DK167599B1 - Vaccine til beskyttelse af heste mod kvaerke foraarsaget af streptococcus equi, fremgangsmaade til fremstilling af en stamme af s. equi, som er avirulent for heste, samt s. equi-stamme - Google Patents

Description

i DK 167599 B1

Den foreliggende opfindelse angår en vaccine til beskyttelse af heste mod kværke forårsaget af S.egui, hvilken vaccine omfatter en avirulent stamme af S.equi, som stimulerer en antistofreaktion i den modtagelige hests nasofaryngeal slim-5 hinde, en fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af S.equi, som er avirulent for heste, og S.equi-stamme 709-27 med ATCC nr 53186.

Vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes til immunisering 10 af heste mod Streptococcus equi. S. equi bevirker kværke, en akut sygdcm i den øvre åndedrætskanal hos heste, som er karakteristisk ved feber, næseudflod og bylddannelse i de retrofaryngeale og mandibulære lymfeknuder. Heste, som er blevet således inficeret i marken eller eksperimentelt inficeret med kværke, og som 35 kommer sig efter kværken, bliver meget modstandsdygtige mod geninfektion. Endvidere er kun én antigentype S.equi blevet iagttaget i marken.

Til trods for ovenstående har vacciner fremstillet af bakteriner 20 af S.equi eller delekstrakter af disse, såsom Mr-proteinrige ekstrakter, været forholdsvis ineffektive til at beskytte mod S.equi i marken. Dette gælder, selv om en artikel med titlen "Studies with Equine Streptococcus", offentliggjort så langt tilbage som i 1943 i the Australian Veterinary Journal 19:62 af 25 P.O.Bazeley, viste en bred undersøgelse af problemet sammen med forsøgsresultater, som dr. Bazeley og andre karakteriserede som meget håbefulde. Der er imidlertid gået mange år uden en tilstrækkelig eller effektiv metode eller midler til beskyttelse af heste mod kværke. Et af problemerne med tidligere forsøg i mar-30 ken var, at videnskabsmænd og forskere satte lighedstegn mellem beskyttelse af hesten mod S.equi og stimulering af baktericide antistoffer i hestens blodserum. Svigtende vaccine skyldtes faktisk ikke vaccinernes manglende evne til at stimulere bakteri-cidt antistof i serum, som det blev påvist ikke at være det sam-35 me som beskyttelse mod udsættelse for S.equi i marken eller eksperimentelt. Det blev faktisk opdaget, at ponyer, der nylig var blevet raske efter eksperimentelt induceret kværke, var me- 2 DK 167599 B1 get modstandsdygtige mod geninfektion, før der kunne påvises serum-bakterieid aktivitet. Endvidere blev det bestemt, at deri nasofaryngeale slimhinde hos resistente ponyer indeholdt større IgG- og IgA-antistofaktivitet over for kun ét syreekstrakt-protein med en molekylvægt på ca. 41.000 (mw) , hvorimod serum-antistoffer havde et antal større specificiteter. Disse konstateringer antydede, at vellykket vaccination kræver stimulering af den nasofaryngeale immunreaktion.

Følgende publikationer er foretaget af opfinderen vedrørende denne udvikling: 1) Abstract nr. 172, der forekommer i Abstracts IXth,

Lancefield International Symposium on Streptococci and ^ Streptococcal Diseases, Fuji, Japan, 10.september 1984, 2) Infection and Immunity, marts 1985, bind 47, nr. 3, side 623 - 628, 20 3) Infection and Immunity, april 1985, bind 48, nr. 1, side 29 - 34.

Figur 1 er en graf med adskilte koordinater for IgA- og IgG-antistoftiterne i nasalvaskevæsker fra 14 ponyer som funktion 25 af dage, der var forløbet efter immunisering med S.equi 709 - 27. Antigenerne i radio immunbestemmelsen var syreekstrakt og overliggende kulturvæske (den native form) protein af S.equi.

Figur 2 er en graf over kumulativ dødelighed som funktion af 30 dage efter smitte for grupper på 40 mus vaccineret med levende S.equi 709-27 eller en syreekstrakt af S.equi 709-27 og en gruppe ikke-immuniserede kontrolmus. Alle mus blev smittet med 5 x 10-7-CFU virulent S.equi CF32. Den oplysning, som figur 2 giver, er vigtig, fordi den viser, at S.equi 709-27 basrer det 35 intakte M protein svarende til det i stamformen S.equi CF32.

DK 167599 Bl 3

Figur 3 er en iiranunoaftrykning, der viser proteiner (SDS-PAGE) , S.equi og S.zooepidemicus, genkendt af IgG og IgA i den naso-faryngeale slimhinde og i serum hos en pony efter intranasal vaccination med S.equi 709-27. Aftrykningerne blev vasket i monospecifikke antisera over for heste-IgA eller -IgG efter 5 behandling med nasofaryngeal slimhinde eller serum.

Spor: A - syreekstrakt af S.zooepidemicus, B - syreekstrakt af S.equi (CF32), 1Q C - protein af S.equi (CF32) i overliggende kulturvæske.

Antigener af S.zooepidemicus blev inkluderet, fordi de fleste heste bærer denne organisme i næsesvælget og derfor stimuleres til at fremstille antistoffer mod dets proteiner, hvoraf nogle 15 er fælles med S.equi.

Målingsteknikken, der er beskrevet på tegningerne, svarer til de i følgende publikationer diskuterede: 20 a) Infection and Immunity, bind 47, nr. 3, side 623 - 628 (marts 1985), b) Infection and Immunity, bind 48, nr. 1, side 29 - 34 (april 1985).

25 .

Vaccinen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at stammen af avirulent S.equi er S.equi 709-27 (ATCC nr. 53186), at den er ikke-indkapslet, og at den omfatter et M-proteinfragment med en molekylvægt på ca. 41.000.

3 0

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af S.equi, som er avirulent for heste, kendetegnet ved, at den omfatter, at 1

man underkaster en virulent stamme af S.equi-CF32 (ATCC

3 5 nr. 53185) mutagenese; 4 DKib/byyBi 2. man udvælger en fremkommen bakterie, som giver et M-prote-infragment med en molekylvægt på 41.000, hvilken bakterie fremkalder en S.equi—antistofreaktion i det nasofaryngeale slim hos en for S.equi modtagelig hest.

S

Den nasofaryngeale immunreaktion stimuleres f .eks. ved anvendelse af en bakterieklon afledt af en meget virulent stamme af S.equi, der er kendt som S.equi CF32, der er deponeret i the American 10 Type Culture Collection (ATCC nr. 53185), Rockville, Maryland, og som er tilgængelig for offentligheden på tidspunktet for patentansøgningens udstedelse. CF32 producerer store (1-3 mm) transparente, mukoide kolonier, der er tilbøjelige til at flyde sammen og omgives af en bred zone (5-10 mm) af β-hæmolyse.

15 Deponeret i the American Type Culture Collection er også et derivat af S.equi CF32, som er blevet gjort avirulent i overensstemmelse med den foreliggende opfindelses angivelser. Det avirulente derivat S.equi-bakterium er kendt som Cornell S.equi 709-27 og vil være tilgængeligt gennem ATCC under ATCC nr.

53186, når den foreliggende patentansøgning udstedes som US-patent. Cornell 709-27 producerer en lille (0,5 mm i diameter) hvid koloni med konveks glat overflade, omgivet af en snæver (1 mm) zone af β-hæmolyse.

Den foreliggende opfindelse angår en hestevaccine mod kværke hos en hest forårsaget af S.equi, hvilken vaccine stimulerer en nasofaryngeal immunreaktion i en over for kværke modtagelig hest, og hvilken vaccine omfatter en avirulent stamme af S.equi dannet ved mutering af en virulent kværkeforårsagende S.equi 3Q stamme for at gøre den avirulent under bevarelse derpå af protein, som giver et syreekstrakt M-proteinfragment med en molekylvægt på ca. 41.000, som stimulerer en immunologisk reaktion på IgG- og IgA-antistof, svarende til det i den nasofaryngeale slim hos en hest, der er kommet sig af kværke forår-35 saget af S.equi.

6 DK 167599 B1 M-proteinrige ekstrakter var forholdsvis ineffektive, fordi de ikke stimulerede en nasofaryngeal immunreaktion hos den modtagelige hest, selv om de var effektive til at frembringe en -· immunreaktion i dyrets blodserum. For at stimulere den krævede 5 reaktion angiver den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til at fremstille avirulente S.equi-bakterier, der kan anvendes som en vaccine og anvendes enten intranasalt eller oralt og frembringer større IgG- og IgA-antistofreaktioner i den naso-faryngeale slimhinde hos den modtagelige hest. Den avirulente 10 stamme af S.equi (Cornell 709-27) er en sådan bakterie. I det følgende kaldes denne specielt fremstillede bakterie S.equi (Cornell 709-27) .

Fremgangsmåde til fremstilling af en effektiv avirulent vaccine-stamme af S.equi;

Stammen af S.equi (Cornell 709-27), der er avirulent for mus og ponyer, fremkom på følgende måde: Udgangsbakterien S.equi CF32 20 blev underkastet nitrosoguanidin-mutagenese ved at følge angi velserne i en artikel af B.C.Carlton og B.J.Brown (1981) i Manual of Methods for General Bacteriology (redaktør: P.Gerhardt m.fl.), American Society for Microbiology, Washington, D.C., side 226. Der blev foretaget en modifikation af fremgangsmåden, 25 der er angivet i spalte 1 på side 226. Specielt blev der gen nem hele fremgangsmåden anvendt Todd Hewitt bouillon som vækstmedium. Ikke-indkapslede kolonier blev sorteret for tab af virulens ved intraperitoneal podning af mus (ICR). Stammerne, som ikke dræbte mus, blev anset for positive stammer. De po-3q sitive musestammer blev så anvendt til at vaccinere mus ad den intraperitoneale vej for at bestemme deres beskyttelseskvalitet. De stammer, som beskyttede mus, blev podet intranasalt på heste. Endelig blev, som beskrevet i den foreliggende beskrivelse, en afledt stamme af S.equi 709-27 fundet at være avirulent i en 9 35 dosis på 3 x 10 CFU og effektiv som vaccine mod S.equi for modtagelige heste, når den blev podet intranasalt eller oralt i 5 DK 167599 B1

Vaccinen ifølge opfindelsen er ikke stamxnespecifik. Kun én antigentype S.egui er blevet iagttaget i marken. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan derfor anvendes til enhver virulent stamme af S.equi, som forårsager kværke.

5

Den virulente S.equi stamme kan gøres avirulent på enhver måde, når blot den fremkomne avirulente S.equi-stamme bevarer det M-proteinfragment, der har en molekylvægt på ca. 41.000, som stimulerer en immunologisk reaktion ligesom den i den naso-faryngeale slimhinde hos en hest, der er kommet sig af kværke 1° forårsaget af S.equi. Den i øjeblikket foretrukne metode er bevidst induceret mutagenese, f.eks. ved anvendelse af kemikalier eller stråling. Særligt nyttig er kemisk mutagenese, f.eks. ved anvendelse af nitrosoguanidin. (Se kapitel 13, Gene

Mutation, Manual of Methods of General Bacteriology, American 15

Society for Microbiology, Washington, D.C. 1981)

Med det formål at karakterisere vaccinen ifølge opfindelsen ved radioimmunbestemmelse eller immunaftrykningsbestemmelse isoleres syreekstraktsproteinet ved teknik, der er beskrevet i en publikation af R.C.Lancefield med titlen "The Antigenic Complex of Streptococcus Hemolyticus I, Demonstration of a Type Specific Substance in Extracts of Streptococcus Hemolyticus", J.Exp.Med. 47:91.

25

Med det formål yderligere at karakterisere vaccinen ifølge opfindelsen bestemmes proteinmolekylvægten ved SDS - PAGE elektro-forese og brugen af molekylvægtsstandarder.

Ifølge den foreliggende opfindelse kræver en vellykket vaccine 3 0 mod S.equi stimulering af den nasofaryngeale immunreaktion hos en modtagelig hest ved intranasal eller oral podning. Antistofaktivitet i den nasofaryngeale slimhinde står i sammenhæng med beskyttelse mod kværke, og antistofaktivitet i blodserum har mindre betydning.

3 5 7 DK 167599 B1 hesten. Endvidere blev den positive stamme, som også beskyttede heste, afprøvet for tilstedeværelse af 4Ik-fragmentet af M-pro-teinet ved immunoaftrykning. Identificeringsnummeret for den stamme er S.equi 709-27.

5

En syreekstrakt af stammen S.equi (Cornell 709-27) blev påvist ved immunaftrykning at bære samme immunologisk reaktionsdygtige proteiner som grundstammen S.equi (CF32). Den anvendte immun-aftrykningsmetode svarede til den, der er anvendt i en artikel med titlen "Infection and Immunity", bind 48, nr. 1, side 29 - 34 (april 1985).

«·

Hesteimmunisering og -smitte; 15 S.equi (Cornell 709-27) blev så afprøvet for effektivitet som vaccine over for eksperimentel S.equi infektion hos heste. Følgende tabel viser afprøvningen.

TABEL 1 - Modstandsevne hos ponyer mod intranasal smitte med 20 -------

Streptococcus equi efter intranasal immunisering med den avirulente stamme af S.equi 709-27.

Behandling Smitte (vaccineret med (CFU virulent Antal Antal S.equi 709-27) S.equi CF32) ponyer resistente 25 3 x 109 5 x 108 14 14

Dag 0 og dag 30 dag 59

Kontaktkontroller dag 59 2 2 30 .

Isolationskontroller dag 59 6 0 x

Alle kontroller udviklede akut kværke inden for 4 dage efter smitte.

x) 35 DK 167599 B1 8 14 årgamle ponyer, opvokset i isolation og aldrig udsat for S.equi, fik givet en forstøvet suspension (intranasalt) af en 18 timers kultur (3 x 10^ CFU) i Todd Hewitt bouillon af 709-27.

-" En gentagen podning blev givet 29 dage senere. Ponyerne blev g smittet intranasalt 30 dage senere med 5 x 10 CFU af en natgammel kultur af S.equi CF32. Kulturerne blev administreret ved hjælp af en næseforstøver (model nr. 281, Devilbiss Co., Somerset, PA).

6 ikke-vaccinerede ponyer, der var i stald adskilt fra den vaccinerede gruppe, og 2 kontaktkontrol-ponyer blev også smittet med samme CF32-podemateriale. Alle de immuniserede ponyer og de 2 kontaktkontrol-ponyer var resistente mod S.equi, når de blev smittet, men alle isolationskontrollerne udviklede 15 akut kværke inden for 4 dage efter smitten.

Desuden blev ca. 800 heste på gårde med endemiske S.equi-infek~ tionsproblemer eksperimentelt vaccineret intranasalt eller oralt med S.equi 709-27, og indtil i dag har kun 2 heste udviklet 20 kværke. Den forventede forekomst af kværke på gårdene, baseret på erfaringerne fra de tre foregående år, er således, at man ville have forventet forekomst af kværke hos ca. 40% af hestene.

25 Ved anvendelse af vaccinen ifølge den foreliggende opfindelse til vaccina tion af heste mod S.equi syntes resultaterne af oral podning at være sammenlignelige med intranasal podning med samme dosis. Vaccinedosen (antal organismer), der blev anvendt til den her beskrevne vaccination, var 100 gange større end antallet af 30 organismer af en vild virulent stamme af S.equi (CF32), som kunne forventes at forårsage sygdom hos en normal hest. Et industrielt S.equi-vaccineprogram ville dog anvende dosisstørrelser, som blev bestemt ved konsultation mellem fabrikanten og de pågældende regeringsmyndigheder.

Frysning eller frysetørring skader ikke vaccinen. Disse metoder kan derfor anvendes til masseproduktion og fordeling af vaccinen.

35 DK 167599 B1 9

Vaccinen har været helt uden bivirkninger hos voksne dyr, men en lav (ca. 5%) forekomst af submandibulære bylder er blevet iagttaget ved én lejlighed hos 3 måneder gamle føl. Denne skadelige reaktion forekom, når en meget kraftig dosis vaccine blev 5 administreret i et forsøg på at opnå konsekvent seroomdannelse i blodserumet hos den podede hest. Som anført andetsteds, er det den nasofaryngeale slimhinde hos den modtagelige hest, der indeholder antistoffer, som indgår i den immunologiske beskyttelse.

10

Antistofbestemmelse - figur 1.

IgA- og IgG-antistoffer mod proteiner af S.equi (CF32) blev bestemt i sera og næseudvaskninger opsamlet før, under og efter vaccination og smitte. Bestemmelserne blev udført ved fast fase-radioimmunbestemmelse som beskrevet i en artikel med titlen "Immunochemical Quantitation of Antigens by Single Radial Immunodiffusion" af G.Mancini, A.0.Carbonara & J.H. Heremans i Immunochemistry 2, side 235 - 254. Fordybninger 20 blev belagt med syreekstrakt (AE) eller protein af S.equi i overliggende kulturvæske (CS) .

IgA- og IgG-antistofreaktioner på syreekstraktproteiner og proteiner i overliggende kulturvæske af S.equi blev iagttaget i 25 næseudskylninger fra alle vaccinerede dyr (figur 1). Serum-antistof reaktioner blev også iagttaget, men de var usammenhængende. Kontaktkontrol-ponyer viste nasal og serumantistof-omdannelse samtidig - et tegn på, at overføring af vaccinestammen var sket i gruppen. Forsøgsponyer og kontaktkontrol-30 ponyer var modstandsdygtige mod smitte med virulent S.equi, hvorimod ikke-vaccinerede ponyer udviklede typisk kværke inden for 4 dage fra smitten (tabel 1).

Museimmunisering og -smitte - figur 2.

Musen har historisk været model for immunologien af S.equi-infektion. Som en parallelprøve for effektivitet blev voksne 35 10 DK 167599 B1 ICR-mus derfor immuniseret subkutant med et med hydroxyapatit renset protein fra en syreekstrakt af S.equi 709-27. Der henvises til en artikel af K.L.Vosti, Journal of Med.Microbiol. 11: 453 (1978). Protein blev absorberet på aluminiumhydroxid og 5 administreret i to subkutane doser på 50 ,ug med 21 dages mellemrum. Alle mus, inklusive en gruppe ikke-vaccinerede kontroller, 7 blev senere smittet med virulent S.equi (5 x 10 CFU) givet intraperitonealt. Musedødeligheden blev registreret i 7 dage efter smitten. Forskellen i dødelighed mellem kontrollen og 10 den vaccinerede gruppe var meget signifikant, når der anvendtes den i statistikken benyttede khi kvadratanalyse. Musene immuniseret enten med en syreekstrakt eller med levende celler af S.equi 709-27 udviste en signifikant beskyttelsesreaktion (sandsynlighed mindre end eller lig med 0,01) sammenlignet med 15 ikke-vaccinerede kontroller (figur 2). Dette resultat antydede, at S.equi 709-27 bevarede det beskyttende M-antigen fra S.equi.

Til trods for, at den ikke er virulent, blev syreekstrakten af S.equi 709-27 påvist ved immunoaftrykning at bære de samme immunologisk reaktionsdygtige proteiner som grundstammen S.equi.

20 Immunoaftrykning, der viser proteiner genkendt af slimhinde antistoffer og serumantistoffer - figur 3.

De immunologisk reaktionsdygtige proteiner i en syreekstrakt og overliggende kulturvæske fra S.equi og en syreekstrakt af S.zooepidemicus blev gjort tydelige på nitrocellulose-aftrykninger 25 af SDS-PAGE geler. Aftrykninger blev behandlet med sera eller nasofaryngeal slim opsamlet, når ponyer blev dræbt 7 dage efter smitte. En artikel med titlen "Infection and Immunity", bind 47, nr. 3, side 623 - 628 (marts 1985) beskriver den anvendte teknik.

Immunoaftrykning afslørede, at IgA- og IgG-antistoffer i naso- 11 DK 167599 B1 faryngeal slim fra vaccinerede dyr var rettet hovedsagelig mod et 41k M-proteinfragment/ hvorimod serumantistoffer havde et meget bredere aktivitetsspektrum, en konstatering, der er gjort tidligere hos ponyer, som er kommet sig efter eksperimentelt 5 induceret kværke. Da en antistofreaktion på 41.000 mw M-protein-fragmentet er et konstant træk ved den nasofaryngeale immunreaktion hos resistente heste, er det et vigtigt beskyttende antigen.

Antistofreaktionen er også specifik for S.equi, for lignende 10 reaktionsdygtige proteiner fra S.zooepidemicus kunne ikke påvises på immunoaftrykningen (spor A). Andre undersøgelser har vist, at antistoffer i stærkt baktericide sera reagerer stærkt med M-proteinfragmenter med en molekylvægt på ca. 29.000 og 37.000. En hypotese til forklaring af de forskellige molekyl-15 vægte af M-proteinfragmenterne af S.equi, genkendt af serum, og nasofaryngealt antistof er, at den del eller det område af M-proteinmolekylet af S.equi, som er vigtigt i den nasofaryngeale reaktion, er forskellig fra det, der indgår i stimuleringen af baktericidt antistof i serum.

20 Sammenfattende angiver den foreliggende opfindelse en ny og forbedret bakteriel vaccine til beskyttelse af modtagelige heste mod S.equi, som forårsager kværke. Vaccinen stimulerer en naso-faryngeal immunreaktion hos en modtagelig hest gennem tilstedeværelse af antistof i den nasofaryngeale slim. Vaccinen er en 25 S.equi-stamme, som indeholder et M-proteinfragment på 41.000 mw og er egnet til administration til heste, enten intranasalt eller oralt, som en vaccine. Opfindelsens lære indbefatter:

En ny stamme af S.equi (709-27), en fremgangsmåde til fremstilling og isolering af en nyttig vaccinestamme af S.equi-bakterier, 30 og som stimulerer en antistofreaktion i den modtagelige hests nasofaryngeale slimhinde.

Claims (7)

1. Vaccine til beskyttelse af heste mod kværke forårsaget af S.equi, hvilken vaccine omfatter en avirulent stamme af 5 . S.equi, som stimulerer en antistof reaktion i den modtagelige hests nasofaryngeale slimhinde, kendetegnet ved, at stammen af avirulent S.equi er S.equi 709-27 (ATCC nr. 53186), at den er ikke-indkapslet, og at den omfatter et M-protein-fragment med en molekylvægt på ca. 41.000. • 10

2. Vaccine til beskyttelse af heste mod kværke forårsaget af S.equi, hvilken vaccine omfatter en avirulent stamme af S.equi, som stimulerer en antistof reaktion i den modtagelige hests nasofaryngeale slimhinde, kendetegnet ved, at 15 stammen af avirulent S.equi er S.equi 709-27 (ATCC nr. 53186), at den omfatter et M-proteinfragment med en molekylvægt på ca. 41.000, og at den kan podes intranasalt eller oralt.

3. Vaccine til beskyttelse af heste mod S.equi, hvilken vac- 20 cine omfatter en avirulent stamme af s.equi, der er kendt som S.equi 709-27 (ATCC nr. 53186), som kan podes intranasalt eller oralt i den modtagelige hest.

4. Fremgangsmåde til fremstilling af en stamme af S.equi, som 2. er avirulent for heste, kendetegnet ved, at den omfatter, at 1 2 35 man underkaster en virulent stamme af S.equi-CF32 (ATCC nr. 53185) mutagenese; 30 2 man udvælger en fremkommen bakterie, som giver et M-prote-infragment med en molekylvægt på 41.000, hvilken bakterie producerer en S. equi-antistofreaktion i det nasofaryngeale slim hos en for S.equi modtagelig hest. DK 167599 B1

5- S.equi-stamme 709-27 (ATCC nr. 53186) til anvendelse i terapi.

6. S.equi-stamme 709-27 (ATCC nr. 53186) til anvendelse ved fremstilling af et lægemiddel til anvendelse ved behandling af heste mod kværke,

7. S.equi-stamme 709-27 (ATCC nr. 53186). 10 15 20 25 30 35