FI87530C - Foerfarande foer framstaellning av streptococcus equi -stammen - Google Patents

Description

1 87530

Menetelmä Streptococcus equi -kannan valmistamiseksi

Keksintö koskee menetelmää sellaisen Streptococcus equi -kannan valmistamiseksi, joka on avirulentti hevosille.

S. equi aiheuttaa hevosen pääntaudin, joka on hevosilla esiintyvä äkillinen hengitystiesairaus, jolle on tunnusomaista kuume, vuoto sieraimista ja märkäpesäkkeiden muodostuminen nieluntakaisiin ja alaleuanluun imusolmukkeisiin. Hevoset, jotka ovat saaneet tällaisen pääntauti-infektion luonnossa tai kokeellisesti, ja jotka ovat toipuneet pään-taudista, ovat tulleet hyvin vastustuskykyisiksi taudin suhteen. Lisäksi on niin, että luonnossa on tavattu vain yhtä antigeenityyppiä edustavaa S. equita.

Edellä sanotusta huolimatta S. equi -bakteriineista tai niiden uuttamalla saaduista jakeista, kuten M-proteiinirikkais-ta uutteista, valmistetut rokotteet ovat olleet suhteellisen tehottomia saamaan aikaan suojausta S. equita vastaan luonnossa. Tämä pitää paikkansa, vaikka P.O. Bazeley jo vuonna 1943 julkaisemassaan artikkelissa ("Studies with Equine Streptococcus", Australian Veterinary Journal 1<?:62) esitti laajan tätä ongelmaa koskevan tutkimuksen sellaisten koetu-.·"·. losten tukemana, joita tri Bazeley ja muut luonnehtivat hy- vin toiveita herättäviksi. Vuosia on kuitenkin kulunut ilman, että olisi tarjolla riittävä tai tehokas menetelmä tai välikappale hevosten suojaamiseen pääntaudilta. Eräs aiempiin kenttäkokeisiin liittyvä ongelma oli se, että tiedemiehet ja tutkijat samaistivat hevosen suojaamisen S. equita - ·: vastaan siihen, että hevosen veriseerumissa stimuloitui V vasta-aineiden tuotanto bakteeria vastaan. Tosiasiassa ro kotteiden epäonnistuminen ei johtunut niiden kykenemättömyydestä stimuloida bakteerin vasta-aineiden syntymistä seerumiin, sillä voitiin osoittaa, etteivät nämä vasta-aineet suojanneet S. equin aiheuttamalta taudilta luonnossa tai koeolosuhteissa. Tosiasiassa havaittiin, että vastikään 2 87530 kokeellisesti aiheutetusta pääntaudista toipuneet ponit olivat hyvin vastustuskykyisiä uudelle tartunnalle jo ennenkuin seerumista voitiin havaita bakteerin vasta-aineita. Lisäksi voitiin määrittää, että vastustuskykyisten ponien nenänielun limakalvo sisälsi pääasiallista IgG- ja IgA-vasta-aineaktiivisuutta vain yhtä happouut-teen proteiinia vastaan, jonka molekyylipaino oli noin 41 000, kun taas seerumin vasta-aineissa oli useampia spesifisiä vasta-aineita. Nämä havainnot viittasivat siihen, että onnistunut rokottaminen vaatii nenänielun immuunivasteen stimulointia.

Tämän keksinnön tekijä on kirjoittanut seuraavat tähän kehitystyöhön liittyvät julkaisut: 1) Tiivistelmä no. 172, Abstracts, IXth Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Fuji, Japan, September 10, 1984; 2) Infection and Immunity, March 1985, Voi 47, No. 3, ss. 623 - 628; 3) Infection and Immunity, April 1985, Vol. 48, No. 1, ss. 29 - 34.

Kuva 1 esittää käyrän muodossa omissa koordinaatistois-:.· saan 14 ponin sierainten huuhteluissa saatujen liuosten

IgA- ja IgG-vasta-ainetiittereitä sen vuorokausimäärän funktiona, joka on kulunut S. equi 709-27:llä tapahtuneesta immunisoinnista. Radioimmunomäärityksessä käytetyt antigeenit olivat S. equin happouuteproteiini ja viljelmän supernatantin (luontainen muoto) proteiini.

Kuvan 2 käyrästö esittää 40 hiiren ryhmissä ilmenevää kumulatiivista kuolleisuutta sen vuorokausimäärän funktiona, joka on kulunut infektoinnista, kun ryhmien hiiret olivat S. equi 709-27:llä tai S. equi 709-27:n happouutteella ro-: .. kotettuja tai edustivat immunisoimatonta vertailuryhmää.

3 87530

Kaikille hiirille annettiin ärsykkeenä 5 x 107 CFU:ta (CFU = colony forming unit, pesäkkeenmuodostusyksikkö) virulenttia S. equi CF32:ta. Kuvan 2 esittämä informaatio on tärkeätä, koska se osoittaa, että S. equi 709-27 kantaa ehjää M-prote-iinia, joka on samanlainen kuin S. equi CF32 -peruskannan proteiini.

Kuva 3 on immunoblot-kuvio, joka esittää ponin nenänielun liman ja seerumin IgG:n ja IgA:n tunnistamia S. equin ja S. zooepidemicusin proteiineja (SDS-PAGE) sen jälkeen kun on suoritettu nenänsisäinen rokotus S. equi 709-27:llä. Täplät käsiteltiin nenänielun limalla tai seerumilla ja sen jälkeen ne pestiin hevosen IgA:ta tai IgG:tä vastaan kohdistuvassa monospesifisessä seerumissa.

Kaistat: A - S. zooepidemicusin happotuute B - S. equin (CF32) happouute C - S. equin (CF32) viljelmän emäliuoksen proteiini S. zooepidemicusin antigeenit sisällytettiin myös määritykseen, koska useimmilla hevosilla on tämä organismi nenänielussaan, ja näin ollen ne ovat stimuloituneet tuottamaan vasta-aineita sen proteiineille, joista jotkin ovat samoja kuin S. equilla.

Kuvissa esitetty mittaustekniikka on sama kuin seuraavissa I'-.. julkaisuissa kuvattu: a) Infection and Immunity, Voi. 47, No. 3, ss. 623-628 (March 1985); b) Infection and Immunity, Voi. 48, No. 1, ss. 29-34 :.. (April 1985) .

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on annettu oheisissa patenttivaatimuksissa.

Esillä oleva keksintö tarjoaa tavan, jolla voidaan stimuloida nenänielun immuunivastetta esimerkiksi käyttämällä bak-teerikloonia, joka on johdettu voimakkaan virulentista S.

4 87530 equi -kannasta, jonka nimi on S. equi CF32, ja joka on talletettu American Type Culture Collection -kokoelmiin, Rockville, Maryland, numerolla ATCC No. 53185 ja vapaasti yleisön saatavissa tämän patenttihakemusjulkaisun julkiseksi tulosta lähtien. CF32 tuottaan suuria (1-3 mm) läpikuultavia, limaisia pesäkkeitä, joilla on taipumus virrata yhteen, ja joita ympäröi laaja (5-10 mm) beeta-hemolyysivyöhyke. American Type Culture Collection -kokoelmiin on myös talletettu S. equi CF32:n johdannainen, joka on tehty avirulen-tiksi esillä olevan keksinnön mukaisesti. Kyseinen aviru-lentti S. equi -bakteeri tunnetaan nimellä Cornell S. equi 709-27 ja se on saatavissa ko. kokoelmista numerolla ATCC 53186. Cornell 709-27 tuottaa pieniä (halkaisija 0,5 mm) valkoisia, kuperia, sileäpintaisia pesäkkeitä, joita ympäröi kapea (1 mm) beeta-hemolyysivyöhyke.

Virulentti S. equi -kanta voidaan muuntaa avirulentiksi millä tahansa menetelmällä, kunhan näin syntynyt avirulentti S. equi -kanta on säilyttänyt M-proteiinifragmentin, jonka mo-lekyylipaino on noin 41 000, ja joka stimuloi samanlaisen immunologisen vasteen hevosen nenänielulimaan kuin sellaisella hevosella on, joka on toipunut S. equin aiheuttamasta pääntaudista. Tällä hetkellä etusijalle asetettava menetelmä on tarkoituksellisesti aikaansaatu mutaationmuodostus esimerkiksi kemikaaleja tai säteilytystä käyttämällä. Kemiallinen mutatointi, esimerkiksi nitrosoguanidiinia käyttämällä, i on erityisen hyödyllinen, (ks. kappale 13, Gene Mutation, :: Manual of Methods of General Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1981).

Happouuteproteiini eristetään menetelmillä, joita on selostettu julkaisussa R.C. Lancefield, "The Antigenic Complex of Streptococcus Hemolyticus I Demonstration of a Type Specific Substance in Extracts of Streptococcus Hemolyticus", J. Exp. Med. 47:91.

Proteiinin molekyylipaino määritetään SDS-PAGE-elektroforeesilla ja käyttämällä molekyylipainostandardeja.

5 87530 M-proteiinirikkaat uutteet olivat suhteellisen tehottomia, koska ne eivät stimuloineet taudille alttiin hevosen nenänielun immuunivastetta, vaikka ne kykenivätkin saamaan aikaan immuunivasteen eläimen veriseerumissa.

Jotta vaadittava vaste saataisiin stimuloiduksi,tarjoaa esillä oleva keksintö menetelmän sellaisten avirulenttien S. equi-bakteerien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää rokotteena joko nenänsisäisesti tai suun kautta annettuna, jolloin rokote tuottaa pääasiallisesti IgG- ja IgA-vas-ta-ainevasteen taudille alttiin hevosen nenänielun limaan. Avirulentti S. equi (Cornell 709-27)-kanta edustaa tällaista bakteeria. Tästedes tuota erityisvalmisteista bakteeria kutsutaan S. equi (Cornell 709-27):ksi.

Menetelmä tehokkaan avirulentin rokotekannan valmistaminen S. equista S. equi ( ornell 709-27) -kalit a, joka on .iv I ru lciitl I hiirille ja poneille, saatiin seuraavalla tavalla: Lähtöbak- teerina käytetty S. equi CF32 saatettiin alttiiksi nitro-soguanidiinin mutatoivalle vaikutukselle noudattamalla · B.C. Carltonin ja B.J. Brownin artikkelissaan (1981) se- lostamia menetelmä, joka artikkeli sisältyy käsikirjaan Manual of Methods for General Bacteriology (toim. P. Ger-hardt et ai.), American Society for Microbiology,

Washington, D.C., s. 226. Noudatettiin sivun 226 ensimmäisessä sarakkeessa esitettyä menetelmänmuunnosta. Tarkemmin sanottuna kaikissa toimenpiteissä käytettiin Todd-Hewitt-ravinnelientä kasvualustana. Kapselittomien pesäkkeiden virulenssinmenetys seulottiin antamalla niitä hiirille (ICR) vatsaonteloon. Kannat, jotka eivät tappaneet hiiriä, katsotiin positiivisiksi kannoiksi. Hiirissä positiivisiksi osoittautuneita kantoja käytettiin sitten hiirten rokottamiseen vatsaontelonsisäisesti, jotta niiden positiivinen laatu saatiin määritetyksi. Ne kannat, jotka suojasivat hiiriä, siirrostettiin hevosiin nenänsisäisesti. Lopuksi, kuten tässä julkaisussa on se- 6 87530 lostettu, S. equi 709-27-johdannaiskannan havaittiin olevan 9 .....

avirulentti annoksena 3x10 pesäkkeenmuodostusyksikköa (engl. colony forming unit, CFU) ja tehokas rokotteena S. equita vastaan tartunnalle alttiissa hevosissa, kun sitä annettiin hevosille nenänsisäisesti tai suun kautta. Lisäksi positiivisesta kannasta, joka suojasi myös hevosia, löydettiin inmunoblottauksella M-proteiinifraqmentti, jonka molekyylipaino on 41 000. Tuon kannan tunnistusnumero on S. equi 709-27.

S. equi (Cornell 709-27)-kannan happouutteen havaittiin immunoblottauksen perusteella sisältävän samoja immunolo-gisesti reaktiivisia proteiineja kuin S. equi-peruskannan (CF32) . Immunob loi tausmeno telinä oli sama kuin se, joka on selostettu artikkelissa sivuilla 29 - 34 aikakauslehdessä Infection and Immunity, Voi. 48, No. 1 (April 1985).

Hevosten immunisointi ja infektointi Tämän jälkeen S. equi (Cornell 709-27)-kannan tehokkuutta .*··. rokotteena hevosille kokeellisesti aiheutettua S. equi- ' infektiota vastaan testattiin. Saadut koetulokset on esi- X. tetty seuraavassa taulukossa.

7 87530

Taulukko 1. Ponien vastustuskyky nenän kautta saadulle Streptococcus equi-infektiolle kun ne on ensin immunisoitu nenän kautta annetulla avirulentilla S. equi 709-27-kannalla Käsittely Infektointi Ponien Vastus- / , . „ ,„„„ . . luku- tusky- (rokotus S. (CFU:ta virulent- mSärg kyisten equi 709-27:llä) tia S. equi CF32:ta) lukumää- 9 8 rä 3 x 10 5 x 10 14 14 vrkrina 0 ja 30 vrk:ena 59 kontaktivertailuryhmä " 2 2 eristetty vertai- " 6 0* luryhmä ♦Kaikki vertailuryhmän eläimet kehittivät äkillisen pään-taudin 4 vuorokauden kuluessa infektoinnista

Neljälletoista vuoden ikäiselle ponille, jotka oli kasvatettu eristyksessä eivätkä koskaan olleet olleet alttiina S. equille, annettiin suihkeen muodossa (nenänsisäises-ti) 18-tunnin 709-27-v.il jelmää (3 x 10^ CFU) , joka oli Todd-Hewitt-liemessä. 29 vuorokautta myöhemmin annettiin tämä annos toisen kerran. Ponit infektoitiin 30 vuoro- g kautta myöhemmin 5 x 10 CFU:11a yön yli kasvatettua S. equi CF32-viljelmää. Viljelmät annettiin nenäsumuttimen avulla (malli no. 281, Devilbiss Co., Somerset, PA).

Kuudelle rokottamattomalle ponille, joita pidettiin erillään rokotetusta ryhmästä, ja kahdelle kontaktissa olleelle vertailuponille annettiin edellä mainittu CF32-tar-tutusannos. Kaikki immunisoidut ponit ja 2 kontaktissa ollutta vertailuponia olivat vastustuskykyisiä S. equilla aiheutetulle tartunnalle, mutta kaikki eristetyn vertailuryhmän ponit kehittivät äkillisen pääntaudin 4 vuorokauden kuluessa infektoinnista.

Lisäksi noin 800 hevosta maatiloilla, joilla oli endee- 8 37530 misiä S. equi-infektio-ongelmia, rokotettiin nenänsisäi-sesti tai suun kautta S. equi 709-27:llä ja tähän mennessä vain kahdelle hevoselle on kehittynyt pääntauti. Kolmen aiemman vuoden kokemuksiin perustuen olisi noilla maatiloilla pitänyt ilmetä pääntauti noin 40 %:lla hevosista.

Käytettäessä tämän keksinnön perustana olevaa menetelmää hevosten rokottamiseen S. equita vastaan on osoittautunut, että suun kautta tapahtuva rokotus vastaa nenänsisäistä rokotusta samana annoksena. Rokoteannos (organismien lukumäärä) tässä selostetussa rokotuksessa oli 100 kertaa suurempi kuin villin, virulentin S. equi-kannan (CF32) lukumäärä annoksessa, jonka viimeksimainitun annoksen odotettaisiin aiheuttavan sairauden normaalissa hevosessa. Kuitenkin kaupallisessa S. equi-rokoteohjelmas-sa tultaisiin käyttämään valmistajan ja kyseeseen tulevien hallintoelinten välisissä neuvotteluissa määritettyjä annostuksia.

Syväjäädytys tai kylmäkuivaus eivät vaikuta rokotteeseen haitallisesti. Näin ollen näitä menetelmiä voidaan käyttää rokotteen massatuotannossa ja jakelussa.

Rokotteen ei ole havaittu aiheuttavan mitään sivuvaikutuksia täysikasvuisille eläimille, mutta 3 kuukauden ikäisillä varsoilla esiintyi vähäisessä määrin (n. 5 %:lla) leuanalaisia märkäpesäkkeitä. Tämä ei-toivottu reaktio ilmeni, kun annettiin hyvin suuri rokoteannos tarkoituksena saada aikaan yhdenmukainen serokonversio rokotteen saaneissa hevosissa. Kuten jo muussa yhteydessä on mainittu, aiheutuu immunologinen suojaus alttiina olevien eläinten nenänielun liman sisältämistä vasta-aineista.

Vasta-ainemääritykset - kuva 1 S. equi (CF32):n IgA- ja IgG-vasta-aineet määritettiin 9 87530 seerumeista ja sieraintenhuuhteluliuoksista ennen rokotusta tai infektointia, niiden aikana ja jälkeen. Määritykset suoritettiin kiinteässä faasissa tapahtuvalla radioimmunologisella menetelmällä (G. Mancini, A.O. Carbonara ja J.H. Heremans, Immunochemical Quantitation of Antigens by Single Radial Immunodiffusion, Immunochemistry 2_, ss. 235 - 254. Kolot päällystettiin S. equin happouuteprote-iinilla (AE) tai viljelmän emäliuosproteiinilla (CS).

Kaikkien rokotettujen eläinten sieraintenhuuhletuliuoksis-ta löydettiin S. equin happouutteen ja viljelmän emäliuok-sen proteiinien IgA- ja IgG-vasta-ainevasteet (kuva 1). Seerumeissa havaittiin myös vasta-ainevasteet, mutta ne olivat epäyhtenäisiä. Kontaktissa olleiden ponien sieraimista ja seerumista löydettiin vasta-ainekonversio samanaikaisesti - viite siitä, että rokotekannan läpäisy oli tapahtunut ryhmässä. Rokotetut ja kontaktissa olleet ponit olivat vastustuskykyisiä virulentilla S. equilla suoritetulle infektoinnille, kun taas rokottamattomissa poneissa kehittyi tyypillinen pääntauti neljän vuorokauden kuluessa infektoinnista (taulukko 1).

Hiirten immunisointi ja infektointi - kuva 2

Hiiri on jo historiallisesti ollut mallina S. equi-infek-tion immunologialle. Näin ollen rinnakkaisena suoritet-.·. tavaa tehokkuuskoetta varten aikuiset ICR-hiiret immunisoi tiin subkutaanisti S. equi 709-27:n happouutteesta saa-. . dulla, hydroksiapatiitilla puhdistetulla proteiinilla.

Tässä yhteydessä viitataan julkaisuun K.L. Vosti, Journal of Med. Microbiol. 11:453 (1978): Proteiini absorboitiin alumiinihydroksidiin ja annettiin subkutaanisti kahtena 50 yg:n annoksena 21 vuorokauden välein. Kaikki hiiret, joukko rokottamattomia verrokkeja mukaanluettuna, infek- 7 toitiin myöhemmin virulentilla S. equilla (5 x 10 CFU), joka annettiin vatsaonteloon. Hiirten kuolleisuus merkittiin muistiin 7 vuorokauden kuluttua infektoinnista.

10 8 7 530

Ero verrokkiryhmän ja rokotetun ryhmän kuolleisuudessa oli erittäin merkitsevä tilastotieteessä käytetyn khin neliöanalyysin perusteella laskettuna. Joko S. equi 709-27 :n happouuttee 1 la ta i. eläviL Lä soluilla immunisoiduissa hiirissä ilmeni merkitsevä suojaava vaste (todennäköisyys = 0,01) verrattuna rokottamattomiin verrokkeihin (kuva 2). Saatu tulos viittasi siihen, että S. equi 709-27 oli säilyttänyt S. equin suojaa antavan antigeenin M.

Vaikka S. equi 709-27 ei ollutkaan virulentti, sen happo-uutteen havaittiin immunoblottauksen perusteella sisältävän samoja immunologisesti reaktiivisia proteiineja kuin S. equi-peruskannan.

Kuva 3: Immunoblottaus, joka osoittaa liman ja see rumin vasta-aineiden tunnistamat proteiinit

Immunologisesti reaktiiviset proteiinit, joita oli S. equin happouutteessa ja viljelmän emäliuoksessa ja S. zooepidemi-cusin happouutteessa, blotattiin nitroselluloosalle SDS-PAGE-geeleistä. Blotit käsiteltiin seerumilla tai nenänielun limalla, jotka oli kerätty 7 vuorokautta infek-toinnin jälkeen surmatuilta poneilta. Tämä määritystek-nikkka on selostettu julkaisussa Infection and Immunity, Voi. 47, No. 3, ss. 623-628 (March 1985).

Immunoblottaus paljasti, että rokotettujen eläinten nenänielun liman IgA- ja IgG-vasta-aineet kohdistuivat pääasiassa M-proteiinifragmenttiin (molekyylipaino 41 000), kun taas seerumin vasta-aineilla oli paljon laajempi spektri, mikä havainto on tehty jo aiemmin poneilla, jotka ovat toipuneet kokeellisesti aikaansaadusta pään-taudista. Koska vasta-ainevaste, joka kohdistuu M-proteiini-fragmenttiin, jonka molekyylipaino on 41 000, on vakio-ominaisuus vastustuskykyisten hevosten nenänielun immuunivasteessa, on se tärkeä suojaava antigeeni.

n 87530

Vasta-ainevaste on myös ominainen S. equille, sillä vastaavasti reagoivia S. zooepidemicusin proteiineja ei voitu havaita immunoblot-kuviossa (kaista A). Muut tutkimukset ovat viitanneet siihen, että voimakkaasti bakteri-sidiset seerumit reagoivat voimakkaasti M-proteiinifrag-menttien kanssa, joiden molekyylipaino on noin 29 000 ja 37 000. Hypoteesi sille, miksi seerumin ja nenänielun vasta-aineet tunnistavat S. equin molekyylipainoltaan erilaiset proteiini fragmen tit, on se, että S. equin M-pro-teiinimolekyylin se osa tai alue, joka on tärkeä nenänielun vasteessa, eroaa siitä, joka aiheuttaa bakterisidisen vasta-aineen stimuloitumisen seerumissa.

Tiivistetysti sanottuna, esillä oleva keksintö tarjoaa uuden ja paremman rokotteen, jolla voidaan suojata hevoset pääntautia aiheuttavaa S. equita vastaan. Rokote stimuloi taudille alttiiden hevosten neneänielun immuunivastetta siten, että nenänielun limaan ilmestyy vasta-ainetta. Rokote on S. equi-kanta, joka sisältää M-proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on 41 0U0, ja on saatettu sellaiseen muotoon, että se voidaan antaa hevosille rokotteena joko nenänsisäisesti tai suun kautta. Esillä oleva keksintö koskee uutta menetelmää hyödyllisen, rokotteena toimivan S. equi-bakteerikannan aikaansaamiseksi ja eristämiseksi, joka bakteerikanta stimuloi vasta-ainevasteen taudille alttiiden hevosten nenänielun limakalvossa.

Huomattakoon, että tässä selostetut tämän keksinnön toteutustavat ovat vain tämän keksinnön periaatteiden soveltamista valaisevia. Selostettujen toteutustapojen yksityiskohdilla ei ole tarkoitus rajoittaa patenttivaatimusten kattamaa alaa, sillä patenttivaatimukset määrittelevät tämän keksinnön kannalta oleelliset seikat.

Claims (4)

12 87530

1. Menetelmä sellaisen Streptococcus equi -kannan aikaansaamiseksi, joka on avirulentti hevosille, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat vaiheet: 1. saatetaan virulentti S. equi CF32 -kanta (ATCC 53185) alttiiksi mutaationmuodostukselle käsittelemällä kemiallisella mutageenilla tai säteilyllä, ja 2. valitaan saatu avirulentti ja suojaava kanta tutkimalla kapselittomia pesäkkeitä ja valitsemalla kanta, joka on avirulentti, sisältää M-proteiinifragmentin, jonka molekyyli-paino on 41 000 ja saa aikaan S. equi -vasta-ainevasteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virulentti Streptococcus equi -kanta mutatoidaan kemiallisesti indusoidulla mutageneesilla tai säteilyin-dusoidulla mutageneesilla.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että virulentti S. equi -kanta mutatoidaan käsittelemällä nitrosoguaniinilla ja avirulentti ja suojaava kanta valitaan tutkimalla kapselittomia pesäkkeitä ja valitsemalla kanta, joka on avirulentti hiirille vatsakalvonsisäisesti annettaessa, suojaa hiiriä virulenttia kantaa vastaan, ja joka sisältää M-proteiinifragmentin, jonka molekyylipaino on noin 41 000 ja joka aikaansaa S. equi -vasta-ainereaktion.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu sii- ' tä, että avirulentti S. equi -kanta on Streptococcus equi 709-27, joka on talletettu ATCC:hen numerolla 53186. 13 87530