FI86193C - Foerfarande foer framstaellning av farmaceutiskt anvaendbar peptid. - Google Patents

Description

1 86193

Menetelmä farmnseutlisesti käytettävän peptidin valmistamiseksi

Keksintö kohdistuu sulfaattiesteriryhmiä sisältävien peptidien, joilla on ravinnon ottoa estäviä ominaisuuksia, ja jotka kykenevät kiihottamaan sappirakon supistumista, valmistamiseen. Näissä peptideissä on 6-9 aminohappoa. Näiden kaikkien peptidien rakenne eroaa kuitenkin kahdesta samankokoisesta peptidistä, joilla tiedetään olevan ravinnon ottoa estäviä ohi I na I suukf; I a : CCK-U, Jolla on i aitonne Asp-'I'yi ( SO3II ) Me l G I y Ti μ-Met Asp-IMio- Nli^,, sekä soiuletidi, jonka rakenne on Glp-Gln-Asp-Tyr(SO3II)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2- Keksinnön mukaisia peptidejä ei esiinny luonnossa, vaan ne on syntetisoitava.

Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat peptidejä, joilla on kaava

(D

OSO3H

φ 9 en2 ch2 ! (J -YCIICO- M-G-W-X-J -fJ-CIICU- 7.

jossa : Q on H-pAsp, H-DAsp, For, Sue, desQ, tai rIr^CHOCO, : Y on H tai (S)-NH, M on Met tai Ahx, G on Gly, . W on Trp, X on Met tai Ahx, *’ * J on Asp, .* * : F^- on (S)-MeN-, Z on NH2, * · · • » · 2 86193 R1 ja ovat toisistaan riippumatta alempi alkyyli sekä näiden yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, edellyttäen, että Q on desQ, kun Y on H.

Määritelmät "Alemmat alkyylit" sisältävät 1-6 hiiliatomia.

(R) ja (S) tarkoittavat absoluuttisia konfiguraatioita viereisen metiinihiilen suhteen. Mikäli Y on (S)-NH, niin

OSOoH

Φ ch9

YCHCO

on L-konfiguraatiossa.

Kaikki optisesti aktiiviset aminohapot ovat L-konfiguraatiossa, mikäli toisin ei mainita.

Lyhenteissä Η-Asp, H-pAsp, H-DAsp- H-MeAsp, H-Arg, H-Abu ja Η-Ala H tarkoittaa vetyä.

DesQ, joka saadaan, kun Y on H, tarkoittaa sitä, ettei Q ole läsnä.

R1R^CHOCO on kaava

R1 H O

\ I II

R2>C-°-C- : : Hpp(SO3H) on kaava 3 86193

OSOqH

φ CH9 HCHCO-

Jokainen yhdisteeseen kohdistuva vaatimus sisältää sen farmaseuttisesti hyväksyttävät emäsadditiosuolat. Emäsaddi-tiosuoloihin kuuluvat sekä orgaanisilla että epäorgaanisilla emäksillä saadut suolat, ja näistä emäksistä mainittakoon esim. ammoniakki, natriumhydroksidi, kalsiumhydroksidi, bariumhydroksidi, tetraetyyliammoniumhydroksidi, etyyliamii-ni, dietyyliamiini, trietyyliamiini ja muut vastaavat.

Kaavan (I) vaihtoehtoisessa esitystavassa, jota käytetään lyhyyden vuoksi, peptidit esitetään perinteisen esitystavan mukaisesti, esimerkiksi Η-Asp, DTyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2, joka esittää kaavan (I) mukaista yhdistettä, kun Q on H-Asp, Y on (R)-NH, M on Met, G on Gly, W on Trp, X on Met, J on . ·. Asp, F1 on (S)-NH ja Z on NH2. 1 · • · · 4 86193

Kun tässä kuvauksessa ja liitteenä olevissa patenttivaatimuksissa aminohappoja, peptidejä, suojaavia ryhmiä, aktiivisia ryhmiä, jne., esitetään symboleilla, niin tällöin käytetään liittojen IUPAC ja IUB määrittelemiä tai alalla tavallisesti käytettyjä symboleja. Esimerkkejä symboleista esitetään seuraavassa:

Abu 2-aminobutyyrihappo

Ac asetyyli

Ahx 2-aminoheksaanihappo

Aib 2-aminoisobutyyrihappo

Ala alaniini

Arg arginiini

Asn asparagiini

Asp aspartiinihappo /3 Asp beeta-aspartiinihappo

Boc tert.-butyylioksikarbonyyli

BrCH^-Pam 4-(bromimetyyli)fenyyliasetamidometyyli

Cbz karbobentsoksi

Cys(Me) S-metyylikysteiini DAla D-alaniini DAhx D,2-aminoheksaanihappo DAsp D-aspartiinihappo DMet D-metioniini DPhe D-fenyylialaniini DPhe-NH^ D-fenyylialaniini-amidi ·'.· DTrp D-tryptof aani .·. DTyr D-tyrosiini

EtOCO etyylioksikarbonyyli • *

EtPhe N-etyylifenyylialaniini • * ’V EtPhe-NH- N-etyylifenyylialaniini-amidi • ·

Fmoc 9-f luorenyylimetyylioksikarbonyyli • » * * For formyyli

Gin glutamiini • · .*·*: Glp , pyroglutamyyli • · · .· : Glu glutaamihappo

Glt HOOC(CH-) ,C0- ,···, Gly glysiini

His histidiini • · \’·· Hpp 3-(4-hydroksif enyyli) propionyyli • · • I i • · · • · 5 86193

Hpp ( SO-jH) 3-(0-sulfo-4-oksif enyyli ) propionyyli iBuOCO isobutyylioksikarbonyyli

He isoleusiini

Leu leusiini

Lys lysiini

MeAhx N-metyyli-2-aminoheksaanihappo

MeAsp N-metyyliaspartiinihappo

MeLeu N-metyylileusiini

Melle N-metyyli-isoleusiini

MeMet N-metyylimetioniini

MeOCO metyylioksikarbonyyli

MePhe N-metyylifenyylialaniini

MePhe-NF^ N-metyylifenyylialaniini-amidi

Met metioniini

MetO metioniini-sulfoksidi

MeTrp N-c£-metyylitryptof aani

MeTyr N-metyylityrosiini

MeTyr(Me) N,O-dimetyylityrosiini

MeTyr( Me )-NH2 N,O-dimetyylityrosiini-amidi Mox metoksiniini

Nal 3-(2-naftyyli )alaniini OBt 1-bentsotriatsolyyliesteri 0CH2-Pam 4-(oksimetyylifenyyli)asetamidometyyli OSu sukkinimidyylioksiesteri

OtBu tert.butyyliesteri

Phe fenyylialaniini ·.·. Phe-NH2 f enyylialaniiniamidi

Phe-NHEt fenyylialaniini-etyyliamidi « *

Phe-NHMe f enyylialaniini-metvyliamidi . ^ Phe-N(Et)2 fenyylialaniini-dietyyliamiini • · ♦ *‘V Phe-N(Me), fenyylialaniini-dimetyyliamidi • · · t • · *

Phe-OH fenyylialaniinihappo *·*·* Phe(4-Cl) . 3-( 4-kloorif enyyli ) alaniini

Phe ( 4-Cl) -NH-, 3- ( 4-kloorif enyyli ) alani ini-amidi • · z

Phe(4-Me) 3-(4-metyylif enyyli) alaniini · Phe ( 4-Me )-NH2 3-(4-metyylif enyyli ) alaniini-amidi ....: Phe(4-N02) 3-( 4-nitrof enyyli ) alaniini ,···, Phe ( 4-NO-)-NH? 3-(4-nitrof enyyli ) alaniini-amidi "* Phe(4-NH,) 3-(4-aminofenyyli)alaniini

Phe ( 4-NH, )-NH., 3-( 4-aminof enyyli ) alaniini-amidi • * z • · · • ·♦ • · 6 86193

COOH

Pht j ^ I

CO-

Pro proliini

PrOCO n-propyylioksikarbonyyli resin (hartsi) polystyreeni

Sar sarkosiini

Ser seriini

Sue HOOC(CH2)2CO- tBu tert.-butyyli

Thr treoniini

Trp tryptofaani

Trp(5-F) 5-fluoritryptofaani

Trp(6-F) 6-fluoritryptofaani

Trp(Me) 1-metyylitryptofaani

Tyr tyrosiini

Tyr-NH2 tyrosiiniamidi

Tyr(Me) O-metyylityrosiini

Tyr(Me)-NH2 O-metyylityrosiini-amidi

Tyr(S03H) O-sulfotyrosiini

Tyr(SO^H)-NH2 O-sulfotyrosiini-amidi

Vai väliini

Edulliset yhdisteet • · ·1 Keksinnön mukaiset edulliset yhdisteet estävät ravinnon oton 48-100-prosenttisesti 0,5 tuntia kestävän ruokintajakson aikana, kun niitä annetaan määränä 30 ^,ug/kg kokeessa, joka kuvataan : jäljempänä otsikon "Hyväksikäyttö" alla (ks. jäljempänä esi- .·/ tetty taulukko 2).

• · • · * ·

Sappirakon supistumista ajatellen edullisin yhdiste on yhdiste

Hpp(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2.

• · • » « • · 1 • » » * • · • · · • · • · • · ♦ • « 1

• 1 I

li « · » · · 7 86193

Yhdiste Et0C0-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH2 esti (inhiboi) ravinnon oton 72-prosenttisesti, kun sitä annettiin 0,3 /ug/kg.

Peptidien valmistaminen

Keksinnön mukaiset uudet sulfaattiesteriryhmiä sisältävät peptidit ja niiden uudet välimuodot voidaan valmistaa alalla hyvin tunnettuja menetelmiä käyttäen, niitä voidaan valmistaa esimerkiksi yhdistämällä erillisiä aminohappoja kiinteänä faasina toimivaan hartsiin vaiheittain, aminohappo aminohapolta, tai vaihtoehtoisesti yhdistämällä aminohapporyhmiä kiinteänä faasina toimivaan hartsiin välimuotona toimivan peptidyyli-hartsin aikaansaamiseksi. Tunnetusti tällaiset lisäämiset toteutetaan suojaamalla aminohapon tai aminohappojen ryhmän aminoryhmä muuntamalla se esimerkiksi tert.-butyylioksikarbonyyli_ (Boc-) tai 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli- (Fmoc-) johdan-naisekseen, minkä jälkeen tällaisen aminohapon tai aminohappojen ryhmän karboksyyliryhmä aktivoidaan muuntamalla se esimerkiksi 1-hydroksibentsotriatsoli- (HOBt-) tai N-hydroksi-sukkinimidi- (HOSu-) esterijohdannaisekseen. Sitten tämän suojatun ja aktivoidun välimuodon annetaan reagoida vapaan amino-ryhmän sisältävän, aminohapon ja hartsin välisen yhdistelmän tai peptidyyli-hartsin kanssa, jolloin peptidiketju pitenee tuottaen kaavan (2) mukaisen peptidyyli-hartsin, jossa kaavassa '' (2) Pg on sopiva suojaava ryhmä, esimerkiksi Boc tai Fmoc.

’.i.: OH

» • · · * · j

Lii ··.:> LJJ II) (2>

" I I

CH- CH_ 1 2 1 2 pg - Q - YCHCO - M-G-W-X-J - F1CHCO- hartsi.

* * ·

Kaavan (2) fenolinen OH-ryhmä muunnetaan sulfaattiesteriksi : : käyttämällä tavallisia sulfatoivia aineita, kuten rikkitrioksi- : din ja pyridiinin välistä kompleksia. Tämä reaktio toteutetaan * · · • · · « * s 86193 erityisemmin, esimerkiksi, suspendoimalla kaavan (2) mukainen peptidyyli-hartsi dimetyyliformamidiin (DMF), pyridiiniin tai muuhun vastaavaan liuottimeen, ja lisäämällä siihen rikkitri-oksidin ja pyridiinin välistä kompleksia noin 10-40-kertaisena molaarisena ylimääränä, jolloin saadaan kaavan 3 mukainen sulfatoitunut peptidyyli-hartsi.

OSO..H

f i I 131 CH, CH, I . 1

Pg - Q - YCHCO -'m-G-W-X-J- F]-CHCO- hartsi.

Koska lopputuotteina toimivat keksinnön mukaiset, sulfaattieste-riryhmiä sisältävät peptidit ovat C-päätteisiä amideja, niin peptidiketjun hartsiin kytkevän kemiallisen sidoksen on oltava sellainen, että sen katkaiseminen sopivilla reagensseilla tuottaa vaivattomasti amideja. Koska sulfaattiesteriryhmät ovat herkkiä vahvoille hapoille (esimerkiksi nestemäiselle fluori-vedylle), niin peptidyylin ja hartsin välinen sidos voidaan katkaista joko heikommilla hapoilla (esimerkiksi käsittelemällä lyhyen aikaa trifluorietikkahapolla TFA) ja/tai nukleofiileillä (esimerkiksi ammoniakilla, amiineilla, hydroksidilla ja alkoksi- • · i ’.· deilla) . Sopivista hartsi johdannaisista mainittakoon oksimetvyli- polystyreeni , 4-(oksimetyylif enyyli ) (CH2 ) nC0-aminometyyli-·;·1: polystyreeni (n = 0-3) sekä 4-(oksimetyylif enyyli ) oksimetyyli- polystyreeni. Samankaltaisesti substituoituneet polyakryyliami-. dihartsit sopivat yhtä hyvin kuin edellä mainitut polystyreeniin pohjautuvat hartsit. Tämän keksinnön tavoitteita ajatellen peo- • I · 1" tidiamidien valmistamiseen sopivat parhaiten 4-(oksimetyylifenvy-. . li)CH-CO-aminometyyli-polystyreeni /jota kutsutaan ohessa 4-

• · · L

(oksimetyylif enyyli ) asetamidometvylipolystyreeniksi tai 0CH?-'·1 Pam-hartsiksiy. Näin ollen tässä keksinnössä kuvataan menetelmä ·:··: kaavan (4) mukaisten sulfatoitujen peptidyyli-OCH2-Pam-hartsien syntetoimiseksi, jossa menetelmässä hartsi on polystyreeni * · · * • « · • · · * · · ♦ · · • 1 · • · q 86193 (käsite "polystyreeni" kattaa kopolymeerit, jotka sisältävät pieniä määriä, tavallisesti 1%, tyydyttymättömiä monomeerejä kuten divinyylibentseeniä) .

OSO,H

i _| (41 V V i CH9 CH- i

I | I

Pg — Q -YCHCO — M — G ~ W~ χ - J - F1CHCO — OCH2 — Pam-hartsi ! i

Keksinnön mukaisia peptidiketjuja muodostettaessa aminofunktiot j i voidaan suojata tavallisesti käytetyillä aminoryhmiä suojaavilla 1 ryhmillä, kuten Boc, Fmoc, (4-metoksibentsyyli)oksikarbonyyli, 2-nitrofenyylisulfenyyli, ja niin edelleen. Suojaavana ryhmänä käytetään mielellään Boc- ja Fmoc-ryhmiä. Karbonvyli- ja hydrok- ! i syyliryhmien suojaamiseen voidaan käyttää metyyliä, tert.-butyyliä (tBu), bentsyyliä, 4-metoksibentsyyliä ja niin edelleen. Mieluiten käytetään tBu-ryhmää.

Kaavassa (4) esiintyvän ryhmän F määrittämät aminohapot voidaan kiinnittää OCH_-Pam-hartsiin useilla tavoilla. (a) Esi- . . 2 i ‘ merkiksi, Boc-suojatun f enyylialaniinin, missä F on (S)-NH ja 2

•rt F on H , voidaan antaa reagoida sopivan 4-(bromimetyyli)-fenvyli-asetaattiesterin (esimerkiksi f enasyylies terin) kanssa, ja jatko— käsitellä edelleen Boc-Phe-(4-oksimetyylif enyyli)etikkahapon I

, .·. aikaansaamiseksi, joka viimeksi mainittu yhdiste voidaan kytkeä aminome tyylipolystyreeniin , jolloin saadaan Boc-Phe-( 4-oksime tyyli- • · · fenyyli)asetamidometyylipolystyreeniä (Boc-Phe-OCH?-Pam-hartsia).

. . (b) Vaihtoehtoisesti 4-(bromimetyyli)fenyylietikkahappo voidaan kytkeä aminome tyylipolys tyreeniin , jolloin saadaan 4-(bromime-'·1 ' tyyli ) f enyyliasetamidometyylipolystyreeniä ( BrCt^-Pam-hartsi ) , *:·1: jonka annetaan sitten reagoida yhdisteen Boc-Phe-OH keesiumsuolan kanssa, jolloin saadaan Boc-Phe-OC^-Pam-hartsia.

» · • 2· • · · • · · 2 • M , · 10 861 93

Sopivista aktivoivista ryhmistä mainittakoon sellaisten ryhmien mikä tahansa yhdistelmä, jotka ryhmät saavat aminohapon happo-ryhmän reaktiivisemmaksi, ja joista ryhmistä mainittakoon happo-kloridit, seka-anhydridit ja symmetriset anhydridit, karbodi-imidin kanssa saadut reaktiotuotteet (esimerkiksi disykloheksyyli-karbodi-imidi, DCC) ja aktiiviset esterit (esimerkiksi esterit, jotka on saatu yhdisteistä HOBt,HOSu, 2- tai 4-nitrofenoli sekä 2,4,5-trikloorifenoli). Erityisen mielellään käytetään yhdistettä DCC ja yhdisteiden HOBt ja HOSu estereitä, koska tällöin saanto on hyvä, sivutuotteet puuttuvat, minkä ansiosta puhdistaminen on helppoa.

Suojaavat ryhmät poistetaan tunnetuilla reaktioilla, kuten käsittelemällä laimealla TFA-liuoksella (50% dikloorimetaanissa DCM) Boc- ja/tai tBu-ryhmiä poistettaessa, sekä käsittelemällä laimealla piperidiinillä (20% DMF:ssä) Fmoc-ryhmiä poistettaessa, vain muutama menetelmä mainiten, jolloin saadaan kaavan (5) mukainen sulfatoitunut peptidyyli-hartsi.

OSO h A3 v o CH2 CH2 I r1 . q - YCHCO — M — G — W - X - J -F^CHCO - OCH- -Pam-hartsi « ^ • · · # · • · · *···· . , Sulfaattiesteriryhmiä sisältäviä kaavan 1 mukaisia peptidejä » « « :1· ’ voidaan saada katkaisemalla kaavan (5) mukaisen peptidyyli- « · « OCH_-Pam-hartsin sidos asianmukaisella reagenssilla. C-päät- • · C.

• · · \V teiset sulfatoituneet peptidiamidit saadaan esimerkiksi käsit telemällä kaavan (5) mukaista sulfatoitua peptidvyli-hartsia • · *·/·· ammoniakin, alkyyliamiinien ja dialkyyliamiinien metanoliliuok- : : i silla.

»·»·· ... Automaattista peptidisyntetisaattoria käytettiin keksinnön mu- • · kaisten sulfatoituneiden peptidiamidien syntetoimiseksi , joka ·.1'1 toteutetaan kiinteässä faasissa. Toimenpiteet, eli kytkeminen • · • 1 · • · · • · 11 86193 aminometyylihartsiin tai peptidyyli-OCH^-Pam-hartsiin (1 mmooli käytettävissä olevaa typpeä), suojaavien ryhmien poistaminen, sulfatointi, katkaiseminen ja tuotteen puhdistaminen, esitetään taulukossa 1.

Taulukko 1

Sulfatoituneiden peptidiamidien synteesissä, joka toteutetaan kiinteässä faasissa, käytetyt toimenpiteet (1 millimoolin mittakaava). Kunkin vaiheen tilavuus on 50 ml, mikäli toisin ei mainita. Kaikki pesuvaiheet toistetaan kolmasti. Käytetyt lyhenteet: DCC = disykloheksyylikarbodi-imidi; DCM = dikloori- metaani; DIEA = N,N-di-isopropyylietyyliamiini; DMF = dimetyyli-formamidi; HOBt = 1-hydroksibentsotriatsoli; TFA = trifluori-etikkahappo. 1 * * · « • · i2 861 93

Vaihe Reagenssi tai liuotin Tarkoitus Sekoitusaika 1 DCM Pesu 1 min 2 Siirry vaiheeseen 3, 5 tai 8 - 3 Lisää suodatettu, etukäteen aktivoitu Etukäteen ak- 2-15 tuntia (0°C, 1 tunti) seos, joka sisältää suojat- tivoitu DCC:n tua aminohappoa (tai suojattua dipeptidiä, ja HOBt:n 3 mmol), yhdisteitä HOBt (4,5 mmol) ja kytkeminen DCC (3 mmol) 1:4 DMF/DCN-liuoksessa 4 Siirry vaiheeseen 10, 16, 21 tai 26 - 5 Lisää suojattua aminohappoa (tai suojat- In situ akti- 2-15 tuntia tua dipeptidiä, 3 mmol) ja yhdistettä voitu DCC:n HOBt (4,5 mmol) 30 millilitrassa 1:2 ja HOBt:n DMF/DCM-liuosta, sitten yhdistettä DCC kytkeminen (3 mmol) 20 millilitrassa DCM-liuotinta 6 2-propanoli pesu 1 min 7 Siirry vaiheeseen 4 - 8 Lisää aktiivista esteriä tai anhydridiä Aktivoimaton 2-15 tuntia (3 mmol) liuottimessa DCM tai DMF tai DCC/HOBt- niiden seoksessa kytkeminen 9 Siirry vaiheeseen 4 - - 10 DCM pesu 1 min 11 Käsittele 49:1:50 TFA/anisoli/DCM- Eoc- ja tBu- 30 min seoksella ryhmien poisto 12 DCM pesu 1 min 13 Käsittele 1:19 DIEA/DCM-seoksella neutralointi 1 min 14 DCM pesu 1 min 15 Siirry vaiheeseen 1, 16, 21 tai 26 - 16 DMF pesu 1 min 17 Käsittele 1:4 piperidiini/DMF-seoksella Fmoc-ryhmän 3 min • poisto 18 Käsittele 1:4 piperidiini/DMF-seoksella Fmoc-ryhmän 7 min : poisto . 19 DMF pesu 1 min I" 20 Siirry vaiheeseen 15 - 21 DMF pesu 1 min 22 1:2 pvridiini/DMF pesu 1 min '· 23 Lisää rikkitrioksidin ja pyridiinin vä- sulfatointi 20-24 tuntia listä kompleksia (40 mmol) 60 millilitrassa 1:2 pyridiini/DMF-seosta 24 DMF pesu 1 min 25 Siirry vaiheeseen 4 - : 26 Metanoli pesu 1 min « · « « * • « * * · 13 861 93 27 Ammoniakilla kyllästetty (-20°C) meta- hartsin 2-5 vuorc- noli tai amiinin 20-prosenttinen metano- pilkkominen kautta liliuos (250 ml) 28 Metanoli pesu 1 min 29 Yhdistä ja väkevöi vaiheiden 27-28 eristäminen suodokset 30 Käsittele jäännös kromatografisesti puhdistaminen käyttäen kolonneja Amberlite XAD-2 (Rohm & Haas, 2,5 x 60 cm, metanoli-gradientti 0,1 M ammoniakissa),

Trisacryl M DEAE (LKB Inc., 2,5 x 47 cm, ammoniumbikarbonaattigradientti) ja/tai P-40 ODS-3 (Whatman, 4,8 x 50 cm, metano-ligradientti 0,2 % ammoniumasetaatissa).

Täten valmistetuista kaavan (1) mukaisista, sulfaattiesteriryh-miä sisältävistä peptideistä voidaan poistaa suolat ja ne voidaan puhdistaa tavallisia menetelmiä käyttäen. Esimerkiksi, tuote voidaan puhdistaa ioninvaihtokromatografisesti käyttäen Trisacryl M DEAE-geeliä, DEAE-selluloosaa tai muita vastaavia, osittavalla kromatografialla käyttäen Sephadex LH-20-geeliä, Sephadex G-25-geeliä tai muita vastaavia, käsittelemällä käänteis-faasiin perustuvalla kromatografiällä käyttäen Amberlite XAD-2 hartsia, ODS-silikageeliä tai muita vastaavia, normaalifaasiin perustuvalla kromatografialla käyttäen silikageeliä tai muita vastaavia,' tai korkean suorituskyvyn nestekromatografisesti (HPLC).

• Analogiset menetelmät, joissa reaktiot toteutetaan ilman kiin- teänä faasina toimivaa komponenttia (hartsia), ovat hyvin tunnet-: tuja alalla, ja ne sopivat hyvin suuressa mittakaavassa toteutet- "V tuun tuotantoon. (Katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu 3 892 726).

Hyväksikäyttö ’· Keksinnön mukaiset peptidit kykenevät inhiboimaan ravinnon oton : aktiivisuutta nisäkkäissä. Näin ollen niitä voidaan käyttää lii- kalihavuuden ennaltaehkäisyyn ja käsittelyyn. Ravinnon ottoa .1··. inhiboiva aktiivisuus voidaan osoittaa rotilla seuraavasti: i4 861 93

Urospuolisia Sprague-Dawley-rottia (joiden paino on 300-350 g) laitetaan erillisiin häkkeihin, ja niitä pidetään 12 tunnin pituisessa valoisassa ja pimeässä jaksossa. Niitä totutellaan vähintään 14 vuorokauden ajan siihen, että ruokinta tapahtuu pimeän vaiheen aikana kolmen tunnin ajan, muttei tätä kolmen tunnin pituista ajanjaksoa edeltävien 21 tunnin aikana. Kokeen toteuttamispäivänä rotille annetaan vatsaontelon sisäisesti suolaliuosta (vertailu) tai testattavaa yhdistettä (joka on liuotettu suolaliuokseen ja jonka pitoisuus on tavallisesti 0,3-300 mikrogrammaa testattavaa yhdistettä rotan painokiloa kohden). Ruokaa annetaan 10 minuuttia sen jälkeen, kun eläimille oli annettu suolaliuosta tai testattavaa yhdistettä. Testatut yhdisteet katsotaan aktiivisiksi, mikäli koeryhmä kuluttaa merkittävästi vähemmän ruokaa kuin suolaliuosta saaneet vertailueläimet ruokin-tavaiheen aikana, joka ruokintavaihe päättyy joko 0,5 tai 3 tunnin kuluttua ruuan tarjoamisesta. Ravinnon oton prosenttinen inhiboituminen 0,5 tunnin pituisen ruokintajakson aikana, joka inhiboituminen saatiin antamalla eläimille 30 pg/kg suuruinen annos testattavaa yhdistettä, esitetään taulukossa 2 tuotteen CCK-8 sekä lukuisten keksinnön mukaisten yhdisteiden tapauksessa.

Taulukko 2

Rakenne Ravinnon oton inhiboitumi- ... __nen, %_ H-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 70 H-Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MeTyr(Me)-NH2 65 H-8Asp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 100 : : H-DAsp-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 100

For-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 100 iBuOCO-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 100

Hpp( SO3H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 69 : Hpp(S03H)-Met-Gly-Trp-Pro-Asp-Phe-NH2 48

Suc-Tyr (S03H) -Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH2 100 ... iBuOCO-Tyr (SO3H)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH2 100

Hpp(SO3H)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH2 94 1 · · 15 861 93

Sopiva tapa peptidin, joka ohessa katsotaan sopivaksi vatsaontelon sisäistä, suonen sisäistä, lihaksen sisäistä, ihon alaista tai nenän sisäistä antamista varten, antamiseksi nisäkkäälle, jota on käsiteltävä liikalihavuuden hoitamiseksi tai ennaltaehkäisemiseksi, on käyttää annoksia, joiden suuruus on noin 0,3 mikrogrammasta (pg) 3 milligrammaan ruumiin painokiloa kohti vuorokaudessa, ja jotka annetaan joko yhtenä annoksena, tai jotka jaetaan kahdesta annoksesta neljään annokseen. Annoksen suuruus voi vaihdella, riippuen potilaan tarpeista sekä käytettävästä yhdisteestä.

Keksinnön mukaiset peptidit kykenevät kiihottamaan sappirakon supistumista nisäkkäissä. Näin ollen niitä voidaan käyttää myös diagnostisina apuaineina sappirakon röntgentutkimuksissa. Sappirakkoa supistavien aineiden käyttö diagnostisina apuaineina on hyvin tavallinen lääketieteellinen toimenpide.

Taulukossa 1 on esitetty stabiilisuus- ja ravinnonottoinhi-bitiovertailu keksinnön mukaisten yhdisteiden ja tekniikan tason edustavien yhdisteiden välillä. Analyysimenetelmät ovat seuraavat: (1) Stabiilisuusanalyysi

Peptidien stabiilisuus proteolyyttisille entsyymeille koiran : munuaishomogenaateista mitattiin Benovitzin ja Spatolan menetelmällä [Peptides 6, 257-261 (1985)]. Saadut tulokset on suhteutettu standardi CCK-8:aan, jonka arvona on 1.

(2) Ravinnonottoestoanalyysi

Ravinnonoton inhibitioprosentti 30 pg/kg:ssa peptidiannoksen jälkeen ravinnonottoajan jaksolle, joka päättyy 3 tuntia ravinnon antamisen jälkeen, on esitetty. Joissakin tapauksissa, joissa IC5Q-arvo (pg/kg) määritettiin, tulos on : myöskin annettu.

,fc 86193 O' Λί o o o o o 00 o o o o o o ....:,:

tt O θ' Ή rd r-i r-i Π O rd (N

$ H * 'ä : -' :«3 --

P C

:"H C Öi > <D Λ? w „ & a) · Q Ή n C-H p -H 3d -P+J (1) C -H C -H O « · ’ g Ja qj n m ^ - ’d id Q inooo-^-r^nHOHrHcofMvocrvoeocx -vo ro *-t ro ro ro ro ro cm Γ' Γ' σ\ σ\ ο σ> o. , en t

1/1 (U

•H r—I ...

g ia 3 | p d § S OCOCOCTl^r^rHCOiriiHfNJCriOCriOOCn -cr r—I C ················'*· •h C | HinHHHOrHOr-innrMVOVOOCOn. .Tf S Q H ; · 3 o c n m .c «n f\» (Mrvjojrvjrjrsjrjrj

SK K KKKKSXSCK

X 2 c\i rj rj cj X pj rj X 3C 2 ^ ^ 2 3.

XI I X X X 2 I X X I I I I I I I I 20)0)2222(1)220)0)0)(1)0)0)(1)0) ' x x i i i i x i i xxnx.c.cx.c o)G.DjQ)Q)Q)(ua.Q)Q)aiaiCi,a.cua.a.Q.

xi ιχχχχιχχα)α>α;α>ο)α>α>α> (x aaöiPjc^i^Qcuixssssssss

I ui W I I I I I I I I I I I I · I I I

Cu < < CUCuCUCuQiCuCuCuCuCuthCuCuCuCu W I I U1t/)V)t/)(/)(0(/)(/)I/l(0U)(/](/)U)Ul

I o <D I I I I I I I I I I I I | | I

M ΡΕΕ3ΧΧΡΡΡΡΡΡΡΡΡχχχ o <ui i o)xxo)(ua)Q)Q)Q)a)(i)(ux:jcx: S spua^i<<:sssasssss<rt;<

g I P P I I I I I I I 1 I I I I | | I

d aE-iHaaaaDiaaaaQ.aaaaa fij 1H <ΟΟΕ-<|ΠΕ-<Ε“<Ε-»Ε-<Ε*Ε-<ε-<Ε-<Ε-ιΕ-<ΙΗΕ-ιΕ-<

Eh « '-J » I 1 1 t 1 I * I.......

0)

S H I ·~Η I ( rd r—( r—( r—( r—( f—( t—( r—( f—( r—( f—( r—( rd rH

S UQOUOUOOOUOOOOOOOU

2 I I I I I I I I I I I I I I I I I I

73 pppsxppppppppppxxx m o)Q)o)o)Xo)Q)Q)a)a)a)<i)Q)<i)(Ujrjd£ c sssspi<sssssss£as<<<<

.5 I I I I I I I I I I I I I I I I I I

S wwwwwwwwwwwwwwwwww Ή w,wcowwcnwwwwwcnwwwtnwtn >1>1>1>1>1>1>1>1>,>1>1>1>,>lD«>1>i04

EdEdEdEdEdE-iEdE-iEdEdEdEdEdHXE-tEdX 1 I I I I I I I I I I I I I II

α,ο.ααο.αα,αχο.αο.Ρϋ ου I/lWlWOlWt/lWt/) wwwoo 30

<<<<<|<><|<< <C <C <C (li (Q 10 CQ

I I I I I I I I III I I

XXX2XX<Q.X Q <0. Q -H -H

I III

X X X X

—- — — 'l· VO O 00 m co <—

, <n p- T- (N

I in d p H ocn in(N:0PQ) •HO) CTi CTi 0 ro e ο) Φ •HP ^ co ·· g w p *9 <2 ® "!Γ Η -H to PH I 71' <n ro o tn to -π

1¾ w'l'cu'HS

>>1 ^DD O *5 « E >t I! i7 861 93

Tulokset

Taulukon 1 tuloksista nähdään, että kaikilla MePhe-johdannaisilla on suurempi ravinnonottoa estävä vaikutus kuin tekniikan tason yhdisteillä. Tekniikan tason yhdisteistä ainoastaan CCK-8 on potentiaalinen ja sen teho on ainoastaan 1/3-1/4 30 pg/kg annoksella. IC5Q-arvojen vertailu osoittaa CCK-8:n olevan 30-100 kertaa vähemmän potentiaalinen kuin MePhe-yhdisteet.

Stabiilisuustulosten vertailu paljastaa, että MePhe-analo-geilla on 2-10 kertaa suurempi stabiilisuus kuin tekniikan tason yhdisteellä lukuunottamatta D-Ala- ja D-Asp-yhdistei-tä. Kuitenkin näillä substituutioilla menetetään käytännöllisesti katsoen kokonaan ravinnonottoa estävä vaikutus.

Keksintöä voidaan havainnollistaa edelleen seuraavilla esimerkeillä. Esimerkit I-XVIII havainnollistavat välimuotojen syntetoimista yhdisteiksi. Esimerkit 1-7 havainnollistavat keksinnön mukaisten yhdisteiden synteesiä yhdisteiksi, joita voidaan käyttää liikalihavuuden käsittelemiseen ja ennaltaehkäisyyn. Esimerkit pyrkivät havainnollistamaan keksintöä sitä millään tavalla rajoittamatta.

Mikäli toisin ei mainita, peptidisynteesi käynnistettiin 1 milliekvivalentilla aminometyylihartsia, jossa hartsi oli, painosuhteessa 99:1, styreenin ja divinyylibentseenin välis-. tä kopolymeeria. Mikäli toisin ei mainita, reaktiot toteu tettiin huoneen lämpötilassa. Pesuvaiheet toteutettiin - kolmasti käyttäen 50 ml mainittua liuotinta, mikäli toisin "V ei mainita.

Esimerkki I

Isobutyyli-sukkinimidyyli-karbonaatti (iBuOCO-OSu)

Liuokseen, joka sisältää isobutyyli-kloroformaattia (26 ml, 200 ·. : : mmol) 600 millilitrassa kloroformia, lisättiin annoksittain ie 86193 ^ΤΓ-hydroksisukkinimidin (HOSu) disykloheksyyliamiinisuolaa (DCHA-suolaa; 49,28 g, 200 mmol) . Sen jälkeen, kun tuloksena olevaa suspensiota oli sekoitettu yön yli, saostunut DCHA-hydro-kloridi erotettiin suodattamalla, ja pestiin kloroformilla. Väkevöity suodos (noin 50 ml) ja pesunesteet laimennettiin 400 millilitralla etyyliasetaattia (EtOAc) ja pestiin 10-prosentti-sella sitruunahapolla (4 x 10O ml), suolaliuoksella (2 x 100 ml), 10 % natriumbikarbonaatilla (3 x 10 ml) ja suolaliuoksella (4 x 100 ml), minkä jälkeen se kuivattiin magnesiumsulfaatilla, suodatettiin ja väkevöitiin noin 100 millilitraksi. Se laimennettiin eetterillä ja saostettiin heksaanilla, jolloin saatiin 26,6 g (saanto 52 %) yhdistettä iBuOCO-OSu, jonka sulamispiste (sp. ) on 33-35°C.·

Esimerkki II Fmoc-DTyr-OH

D-tyrosiinia (1,81 g) liuotettiin 20 millilitraan vettä ja 30 millilitraan tetrahydrofuraania (THF), joka sisältää 10 ml IN natriumhydroksidia. Tähän liuokseen lisättiin nopeasti sekoittaen kiinteätä 9-fluorenyylimetyyli-sukkinimidyyli-karbonaat-tia (Fmoc-OSu, 3,37 g). Suspension pH asetettiin arvoon 7 N natriumhydroksidilla, ja sitä sekoitettiin yön yli. Siihen lisättiin kiinteätä sitruunahappoa (3 g) ja sitten 60 ml yhdis-. . tettä EtOAc. EtOAc-kerros otettiin talteen, pestiin 10 % sitruu- ‘ · nahapolla ja suolaliuoksella, ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla.

• · · ·*·* EtOAc-liuos haihdutettiin, jolloin saatiin vaalean ruskeata ' ' siirappia, joka kiteytettiin dikloorimetaanista (DCM), jolloin • · ; saatiin 3,9 g yhdistettä Fmoc-DTyr-OH, sp. 178-181°C.

* * · * » · :V: Esimerkki m

Fmoc-Tyr-OH

.*. : Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin Ilmenetelmää, mutta * · D-tyrosiini korvataan L-tyrosiinilla (9,06 g), jolloin saadaan • 18,4 g yhdistettä Fmoc-Tyr-OH, sp. 172-177°C.

• # • · • · * • · • · · • ·» » · · · • »* • · '· 86193

Esimerkki IV Fmoc-MeTyr-OH

Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin II menetelmää, mutta D-tyrosiini korvataan N-metyy1ityrosiini11 a (1,95 g), jolloin saadaan 1,22 g yhdistettä Fmoc-MeTyr-OH, sp. 152-158°C.

Esimerkki V

Boc-MePhe-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappo 1

Liuokseen, joka sisältää yhdistettä Boc-MePhe-OH (97,91 u) ia 4- ( broinime tyy I i ) - Tenyy 1 i e t i k k ah apu n Ie n a s y y 1 i o s t« r i ä (11,12 a ) lOOO mi 11 ili t rassa ase töni t rii .1 iä , lisättiin k a 1 ium f I uo r i d i n dihydraattia (18,28 g). Suspensiota sekoitettiin yön yli, se suodatettiin ja suodos haihdutettiin kuiviin. Jäännös,

Boc-MePhe-( 4-oksime tyy 1. i fenyy li )etikkahapon fenasyy 1.ies teri , liuotettiin 85-prosenttiseen etikkahappoon (1200 ml), käsiteltiin sinkkipöly1 la (128 g) ja sekoitettiin 2-4 tuntia. Suodatet- j tu reaktioseos väkevöitiin noin 400 mi 11ilitraksi, ja se laimennettiin noin 3200 mi 11i1itra 1la vettä, jolloin saatiin ölivä, 1 - * 1 joka liuotettiin yhdisteeseen EtOAc ja käsiteltiin yhdisteellä · DCHA, jolloin saatiin 41,31 g otsikon mukaisen yhdisteen DCHA-suolaa, sp. 120-122°C.

Esimerkki VI

• «

Boc-EtPhe - (4-oksinietyylifenyyli)etikkahappo Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin V menetelmää, mutta . , Boc-MePhe-OH korvataan yhdisteellä Boc-EtPhe-OM (7,33 g), joi- « · · ‘ loin saadaan 5,69 g Boc-EtPhe-(4-oksimetyy1ifenyy1i)etikkahacon *·-·' DCHA-suolaa, sp. 137-14l°C.

• “ · • ·

Esimerkki VII

: Boc-Phe ( 4-Cl) - ( 4-oks ime tyyli! enyyli)etikkahappo Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin v menetelmää, mutta

Boc-MePhe-OH korvataan yhdisteellä Boc-Phe(4-Cl)-OH (2,5 g), ‘..I jolloin saadaan 3,44 g Boc-Phe(4-Cl)-(4-oksimetyylifenvy 1i)- ·”* etikkahapon vapaata emästä.

0 · « 20 861 93

Esimerkki VIII

Boc-Tyr( Me )-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappo Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin V menetelmää, mutta Boc-MePhe-OH korvataan yhdisteellä Boc-Tyr(Me)-OH (2,5 g), jolloin saadaan 1,83 g Boc-Tyr(Me)-(4-oksimetyylifenyyli)etik-kahapon vapaata emästä, sp. 64-67°C.

Esimerkki IX

Fmoc-Tyr(tBu)-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappo Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin V menetelmää, mutta Boc-MePhe-OH korvataan yhdisteellä Fmoc-Tyr(tBu)-OH (6,86 g), jolloin saadaan 4,88 g Fmoc-Tyr(tBu)-(4-oksimetyylifenyyli)etik-kahapon vapaata emästä, sp. 192-195°C.

Esimerkki X_

Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH

Fmoc-Met-OSu valmistettiin in situ yhdisteiden Fmoc-Met-OH (14,87 g), HOSu (5,52 g) ja disykloheksyy1ikarbodi-imidi (DCC, 8,26 g) välisellä reaktiolla tetrahydrofuraanissa THF (200 ml) 0°C:n lämpötilassa 3,5 tunnin aikana. Saostunut öisykloheksvyli-urea (DCU) poistettiin suodattamalla, ja THF-suodos lisättiin kylmään liuokseen, joka sisältää yhdistettä Η-Asp (OtBu)-OH 220 millilitrassa veden ja THF:n 10:l-seosta, ja johon oli lisätty 40 ml N natriumhydroksidia. Sen jälkeen, kun reaktioseos-ta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa yön yli, siihen lisättiin • kiinteätä sitruunahappoa (20 g) sekä yhdistettä EtOAc (600 ml). EtOAc-kerros erotettiin, pestiin 10-prosenttisella sitruunaha- ’•'v polla ja suolaliuoksella ja kuivattiin magnesiumsulfaatilla.

I \ ] EtOAc-liuos haihdutettiin, jolloin saatu jäännös liuotettiin : 200 millilitraan yhdistettä EtOAc, ja käsiteltiin yhdisteellä DCHA (7,84 ml), jolloin toivotun tuotteen DCHA-suolaa saatiin saostumaan 17,93 g. Sp. 159-162°C.

• · • » 1

Esimerkki XI

« 1 · ----— « · · H-Phe-OCH2-Pam-hartsi

• · · « · ' > - I —.m I

• « ... Boc-Phe-( 4-oksimetyylifenyyli )etikkahappoa (0,83 g, 2 mmol) , • » ’···1 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt, 0,46 g, 3 mmol) ja yhdistettä « · » • ·» « « I: « • · « • · · 2i 86193 DCC (0,41 g,_Z._mmol) liuotettiin 50 millilitraan 4:1 DCM/DMF-- seosta, ja saatua liuosta sekoitettiin 0°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan. Suodatettuun reaktioseokseen (saostunut DCU poistettu) suspendoitiin aminometyyli-hartsia (1,34 g, 2 mmol käytettävissä olevaa typpeä), jä ravisteltiin 2-15 tuntia. Tuote, Boc-Phe-OCH^-Pam-hartsi, eristettiin suodattamalla, ja sitä käsiteltiin taulukon 1 (vaiheet 10-14) mukaisesti, jolloin saatiin toivottua vapaata emästä H-Phe-OCH^-Pani-hartsi.

Esimerkki XII

f ' H-MePhe-OCH2-Pam-hartsi

Boc-MePhe-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappoa(1,82 grammasta, 3 mmol, sen DCHA-suolaa, esimerkki 5) ja yhdistettä HOBt (0,69 g, 4,5 mmol) 40 millilitrassa 1:3 DMF/DCM-seosta, ja sitten yhdistettä DCC (0,62 g, 3 mmol) 20 millilitrassa yhdistettä DCM lisättiin aminometyylihartsiin (1,34 g, 1 mmol käytettävissä olevaa typpeä), jolloin saatua suspensiota ravisteltiin 2-15 tuntia. Toivottu tuote, Boc-MePhe-OCf^-Pam-hartsi, eristettiin suodattamalla, pestiin 2-propanolilla ja yhdisteellä DCM, ja käsiteltiin taulukon 1 (vaiheet 10-14) mukaisesti, jolloin saatiin vapaata emästä, H-MePhe-OCf^-Pam-hartsi.

Esimerkki XIII H-EtPhe-OCF^-Pam-hartsi . V Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin XII toimenpidettä, mutta * : : Boc-MePhe-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappo korvataan Boc-EtPhe- (4-oksimetyvlifenyyli )etikkahapolla (1,87 grammasta, 3 mmol, : sen DCHA-suolaa, esimerkki VI), jolloin saatiin H-EtPhe-OCH2- , Pam-hartsia.

Esimerkki XIV

. . H-Phe(4-C1)-OCH^-Pam-hartsi « · · c.

.·*.*. Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin XI menetelmää, mutta

Boc-Phe-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappo korvataan Boc-Phe >«»·* (4-C1)-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahapolla (0,90 g, 2 mmol, esi-*...’ merkki 7), jolloin saadaan H-Phe ( 4-C1)-OCH2~Pam-hartsia.

• m • · * » · · « ·« m · 22 86 1 93

Esimerkki XV

H-Phe(4-N02)-OCH2-Pam-hartsi

Boc-Phe (4-NC>2) -OH (1,39 g) liuotettiin 100 millilitraan 70-prosenttista metanolia (MeOH), ja liuoksen pH asetettiin arvoon 7 lisäämällä siihen N keesiumbikarbonaattia. Liuos haihdutettiin kuiviin, ja jäännös haihdutettiin vielä kolmeen kertaan yhdistettä DMF lisäten. Tuloksena oleva Boc-Phe(4-NO^)-OH:n kuivattu keesiumsuola liuotettiin 60 millilitraan yhdistettä DMF, ja sitä ravisteltiin BrCH2-Pam-hartsin (1 milliekvivalentti Br) kanssa yön yli. Toivottu tuote, Boc-Phe(4-N02)-OCH2~Pam-hartsi , eristettiin suodattamalla, se pestiin yhdisteellä DCM ja sitä käsiteltiin taulukon 1 (vaiheet 10-14 mukaisesti, jolloin saatiin toivottua vapaata emästä, H-Phe(4-N02)-OCH2~Pam-hartsi.

Esimerkki XVI

H-Tyr(Me)-OCH2~Pam-hartsi Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin XI menetelmää, mutta Boc-Phe-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahappo korvataan Boc-Tyr(Me)-(4-oksimetyylifenyyli)etikkahapolla (0,87 g, 2 mmol, esimerkki 8), jolloin saatiin H-Tyr(Me)-OCH2-Pam-hartsia.

Esimerkki XVII

H-Tyr(tBu)-OCH2-Pam-hartsi 0 « . Fmoc-Tyr (tBu )-( 4-oksimetyylif enyyli ) etikkahappoa (1,82 g, 3 mmol, *· esimerkki 9) , 1-hydroksibentsotriatsolia (HOBt, 0,69 g, 4,5 mmol), . . sekä yhdistettä DCC (0,62 g, 3 mmol) liuotettiin 50 millilitraan ··_· 4:1 DCM/DMF-seosta ja sekoitettiin 0°C:n lämpötilassa 1 tunnin ajan. Suodatettuun reaktioseokseen (saostunut DCU poistettu) suspendoitiin aminometyylihartsia (1,34 g, 1 mmol käytettävissä olevaa typpeä) ja suspensiota ravisteltiin 2-15 tuntia. Tuote, • ·

Fmoc-Tyr (tBu )-OCH2~Pam-hartsi , eristettiin suodattamalla ja käsi-: teltiin taulukon 1 (vaiheet 16-20) mukaisesti, jolloin saatiin toivottua vapaata emästä H-Tyr(tBu)-OCH2~Pam-hartsi.

• · · * · • · » • · • 1 · • 1· • · · • 1 · - ♦ · • · 23 861 93

Esimerkki XVIII

H-MeTyr(Me)-OCH^-Pam-hartsi Tässä esimerkissä noudatetaan esimerkin XV menetelmää, mutta Boc-Phe(NC>2 )-0H korvataan yhdisteellä Boc-MeTyr(Me)-OH, (1,47 grammasta sen DCHA-suolaa), jolloin saadaan H-MeTyr(Me)-0CH2~Pam-hartsia.

Esimerkki 1 H-gAsp-Tyr(SO^H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-0CH2"Pam-hartsiin (esimerkki XI) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH, (esimerkki 10), Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-0H, ja Boc-PAsp(0tBu)-0H taulukon 1 mukaisesti (kytkemisvaiheet 5-7, joita seuraa Fmoc:n poistaminen vaiheissa 16-20), jolloin saadaan Boc-pAsp(OtBu)Tyr(tBu)-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-MePhe-0CH2~Pam-hartsi, josta poistettiin suojaavat ryhmät taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15), ja joka kytkettiin yhdisteeseen Fmoc-OSu (1,1 g) taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 8-9, jolloin saadaan Fmoc-pAsp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-0CH2-Pam-hartsi, joka sulfatoitiin, ja josta poistettiin suojaavat ryhmät ja joka irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 21-25, vaiheet 16-20, ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saadaan otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen peräkkäin Amberlite XAD-2-hartsia, Trisacryl M DEAE-geeliä ja P40 0DS-3-geeliä, taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), • jolloin saadaan 72 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammonium- suolaa. Yhdiste hajotetaan hapolla ja aminohapot analysoi-daan, jolloin saatiin Asp 2,03 (2), Tyr 1,05 (1), Met 1,85 : : : (2), Gly 1,10 (1). Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä : todetaan voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm-]^. TLC Rf 0,33.

. . Esimerkki 2 • ·· H-DAsp-Tyr ( SO-^H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-0CH2-Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräk-käin yhdisteet Fmoc-Met-Asp(OtBu)-0H, (esimerkki 10), Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Tyr( tBu )-OH, ja 24 86193

Fmoc-Asp(OtBu)-OH taulukon 1 mukaisesti (kytkemisvaiheet 3-4, joita seurasi Fmoc:n poistaminen vaiheissa 16-20), jolloin saatiin Fmoc-DAsp(OtBu)-Tyr(tBu)-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-MePhe-0CH2~Pam-hartsi, josta poistettiin suojaa-vat ryhmät, ja joka sulfatoitiin, ja josta poistettiin suojaavat ryhmät ja joka irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15, vaiheet 21-25, vaiheet 16-20, ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesta peräkkäin käyttäen Trisacryl M DEAE-geeliä ja P40 0DS-3-geeliä, taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 110 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammoniumsuolaa. Yhdiste hajotettiin hapolla ja aminohapot analysoitiin, jolloin saatiin Asp 2,01 (2), Tyr 1,01 (1), Met 1,91 (2), ja Gly 1,07 (1). Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä todettiin voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm-1. TLC Rf 0,35.

Esimerkki 3

For-Tyr (SO-^H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-OCH2-Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Met-Asp(OtBu)-0H, (esimerkki 10), Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-OH ja Fmoc-Met-OH, taulukon 1 mukaisesti (kytkemisvaiheet 5-7, joita seurasi Fmoc:n poistaminen vaiheissa 16-20), jolloin saatiin Fmoc-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu )-MePhe-OCH2-Pam-hartsi, josta poistettiin suojaavat *’ ryhmät taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-20) ja joka kytket tiin yhdisteeseen For-Tyr-OH taulukon 1 mukaisesti (vaiheet " 5-7), jolloin saadaan For-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe- 0CH2-Pam-hartsi, joka sulfatoitiin, ja irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 21-25 sekä vaiheet 26-29 • ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen peräkkäin : Amberlite XAD2-hartsia, Trisacryl M DEAE-geeliä ja P40 0DS-3-geeliä, taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 78 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammoniumsuolaa. Yhdiste hajotettiin hapolla ja aminohapot analysoitiin, : : jolloin saatiin Asp 1,02 (1), Tyr 1,01 (1), Met 1,95 (2), 25 861 93 ja Gly 1,02 (1). Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä todettiin voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm-1. TLC Rf 0,45.

Esimerkki 4 iBuOCO-Tyr(SO^H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH? H-MePheOCH2-Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH, (esimerkki 10), Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-0H, Fmoc-Met-OH, ja Fmoc-Tyr(tBu)-OH taulukon 1 mukaisesti (kytkemisvaiheet 5-7, joita seurasi Fmocrn poistaminen vaiheissa 16-20), jolloin saatiin H-Tyr(tBu)-Met-Gly-Trp-Met-Asp(0tBu)-MePhe-0CH2“Pam-hartsi, ja joka kytkettiin yhdisteeseen iBuOCO-OSu (esimerkki 1) taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 8-9), jolloin saadaan iBuCO-Tyr-Met--Gly-Trp-Met-Asp(0tBu)-MePhe-0CH2-Pam-hartsi, josta poistettiin suojaavat ryhmät, ja joka sulfatoitiin, ja irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15, vaiheet 21-25, ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesta käyttäen peräkkäin Amberlite XAD-2-hartsia, Trisacryl M DEAE-geeliä ja P40 ODS-3-geeliä, taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 302 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammoniumsuolaa. Yhdiste hajotettiin hapolla ja aminohapot analysoitiin, jolloin saatiin Asp 1, 03 (1), Tyr 1,02 (1) Met 1,91 (2), ja Gly 1,04 (1). Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä todettiin voimakas, rikkihapon *' esterille tyypillinen kohdalla piikki 1050 cm “ TLC Rf 0,67.

I. I | Esimerkki 5 : : : Hpp( SO-^H) -Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-OCH2-Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Met-Asp(OtBu)-OH, (esimerkki 10), Fmoc-.·. ; Trp-OH, Fmoc-Gly-0H, ja Fmoc-Met-OH taulukon 1 mukaisesti 1..’ (kytkemisvaiheet 3-4, joita seurasi Fmoc:n poistaminen vai heissa 16-20), jolloin saatiin H-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-MePhe-OCH2-Pam-hartsi, ja joka kytkettiin yhdisteeseen 3-(4-hydroksifenyyli )propionihapon N-hydroksisukkinimidiesteriin 26 861 93 (Hpp-OSu) taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 8-9), jolloin saadaan Hpp-Met-Gly-Trp-Met-Asp(OtBu)-MePhe-0CH2-Pam-hart-si, josta poistettiin suojaavat ryhmät, ja joka sulfatoi-tiin, ja irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15, vaiheet 21-25, ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen peräkkäin Trisacryl M DEAE-geeliä ja P40 0DS-3-geeliä, taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 170 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammoniumsuolaa. Yhdiste hajotettiin hapolla ja aminohapot analysoitiin, jolloin saatiin Asp 1,02 (1), Met 1,97 (2), ja Gly 1,01 (1). Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä todettiin voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm--1-. TLC Rf 0,58.

Esimerkki 6

Suc-Tyr ( SO-^H)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-0CH2-Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Ahx-Asp(OtBu)-OH, (esimerkki X, Fmoc-Met-OH korvattu yhdisteellä Fmoc-Ahx-OH), Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ahx-0H, ja Fmoc-Tyr(tBu)-OH taulukon 1 mukaisesti (kytkemisvaiheet 5-7, joita seuraa Fmoc:n poistaminen vaiheissa 16-20), jolloin saadaan H-Tyr(tBu)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp(OtBu)-MePhe-0CH2Pam-hartsi, joka kytkettiin meripihkahapon anhydridiin DMF-liuottimessa taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 8-9), jolloin saadaan Suc-Tyr(tBu)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp(0tBu)-MePhe-0CH2-Pam-hartsi, josta poistettiin suojaavat ryhmät, ja joka sulfatoitiin ja irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15, vaiheet 21-25 ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen peräkkäin Amberlite XAD-2-hartsia, Trisacryl M DEAE-geeliä ja P-40 0DS-3-geeliä taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 100 mg otsikon mukaisen yhdis- i-- teen ammoniumsuolaa. Yhdiste hajotettiin hapolla ja aminoha pot analysoitiin, jolloin saatiin Tyr 0, 97 (1), Gly 1,00 (1) ja Asp 1,00 (1). Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä

II

»· 27 861 93 todettiin voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm-1. TLC Rf 0,46.

Esimerkki 7 iBuOCO-Tyr(SOqH)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-OCH2~Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Ahx-Asp(OtBu)-OH, (esimerkki X, Fmoc-Met-OH korvattu yhdisteellä Fmoc-Ahx-OH), Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ahx-OH, ja Fmoc-Tyr(tBu)-OH taulukon 1 mukaisesti (kytkemisvaiheet 5-7, joita seuraa Fmoc:n poistaminen vaiheissa 16-20), jolloin saadaan H-Tyr(tBu)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp(0tBu)-MePhe-0CH2-Pam-hartsi, joka kytkettiin yhdisteeseen iBuOCO-OSu (esimerkki 1) DMF-liuottimessa taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 8-9), jolloin saadaan iBuO-CO-Tyr(tBu)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp(OtBu)-MePhe-OCH2-Pam-hart-si, josta poistettiin suojaavat ryhmät, ja joka sulfatoitiin ja irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15, vaiheet 21-25 ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen peräkkäin Amberlite XAD-2--hartsia ja P-40 0DS-3-geeliä taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 290 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammoniumsuolaa. Infrapunasäteilyn absorptiospektrissä todettiin voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm-1. TLC Rf 0,54.

- *' Esimerkki 8

Hpp(SOqH)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH? H-MePhe-0CH2“Pam-hartsiin (esimerkki XII) kytkettiin peräkkäin yhdisteet Fmoc-Ahx-Asp(OtBu)-OH, (esimerkki X, Fmoc-Met-OH korvattu yhdisteellä Fmoc-Ahx-OH), Fmoc-Trp-OH, :Y: Fmoc-Gly-OH, ja Fmoc-Ahx-OH taulukon 1 mukaisesti (kytkemis vaiheet 5-7, joita seuraa Fmoc:n poistaminen vaiheissa : 16-20), jolloin saadaan H-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp(OtBu)-MePhe- 0CH2-Pam-hartsi, joka kytkettiin yhdisteeseen Hpp-OSu DMF-liuottimessa taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 8-9), jolloin saadaan Hpp-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp(OtBu)-MePhe-OCH2-Pam-hart- • - si, josta poistettiin suojaavat ryhmät, ja joka sulfatoitiin 28 861 93 ja irrotettiin hartsista taulukon 1 mukaisesti (vaiheet 10-15, vaiheet 21-25 ja sitten vaiheet 26-29 ammoniakilla), jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä, joka puhdistettiin kromatografisesti käyttäen peräkkäin Amberlite XAD-2-hartsia, Trisacryl M DEAE-geeliä ja P-40 0DS-3-geeliä taulukon 1 mukaisesti (vaihe 30), jolloin saadaan 91 mg otsikon mukaisen yhdisteen ammoniumsuolaa. Yhdiste hajotettiin hapolla ja aminohapot analysoitiin, jolloin saadaan Ahx 1,92 (2), Gly 1,03 (1), ja Asp 1,05 (1). Infrapunasäteilyn absorptlospektrissä todettiin voimakas, rikkihapon esterille tyypillinen piikki kohdalla 1050 cm-1. TLC Rf 0,40.

« · • ·

Claims (6)

29 861 93

1. Menetelmä farmaseuttisesti käytettävän peptidin, jolla on kaava OSO3H φ 9 CHo CHo 1 l1 Q -YCHCO- M-G-W-X-J -F^-CHCO- Z jossa Q on Η-βΑβρ, H-DAsp, For, Sue, desQ, tai R^R^CHOCO, Y on H tai (S)-NH, M on Met tai Ahx, G on Gly, W on Trp, X on Met tai Ahx, J on Asp, F1 on (S)-MeN-, Z on NH2, R1 ja R2 ovat toisistaan riippumatta alempi alkyyli, sekä tämän peptidin farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, edellyttäen, että Q on desQ, kun Y on H, tunnettu siitä, että a) valmistus tapahtuu kiinteään faasiin perustuvalla menetelmällä, jossa tarpeelliset suojatut aminohapot tai suojatut oligopeptidit lisätään peräkkäin (kutakin lisäystä seuraa suojaavien ryhmien poistaminen) aminoasyylihartsiin, jolla on kaava F2 Φ CHo H -F^HCO- OCH2-Pam-hartsi 30 86193 jolloin saadaan suojattu peptidyylihartsi, jolla on kaava OH F2 0 o ch2 ch2 Pg-Q-YCHCO- M-G-W-X-J -F1CHCO-OCH2-Pam-hartsi joka puolestaan suliatoidaan ja josta poistetaan suojaavat ryhmät ja jota käsitellään amiinin metanoliliuoksella, tai b) valmistus suoritetaan liuosfaasiin perustuvalla menetelmällä, jossa tarpeelliset suojatut aminohapot tai suojatut oligopeptidit lisätään peräkkäin (kutakin lisäystä seuraa suojaavien ryhmien poistaminen) aminoasyyliamidiin, jolla on kaava F2 0 ch2 H -F1CHC0- Z jolloin saadaan suojattu peptidiamidi, jolla on kaava OH F2 y Φ o ch2 cii? v·! I J ' •V. Pg - Q -YCHCO- M-G-W-X-J -FiCIICO- Z joka sulfatoidaan ja josta poistetaan suojaavat ryhmät. Il 3i 86193

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on H-DAsp-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on H-pAsp-Tyr(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 tai For-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on iBuOCO-Tyr(SO3H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2 tai Hpp(S03H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-MePhe-NH2.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on Suc-Tyr(SO3H)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH2.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi on iBuOCO-Tyr(SO3H)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH2 tai Hpp(SO3H)-Ahx-Gly-Trp-Ahx-Asp-MePhe-NH2· 32 861 93