäisesti furosemidiä (1 mg/kg ruumiin painoa vuorokaudessa) kuuden vuorokauden ajan. Juomavettä sallittiin mielin määrin. Seitsemäntenä päivänä valtimon johtoputki liitettiin Statham-paineanturiin ja Grass-polygrafiin, jotta verenpainetta voitaisiin mitata jatkuvasti. Sydämen lyöntinopeutta seurattiin jatkuvasti Grass-takografilla, joka sai impulssin valtimon painepulssina. Apinoille annettiin saralasiinia, joka on angio-tensiini II :n antagonisti, suonen sisäisesti annoksena 1 mg/kg noin 5 tuntia ennen kuin niille annettiin suonen sisäisesti reniiniä inhiboivaa peptidiä tai 18 tuntia ennen kuin niille annettiin suun kautta reniiniä inhiboivaa peptidiä reniinistä riippuvan verenpaineen suuruuden selvittämiseksi. Reniiniä inhiboivaa peptidiä välittäjäaineessa tai pelkkää välittäjäainetta annettiin suonen sisäisesti kaulalaskimossa olevan johto-putken kautta tai annettiin "suun kautta" vatsaan nenän kautta vatsaan johdetulla imeväisen syöttöputkella (Davol no. 3641).

Näissä kokeissa testatuista, tämän keksinnön mukaisista yhdis teistä suositaan yhdisteen Boc-Pro-Phe-NMHis-Leu-4>/-CHOHCH27-

Val-Ile-AMP sitraattisuolaa (katso kohta C76. Valmistus X^qVI).

123 88400

Taulukko 1

Olosuhteet reniiniä inhiboivien peptidien entsymaattisessa hajoamisessa

Entsyymi Pitoisuus Puskurijär- 25 millilitraa jestelmä kohden lisätty määrä peptidiä, pitoisuus 0,8 _ _ _ _mg/ml_

Pepsiini (Difco 0151-15) 0,01 mg/ml 0,05 M HC1 0,25 ml

KarbokBipeptidaasi 50 U/ml 50 mM Tris-HCl Y (Sigma C 3888) pH 7,5 5 ^ul

Kymotrypsiini 25 U/ml 50 mM Tris-HCl 5 ,ul (Sigma C-3142) (0,51 mg pH 7,5 ' kiintoainetta/ ml)

Elastaasi 50 U/ml 50 mM Tris-HCl 5 ui (Sigma E-1250) (9,2 ul/0,25 pH 7,5 ' ml puskuria) 124 88 400

Taulukko A

Yhdiste* X Ag B, Cg Dg %0/Fii G12 Z

1 Ac FTrp Pro Phe NMIis LVA Ile AMP

2 PQA abs abs abs t»His LVA Ile AMP

3 Ac FTrp Pro Phe NMIis S tätiini Ile 1¾¾

4 Ac abs Pro Phe rWHis LVA Ile AMP

5 Ac Phe Pro Phe MflHis LVA Ile AMP

6 H- abs Pro Phe M«is LVA Ile AMP

7 PGA abs abs Phe Mfflis LVA Ile AMP

8 Ac PLA abs abs IWEiis LVA Ile AMP

9 Ac His Pro Phe MMis LVA Ile AMP

10 Boc abs abs Nall IWfiis LVA Ile AMP

11 Boc abs Pro Nall IWHis LVA Ile AMP

12 NQAl abs abs abs NMiis LVA Ile AMP

13 NQA2 abs abs abs NYHis LVA Ile AMP

14 Ac abs abs abs IMIis LVA Ile AMP

- 15 Boc abs abs Phe IMHis LVA abs IBA

16 Boc abs abs ' ENal2 ISMHis LVA Ile AMP

17 Boc abs abs Nal2 rtEis LVA Ile AMP

18 Ac Phe Pro Ehe IMtLs Statiini Ile NE^ 19 Ac FTrp Pro Phe NMiis Statiini Ile NHj 20 Ac FTrp Pro Phe Nfiis PRP abs NHj

21 Boc abs Pro Nal2 M4iis LVA Ile AMP

22 Boc abs Pro DEhe IMIis LVA Ile AMP

23 Boc abs abs Phe M*His LVA abs ΓΈΑ 24 Ac abs Pro Phe NMHis PRP abs NE^ ,25 88400

Yhdiste’ X Ag B7 C8 D9 e10/fx1 G12 Z

25 AC ETrp Pro Phe IMiis LVA Ile 1¾ 26 H ETrp Pro DPhe IMiis S tätiini Ile 1¾ 27 H ETrp Pro Phe IMiis S tätiini Ile 14¾ 28 Ac FTrp Pro · DPhe IMiis S tätiini Ile 14¾ 29 Ac ETrp Pro Phe IMiis S tätiini Ile 14¾

30 Ac ETrp Pro Phe N-His LVA Ile AMP

31 Boc ETrp Pro Phe IMiis LVA Ile AMP

32 Boc abs Pro Phe IMiis LVA Ile AMP

33 Boc abs abs Phe IMiis LVA Ile AMP

* Yhdisteiden kemialliset nimet ovat seuraavat:

Yhdiste 1: N-asetyyli-l-formyyli-L-tryptofyyli-L-propyyli-L-fenyylialanyyli-N-[2-hydroksi-5-metyyli]-1-(2-metyylipropyy-li)-4-11 t2-metyyli-l-[(2-pyridinyylimetyyli)amino]karbonyy-li]butyyli]amino]karbonyyli]heksyyli]-N-alfa-metyyli-(1S-[1R*, 2R*,4R*(1R*,2R*)]]-L-histidiiniamini

Yhdiste 3: N-asetyyli-l-formyyli-L-tryptofyyli-L-prolyyli-L-1“ fenyylialanyyli-N-[4-[[1-(aminokarbonyyli)-2-metyylibutyy- li]amino] -2-hydroksi-l- (2-metyylipropyyli) -4-oksobutyy 1 i] -N- alfa-metyyli-(IS(lR*f2R*,4(1R*,2R*)]]-L-histidiiniamidi/mo- : notrifluori-asetaattisuola

Yhdiste 4: 1-asetyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-N-[2-hyd-roksi-5-metyyli-1-(2-metyylipropyyli)-4-[[[2-metyyli-l-[[2--T: pyridinyylimetyyli)amino]karbonyyli]butyyli]butyyli]maino]k- [ . arbonyyli]heksyyli]-N-alfa-metyyli-(IS[1R*,2R*,4R*)1R*, 2R*)]]-L-histidiiniamidi 126 88400

Yhdiste 10: N-[(1,1-dimetyylletoksi)karbonyyli]-3-(1-nafta-lenyyli)-L-alanyyli-N-[2-hydroksi-5-metyyli-1-(2-metyylipro-pyyli)-4-[[[2-metyyli-l-[[(2-pyridinyylimetyyli)amino]kar-bonyyli]butyyli]amino]karbonyyli]heksyyli]-alfa-alfa-metyy-li-[IS-(1R*,2R*,4R*(1R*,2R*)]]-L-histidiiniamidi

Yhdiste 20: N-asetyyli-l-formyyli-L-tryptofyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-N-[1-[[[2-amino-2-okso-l-(fenyylimetyy-li)etyyli]amino]metyyli]-2-fenyylietyyli]-N-aifa-metyyli[s-(R*,R*)]-L-histidiiniamidi,bis-trifluoriasetaattisuola-hyd-raatti

Yhdiste 25: N-asetyyli-l-formyyli-L-tryptofyyli-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-N-[4-[[[1-(aminokarbonyyli)-2-metyylibu-tyyli]amino]karbonyyli]-2-hydroksi-5-metyyli-1-(2-metyyli-propyyli)heksyyli]-N-aifa-metyyli-[IS-[1R*,2R*,4R*(1R*, 2R*) ] ]-L-histidiiniamidi,monotrifluoriasetaattisuola-hyd-raatti

Yhdiste 31: N-[(1,1-dimetyylietoksi)karbonyyli]-1-formyyli-L-tryptofyyli-L-prolyyli-N-(2-hydroksi-5-metyyli-1-(2-metyy-lipropyyli)amino]karbonyyli]butyyli]amino]karbonyyli]heksyyli] -N-alfa-metyyli-[IS-[1R*,2R*,4R*(1R*,2R*)]]-L-histidiiniamidi ,

Yhdiste 32: 1-[(1,l-dimetyylietoksi)karbonyyli]-L-prolyyli-L-fenyylialanyyli-N-[2-hydroksi-5-metyyli-l-(2-metyylipro-pyyli)-4-[[[2-metyyli-l-[[2-pyridinyylimetyyli)amino]karbonyyli] butyyli] amino] karbonyyli] heksyyli] -N-alfa-metyyli-[1S-(1R*,2R*,R*(1R*,2R*)]]-L-histidiiniamidi

Yhdiste 33: N-[(1,1-dimetyylietoksi)karbonyyli]-L-fenyyli-alanyyli-N-[2-hydroksi-5-metyyli-1-(2-metyylipropyyli)-4-[[[2-metyyli-l-[[(2-pyridinyylimetyyli)amino]karbonyyli]-butyyli]amino]karbonyyli]heksyyli]-N-alfa-metyyli-[1S-[1R*,2R*,4R*(1R*,2R*)]]-L-histidiiniamidi.

127 88 400

Taulukko B

Taulukko B - Fysikokemiallisiä tietoja

Yhdiste Ms [M + H]+ Aika (min) Tietoja retentiosta HPLC-määrityksessä

Olosuhteet1 1 1086 15,3 a 2 720 12,2 a 3 - 10,1 d 4 872 18,5 a 5 1019 15,2 a 6 830 2,0 a 7 844 12,5 a 8 776,4696 18,5 b(i) 9 1009 2,0 a 10 883 16,4 a 11 980 15,3 a ;:· 12 770 7,9 a :···: 13 770 7,5 a 14 628 13,3 a : 15 685 4,7 c(i) 16 883 18,5 a ... ; 17 883 16,4 a :T: 18 - 14,1 d :V: 19 - 13,8 d :···: 20 949 11,3 d *·*·’ 21 980 18,2 a 22 930 16,4 a • 128 88 400

Yhdiste Ms [Μ + Η]+ Aika (min) Tietoja retentiosta HPLC-määrityksessä

Olosuhteet1 23 699 6,1 c(ii) 24 - 6,3 d 25 995 11,3 d 26 - 0,9 d 27 - 9,2 d 28 - 5,02 d 29 - 5,08 d 30 1086 15,3 b 31 1144 17,0 b k'-arvo lasketaan esitetyissä olosuhteissa vähentämällä yhdisteen retentioajasta liuotinrintaman retentioaika ja jakamalla tämä erotus liuottimen retentioajalla.

1. HPLC-olosuhtet: a. Kolonnina Brownlee RP-18 Spheri-10 18-10A, 25 cm x 4,6 mm (sisähalkaisija) μΜ, UV-ilmaisin aallonpituudella 254 nm, eluentti: 90-prosenttinen metanoli, 10-prosenttinen fosfaattipuskuri vedessä, pH 3, virtausnopeus 1,5 ml/min.

b. Kolonnina Brownlee RP-18 Spheri-5 25 cm x 4,6 mm (sisähalkaisija) , virtausnopeiis 2 ml/min, liuotin A on 90-pro-senttista fosfaattipuskuria ja 10-prosenttista asetonitrii-liä (CH3CN), liuotin B on 10-prosenttista TFA:ta, 10-pro-senttista fosfaattipuskuria, pH 3, ja 80-prosenttista CH3CN:a, olosuhteet: (i) 25 % A:ta, joka muuttuu 0 %:ksi A:ta 20 minuutin aikana, käyttäen ohjauslaitteena Waters Model 680 Automated Gradient Controlleria, sen käyrää 8.

129 68400 c. Esitetty arvo ei ole aika minuutteina vaan k'-arvo. Kolonnina (mitat 25 cm x 4,6 mm sisähalkaisija): EM (EMerck Hibor LlChrosorb RP-181, W (Waters /xBondapak-fenyyli tai BR (Brownlee RP-18 Spheri, UV-detektio aallonpituudella 225 nm, virtausnopeus 1,5 ml/min, liuotinjärjestelmä I: liuotin A on 0,2-prosenttinen TFA vedessä ja liuotin B on 0,2-prosenttinen TFA CH3CN:ssä tai liuotinjärjestelmä II: liuotin A on 98 % vettä, 1 % CH3CN:a 1 % H3P04:a, 50 mM NaH2P04:a ja liuotin B on 75 % CH3CN:a 25 % vettä, 0,25 % H3P04:a, 125 mM NaH2P04:a; olosuhteet: (i) BR, II 35 % A, 65 % B; (ii) BR, II 40 % A, 60 % B.

d. Retentioaika määritettiin käyttäen SYNCHROPAK-käänteis-faasikolonnia C18 analyyttisessä HPLC-määrityksessä seuraa-valla gradienttijärjestelmällä: 83,3 % A ja 16,7 % B kahden minuutin ajan; 83,3 % A ja 16,7 % B, joka muuttui 100 %:iin B:tä 20 minuutin aikana; virtausnopeus 1,5 ml/min, paine noin 10 MPa; UV-detektio aallonpituudella 220 tai 280 nm; liuotin A on 10 % CH3CN:a, 0,2 % TFA:ta, loppu vettä; liuotin B on 70 % CH3CN:a, 0,2 % TFA:ta ja loppu vettä.

130 88400

Kaavat (CH3>2CHCH2 H

t,/WOH S ta (Statiini)

H2N /'> M H# ÖH O

0 «2 H

Λ"'Χη iTH *

/"H R H O

OTBDMS

*1^2 β 0 iii—jj x y Ii / n u b

OTBDMS X-O. JCOOH

XXrT

R4 **6 131 88 400

Kaavat (jatkuu) 0 /- r-ch2-c-n 11

K

ch2oh

H

Rl - CH2 - L

- CH2Br I

H V

H

h - CH2 - C.

- H

CH2Br VI] 132 88 400

Kaavat (jatkuu)

^ /N, K VIIA

H CH20H H

_ VIIB

f ''R f\ n - -ch2oh ' Q Qi °

IXA/B/C/D

H * *H

ch2oh

Kaavat (jatkuu) 133 88400 no-jy

Rr^/ R XA/B/C/D

" \ o H

, OH

RK .H

WD

o

h°a „'H

WC

°Y\

·:·: 0 H

134 88400

Kaavat (jatkuu) (Br)

CV XH

Riv. y' xia/d

0 H

H II

XIIA/B

O H

h m2

^ R XIIIA/B

°^r\

0 H

Kaavat (jatkuu) 135 88400

^NHBOC

XIVA/B

v^'

O H

/COOK

80C-N)i

\ / X XVA/B

H R

S02CH3 T\,

XVIB/C

136 88 400

Kaavat (jatkuu) 0

X“fi6‘B7"C0*D9- 2” Z XX

HO/ H h R

R i CH^ h

\/ O

xl6 H(A H r1 1 (CH3)2CH-CH2 h 0 ROB-Hi, H J\ xx« H OH H CH(CH3)2 R V1 °

'/K/' IXfi/B/C/D

02 Oi hk f\ hoch2 h

137 8 8 4 O O

Kaavio A Tapaus I

S /- 0 ,- r-ch2-c-oh+h/J-,

Ch20H CH20H *

II

Tapaus I

I-1 iSb).CH.CH,COCl , («,,,οκηΑΓΊ V ^ >v ch2oh ^ ij ch2-o-c-ch2-ch(ch3)2

Tapaus I2 KOH \ / (CH3)2CHCH2CN --) (ch3)2chch2cn

j\ o X

m // A H

ch2o - C - CH2CH(CH3)2 *

Kaavio B

Tapaus II

138 88400

H

R^CHa-CHC-CHa-OH vaihe R,-CHa-C

\-CHa-0H

H

III IV

Vaihe III Ha/cat. Vaihe II

i

H H

/ /

Ri-CH2-Cv Ri-CHa-C

NC-H \-CHa-Br

I I

CHa-OH H

VI- V

Vaihe IV

H

Rn-CHa-C

\-H

CHa-Br

VII

Kaavio B (jatkuu) 139 88 400

Tapaus II^ 1) EtMgBr

(CH3)aCH-CHa-CSCH 2)~~CH^Ö-* (CH3) 2CH-CH-C = C-CH2OH

III missä Rx on isopropyyli

Tapaus II^ S0C12

ho-ch2-c=c-ch2-oh -> C1-CH2-C=C-CH20H

— phM?Br--J> Ph-CHa-C=C-CHa-0H

III missä on fenyyli

Kaavio C

Tapaus III A/B

140 88400 R-CHa-C- \ί 1L-LDA---¥ jf~ ^ z) v γη m 'C-CHaBr * Ή

CHa0H I CH20H

H

11 V VIIIA

Vaihe IA

Λ v0H o ,- OH H 0 _

Me3N0 /ί \ + H * H R /d. H° 'H H *»

CH20H CHa°H

Vaihe HA IXB

°2 ?1 0 Q2 όι 14 R f\

HOCHj H

Kaavio D

Tapaus IIIA

141 88400

Ph-P (Br) H » CCI4 CV/ if CBr4 * /\f ixfl -^ 1*1 —' /~\J* -^ o~\^

Vaihe IIIA tl Ή Vaihe IVA lf 'H

0 0

Xfl Xlfl H N 3 Pelkistys ^/^2 k· w_ \ H esim. X » ^ A/ H,/kat. , _/Y_ „ -> 'Xff' 1

Vaihe VA li H Vaihe VIA 0 0

Xllfl xlllfi

H

u N-BOC „ B0C2° V H Κΐΐ2 fi

X/ KOH V COOK

-> h-/ > boc- h/CY

°V'\. H# °H H R

Vaihe VIIA H Vaihe VIHA

0 XVfl

XlVfl

(1 )TB0MS-Cl /imidatsoli R1^2 ,H

(2) K2C03/Me0H V' COOH

XVfi _____> BOC- (31 KHS04 H /\ 4\

OTBDMS

Vaihe IXA

IA

Kaavio E

Tapaus IIIB

142 88400 HO H CH3SO2CI CH3SO2 0 h

V h E13N V H

IXB-=> -> Ri~^ / \yR

Vaihe IIIB 0s|f'''H Vaihe XB V^'''H

0 0 XB XVIB

H* "S H* <NH2 u Pelkistys γ h Ν°Ν3 /\i esim. /\f R.—' f—\ .o H_/kat. RiS f \ jfi.

—> Oc —* °γ%

Vaihe XIB |J H Vaihe VIB jj XI IB Χ1ΠΒ

H NH-BOC

BOC2O V μ R1CJJ2

p K0H X COOK

^ 1 ^ Β<Κ·η/Υ

Vaihe VIIB j] ^ Vaihe VIIIB HO H H R

X1VB XVB

Rt^2 ^ <1 )TB0MS-Cl /imidatsoli \/ (2) K2C03/Me0H BOC- nV/ XVB -> H J\ /\

(3) KHS0< o<bohsH R

Vaihe IXB IB

Kaavio F

Tapaus III C/D

1« 88400

Ri —-i 0 ϊ ΓΛ R-CHa-C-N H yA Nx M " -“-v, ‘ '* Λ“

CnadH cHaBr CH2°H

II VII VII IB

Vaihe IB

OH 0H 0 _ R H\/>s0H °j y_ \ + /θ^\ H OH H * fZ HO H H R /T"5

/ Ή /'H

CHaOH ch_0h

Vaihe IIB

IXC IXD

R V* °

IXC/O

02 / R yC^ hoch2 h 144 88400

Kaavio G Tapaus IIIC

nH SO-CH, r ä nH _ 0 2 3

1 \ Rl V'HAH

“—

Vaihe IIIC Vv"v- Vaihe XC 0. iR

1Γ ii V"\

xc 0 XVIC I H

H N3 'o</

—' VT

Vaihe XIC q

XIIA

1« 88400

Kaavio H

Tapaus IIID

(Br)

Cl

H 0H 4 Ή M

IM ' X,·' _^ Pl'.....-^ r~-i —> 's?i* 0 υ

Vaihe IIID χρ XJQ

H «3 -0¾

—^ vV

Vaihe VD q

XI IB

Kaavio I

Tapaus IV

146 88400 R1^2 ,H RlCth h o Y COOH H-Ile-OBz \/ Il H2/Pd ~OfX -- -OOC ^

H \ H li K \ H R Vaihe II

OTBDMS Vaihe I OTBDMS

R‘% .H 0 R,<^/ S

Y^JI-Π,-ΟΗ H-Phe-OCH, 80C- Λ/νΗ '«-Phe-O-CHj ΒΚ-Ν / Y -> H /, /'

H #' «v H \ H R

H \ H R Vaihe* TTT OTBDMS

OTBDMS vame j.ii XXIV xxi 147 88400

Kaavio J

Tapaus V

“%H li *«&(· o BOC-N'V^Y'C',,*'Ph*‘0'CH3 TFR u X^.C-ll.-Ph.-O-CHj H h ·, ff > —> ^vO(

0TBI,HS vaihe I H OTBOMS

xxi h2n-xxii POfi-Phe

Rich, h n DCC/HOBT V/ Π H* X. X-Ile-Phe-O-CH, -> P0fl-Phe-N y y 3 ->

H ' H R

Vaihe II OTBDMS Vaihe III

RlCljU H o X /-v .C-I1e-Phe-O-CH, POfl-Phe-hT y y 3

H OH H R

XX1

Kaavio K

Tapaus V

148 88 400 i —ϊϊ_>

Ph - 0 - CH2 - C - NH ^0CH2Ph 10% Pd/C

Λ ''CH2Ph H

V'A

0 0 Ph - 0 - CH2 - C - J l.

^oh * 'cH2Ph

V B

Kaavio L

Tapaus VI

149 B8400

RlCik ,H 0 BOM

V II I

^^X^vs^C-lU-Phe-OCHj BOC-His-OH

"2" Jk X ->

H \ H R DCC/HOBT

OTBDMS

Η2Ν-ΧΧΠ Vaihe 1

«1% ,H O

BOM H TFfl

H H R Vaihe II

OTBDMS

POfi-OH

*1% ,H o MSCI-HCl I X XC-I le-Phe-O-CH-x H0BT ^ H-Hls-hT Y Y 3 > H /' /v

H OH H R

Vaihe III

H2N-XXIII r1W2H 0 T X>\J!-ne-Phe-0-CH3 H2/Pd

H OHH R

• : Vaihe IV

» n ,/'ν. X-I l e-Phe-O-CH·» ·. Pon-His-r y' y 3

H /\ A

li OHH R 1 : xx2

Kaavio M

Tapaus VII

150 88400

TBA-Phe-OH

BOMI(^ /H 0 XXV

H-hI 1 e~Phe~°“CH3 ^01 HCI

H OH H ίϊ HOBT

H2N-XXI11 Vaihe I

rich2 H

BOM V · S

I y II H^/Pd TBfl-Phe-ΗΪ s-NxV^sv^C"11 e"Phe"0_CHx H Λ i\ -->

H OH H R

Vaihe II

rich2 h

V S

TBR-Phe-His-N'^Sf^X^0-1 le~Phe-0-CH,

H OHH R

XX3

Kaavio N

Tapaus VIII

151 88 400

H-BPR

RlCH2 H o EDC-HCl R1CH2 H 0

\/ Il HOBT V H

X /v .C-lle-OH X /x X-He-BPR

boc-nj; -> B0C h Jl· /

H \ H R Vaihe I H \ H R

OTBDMS 16 1 OTBDMS

XXIV

1) TFfl

TFfi 2)TBfl-Phe-0H

2> T Ricy2 n o XXV

BOC-Kis-OH TOS \; Il 3) DCC

_^ I X ^ .C-lte-BPfi ^ BOC-His-NX V ^ 3) DCC H /\

H ' H R

Vaihe II OTBDMS Vaihe 111

RlCi2 <H O HOBT

TOS \/ li H0BT

I X ^ .C-Ile-BPA

TBfi- Phe-flis-N > H /·

H 0HH R Vaihe IV

*>%,Η o

V II

____ X /V .C-lle-BPA

TBfi- Phe-Hi s-N

H /\

H OHH R

Y : XX4

Kaavio O

Tapaus IX

1=2 88400 H2/Pd (CH3)2CHCH2 H n V 11 ^ >S. X-l le-O-Bz

BOC-Jj Y/C Vaihe I

§ H H bHtCHjJo OTBDMS

(CH3)2CHCH2 H 0 H-Phe-0CH3

V H,, Λ11 EDC-HCl HOBT

BOC- K Y Y -> H /H i‘tH(CH3)2 N-metyylimorf Oliini

OTBDMS

Vaihe II

(CH3)2CHCH2 h 0 BOC- AV'1 lC“Phe'°CH3 TF° H £ H H fcH(CH3)2 >

OTBDMS

Vaihe III

153 88400

Kaavio O (jatkuu)

Tapaus IX (jatkuu)

TOS

(CHsljOH&H g BOC-h/is-OH

l e-Phe-0-CH3 Dcc ^ /H H fcH(CHt)2

OTBDMS Vaihe IV

XXIX2 1) TFfl (CH3)2CHqH, H n 2) NaC03

T0S y/ jj 3) TBfl-Phe-OH

B°c- ^Y^Yy;0'11 c-phe-°-CH3 edc , #H H fcH(CH3)2

0TBDMS Vaihe V

XXIX3 (CH3)2CHCH2 H 0

70S V'* 11 HOBT

_ 1 /s. X~I le-Phe-O-CH-T

T8fl- Phe-His-N jr yf 3 ^ HO H H CH(CH3)2

: Vaihe VI

-;v (ch3)2chch2 h 0 ^ .C-lle-Phe-O-CH-, T8R- Phe-His-N γ y' 3 HO H H CH(CH3)2 XX5

Kaavio P

Tapaus P-I

154 88400 ΓοΊ Dcc

Boc-lle + H2NCH2--OiJ ->

1-HOBT

CH2CI2

Boc-lle-NHCH‘2 1 suojaavan ryhmän poistaminen hapolla 2) neutralointi 3) Boc-Sta, DCC, 1-HOBT, CH2CI2

Boc-Sta-lle-NHCHi—Cp3 Suojaavan ryhmän poistami- if 1) nen hapolla —--> 2) neutralointi 3) 8oc-His(Tos), DCC, CH2CI2 8oc-His(Tos)-Sta*lle-NHCH2 -J§)

N

1) suojaavan ryhmän poistaminen hapolla 2) neutralointi 3) Boc-Pro*[CH2OlPhe-OH.

DCC,CH2Cl2 8oc-Pro*[CH20}Phe-HisCTos)-$ta-l!e-NHCH2 1-HOBT.

THF, CH2Ö2

Boc-Pro*[CH20lPhe-His-Sta-lle-NHCH2

Kaavio Q

Tapaus Q-I

155 88400

. H OH

f 1, (R)-PhCH2CHCCOH

""-^0H *· . . (—1^,9h occ L-orolinoli 0

NcH, THF, ^

^ H

eoe-i-A^v^00" 1) 6N HCl Qp>> 2) Boc20 0 2 4 4·

Bee-12S. 5S)-ProV tCH^J Ph· H OH 1-

O

3 . · . ·

Claims (8)

156 88 400

1. Menetelmä reniiniä inhiboivien peptidien valmistamiseksi, joilla peptideillä on kaava x-a6-B7_c8-d9~e10“f11"g12-Z jossa X on vety tai tavanomainen peptidikemiassa käytetty amino- tai hydroksisuojaryhmä; jossa Ag puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XLX tai XL2 r4 r6 r4 r6 \ / \ / CH R* CH O I 111 CH O -N—CH—C- / M O C- / XLX XL2 jossa By puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XLb Sf-—— R4 J XLb jossa Cg puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XL1, xl2 XL2a' r4 r6 r4 r6 \ / \ / CH R4 CH O Ron O I 111 I II CH O -N—CH—C- -N CHo-C- / \1 .t o c- ; / XL1 XL2 XL2a jossa Dg on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XLg 157 88400 Λ -LILX xl3 jossa Eio_Fll on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XLg, XL6a tai XL6b r1ch2 .h 0 RiCH2 H HO H H Rn H R21 O XL6 XL6a RlCH2 H O -nh v if -RU XL6b jossa * tarkoittaa asymmetriakeskusta, joka on joko R- tai S-koni iguraatiossa; jossa Gi2 puuttuu tai on kaksiarvoinen ryhmä, jolla on kaava XL4 tai XL4a R4 R0 R2 H \ / v R4 CH O X I I Ϊ -nxV t : —N—CH—C— H O xl4 XL4a jossa Z on -N(R4)R14 ·:··; jossa R]_ on ; (a) vety, » · • · « 158 88400 (b) Ci-Cs-alkyyli, (c) fenyyli tai (d) C3-C7-sykloalkyyli; i jossa R2 on (a) vety tai (b) -CH(R3)R4; jossa R3 on (a) vety tai (b) Ci-Cg-alkyyli; jossa R4 aina esiintyessään on sama tai eri ryhmä ja on (a) vety tai (b) C^-Cg-alkyyli; jossa R4 ryhmässä Dg on Ci-Cg-alkyyli; jossa Rg on (a) vety, (b) C^-Cg-alkyyli, (c) -(CH2)p-aryyli, (d) -(CH2)p-Het tai (e) C3-C7~sykloalkyyli; jossa R7 on lH-imidatsol-4-yyli; jossa Rg on (a) vety, (b) C^-Cg-alkyyli, jossa Rj^i on (a) vety, (b) C^-Cg-alkyyli tai (c) fenyylimetyyli; jossa R^4 on (a) vety, (b) Ci-CiQ-alkyyli tai (c) pyridinyyli-C^-Cg-alkyyli; jossa R2q on (a) vety tai (b) C^-Cg-alkyyli; jossa R2i on (a) -NH2 tai (b) -OH; jossa m on yksi tai kaksi; jossa p on 0-2; 159 88400 jossa M on (a) -CO- tai (b) -CH2-; jossa aryyli tarkoittaa fenyyliä tai naftyyliä; ja jossa -Het on indolyyli, N1n-formyyli-indolyyli tai iraidat- solyyli; tai näiden yhdisteiden karboksi-, amino- tai muusta reaktiivisesta ryhmästä suojatun muodon valmistamiseksi tai näiden yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävien happoadditiosuo-lojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että aminohappo j äännösten sopivien asyylijohdannaisten annetaan reagoida peräjälkeen keskenään, joko erillisinä tai kahdesta tai useammasta jäännöksestä muodostuvana yksikkönä, kunnes mainittu yhdiste on saatu valmistetuksi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Cg on XL^.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Ag on XL2, jossa Rg on N^n-formyyli- 3-indolyyli.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että XLgissa R4 on metyyli.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, t u n -n e t t u siitä, että valmistetaan Ac-PLA-NMHis-LVA-Ile-AMP tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola. • ·

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, t u n - . n e t t u siitä, että valmistetaan *' Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-Statiini-Ile-NH2; Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-NH2; tai Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-PRP-NH2; · · * · 160 88400 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan Boc-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP; Boc-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP; Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-LVA-IleNH2; Ac-FTrp-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP; Boc-FTrp-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP; tai TBA-Phe-NMHiS-LVA-Ile-AMP; tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan Boc-Phe-NMHis-LVA-IBA, Boc-Phe-NMHis-LVA-MBA; Ac-Pro-Phe-NMHis-PRP-NH2, Boc-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP, Ac-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP, Boc-Pro-Phe-NMHis-LVA-Ile-AMP, tai Boc-Naii-NMHis-LVA-Ile-AMP tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä happoadditiosuola. 161 88400