FI86415B - Foerfarande foer framstaellning av l-tryptofan. - Google Patents

Description

8641 5

MENETELMX L-TRYPTOFÄÄNIN VALMISTAMISEKSI - FÖRFARANDE FÖR FRAMSTÄLLNING AV L-TRYPTOFAN

L-tryptofaani on luontainen välttämätön aminohappo ja sillä on moninaisia käyttömahdollisuuksia ravintoaineiden ja rehujen täydennysaineena, koska se on rajoittavana aminohappona eräissä kasviproteiineissa. Näin on erityisesti maissiproteiinin kohdalla, ja L-tryptofääniä lisäämällä voidaan maissiproteiinin ravintofysiolo-gista arvoa parantaa oleellisesti.

Tällä hetkellä valmistettu L-tryptofaani käytetään kuitenkin lähes yksinomaan lääkinnällisiin tarkoituksiin eli infuusioliuosten aineosana tai hermoston välittäjäaineena, koska sen käyttö ravintoaineissa ja rehuissa kariutuu liian korkeaan hintaan, ja näin ollen onkin uhrattu paljon tutkimusta L-tryptofäänin valmistamiseen hinnaltaan edullisesti.

Intialaisessa patenttijulkaisussa no. 61 235 vuodelta 1957 selostetaan mikrobiologista menetelmää L-tryptofäänin valmistamiseksi L-seriinistä ja indolista käyttämällä Escherichia coli ATCC 12783-kannan auksotrofista mutant-tia ja saksalaisessa patenttijulkaisussa no. 28 41 642 ehdotetaan Escherichia coli W 3110-kannan L-tryptofaani-auksotrofisen mutantin käyttöä L-seriinin ja indolin väliseen biokemialliseen kondensointiin lisäämällä ei-ionista tensidiä tai immobilisoimalla solut. Escherichia colin tilalla voidaan biokemialliseen tryptofaanisyntee-siin käyttää myös muita tryptofaanisyntetaasipitoisia mikro-organismeja, joista mainittakoon Proteus vulgaris IFO 3045 ja Pseudomonas Punctata MT 10243 (japanilainen patenttijulkaisu no. 49 81 591).

Näissä ennestään tunnetuissa menetelmissä on haittapuolena L-seriinin korkeat valmistuskustannukset. . Koska tähän mennessä ei seriiniä ole suoraan kyetty fermentoimaan sokerista, tapahtuu L-seriinin valmistus biokemiallisel- 2 86415 la reaktiolla glysiinistä, DL-seriinin entsymaattisella hajottamisella tai uuttamalla proteiinihydrolysaateista.

Silkin fibroiinin ja villan keratiinin seriinipitoi-suus on korkea, mutta maapähkinän ja soijan proteiineissa on myös suurehkoja seriinipitoisuuksia. Kun nämä proteiinit hydrolysoidaan suolahapolla tai rikkihapolla, saadaan vapaita aminohappoja, ja kun nämä hydrolysaatit neutraloidaan, saadaan vaikealiukoiset aminohapot saostumaan ja erottumaan. Suodos tai tämän saostuksen ulostu-lovirtaus sisältää helppoliukoiset aminohapot, mm. L-se-riinin. L-seriini voidaan eristää näistä ulostulovir-tauksista seostamalla seriinin vaikealiukoisen p-hydrok-siatsobentseeni-p-sulfonihapposuolan muodossa. Tämä suola pitää vielä hajottaa bariumasetaattilla (Greenstein, Winitz, Chemistry of the Amino Acids, Vol. 3, s. 2202). Tämä L-seriinin erotusmenetelmä on hyvin monimutkainen.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on tarjota sellainen menetelmä L-tryptofäänin ja DL-seriinin valmistamiseksi, että on mahdollista saada aikaan riittävän puhdas L-seriiniliuos hinnaltaan edullisesti, jota liuosta voidaan käyttää L-typtofaanin biosynteesiin.

Sokerijuurikkaidenjalostuksessa saatujen saturoitujen mehujen ja sokerisiirappien ioninvaihtoeluaateista tai muista seriinipitoisista ulostulovirtauksista, jotka on saatu poistettaessa sokeria melassista, valmistetaan keksinnönmukaisesti pH-alueella 5,5 - 6,5 ioni-kromatografiällä niukkatuhkainen seriiniliuos, joka sen jälkeen konsentroidaan niin, että DL-seriini erottuu, ja jäljelle jäänyt konsentroitunut L-seriiniliuos saatetaan reagoimaan indolin kanssa tryptofaanisyntetaasia sisältävien solujen suspensiossa, jolloin syntyy L-tryptofaania.

L-seriiniliuoksen valmistukseen sopivan raaka-aineen löytäminen ja valinta ovat menetelmän kannalta erittäin tärkeitä, koska proteiinihydrolyysien ulostulovirtauk-set ovat vain rajoitetussa määrin käyttökelpoisia 3 86415 ja lisäksi niiden raaka-aine- ja valmistuskustannukset ovat korkeat.

Sen sijaan sokerijuurikkaidenjalostuksessa syntyvät ulostulovirtaukset sekä melassin sokerinpoistossa syntyvät ulostulovirtaukset ovat suurina määrinä syntyviä jätteitä, jotka ovat käytettävissä. Sokerijuurikkaassa ovat aminohapot vapaassa muodossa ja joutuvat sokerin-uutossa raakamehuun. Nämä aminohapot ovat sokeriteknologi-an kannalta katsottuina "haitallista typpeä", koska ne estävät sokerin kiteytymistä. Suurempina määrinä esiintyvät typpiyhdisteet, kuten beetaiini, glutamiini, glutamiinihappo ja asparagiinihappo, on tutkittu perusteellisesti, kun taas pienempinä määrinä esiintyviin aminohappoihin ei ole juuri kiinnitetty huomiota. Kun näitä aminohappoja on yritetty eristää näistä sokerinval-mistuksen jäteliemistä, on havaittu, että jotkut näistä aminohapoista ovat osittain rasemisoituneina. Kun se-riini tutkittiin HPLC-menetelmällä kiraalipylväissä, todettiin DL-seriinin pitoisuudeksi 20 - 30 %. Tämä tähän mennessä tuntematon raseemisen seriinin esiintyminen sokerijuurikasmelassissa vaikeuttaa L-seriinin eristämistä.

Sokerijuurikasmelassi sisältää noin 48 % sakkaroosia, 10 % tuhka-aineita ja noin 4 % aminohappoja.

Sokerin poisto melassista voidaan suorittaa seostamalla sakkaroosi kalsiumilla tai bariumsuoloilla tai erottamalla muut kuin sokeriaineosat nestekromatografiällä. Viimeksimainittu erotusmenetelmä on selostettu saksalaisissa patenttijulkaisuissa no. 22 32 093, 22 31 784 ja 26 62 211. Tässä käytetään stationäärifaasina ionin-vahdinta ja liikkuvana faasina laimennettua melassia ja vettä vuorotellen. Erotuspylväiden ulostulovirtauk-sina saadaan sokeripitoisia jakeita ja niukkasokerisia jakeita. Eräät tässä erotusprosessissa saadut korkean aminohappopitoisuuden omaavat ulostulovirtaukset ovat edullisia raaka-aineita keksinnönmukaisessa seriinin- 4 86415 talteenotossa käytettäviksi.

Ionikromatografiässä tulee kationinvaihdin kyllästetyksi suodatettavan liuoksen ioneilla.

Tässä systeemissä läpäisevät tuodut vahvat elektrolyytit vaihtimen muuttumattomina, kun taas vaihtimen matriisi adsorboi heikot elektrolyytit tai ei-elektro-lyytit.

Kun tämän jälkeen suoritetaan eluointi vedellä, liukenevat nämä adsorboituneet aineet matriisista. Kun vuorotellen suoritetaan lataaminen käsiteltävällä materiaalilla ja eluointi vedellä, saadaan aikaan elektrolyyttien ja ei-elektrolyyttien erottuminen toisistaan. Täisin uutta ja odottamatonta oli se, että erotettaessa seriinipitoiset ulostulovirtaukset kromatografises-ti natriummuodossa olevalla kationinvaihtimella voitiin vahvojen elektrolyyttien erottamisen lisäksi saada aikaan vielä seriinin erottuminen sakkaroosista ja muista aminohapoista. Tällä keksinnönmukaisella kromatografi-sealla erotuksella voidaan voidaan seriinipitoisuus nostaa 10- - 15-kertaiseksi lähtöliuokseen verrattuna. Koska tässä menetelmässä toisin kuin ioninvaihtokromato-grafiässä ei käytetä mitään regenerointiaineita, on tämä uusi erotusmenetelmä hyvin ympäristöystävällinen eikä synnytä jätevesikuormitusta.

Syötetyn liuoksen pH-arvolla on oleellinen vaikutus seriinin erottumiseen. On havaittu, että pH-arvon pitäisi olla välillä 5, 5 - 6,5. Parhaat erotustulokset saatiin lähellä seriinin isoelektristä pistettä, joka on 5,7. Toinen tärkeä parametri on erotuspylvään lämpötila. Jotta saavutettaisiin hyvä erottuminen ja vältyttäisiin mikrobiologisilta kontaminaatioilta, on tarkoituksenmukaista työskennellä lämpötila-alueella 80 - 90 °C. Kationinvahtimina on edullista käyttää polystyreenihartseja, joiden divinyylibentseenisilloittu-misaste on 4 - 7 %. Hiukkaskoon pitää olla 0,3 - 0,5 mm ja 90 % hartsirakeista pitää olla 20 % sisällä hiukkas- 5 86415 koon keskiarvosta.

Vielä eräs ratkaistava kysymys on ulostulovirtauk-sen ohjaus niin, että yksittäiset jakeet saadaan erotetuiksi. Ennestään tunnettua aminohappojen osoitusta ninhydriinivärjäyksellä ei substraatin oman värin vuoksi voitu käyttää ja muut osoitusreaktiot, esimerkiksi ami-nohappoanalyysi, olivat niin hitaita, etteivät ne olleet käyttökelpoisia prosessin ohjaukseen. Yllättäen ja odottamatta havaittiin, että seriinifraktio voitiin erottaa hyvin tarkasti yksinkertaisella tiheys- ja johto-kykymittauksella. Erotusmenetelmää valaistaan kuvan 1 avulla. Tiheydenmittaukseen käytettiin sokerikemiassa tavallisesti käytettyä Bx-arvoa ja johtokyky ilmaistaan mikrosiemenseinä.

Kuten kuvasta 1 voidaan havaita, kasvavat tiheys ja johtokyky voimakkaasti erotusprosessin alussa, saavuttavat maksimin ja laskevat sen jälkeen jyrkästi ja saavuttavat käännepisteen jälkeen tasanteen, joka viettää syklin loppua kohti. Näiden arvojen käännepisteessä on myös seriinifraktion leikkauspiste. Tämä yksinkertainen mittaus teki mahdolliseksi erotusprosessin välittömän ohjauksen. Seriinijakeen ohella saadaan myös sokeripitoinen jae, joka sisältää myös muut ei-sokerlaineet.

Tämä sokeripitoinen jae voidaan konsentroinnin jälkeen käyttää rehuteollisuudessa tai käymisteollisuudessa. Erotusprosessin aikana otetaan myös välijakeita, kuten palaute 1 ja palaute 2, jotka viedään takaisin seuraavaan erotussykliin.

Erotusmenetelmällä saadaan niukkatuhkaisia seriini-liuoksia tai hyvin puhtaita seriinijakeita. Näistä liuoksista pitää erottaa D-seriini, koska seriiniliuosta tryptofaaninvalmistukseen käytettäessä vain L-seriini reagoi. D-seriinin erottamiseen löydettiin yllättävän yksinkerainen ratkaisu. Kun seriinijae konsentroitiin 35 % kuiva-ainepitoisuuteen ja sen jälkeen jäähdytettiin 20 °C:een, voitiin pääosa D-seriinistä erottaa suodattamalla DL-seriininä. Kiteytyneen DL-seriinin tarkempi « 86415 tutkimus osoitti, että siinä oli epäpuhtautena tyrosii-nia, ja koska tyrosiini on hyvin vaikealiukoinen aminohappo, ei pelkällä uudelleenkiteytyksellä kyetä saamaan aikaan tyydyttävää puhtausastetta. Tutkimuksissa havaittiin, että aromaattiset aminohapot, fenyylialaniini ja tyrosiini, adsorboituivat selektiivisesti voimakkaasti emäksisiin anioninvaihtimiin. Seriini adsorboituu tällöin anioninvaihtimiin vain vähäisessä määrin ja syrjäytyy sitoutuvan tyrosiinin toimesta. Seriinihäviöiden välttämiseksi säädetään suhde tyrosiini:ioninvaihdin niin, että poistettavaa tyrosiinimoolia kohti käytetään 2 litraa ioninvaihdinta. Tyrosiinittomasta DL-seriini-liuoksesta saadaan konsentroimalla ja kiteyttämällä puhdasta DL-seriiniä. Sen sijaan, että tryptofaaninval-mistukseen käytettäisiin L-seriiniliuosta, voidaan liuosta eteenpäin haihduttamalla kiteyttää L-seriini ja puhdistaa se uudelleenkiteyttämällä.

Ennestään tunnettuun L-tryptofaanin syntetisointiin L-seriinistä ja indolista käytetään tryptofaanisyntetasi-pitoisia mikro-organismeja. Keksintö ei koske näiden mikro-organismien kasvatusta tai immobilisointia, vaan ainoastaan keksinnönmukaisesti valmistetun seriiniliuok-sen käyttöä biokemialliseen kondensointiin L-tryptofaa-niksi. Koska tämän liuoksen seriinikonsentraatio on suuri, on tämä reaktio erittäin tehokas, ja lisättäessä solususpensioon stoikiometriset määrät indolia ja serii-niä, saadaan tryptofaania niin suurina pitoisuuksina, että se kiteytyy ja voidaan erottaa solujen kanssa yhdessä. Jäljellejäänyt emäliuos konsentroidaan ja lisätty etanoli otetaan talteen. Kun tämä emäliuos jäähdytetään, kiteytyy toinen raakatryptofaanijae, joka erotetaan.

Nyt jäljelle jäänyt konsentroitunut emäliuos voidaan sitten mielellään käyttää täydennyksenä rehuissa. Jos käytetään proteiinihydrolysaattien seriinipitoisia ulos-tulovirtauksia, voidaan näistä emäliuoksista eristää myös muita aminohappoja sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

ä > t 7 86415

Raakatryptofaani liuotetaan kuumaan veteen ja solut erotetaan aktiivihiilen ja suodatusapuaineiden lisäämisen jälkeen. Tryptofaaniliuos, josta väri on poistettu, konsentroidaan vakuumissa, jäähdytetään ja kiteytynyt tryptofaani erotetaan. Infuusioliuoksissa käyttöä varten pitää L-tryptofaani vapauttaa pyrogeeni-sistä aineista. Nämä pyrogeeniset aineet ovat reaktiossa käytetyistä mikro-organismeista peräisin olevia endo-toksiineja ja ne saavat infuusion yhteydessä aikaan voimakkaita kuumereaktioita. Koska näiden pyrogeenisten aineiden keskimääräinen molekyylipaino on 10 000, ei niitä varmasti pystytä poistamaan ultrasuodatuksella, ja tästä syystä kokeiltiin erilaisia adsorbentteja.

Tällöin piti halutun adsorbentin adsorboida vain pyrogeeniset aineet, mutta ei tryptofaania. Happamaksi aktivoitu alumiinioksidi täytti tämän vaatimuksen. Keksinnönmu-kaisesti perkoloidaan tryptofäänin vesiliuos, josta väri on poistettu, alumiinioksidipylväässä ja sen jälkeen poistetaan alumiinioksidipartikkelit steriilin levysuodat-timen läpi suodattamalla. Tämän jälkeen suodatettu liuos konsentroidaan steriileissä olosuhteissa ja saadaan pyrogeenitöntä L-tryptofaania.

Toteutustapaesimerkki 1

Kaksivaippainen lasipylväs (850 x 40 mm) täytetään 1000 ml:11a natriummuodossa olevaa kationinvaihtajaa. Erotuspylvään kaksoisvaippa kuumennetaan termostaatin avulla 85°C:een. Sitten pylvääseen tuodaan virtausnopeudella 6 ml/min 120 ml melassinsokerinpoistosta saatua seriinipitoista ulostulovirtausta, jonka kuiva-aineesta 60 % on sakkaroosia ja 4 % seriiniä, ja jonka pH on säädetty arvoon 6,0, ja 20 minuutin kuluttua syötetään 85 minuutin ajan vettä, josta suolat on poistettu kokonaan. Sitten alkaa toinen sykli siten, että syötetään seuraava seriinipitoinen ulostulovirtaus.

Erotuspylväästä poistuvat liuokset kulkevat jatkuvasti tiheyden- ja johtokyvynmittauslaitteen läpi ja s 86415 mitatut arvot siirretään piirturiin. Mitattujen tiheys-ja johtokykyarvojen perusteella leikataan mikroproses-soriohjauksella seuraavat jakeet: - 50 minuuttia ei-sokeri- ja sakkaroosijae -10 minuuttia palaute 1 - 30 minuuttia seriinijae -15 minuuttia palaute 2

Palautejae 1 syötetään yhdessä seuraavan seriini-pitoisen ulostulovirtauksen kanssa ja palautejae 2 palautetaan yhdessä veden kanssa. Ei-sokerijae palautetaan sokerinpoistoprosessiin ja seriiniliuos, jonka kuiva-aineesta 40 % on seriiniä, jatkokäsitellään seuraavalla tavalla: 3000 g seriiniliuosta konsentroidaan 450 g:aan ja jäähdytetään sekoittaen 20°C:een, kiteytynyt DL-seriini suodatetaan pois, liuotetaan 90°C:ssa 500 ml:aan vettä, lisätään 3 g aktiivihiiltä ja suodatetaan. Suodos johdetaan 40°C:ssa lasipyIvaan läpi, joka sisältää 50 ml voimakkaasti emäksistä geelityyppistä anioninvahdinta ja puhdistettu, tyrosiinista vapaa liuos konsentroidaan 150 g:aan, jäähdytetään ja kiteytynyt DL-seriini suodatetaan pois. Kuivauksen jälkeen sadaan 13 g DL-seriiniä. Konsentroi-. . tu L-seriiniliuos jatkokäsitellään seuraavalla tavalla:

Ennestään tunnetulla tavalla kasvatetaan ravinne-liuoksessa aerobisissa olosuhteissa sopivaa E. colin ·' mutanttia ja pestyt solut sentrifugoidaan pois kasvu- : liemestä.

· 50 g tätä sentrifugoitua solumassaa suspensoidaan : : : 400 g:aan L-seriiniliuosta ja lisätään 10 g ammoniumsul- .'faattia. jalO mg pyridoksaalifosfaattia ja pH säädetään .·. : ammoniakkia lisäämällä arvoon 8,0. Tähän suspensioon lisätään sekoituksen alaisena liuos, jossa on 60 g indolia 300 ml:ssa etanolia, ja lisäysnopeus säädetään sellaiseksi, että vapaan indolin pitoisuus reaktioliuok-sessa pysyy alle 1,5 g:na per litra. Reaktioaika on .*··. 35°C:ssa 40 tuntia. Reaktion loputtua säädetään liuoksen 9 86415 pH fosforihapolla arvoon 4,0, kuumennetaan 50°C:een ja lisätään 10 g aktiivihiiltä. Koaguloituneet solut erotetaan sen jälkeen yhdessä kiteytyneen tryptofäänin kanssa.

Saanto: 200 g raakatryptofaania I.

Raakatryptofaanin emäliuos konsentroidaan 300 g:aan tislaamalla pois etanoli, jäähdytetään huoneenlämpö-tilaan ja erotetaan toinen raakatryptofaanijae.

Saanto: 20 g raakatryptofaania II.

220 g raakatryptofaania liuotetaan 70°C:ssa 4000 ml:aan vettä, lisätään 20 g aktiivihiiltä ja 50 g piimaata ja soluaine suodatetaan pois. Suodatettu liuos, josta väri on poistunut, johdetaan sitten pylvääseen, jossa on 50 ml alumiinioksidia, ja sen jälkeen suodatetaan steriilin kalvon läpi. Pyrogeeniton liuos konsentroidaan kiertohaihduttimessa 500 ml:aan, jäähdytetään, tyrptofaani suodatetaan pois ja kuivataan vakuumissa 80°C:ssa. Näin saadaan 70 g puhdasta pyrogeenitöntä L-tryptofaania.

j Toteutustapaesimerkki 2

Kahteen peräkkäin kytkettyyn voimakkaasti happamaan kationinvaihtimeen, joiden kunkin tilavuus on 1 1, johdetaan sokerinvalmistuksessa saatua saturoitua mehua, kunnes ensimmäisen kationinvaihtimen pH on muuttunut arvosta 2,0 arvoon 3,0. Sitten kummastakin kationinvaihti-mesta poistetaan makeus ja suoritetaan jälkipesu vedellä. Toinen eli jäljempänä oleva kationinvahdin, jossa on pääosa aminohaposta, regeneroidaan 1,5 litralla IN natrium-hydroksidia tai 1 N ammoniakkiliuosta ja suoritetaan jälkipesu vedellä. Eluaatti ja pesuvesi konsentroidaan sitten yhdessä noin 15 % kuiva-ainepitoisuuteen ja saatu liuos, jonka kuiva-ainepitoisuudesta noin 2 % on seriiniä, . jatkokäsitellään toteutustapaesimerkin 1 mukaisesti.

10 8641 5

Toteutustapaesimerkki 3 1000 g villajätettä hydrolysoidaan 5 litrassa 6N suolahappoa 8 tuntia 105°C:ssa. Saostuneet humiiniai-neet suodatetaan pois ja suolahappohydrolysaatti neutraloidaan sekoituksen alaisena lisäämällä varovasti natriumkarbonaattia, kunnes saavutetaan pH-arvo 5,0 - 6,0. Liuos jäähdytetään huoneenlämpötilaan, jossa kiteytymisen annetaan tapahtua 48 tuntia, ja sitten vaikealiukoiset, kiteytyneet aminohapot suodatetaan pois ja emäliuos, jonka kuiva-aineesta noin 5 % on serii-niä, jatkokäsitellään esimerkin 1 mukaisesti. Raaka-tryptofäänin erottamisen jälkeen saaduista ulostulovis-tauksista voidaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä, kuten ioninvaihtokromatografilla, saada talteen muita aminohappoja.

Claims (6)

11 8641 5

1. Menetelmä L-tryptofäänin ja DL-seriinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että sokerijuurikkaiden jalostuksessa saatujen saturoitujen mehujen ja sokeri-siirappien ioninvaihtoeluaateista tai muista seriinipi-toisista ulostulovirtauksista, jotka on saatu poistettaessa sokeria meiassista, valmistetaan pH-alueella 5,5 - 6,5 ionikromatografian avulla niukkatuhkainen seniniliuos, joka sen jälkeen konsentroidaan niin, että DL-seriini erottuu, ja jäljelle jäänyt konsentroi-tunut L-seriiniliuos saatetaan reagoimaan indolin kanssa tryptofaanisyntetaasia sisältävien solujen suspensiossa, jolloin syntyy L-tryptofaania.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seriinipitoiset ulostulo-virtaukset kromatografoidaan lämpötila-alueella 80 -90°C natriummuodossa olevassa kationinvaihtimessa.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kromatografista seriininero-tusta seurataan mittaamalla ulos virtaavan liuoksen tiheyttä ja sähkönjohtokykyä.

4. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-3 mukainen : menetelmä, tunnettu siitä, että seriinijae konsent- roidaan, kiteytynyt DL-seriini erotetaan, liuotetaan veteen ja puhdistetaan käsittelemällä voimakkaasti emäk-sisessä anioninvaihtimessa ja uudelleenkiteyttämällä sen jälkeen.

5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kiteytynyt L-tryp- . . tofaani erotetaan yhdessä solujen kanssa sen jälkeen, / kun on lisätty aktiivihiiltä ja suodatusapuainetta, ja -* ‘ emäliuoksesta otetaan jatkohaihdutuksen jälkeen talteen •r toinen raakatryptofaanijae.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että L-tryptof aani liuotetaan • · i2 8641 5 veteen, suodatetaan, liuos, josta väri on poistunut, käsitellään aktiivisella alumiinioksidilla, konsentroidaan ja kiteytetään, jolloin saadaan pyrogeenitöntä L-trypto-faania. li 13. r 4 1 Γ PATENTKRAV ° U H ' 3