FI83524C - Foerfarande foer framstaellning av farmakologiskt verkande n-/n-alkanoyl-s-(2,3-dialkanoyloxi-propyl) kysteinyl/-peptider. - Google Patents

Description

83524

Menetelmä farmakologisesti vaikuttavien N-[N-alkanoyyli-S-(2,3-dialkanoyylioksi-propyyli)kysteinyyli]-peptidien valmistamiseksi - Förfarande för framställning av farmakolo-giskt verkande N-[N-alkanoyl-S-(2,3-dialkanoyloxi-propyl)-kysteinyl]-peptider

Keksinnön kohteena on menetelmä farmaseuttisesti vaikuttavien N-[N-alkanoyyli-S-(2,3-dialkanoyylioksi-propyyli)-kysteinyyli]-peptidien valmistamiseksi, joilla on kaava I

R^-CO-O-CH, u2

R^-CO-O-CH

b | (I) CH, CO-Z2

S CH-ZJ ** - R tai S

1 1 *** · R

CH CH

I L I L

R CO-NH-CH-CO-(A·) -A* -NH-CH—CO-ZA n jossa R^-g ja R1^ tarkoittavat kumpikin 7-21 C-atomia sisältävää alkyylitähdettä, R2 tarkoittaa 7-21 C-atomia sisältävää alkyylitähdettä, n = 0 tai 1, As· on kaavan -NH-Kw-CO-mukainen tähde, jossa Kw tarkoittaa alkylideenitähdettä, jossa on korkeintaan 6 C-atomia, As1 on L-alaniini-, L-a-ami-novoihappo-, L-valiini-, N-metyyli-L-alaniini- tai L-serii-nitähde, z1 on amino tai hydroksi, Z2 on amino, hydroksi, L-alanyyli, L-lysyyli-L-lysiini, glysyyli-tauriini, L-argi-nyyli tai L-lysyyli-D-alaniini ja Z3 tarkoittaa vetyä tai karboksia, tai tällaisen yhdisteen, jossa on vähintään yksi karboksyyliryhmä, alempialkyyliesterin valmistamiseksi, jolloin merkeillä *, ** tai vastaavasti *** merkityillä asym-metriakeskuksilla on esitetyt absoluuttiset konfiguraatiot, ja konfiguraatio ryhmän Z3 sisältävässä asymmetrisessä C-atoinlssa voi olla R tai S, tai vastaavien dlastereomeeriseosten tai tällaisten, vähintään yhden suolanmuodostavan ryhmän 2 83524 sisältävien yhdisteiden suolojen valmistamiseksi.

Seuraavassa käytetään yllämainituista yhdisteistä myös nimitystä "kaavan I mukaiset lipopeptidit". Tällöin tarkoitetaan, mikäli toisin ei asian yhteydestä ilmene, käsitteellä "kaavan I mukaiset lipopeptidit" myös niiden kaikkia yllä mainittuja johdannaisia, diastereomeeriseoksia ja suoloja.

Edullisia ovat etenkin yllä mainitut yhdisteet, joissa tähteillä Rg1 ja R^1 on sama merkitys.

Kun a-aminohappojen yhteydessä ei ole annettu lähempää selitystä, tarkoitetaan L-konfiguraatiota. Käytetään seuraa-via suluissa olevia lyhenteitä: glysiini (Gly), alaniini (Ala), N-metyyli-alaniini (MeAla), seriini (Ser), a-amino-voihappo (Abu), väliini (Vai), lysiini (Lys), arginiini (Arg), glutamiinihappo (Glu), glutaniini (Gin) ja y-karboksi-gluta-miinihappo (Gla).

Kansainvälisesti tunnustettujen nimistösääntöjen mukaisesti tässä hakemuksessa aminohappojen lyhenteet, esim. yllä mainitut lyhenteet merkitsevät vapaata happoa ja mikäli toisin ei ole esitetty, L-konfiguraatiota. α-aminoryhmä on ajateltava lyhenteen vasemmalle puolelle, karboksiryhmä oikealle puolelle. H-atomin puuttuminen α-aminoryhmässä on merkitty aminohapon lyhenteestä vasemmalle olevalla yhdysviivalla, kahden H-atomin puuttuminen kahdella vasemmalle olevalla yhdysviivalla. HO-ryhmän puuttuminen karboksiryh-mässä on merkitty oikealla olevalla yhdysviivalla. Aminohappojen sivuketjussa olevat substituentit asetetaan välittömästi aminohapposymbolin taakse sulkuihin. Siten merkitsee esim. palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 N-palmitoyyli-S-(2[r],3-dilauroyyli-oksi-propyyli)kysteinyyli-alanyyli-D-isoglutaminyyli-tert.-butyy-liesteriä.

Eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 0 000 330 on esitetty kaavan 3 83524 1 **

R -CO-O-CH

1 A* R -CO-O-CH s

CH * «= R

I 2

2 * ** * R tai S

R CO-NH-CH-CO-X

mukaisia lipopeptidejä, joissa Rx ja R2 merkitsevät kulloinkin tyydytettyä tai tyydyttymätöntä, alifaattista tai seka-alifaattis-sykloalifaattista, mahdollisesti myös happifunk-tioilla substituoitua, 11-21 C-atomia sisältävää hiilivety-tähdettä, R3 merkitsee vetyä tai tähdettä R1-C0-0-CH2-, jossa tähteellä R1 on sama merkitys, ja X merkitsee peptidises-ti sidottua luonnollista alifaattista, vapaan, esteröidyn tai amidoidun karboksyyliryhmän sisältävää aminohappoa, tai aminohapposekvenssiä, jossa on 2-10 luonnollista alifaattista aminohappoa, joiden terminaalinen karboksyyliryhmä esiintyy vapaassa, esteröidyssä tai amidoidussa muodossa. Näillä yhdisteillä on immunopotensoivia ominaisuuksia eivätkä ne ole edes korkeissa konsentraatioissa lymfosytotoksisia. Tällöin peptidiketju X muodostuu mielivaltaisesti muodostetusta luonnollisten aminohappojen sekvenssistä, kun taas Escherichia coli-organismin ulomman soluseinämän lipoproteiineis-ta hajaantumisella saaduissa luonnollisisa lipopeptideissä (vrt. esim. Eur.J.Biochem. 34, 284-296 (1973)) vain sekvenssi -Ser-Ser-Asn-Ala-Lys-OH on sidottu "glyseryylikysteiini"-osaan.

Mainitussa eurooppalaisessa patenttijulkaisussa pepti-disekvenssin X muodostavat aminohapot ovat peptidien ja proteiinien luonnollisia, L-sarjaan kuuluvia tunnettuja klassisia osia. Kuten yllä olevasta kaavasta I nähdään, sisältää 4 83524 sitä vastoin vastaava sekvenssi lipopeptideissä esillä olevan keksinnön mukaisesti luonteenomaisena tunnusmerkkinä D-aminohapon, nimittäin D-glutamiinihapon (D-Glu) tai D-y-karboksi-glutamiinihapon (D-Gla) tai niiden estereitä tai amideja. Nyt on esillä olevan keksinnön mukaisesti todettu, että tällaisilla yhdisteillä on mainitun eurooppalaisen patenttijulkaisun yhdisteisiin verrattuna parempi farmakologinen vaikutus. Siten kaavan I mukaiset yhdisteet, niiden mainitut johdannaiset ja suolat stimuloivat jo 0,01 pg/ml:n annoksena hiiren B-lymfosyyttien in vitro tymidiini-liitännäl-lä määrättyä proliferaatiota 100-kertaisesti verrattuna ei-stimuloituihin kontrolli-lymfosyytteihin, kun taas mainitun eurooppalaisen patenttijulkaisun yhdisteissä näin on vasta 0,5 pg/ml:n annoksena ja stimuloinnin määrä on vain 20-... 50-kertainen kontrolleihin nähden. Uudet lipopeptidit ovat esillä olevan keksinnön mukaisesti aktiivisia jo konsentraa-tioina, joina tähän asti tunnetulla B-solumitogeeneilla (esim. purified prontein derivative = PPD tai Escherichia coli-organismista peräisin oleva lipoproteiini ja lipo-polysakkaridi) ei ole vielä mitään vaikutusta.

Tämän lisäksi pystyvät nämä yhdisteet aktivoimaan rotan ja hiiren alveolaarimakrofagit in vitro, niin että nämä voivat tappaa aineella suoritetun 24 tuntisen inkubaation jälkeen tuumorisoluja. Jos nämä yhdisteet annetaan liposo-meihin (multilamellaarlsiin rakkuloihin) liitettyinä alveo-laarimakrofageihin yhdisteet pystyvät indusoimaan 0,2 pg/0,2 ml:11a viljelyä tumoritsidaalisia makrofageja, kun taas mainitun eurooppalaisen patenttijulkaisun yhdisteet pystyvät tähän vasta 10-kertaa suurempana annoksena.

Myös in vivo malleissa on uusille yhdisteille ominaista korkea biologinen aktiivisuus: NMRI-hiiret immunisoidaan 0. päivänä intraperitoneaalisella injektiolla, joka sisältää 10 pg naudan seerumialbumiinia (BSA). 8, 18 ja 28 päivän kuluttua otetaan seerumikokeet ja tutkitaan ne niiden anti-BSA-vasta-ainepitoisuuden suhteen passiivisella hemagglutinaatio- 5 83524 tekniikalla. Käytettynä annoksen BSA on vastaanottajaeläi-mille subimmunogeeninen, so. se ei pysty liuottamaan vasta-aineita tai se tuottaa vain vähän näitä. Tässä testissä pystyivät nyt keksinnön mukaiset yhdisteet kohottamaan merkittävästi vasta-ainetuotantoa BSA:ta vastaan annettaessa niitä intraperitoneaalisesti 0,1 mg/kg (annettuna immunisointipäi-vänä). Etenkin korostettava mainitussa patenttijulkaisusa esitettyihin lipopeptideihin verrattuna on uusien yhdisteiden hyvä vaikutus annettaessa niitä s.c., jolloin ne ovat jo 5 mg/kg:n annoksena tehokkaita.

Esillä olevan keksinnön mukaiset uudet lipopeptidit ovat vähän toksisia: Hiiri sietää myös 5-kertaisen intrape-ritoneaalisen 10 mg/kg/päivä-annoksen peräkkäisinä päivinä nähtävästi symptoomeitta ja subkutaanisesti annettaessa yhdisteet ovat 300 mg/kg:n annoksiin asti myrkyttömiä. Koska immuunistimulaation tarvittavat annokset ovat hyvin pieniä, on uusien yhdisteiden terapeuttinen laajuus hyvin suuri.

Esillä olevan keksinnön mukaisia uusia lipopeptidejä voidaan käyttää adjuvantteina sekoitettuna rokotteisiin ro-kotustuloksen parantamiseksi ja humoraalisten vasta-aineiden ja/tai soluimmuniteetin välittämän infektiosuojan parantamiseksi bakteriaalisia, viraalisia tai parasiittitaudinaineut-tajia vastaan.

Uusia lipopeptidejä voidaan käyttää immuunireaktioiden edistämiseksi ihmisessä ja eäimissä. Yhdisteet soveltuvat lisäksi erityisesti ruumiin oman puolustusmekanismin stimulointiin, esim. syövän, kroonisten ja akuuttien infektioiden tai selektiivisten (antigeenispesifisten) immunologisten puutoksien, sekä synnynnäisten, mutta myös saatujen yleisten (so. ei antigeenispesifisten) immunologisten puutostilojen yhteydessä, joita esiintyy iän mukana, vaikeiden primääri-sairauksien aikana ja ennen kaikkea ionisoivilla säteillä tai immunosupressiivisesti vaikuttavilla lääkkeillä suoritetun terapian jälkeen. Mainittuja yhdisteitä voidaan antaa myös yhdessä antibioottien, kemoterapeuttisten aineiden tai 6 83524 muiden aineiden kanssa immunologisten haittojen välttämiseksi. Lopuksi soveltuvat esitetyt yhdisteet myös ihmisten ja eläinten infektiosairauksien yleiseen profylaksiaan.

Asyylitähteet R^CO-, R-^CO- ja R2CO johtuvat alkaani-hapoista, joka sisältävät 8-22, mieluimmin 8-16 C-atomia. Tällaisista mainittakoon esim. tyydyttyneet, etenkin suoran, so. haarautumattoman hiiliketjun sisältävät rasvahapot, kuten kapryylihappo, pelargonihappo, kapriinihappo, undekyyli-happo, lauriinihappo, myristiinihappo, palmitiinihappo, mar-gariinihappo, steariinihappo, arakiinihappo ja behenhappo.

Kaavassa I voivat ryhmät R1a, R1^ ja R2 olla keskenään identtisiä tai ne voivat olla toisistaan poikkeavia.

Etenkin pidetään parhaimpina kaavan I mukaisia yhdisteitä ja niiden johdannaisia, joissa R^ ja R1^, ovat tähteestä R2 poikkeavia, etenkin sellaisia, joissa R^CO-, R^CO- ja R2CO- merkitsevät toisistaan riippumatta kaprylo-yyliä, kaprinoyyliä, lauroyyliä, myristoyyliä, palmitoyyliä tai stearoyyliä.

Kaavan I mukaisten yhdisteiden alempialkyyliesterit johtuvat 1-7 C-atomia sisältävistä alkanoleista, kuten metyyli-, etyyli-, n-propyyli-, isopropyylialkoholista tai bu-tyylialkoholeista.

Kaikki tai vain muutamat peptidiketjun karboksyyliryh-mät voivat esiityä esteröidyssä muodossa. Mieluimmin valmistetaan yhdisteitä, joissa kyseisen aminohapon kulloinkin a-karboksyyliryhmä on esteröity.

Alkylideenitähteellä Kw on mieluimmin 2-6 C-atomia ja se on suora tai etenkin haarautunut, esim. metyleeni, di-, tri- tai tetrametyleeni ja etenkin etylideeni, propylideeni, 2,2-dimetyylietylideeni, butylideeni, 3,3-dimetyylipropyli-deeni, 2-metyylietylideeni, 2-etyylietylideeni, pentylidee-ni. Tähde -NH-Kw-CO on esimerkiksi a-aminohappojen tähde, kuten luonnollisten aminohappojen glysiini, alaniini, a-aminovoihappo, väliini, norvaliini, leusiini, isoleusiini, nor.1 eusiinitähde, mutta se käsittää myös vastaavat R-sarjan 7 83524 yhdisteet, kuten esim. D-alaniinin.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti valmistettaville lipopeptideille on tunnusomaista, että peptidisekvenssissä seuraa aminohappoa As1 D-glutamiinihappo (D-Glu) tai y-kar-boksi-D-glutamiinihappo (D-Gla) tai niiden amidit, kuten mo-noamidit glutamiini [Glu(NH2)], isoglutamiini [Glu-NH2], Gla(NH2) tai Gla-NH2 tai diamidit, esim. Glu(NH2)-NH2.

Parhaimina pidettyjä peptidisekvenssejä kaavan I mukaisissa yhdisteissä ja niiden johdannaisissa ovat sellaiset, joissa n * 0, so. sellaiset, joissa yhdysjäsen As° puuttuu glyseryyli-kysteiini-osan ja aminohapon As1 välistä, ja näistä etenkin sekvenssit: -Aia-D-Glu -Ala-D-Glu-NH2 -Ala-D-Glu(NH2) -Ala-D-Glu(NH^-NH2 -Ala-D-Glu(Ala)-OH -Ala-D-Glu(Ala)-NH2 ja vastaavat sekvenssit, joissa -Ser-, -Abu- tai -Vai- ovat ensimmäisen alaniini-tähteen sijalla, edelleen vastaavat sekvenssit, joiden edessä on As°, joka voi olla esim. D- tai L-alaniinin tai glysiinin tähde, tai jokin yllä tähteen -NH-Kw-CO- yhteydessä mainituista tähteistä.

Erityisen mielenkiintoisia ovat lipopeptidit, joissa on R-konfiguraatio ** asymmetriakeskuksessa ja joissa on 8-16 C-atomia sisältävät tähteet R^CO- ja R^CO- ja 8-16 C-atomia sisältävät tähteet R2-CO- ja yllä mainitut, parhaimpina pidetyt peptidiketjut. Mieluiten asyylitähteet R^-gCO- ja R^CO- ovat tähteestä R2-CO- poikkeavia ja R^CO-, R^jjCO- ja r2-CO- merkitsevät etenkin kapryyli-, kapriini-, lauriini-, myristiini-, palmitiini- tai steariinihapon tähdettä.

Hakemuksen mukaisia erityisen tärkeitä lipopeptidejä ovat palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu- 8 83524 nh2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dipalmitoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Gly(Ala)-NH2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(NH2), palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli}-Abu-F-Glu-NH2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli-Afla-D-Glu(NH2)-OmBu, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OnBu)-NH2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-D-Ala-Ala-D-G1u-NH2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ser-D-G1u(OCH3)-OCH3, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Gla- nh2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Val-D-Glu- nh2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(Lys-Lys-OCH3)-NH2, palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(Arg), sen mono- tai dimetyyliesteri ja sen monoamidi, ja vastaavat lipopeptidit, joissa palmitoyylin sijasta esiintyy kysteiinitähteen typessä lauroyyli, kaprinoyyli, kapry-loyyli tai myristoyyli, ja näitä ja yllä esitettyjä lipopep-tidejä vastaavat yhdisteet, joissa diasyylioksipropyylitäh-teessä esiintyy lauroyylitähteiden sijasta pamitiini-, kap-ryyli-, kapriini- tai myristiinihapon tähteet, sekä kaikki näitä lipopeptidejä vastaavat yhdisteet, joissa konfiguraatio on diasyylioksipropyylitähteen kiraalisessa asemassa S-konfiguraation sijasta R-konfiguraatio, ja vastaavat R- ja S-yhdisteiden diastereomeeriseokset, kuten esim. lauroyyli-Cys(2[R,S],3-didekanoyylioks i-propyyli)-Ala-D-Glu- 9 83524 nh2, dekanoyyli-Cys(2[R,S],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Afla-D-Glu-NH2, myristoyyli-Cys(2[R,S],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-G1u-NH2, palmitoyy1i-Cys(2[R,S],3-didekanoyy1ioks i-propyy1i)-Afla-D-G1u-NH2, palmitoyyli-Cys(2[R,S],3-didekanoyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu{OCH3)-OCH3, sekä mahdollisesti niiden substituoimattomat amidit, sekä 1-7 C-atomia sisältävien alkanolien esterit. Keksinnön mukaisten lipopeptidien tämän tyyppisinä spesifisinä estereinä mainittakoon esim. yllä esitettyjen ja esimerkkeissä selitettyjen erityisten lipopeptidien metyyli-, etyyli- ja bu-tyyliesterit.

Keksinnön kohteena ovat aivan ensisijaisesti esimerkeissä mainittujen kaavan I mukaisten yhdisteiden valmistus.

Esillä olevat uudet lipopeptidit ovat, riippuen niiden substituenttien laadusta, neutraaleja, happamia tai emäksisiä yhdisteitä. Mikäli esiintyy ylimääräisiä happamia ryhmiä, ne muodostavat suoloja emästen kanssa, kuten ammoniumsuoloja tai suoloja alkali- tai maa-alkalimetallien, esim. natriumin, kaliumin, kalsiumin tai magnesiumin kanssa; jos kuitenkin esiintyy ylimääräisiä emäksisiä ryhmiä, ne muodostavat happoadditiosuoloja.

Happoadditiosuoloja ovat erityisesti farmaseuttisesti käyttökelpoiset, ei-toksiset happoadditiosuolat, kuten sellaiset, jotka on muodostettu epäorgaanisten happojen, esim. kloorivety-, bromivety-, typpi-, rikki- tai fosforihappojen, tai orgaanisten happojen, kuten orgaanisten karboksyylihap-pojen, esim. etikkahapon, propionihapon, glykolihapon, meri-pihkahapon, maleiinihapon, hydroksimaleiinihapon, metyyli-maleiinihapon, fumaarihapon, omenahapon, viinihapon, sitruunahapon, bentsoehapon, kanelihapon, mantelihapon, salisyylihapon, 4-amino-salisyylihapon, 4-fenoksi-bentsoehapon, 2- 10 83524 asetoksi-bentsoehapon, embonihapon, nikotiinihapon tai iso-nikotiinihapon, tai orgaanisten sulfonihappojen, esim. me-taanisulfonihapon, etaanisulfonihapon, 2-hydroksi-etaanisul-fonihapon, etaani-l,2-disulfonihapon, bentseenisulfonihapon, p-tolueenisulfonihapon tai naftaliini-2-sulfonihapon kanssa, edelleen myös muut happoadditiosuolat, joita esim. voidaan käyttää välituotteina, esim. vapaiden yhdsiteiden puhdistamiseen tai valmistettaessa muita suoloja, sekä karakterisointiin, kuten esim. sellaiset, jotka on muodostettu pik-riini-, flaviaani-, fosforwolframi-, fosforimolybdeeni-, klooriplatina-, Reinecke- tai perkloorihapon kanssa.

Uudet lipopeptidit voidaan valmistaa sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti. Erään parhaimpana pidetyn menetelmän mukaiseestl kaavan I mukaiset yhdisteet, niiden esterit, niiden diastereomeeriseokset ja niiden suolat valmistetaan siten, että a) kaavan I mukainen yhdiste, jossa ainakin yksi tähteistä R1aCO-, R^jjCO- ja R2-CO- tarkoittaa vetyä ja muut substituentit tarkoittavat samaa kuin edellä, edellyttäen, että tässä lähtöaineessa esiintyvät vapaat funktionaaliset ryhmät, lukuunottamatta reaktioon osallistuvaa hydroksi-ja/tai aminoryhmää (-ryhmiä), esiintyvät tarvittaessa suojatussa muodossa, tai sen suola asyloidaan hapolla R1aCOOH, R1bCOOH tai vastaavasti R2-COOH tai sen reaktiokykyisellä karboksyylihappojohdannaisella ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, tai b) kaavan Ha mukainen karboksyylihappo

Rl-C0-0-CH * R

a I 2 1 ** ** * R tai s

R^-CO-O-CH

CH- I 2 (Ha)

S

h

R2-C0-HN-CH-C0-( (A»*)n-Asl-]q0H

11 83524 jossa kaavassa q on 0 tai 1 ja muut symbolit ja tähteet tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin, kun Asl tarkoittaa L-seriinitähdettä, seriinitähteessä esiintyvä hydroksiryhmä on tarvittaessa suojattu helposti lohkaistavalla hydroksisuoja-ryhmällä, tai sen reaktiokykyinen karboksyylihappojohdannai-nen saatetaan reagoimaan kaavan Hb mukaisen amiinin kanssa CO-Z2 *** · r CH-Z3 CH, (Hb) I 2

H[-(As°)n-Ae lr-NH-CH—CO-Z

jossa kaavassa r on l, kun kaavan Ha mukaisessa reaktio-partnerissa q on 0, ja jossa r on 0, kun q on 1, ja jossa muut symbolit tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin vapaat karboksyyliryhmät -COZ1, -COZ2 ja Z3 ja ryhmässä Z2 mahdollisesti esiintyvät vapaat amino- ja karboksiryhmät on suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, tai c) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa Z2:lla on edellämainitut merkitykset lukuunottamatta hydrok-sia, kaavan Ile mukainen karboksyylihappo r'-co-o-ch * - r a I 2 1 ** ** R tai s

R -CO-O-CH

b I *** « R

CH, CO-OH

I 3

S CH-ZJ

| I (Ile) CH, CH, I 2 I 2 ? * 1 *** 1

R -CO-HN-CH-CO - (As * ) -Aa -NH-CH—CO-Z

n jossa symbolit ja tähteet tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin vapaat karboksyyliryhmät -COZ1 ja Z3 on suojattu helposti lohkaistavilla karboksyylisuojaryhmillä, tai sen i2 83524 reaktiokykyinen karboksyylijohdannainen saatetaan reagoimaan kaavan Ild H-Z2 (Hd) mukaisen yhdisteen kanssa, jossa kaavassa Z2:lla on edellämainitut merkitykset lukuunottamatta hydroksia, jolloin siinä esiintyvät vapaat karboksi- ja aminoryhmät, lukuunottamatta reaktioon osallistuvia aminoryhmiä on suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, tai d) kaavan III mukainen yhdiste

Rl-C0-0-CH- ** « F tai S

a | 2 R^-CO-O—CH (III) fH2

Y

jossa R1a ja tarkoittavat samaa kuin edellä ja Y on nuk-leofuginen ryhmä, saatetaan reagoimaan kaavan IV mukaisen yhdisteen kanssa h co-z2 l I 3

S CH-Z * = R

I I

CH, CH~ *** = R (IV) I 1 I 2

2 * 1 *** 1 R -CO-HN-CH-CO—(Ase) -As -NH-CH-CO-Z

n jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin vapaat funktionaaliset ryhmät, lukuunottamatta reaktioon - - osallistuvia merkaptoryhmiä, on tarvittaessa suojattu hel posti lohkaistavilla suojaryhmillä, tai kaavan IV mukaisen yhdisteen reaktiokykyisen johdannaisen kanssa ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, ja, haluttaessa 13 83524 jonkin menetelmävaihtoehdoista a) - d) suorittamisen jälkeen saadussa kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa on ainakin yksi vapaa karboksyyliryhmä, vapaa(t) karboksyyli-ryhmä(t) esteröidään tai saatu kaavan I mukainen yhdiste, jossa on ainakin yksi suolanmuodostava ryhmä, muutetaan suolaksi tai saatu suola muutetaan vapaaksi yhdisteeksi, ja haluttaessa erotetaan saatu diastereomeeriseos.

Menetelmä a):

Menetelmän muunnelman a) mukaisissa lähtöaineissa esiintyviä suojaryhmiä ovat etenkin amino-, karboksi- tai hydroksiryhmien suojaamiseksi peptidien synteesistä tunnetut, jotka voidaan lohkaista esim. hydrolyysillä, pelkistyksellä, aminolyysillä tai hydratsinolyysillä.

Näin ovat esim. aminoryhmien suojaryhminä asyyli- tai aralkyyliryhmät, kuten formyyli-, trifluoriasetyyli-, ftalo-yyli-, bentseennisulfonyyli-, p-tolueenisulfonyyli-, o-nit-rofenyylisulfenyyli-, 2,4-dinitrofenyylisulfenyyliryhmät, mahdollisesti substituoidut, kuten esim. alempialkoksiryhmil-lä, etenkin o- tai p-metoksiryhmillä substituoidut bentsyy-li-, tai difenyyli- tai trifenyylimetyyliryhmät tai hiilihaposta johtuvat ryhmät, kuten mahdollisesti aromaattisissa renkaissa esim. halogeeniatomeilla, kuten kloorilla tai bromilla, nitroryhmillä, alempialkyyli- tai alempialkoksiryh-millä tai väriä luovuttavilla ryhmillä, esim. atsoryhymillä substituoidut aryylimetyylioksikarbonyyliryhmät, jois- 14 83524 sa metyleeniryhmä voi olla jollakin toisella aryylitähteel-lä ja/tai yhdellä tai mahdollisesti kahdella alemmalla al-kyylitähteellä substituoitu, kuten bentsyyli-, bentshydryy-li- tai 2-fenyyli-isopropyylioksikarbonyyliryhmät, esim.

5 karbobentsoksi, p-bromi- tai p-kloorikarbobentsoksi, p-nit-rokarbobentsoksi tai p-metoksikarbobentsoksi, p-fenyyliatso-bentsyylioksikarbonyyli tai p-(p'-metoksi-fenyyliatso)-bent-syylioksokarbonyyli, 2-tolyyli-isopropyylioksikarbonyyli ja etenkin 2-(p-bifenylyyli)-isopropyylioksikarbonyyli, sekä 10 alifaattiset oksikarbonyyliryhmät, kuten adamantyylioksi- karbonyyli, syklopentyylioksikarbonyyli, trikloorietyyliok-sikarbonyyli, tert.-amyylioksikarbonyyli tai ennen kaikkea tert.-butyy1ioks ikarbonyy1i.

Aminoryhmät voidaan suojata myös muodostamalla enamii-15 neja, jotka saadaan saattamalla aminoryhmä reagoimaan 1,3-diketonien, esim. bentsoyyliasetonin, astyyliasetonin tai dimedonin kanssa.

Karboksyyliryhmät on suojattu esimerkiksi amidi- tai hydratsidimuodostuksen avulla tai esteröinnin avulla. Amidi-20 ja hydratsidiryhmät ovat mieluimmin substituoituja, amidi- ryhmä esim. 3,4-dimetoksibentsyyli- tai bis-(p-metoksifenyy-li)-metyyliryhmällä, hydratsidiryhmä esim. bentsyylioksikar-bonyyli-, triklooriasetyylioksikarbonyyliryhmällä, trifluo-riasetyyliryhmällä, trityyliryhmällä, tert.-butyylioksikar-25 bonyyliryhmällä tai 2-(p-bifenylyyli)-isopropyylioksikarbo- nyyliryhmällä. Esteröintiin soveltuvat esim. alemmat mahdollisesti substituoidut alkanolit, kuten metanoli, etanoli, syaanimetyylialkoholi, bentsoyylimetyylialkoholi tai etenkin tert.-butanoli, edelleen aralkanolit, kuten aryylialempi-30 alkanolit, esim. mahdollisesti alempialkyyli- tai alempial-koksiryhmillä tai halogeeniatomeilla substituoidut bentsyy-lialkoholit tai bentshydrolit, kuten bentshydroli, p-nitro-bentsyylialkoholi, p-metoksibentsyylialkoholi, 2,4,6-trime-tyylibentsyylialkoholi, mahdollisesti elektroneja puoleensa 35 vetävillä substituenteilla substituoidut fenolit ja tiofeno-lit, kuten tiofenoli, tiokresoli, p-nitrotiofenoli, 2,4,5-ja 2,4,6-trikloorifenoli, p-syaanifenoli tai p-metaanisulfo- 15 83524 nyylifenoli, edelleen esim. N-hydroksisukkinimidi, N-hydrok-siftaali-imidi, N-hydroksipiperidiini, 8-hydroksikinoliini.

Hydroksiryhmät, esim. seriini- tai treoniinitähteissä esiintyvät ryhmät voi olla suojattu esim. esteröinnin tai 5 eetteröinnin avulla.

Esteröintiin sopivia asyylitähteitä ovat ennen kaikkea hiilihaposta johtuvat tähteet, kuten bentsyylioksikarbonyy-li tai etyylioksikarbonyyli. Eetteröintiin sopivia ryhmiä ovat esim. bentsyyli-, tetrahydropyranyyli- tai tert.-butyy-10 litähteet. Edelleen sopivia hydroksyyliryhmien suojaamiseksi ovat julkaisussa Chem.Ber. 100 (1967), 3838-3849 esitetyt 2,2,2-trifluori-1-tert.-butyylioksikarbonyyliamino- tai -1-bentsyylioksikarbonyyliaminoetyyliryhmät (Weygand).

Erityisiä karboksiryhmien suojaryhmiä, jotka voidaan 15 lohkaista neutraaleissa olosuhteissa, ovat saksalaisessa hakemusjulkaisussa 27 06 490 esitetyt hydrokarbyyli-silyyli-etyyli-ryhmät, kuten esim. 2-(trimetyylisilyyli)-etyyli-ryhmä .

Merkaptoryhmä, kuten esim. kysteiinissä esiintyvä, voi-20 daan suojata etenkin S-alkyloimalla mahdollisesti substituoi-duilla alkyylitähteillä, tioasetaalimuodostuksella, S-asy-loimalla tai valmistamalla asymmetrisiä disulfidi-ryhmitty-miä. Parhaimpina pidettyjä merkaptosuojaryhmiä ovat esim. mahdollisesti fenyylitähteessä, esim. metoksilla tai nitrol-25 la substituoitu bentsyyli, kuten 4-metoksibentsyyli, mahdollisesti fenyyliosassa, esim. metoksilla substituoitu di-fenyylimetyyli, kuten 4,41-dimetoksidifenyyli-metyyli, tri-fenyylimetyyli, trimetyylisilyyli, bentsyyli-tiometyyli, tetrahydropyranyyli, asyyliaminometyyli, bentsoyyli, bent-30 syylioksikarbonyyli tai aminokarbonyyli, kuten etyyliamino-karbonyyli.

Menetelmän mukainen suojaryhmien lohkaisu tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla, esim. peptidikemian tavanomaisilla menetelmillä. Siten voidaan yllä mainitut aminosuojaryhmät, 35 kuten asyylisuojaryhmät, lohkaista happamen hydrolyysin avulla, esim. trifluorietikkahapolla, kloorivedyllä tai bromive-dyllä, sopivassa liuottimessa, kuten esterissä, esim. etik- 16 83524 kaesterissä, tai klooratussa alifaattisessa hiilivedyssä, kuten kloroformissa, metyleenikloridissä tai etyleeniklori-dissa. Sulfenyyliryhmien ollessa kyseessä lohkaisu voi tapahtua myös nukleofiilisten reagenssien, esim. sulfiittien 5 tai tiosulfiittien vaikutuksessa. Aralkyyliryhmät poistetaan mieluimmin katalyyttisen hydrauksen avulla, esim. palladium-katalysaattoreilla, kuten palladium/bariumsulfaatil-la, palladium-mustalla tai myös rodium-katalysaattorilla, jolloin käytetään kirjallisuudesta tunnettuja liuottimia, 10 esim. syklisiä eettereitä, kuten tetrahydrofuraania, mahdollisesti seoksessa muiden inerttien liuottimien, kuten esim. alempialifaattisen happoamidin, kuten dimetyyliformamidin kanssa.

Karboksyylisuojaryhmien lohkaisu voidaan samoin suo-15 rittaa hydrolyyttisesti (esitetyissä neutraaleissa tai miedoissa happamissa olosuhteissa), esim. samoilla happamilla aineilla, jotka esitetiin yllä aminosuojaryhmien poistamiseksi. Aralkyyliesterit, kuten esim. bentsyyliesteri voidaan lohkaista kuitenkin myös katalyyttisen hydrauksen avulla, 20 kuten aralkyyliamiinien yllä esitetyn lohkaisun yhteydessä.

Yllä mainittu 2-(trimetyylisilyyli)-etyyli-ryhmä voidaan lohkaista neutraaleissa olosuhteissa, esim. fluorivetyhapon suolan, kuten etenkin kvaternäärisen typpiemäksen fluorivetyhapon suolan, esim. tetraetyyliammoniumfluoridin vaikutuk-25 sessa sopivassa liuottimessa.

Sopivalla asyyliryhmällä, orgaanisella silyyliryhmäl-lä tai mahdollisesti substituoidulla 1-fenyylialempialkyy-lillä suojattu hydroksi- tai merkaptoryhmä vapautetaan vastaavasti suojatun aminoryhmän mukaisesti. 2,2-diklooriase-30 tyylillä suojattu hydroksi- tai vast, merkaptoryhmä vapautetaan esim. emäksisen hydrolyysin avulla, tert.-alempialkyy-- -- Iillä tai 2-oksa- tai 2-tia-alifaattisella tai -sykloalifaat- tisella hiilivetytähteellä eetteröity hydroksi- tai vast, merkaptoryhmä asidolyysin avulla, esim. käsittelemällä mine-35 raalihapolla tai vahvalla karboksyylihapolla, esim. trifluo-rietikkahapolla. Kaksi hydroksiryhmää, jotka on suojattu yhdessä mieluimmin substituoidulla metyleeniryhmällä, kuten '7 83524 alempialkylideenillä, esim. isopropylideenillä, sykloalky-lideenillä, esim. sykloheksylideenillä tai bentsylideenillä, voidaan vapauttaa happamen solvolyysin avulla, etenkin mi-neraalihapon tai vahvan orgaanisen hapon läsnäollessa.

5 Menetelmän muunnelman a) mukaisissa lähtöaineissa ovat esteröinnin avulla auojattuja karboksyyliryhmiä etenkin tert.-butyylioksikarbonyyli- tai bentsyylioksikarbonyyli-ryhmät.

Sivuketjujen, kuten lysiinin aminoryhmät on 10 suojattu ensisijassa tert.-butyylioksikarbonyyliryhmällä (Boc). Hydroksiryhmät, esim. seriinissä tähteessä As^ esiintyvät, suojataan ennen kaikkea tert,-butyylieetteriryhmillä. Näiden ryhmien lohkaisu tapahtuu tarkoituksenmukaisesti käsittelemällä mainituilla happamilla aineilla tunnetuissa olo-15 suhteissa, esim. trifluorietikkahapolla, huoneen lämpötilassa, niin että yhdessä vaiheessa voidaan poistaa sekä karbok-syyliryhmien, kuten aminoryhmien että mahdollisesti seriinin suojaryhmät.

20 Lähtömateriaalissa esiintyviä vapaita funktionaalisia ryhmiä, jotka esiintyvät mieluimmin suojatussa muodossa, mikäli ne eivät osallistu reaktioon, ovat etenkin amino-, hydrökäl- ja karboksiryhmät. Vapailla karboksyyli- hapoilla suoritettava esteröinti tapahtuu sopivan vettä pois-25 tavan aineen läsnäollessa. Reaktiokykyisiä karboksyylihappo-"... johdannaisia ovat etenkin anhydridit, kuten esim. seka- tai sisäiset anhydridit, esim. halogeenivetyhappojen kanssa muo-; dostetut, so. vastaavat happohalogenidit, etenkin kloridit, etenkin syaanivetyhapon kanssa muodostetut tai sitten sopi-30 vien hiilihappopuolijohdannaisten, kuten vastaavien -puoli-estereiden kanssa muodostetut (kuten esim. halogeenimuura-haishappo-alempialkyylin, kuten kloorimuurahaishappo-etyy-. . liesterin tai -isobutyyliesterin kanssa muodostetut seka- anhydridit) tai mahdollisesti substituoitujen, esim. halo-35 geenin, kuten kloorin sisältävien alempialkaanikarboksyyli-happojen kanssa muodostetut (kuten esim. pivaliinihappoklo-••V ridin tai trikloorietikkahappokloridin kanssa muodostetut 18 83524 seka-anhydridit). Sisäisiä anhydridejä ovat esim. orgaanisten karboksyylihappojen sisäiset anhydridit, so. keteenit, kuten keteeni tai diketeeni, tai karbamiini- tai tiokarba-miinihappojen anhydridit, so. isosyanaatit tai isotiosyanaa-5 tit. Muita reaktiokykyisiä, asylointlaineina käytettäviä orgaanisten karboksyylihappojen johdannaisia ovat aktivoidut esterit, kuten sopivasti substituoidut alempialkyyliesterit, esim. syaanimetyyliesteri, tai sopivasti substituoidut fe-nyyliesterit, esim. pentakloorifenyyli- tai 4-nitrofenyyli-10 esterit. Esteröinti voidaan suorittaa tarvittaessa sopivien kondensointlaineiden läsnäollessa, käytettäessä vapaita karboksyylihappo ja, esim. karbodi-imidiyhdisteiden, kuten di-sykloheksyylikarbodi-imidin, tai karbonyyliyhdisteiden, kuten di-imidatsolyylikarbonyylin läsnäollessa, ja käytettäes-15 sä reaktiokykyisiä happojohdannaisia, esim. emäksisten aineiden, kuten trialempialkyyliamiinien, esim. trietyyliamiinin, tai heterosyklisten emästen, esim. pyridiinin tai 4-dimetyy-liaminopyridiinin läsnäollessa. Asylointireaktio voidaan suorittaa ilman liuotinta tai liuotinseosta tai liuottimen 20 tai liuotinseoksen läsnäollessa, jäähdyttäen, huoneen lämpötilassa tai lämmittäen, ja tarvittaessa suljetussa astiassa ja/tai inertin kaasun, esim. typen atmosfäärissä. Sopivia liuottimia ovat esim. mahdollisesti substituoidut, etenkin mahdollisesti klooratut, alifaattiset, sykloalifaattiset 25 tai aromaattiset hiilivedyt, kuten bentseeni tai tolueeni, jolloin sopivia esteröintireagensseja, kuten etikkahappoan-: hydridiä voidaan käyttää myös laimentimena.

19 83S24

Menetelmät b) ja c):

Menetelmämuunnelmien b) ja c) eräs parhaimpana pidetty suoritusmuoto on reaktiokykyisen happojohdannaisen reaktio kaavan Hb tai Ild mukaisen amiinin kanssa, jolloin hapon aktivointi voi tapahtua myös in situ.

Reaktiokykyinen happojohdannainen on esim. happoatsi-di, -anhydridi, -imidatsolidi, -isoksatsolidi tai aktivoitu esteri, kuten syaanimetyyliesteri, karboksimetyyliesteri, tiofenyyliesteri, p-nitrotiofenyyliesteri, tiokresyylieste-ri, p-metaanisulfonyylifenyyliesteri, p-nitrofenyyliesteri, 2,4-dinitrofenyyliesteri, 2,4,5- tai 2,4,6-trikloorifenyyli-esteri, pentakloorifenyyliesteri, N-hydroksi-sukkinimidin, N-hydroksi-ftaali-imidin, 8-hydroksikinoliinin, 2-hydroksi- 1,2-dihydro-l-etoksikarbonyyli-kinoliinin tai N-hydroksipi-peridiinin kanssa muodostettu esteri tai sen on enoliesteri, joka on valmistettu N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsolium-3-sul-fonaatin kanssa (Woodward-reagenssi), tai se voidaan muodostaa saattamalla happo reagoimaan karbodi-imidin kanssa (mahdollisesti lisäämällä N-hydroksi-sukkinimidiä) tai substitu-oimattoman tai esim. halogeenilla, metyylillä tai nietoksilla substituoidun 1-hydroksi-bentsotriatsolin, 3-hydroksi-4-ok-so-3,4-dihydrobentso[b]-l,2,3-triatsiinin ja N,N'-karbonyy-li-imidatsolin kanssa, mahdollisesti in situ.

Kondensaation tavallisimpina menetelminä mainittakoon: Weygand-Wilnschin menetelmä (karbodi-imidi N-hydroksisukkin-imidin läsnäollessa), atsidimenetelmä, N-karboksianhydridien tai N-tiokarboksianhydridien menetelmä, aktivoitujen este-reiden menetelmä ja anhydridimenetelmä. Etenkin voidaan tämä kondensaatio suorittaa myös Merrifield-menetelmän mukaan. Menetelmä d):

Nukleofuginen ryhmä Y on lähtöryhmä nukleofugisessa substituutiossa; esim. mieluimmin esteröity hydroksiryhmä, jolloin hydroksiryhmä on esteröity etenkin vahvoilla epäorgaanisilla tai orgaanisilla hapoilla, esim. mineraali- tai 20 83524 sulfonihapoilla. Nukleofuginen ryhmä Y on siten esim. kloridi, bromidi, jodidi, mono- tai dialkyylisulfaatti tai tolu-eenisulfonaatti.

Kaavan IV mukaisessa yhdisteessä esiintyviä funktionaalisia ryhmiä, jotka on mieluimmin suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, ovat ennen kaikkea muut merkapto-ryhmät, mutta myös hydroksi, amino- tai karboksyyliryhmät. Kaavan IV mukaisen yhdisteen reaktiokykyinen johdannainen on yhdiste, jossa reaktioon osallistuvan rikkiatomin nukleofii-lisyys on korotettu, esim. lohkaisemalla merkaptoryhmän protoni. Tällainen reaktiokykyinen johdannainen voidaan muodostaa mahdollisesti myös in situ.

Reaktio voidaan suorittaa myös vastaavalla tavalla, kuten on esitetty eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 0 000 330 tai julkaisussa K.H.Weismtlller, W.Bessler ja G.Jung, Hoppe-Seyler's Z-Physiol.Chem. 364, 593-606 (1983).

Mikäli edellä ei ole toisin esitetty, suoritetaan menetelmät a)-d) ja lisäreaktiot inertissä liuottimessa tai liuotinseoksessa n. - 20...n. +120eC:n lämpötiloissa, ja tarvittaessa suojakaasun atmosfäärissä.

Esillä olevan keksinnön mukaisten yllä esitettyjen menetelmien lähtöaineet ovat tunnettuja, esim. eurooppalaisesta patenttijulkaisusta 0 000 330 tai ne voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla, esim. yllä esitettyjen menetelmien mukaisesti.

Lähtöaineet, joissa kaavassa I tähde R^-CO merkitsee vetyä, voidaan valmistaa esim. saattamalla aminoryhmässä helposti lohkaistavalla suojaryhmällä suojattu glyseryyli-kysteiini, jonka karboksyyliryhmä esiintyy aktivoidussa muodossa, reagoimaan halutun peptidin kanssa saman menetelmän mukaisesti kuin menetelmän muunnelman c) yhteydessä ja poistamalla tämän jälkeen aminosuojaryhmä. Vaihtoehtoisesti voidaan menetellä myös niin, että ensin asyloidaan aminoryhmässä helposti lohkaistavalla suojaryhmällä varustettu S-(2,3- 21 83524 dihydroksipropyyloi)-kysteiini, kondensoidaan sitten peptidin kanssa ja lohkaistaan tämän jälkeen aminosuojaryhmä.

Tämä lohkaisu voi tapahtua edullisesti hieman happamessa tai neutraalissa väliaineessa.

Menetelmän a) lähtöaineet voidaan valmistaa samojen menetelmien mukaisesti kuin menetelmän c) yhteydessä, sillä erotuksella, että ainakin yksi aminohapoissa esiintyvistä funktionaalisista ryhmistä, so. amino-, karboksyyli- tai hydroksiryhmä esiintyy suojatussa muodossa.

Kaavan XII mukaiset peptidit tai niiden fragmentit voidaan valmistaa peptidikemian tunnettujen menetelmien mukaisesti, etenkin yllä menetelmän c) yhteydessä esitettyjen menetelmien mukaisesti. Niiden rakenneosat, etenkin myös D-glutamiinihappo tai D-y-karboksiglutamiinihappo ja niiden amidit ovat tunnettuja yhdisteitä. Lähtöaineina käytetyt N-asyyli-glyseryyli-kysteiinit tai myös niiden glyseriinitäh-teessä asyloidut johdannaiset ovat luonnollisen L-kysteiinin (konfiguraatio R) johdannaisia. Diastereomeerien seokset voidaan erottaa haluttaessa sinänsä tunnetulla tavalla yksittäisiksi diastereomeereiksi.

Terminaaliset tai sivuketju-karboksyyliryhmät voidaan muuttaa, esim. esteröidä tai amidoida mielivaltaisessa vaiheessa näissä lähtöaineiden valmistusmenetelmissä halutulla tavalla sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti.

Saadussa kaavan I mukaisessa yhdisteessä olevan vapaan karboksyyliryhmän esteröinti tapahtuu esim. sinänsä tunnettujen menetelmien mukaisesti. Esim. vapaa happo saatetaan reagoimaan kyseisen alkoholin reaktiokykyisen funktionaalisen johdannaisen, kuten alkyylihalogenidin, esim. alkyyli-bromidin tai -kloridin, tai dialkyylisulfaatin, kuten dime-tyylisulfaatin kanssa, emäksen, kuten pyridiinin tai natriumbikarbonaatin läsnäollessa, tai saatetaan suoraan reagoimaan alkoholin kanssa lisäten sopivaa dehydratoivaa ainetta. Happo voidaan saattaa sinänsä tunnetulla tavalla reagoimaan 22 8 3 5 2 4 myös diatsoalkaanin, esim. diatsometaanin kanssa, mieluimmin eetterissä ja -5...+30eC:n lämpötiloissa, tai kyseisen O-al-kyyli-Ν,Ν·-disykloheksyyli-isotiovirtsa-aineen kanssa, mieluimmin aproottisessa aineessa ja 25-100eC:n lämpötiloissa. Voidaan kuitenkin myös hyvin edullisesti lähteä karboksyyli-happojen metallisuoloista, etenkin alkalisuoloista, ja saattaa nämä reagoimaan valmistettavaa esteriä vastaavan halo-geenihiilivedyn kanssa; käytetään esim. halogeenialkyyliä, kuten metyylibromidia tai etyylikloridia tai dialkyylisul-faattia, kuten dimetyylisulfaattia ja työskennellään mieluimmin polaarisessa liuottimesa, kuten esim. asetonissa, metyylietyyliketonissa tai dimetyyliformamidissa, mieluimmin 25-100*C:n lämpötiloissa. Metallisuoloina käytetään mieluimmin natriumin tai kaliumin suoloja tai etenkin myös cesiumin suoloja. Mainittujen halogeenialkyylien sijasta voidaan käyttää edullisesti myös niiden tertiääriseen amiiniin liittyviä liittymistuotteita, so. kvaternäärisiä tetra-alkyyli-ammoniumsuoloj a.

Lopuksi voidaan esterit valmistaa myös karboksyylihap-pojen funktionaalisista johdannaisista, esim. mahdollisesti niiden halogenideista saattamalla reagoimaan halutun alkoholin kanssa, tai muista estereistä uudelleenesteröinnin avulla.

Saadut lipopeptidit voidaan muuntaa sinänsä tunnetulla tavalla suoloikseen, esim. saattamalla saadut happamet yhdisteet reagoimaan alkali- tai maa-alkalihydroksidien kansa tai saadut emäksiset yhdisteet happojen kanssa. Suolat voidaan saattaa farmaseuttiseen käyttöön sopivaan muotoon liuoksistaan esim. lyofilisoinnin avulla.

Johtuen uusien vapaassa muodossa ja suolojensa muodossa esiintyvien yhdisteiden välisestä läheisestä suhteesta voidaan edellä ja seuraavassa käyttää merkityksen- ja tar-- koituksenmukaisesti mahdollisesti myös vastaavia suoloja.

Saadut isomeeriseokset voidaan erottaa aineosien fysi- 23 83524 kaalis-kemiallisten erojen perusteella tunnetulla tavalla, esimerkiksi kromatografian ja/tai jakokiteytyksen avulla. Edullisesti tehokkaampi isomeereistä erotetaan.

Esitetyt menetelmät suoritetaan esim. sinänsä tunnettujen menetelmien avulla, ilman laimentimia ja/tai liuottimia tai mieluimmin niiden läsnäollessa, tarvittaessa jäähdyttäen tai lämmittäen, korotetussa paineessa ja/tai inertin kaasun, esim. typen atmosfäärissä. Tällöin on käytettävä ottaen huomioon kaikki molekyylissä esiintyvät substituentit, tarvittaesa, etenkin helposti lohkaistavien O-asyylitähtei-den läsnäollessa, erityisen mietoja reaktio-olosuhteita, kuten lyhyitä reaktioaikoja, mietojen happamien aineiden käyttöä alhaisisa konsentraatioissa stökiömetrisissä määräsuh-teissa, sopivien katalysaattoreiden, liuottimien, lämpötilan ja/tai paineolosuhteiden valintaa.

Keksinnön kohteena ovat myös menetelmän ne suoritusmuodot, joissa lähtöaine käytetään reaktiokykyisen johdannaisen tai suolan muodossa. Tällöin lähdetään mieluimmin sellaisista lähtöaineista, jotka johtavat menetelmän mukaisesti yllä erittäin arvokkaiksi esitettyihin yhdisteisiin.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää farmaseuttisina valmisteina, jotka sisältävät esitettyjä uusia lipopeptidejä, niiden seoksia tai farmaseuttisesti käyttökelpoisia suoloja. Nämä farmaseuttiset valmisteet on tarkoitettu käytettäviksi enteraalisesti, kuten oraalisesti tai rektaalisesti, ja etenkin parenteraalisesti tai 24 83524 tooppisesti, esim. nasaalisesti tai vaginaalisesti lämminverisille, jotka valmisteet sisältävät farmakologisen vaikuttavan aineen yksinään tai yhdessä farmaseuttisesti käyttökelpoisten kantoaineiden kanssa. Vaikuttavan aineen annos-5 tus riippuu lämminverisen lajista, iästä ja yksilöllisestä tilasta, sekä antotavasta. Näin annetaan esim. immunopoten-soivan vaikutuksen aikaansaamiseksi lämminverisissä, joiden paino on pieni, esim. hiirissä, subkutaanisesti n. 1-30 mg/ kg:n annoksia ja intraperitoneaalisesti 0,03-3 mg/kg:n annok-10 siä. Heikosti ilmenevän annos-vaikutus-suhteen johdosta on painaville lämminverisille, esim. noin 70 kg painaville ihmisille annostus 0,01 - n. 5 mg/kg/ihminen. Tämä annos annetaan riippuen käsiteltävästä sairaukdesta joko vain kerran sairauden keston aikana tai suunnilleen kaksi kertaa viikos-15 sa noin 4 viikon aikavälillä, esim. subkutaanisesti.

Uusien farmaseuttisten valmisteiden oraaliset tai vast, rektaaliset muodot sisältävät n. 1 - n. 95 %, mieluimmin n.

10 - n. 95 %, etenkin n. 20 - n. 90 % vaikuttavaa ainetta: ne voivat esiintyä esim. annosyksikkömuodossa, kuten rakeina, 20 tabletteina, kapseleina, suppositorioina tai ampulleina ja ne voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla, esim. tavanomaisten sekoitus-, granulointi-, rakeistus-, liuotus- tai lyofilisointimenetelmien avulla.

Oraalisiin muotoihin sopivia kantoaineita ovat eten-• 25 kin täyteaineet, kuten sokeri, esim. laktoosi, sakkaroosi, manniitti tai sorbiitti, selluloosavalmisteet ja/tai kalsium-fosfaatit, esim. trikalsiumfosfaatti tai kalsiumvetyfosfaat-ti, edelleen sideaineet, kuten tärkkelysliisteri, jolloin käytetään esim. maissi-, vehnä-, riisi- tai perunatärkkelys-30 tä, gelatiini, tragantti, metyyliselluloosa, hydroksipropyy-li-metyyliselluloosa, natriumkarboksimetyyliselluloosa ja/ tai polyvinyylipyrrolidoni, ja/tai haluttaessa hajotusaineet, .. kuten yllä mainitut tärkkelykset, edelleen karboksimetyyli- . tärkkelys, silloitettu polyvinyylipyrrolidoni, agar, algii- : ' 35 nihappo tai sen suola, kuten natriumalginaatti. Apuaineita ovat ensisijassa juoksevuudensäätö- ja voiteluaineet, esim. ;.V piihappo, talkki, steariinihappo tai sen suolat, kuten mag- 25 83524 nesium- tai kalsiumstearaatti, ja/tai polyeteeniglykoli. Rae-ytimet varustetaan sopivilla, mahdollisesti mahanestettä kestävillä päällysteillä, jolloin käytetään mm. konsentroituja sokeriliuoksia, jotka sisältävät mahdollisesti arabikumia, 5 talkkia, polyvinyylipyrrolidonia, polyeteeniglykolia ja/tai titaanidioksidia, sopivissa orgaanisissa liuottimissa tai liuotinseoksissa olevia lakkaliuoksia tai mahanestettä kestävien päällysteiden valmistamiseksi sopivien selluloosaval-misteiden liuoksia, kuten mikrokiteistä selluloosaa (Avicel), 10 asetyyliselluloosaftalaattia tai hydroksipropyylimetyyli- selluloosaftalaatti. Tabletteihin tai raepäällysteisiin voidaan lisätä väriaineita tai pigmenttejä, esim. erilaisten vaikuttavan aineen annosten identifioimiseksi tai merkitsemiseksi.

15 Muita oraalisesti käytettäviä farmaseuttisia valmistei ta ovat gelatiinista valmistetut pistokapselit sekä pehmeät suljetut kapselit, jotka on valmistettu gelatiinista ja peh-mentimestä, kuten glyseriinistä tai sorbitolista. Pistokapselit voivat sisältää vaikuttavan aineen granulaatin muodos-20 sa, esim. sekoitettuna täyteaineiden, kuten laktoosin, sideaineiden, kuten tärkkelysten ja/tai 1lukuaineiden, kuten talkin tai magnesiumstearaatin ja mahdollisesti stabilisaatto-reiden kanssa. Pehmeissä kapseleissa vaikuttava aine on liuotettu tai suspendoitu mieluimmin sopiviin nesteisiin, kuten 25 rasvaöljyihin, parafiiniöljyyn tai nestemäisiin polyeteeni-glykoleihin, jolloin niihin voi olla lisätyy myös stabili-saattoreita.

Parenteraaliseen käyttöön sopivat ensisijassa vaikuttavan, vesiliukoisessa muodossa esiintyvän vaikuttavan aineen, 30 esim. vesiliukoisen suolan vesipitoiset liuokset, edelleen vaikuttavan aineen suspensiot, kuten vastaavat öljyiset in-jektiosuspensiot, jolloin käytetään sopivia lipofiilisiä liuottimia tai apuaineita, esim. rasvaöljyjä, esim. seesamiöljyä tai synteettisiä rasvahappoestereitä, esim. etyylioleaattia 35 tai triglyseridejä, tai vesipitoiset injektiosuspensiot, jotka sisältävät viskositeettiä parantavia aineita, esim. nat-rium-karboksimetyyliselluloosaa, sorbiittia ja/tai dekstraa- 26 83524 nia ja mahdollisesti myös stabilisaattoreita.

Parenteraaliseen käyttöön tarkoitetut farmaseuttiset valmisteet sisältävät mieluimmin 0-1,75 %, etenkin 1-50 % aktiivista ainetta.

5 Tooppisesti käytettävinä valmisteina tulevat kysymyk seen esim. voiteet, salvat, tahnat, vaahdot, tinktuurat ja liuokset, jotka sisältävät mieluimmin n. 0,02 - n. 2 % vaikuttavaa ainetta.

Voiteet ovat öljy-vesi-emulsioita, jotka sisältävät yli 10 50 % vettä, öljyisenä perustana käytetään ensisijassa rasva- alkoholeja, esim. lauryyli-, setyyli- tai stearyylialkoholia, rasvahappoja, esim. palmitiini- tai steariinihappo, nestemäisiä. . .kiinteitä vahoja, esim. isopropyylimyristaattia, vil-lavahaa tai mehiläisvahaa, ja/tai hiilivetyjä, esim. vase-15 liinia (Petrolatum) tai parafiiniöljyä. Emulgaattoreina tulevat kysymykseen pinta-aktiiviset aineet, joilla on etupäässä hydrofiilisiä imonaisuuksia, kuten vastaavat ei-ioniset emulgaattorit, esim. polyalkoholien rasvahappoesterit tai niiden etyleenioksidiadditiotuotteet, kuten polyglyseriini-20 rasvahappoesterit tai polyoksietyleenisorbitaani-rasvahappo-esterit (Tweens), edelleen polyoksietyleeni-rasva-alkoholi-eetterit tai -rasvahappoesterit, tai vastaavat ioniset emul-: . gaattorit, kuten rasva-alkoholisulfaattien aikaiimetallisuo- lat, esim. natriumlauryylisulfaatti, natriumsetyylisulfaat-25 ti tai natriumstearyylisulfaatti, jotka käytetään tavanomai-sesti rasva-alkoholien, esim. setyylialkoholin tai stearyy-lialkoholin läsnäollessa. Vesifaasin lisäaineita ovat mm. aineet, jotka estävät voiteiden kuivumisen, esim. polyalko-holit, kuten glyseriini, sorbiitti, propyleeniglykoli ja/tai 30 polyetyleeniglykolit, edelleen säilöntäaineet, hajusteet jne.

Salvat ovat vesi-öljy-emulsioita, jotka sisältävä korkeintaan 70 %, mieluimmin kuitenkin n. 20 - n. 50 % vettä tai vesipitoista faasia. Rasvafaasina tulevat kysymykseen ensisijassa hiilivedyt, esim. vaseliini, parafiiniöljy ja/ ; 35 tai kovaparafiinit, jotka sisältävät vedensitomiskyvyn pa rantamiseksi mieluimmin sopivia hydroksiyhdisteitä, kuten : ·' rasva-alkoholeja tai niiden estereitä, esim. setyylialkoho- 27 65524 lia tai villavaha-alkoholeja, tai vast, villavahaa. Emul-gaattoreita ovat vastaavat lipofiiliset aineet, kuten sorbi-taani-rasvahappoesterit (Spans), esim. sorbitaanioleaatti ja/tai sorbitaani-isostearaatti. Vesifaasin lisäaineita ovat 5 mm. kosteudenpysyttimet, kuten polyalkoholit, esim. glyse-riini, propyleeniglykoli, sorbiitti ja/tai polyeteeniglyko-li, sekä säilöntäaineet, hajusteet jne.

Rasvasalvat ovat edettömiä ja ne sisältävät perustana etenkin hiilivetyjä, esim. parafiinia, vaseliinia ja/tai nes-10 temäisiä parafiineja, edelleen luonnollisia tai osittain synteettisiä rasvoja, esim. kookosrasvatriglyseridiä, tai mieluimmin kovetettuja öljyjä, esim. hydrattua maapähkinä- tai risiiniöljyä, edelleen glyseriinin rasvahappo-osittaiseste-reitä, esim. glyseriinimono- tai -distearaattia, sekä esim.

15 salvojen yhteydessä mainittuja, veden sitomiskykyä parantavia rasva-alkoholeja, emulgaattoreita ja/tai lisäaineita.

Tahnat ovat voiteita ja salvoja, joissa on eritteitä absorboivia jauheaineosia, kuten metallioksideja, esim. titaanioksidia tai sinkkioksidia, edelleen talkkia ja/tai alu-20 miniumsilikaatteja, joiden tehtävänä on sitoa esiintyvä kosteus tai eritteet.

Vaahdot annetaan painesäiliöistä ja ne ovat aerosoli-muodossa esiintyviä nestemäisiä öljy-vesi-emulsioita, jolloin ponneaineena käytetään halogenoituja hiilivetyjä, ku-.25 ten kloorifluorialempialkaaneja, esim. dikloorifluorimetaa-nia ja diklooritetrafluorietaania. öljyfaasina käytetään mm. hiilivetyjä, esim. parafiiniöljyä, rasva-alkoholeja, esim. setyylialkoholia, rasvahappoestereitä, esim. isopropyylimy-ristaattia, ja/tai vahoja. Emulgaattoreina käytetään mm. etu-30 päässä hydrofiilisiä ominaisuuksia omaavien seoksia, kuten polyoksietyleeni-sorbitaani-rasvahappoestereitä (Tweens), ja etupäässä lipofiilisiä ominaisuuksia omaavien seoksia, kuten sorbitaanirasvahappoestereitä (Spans). Tämän lisäksi tulevat tavanomaiset lisäaineet, kuten säilöntäaineet, jne.

35 Tinktuuroissa ja liuoksissa on useimmiten vesipitois- etanolinen perusta, johon lisätään mm. polyalkoholeja, esim. glyseriiniä, glykoleja ja/tai polyeteeniglykolia, kosteuden- 28 83524 pysyttiminä haihtumisen pienentämiseksi, ja takaisinrasvoit-tavia aineita, kuten alempien polyetyleeniglykolien kanssa muodostettuja rasvahappoestereitä, so. vesipitoisessa liuoksessa liukenevia, lipofiilisiä aineita etanolin ihosta pois-5 tamien rasva-aineiden korvaamiseksi, ja tarvittaessa muita apu- ja lisäaineita.

Tooppisesti käytettävien farmaseuttisten valmisteiden valmistus tapahtuu sinänsä tunnetulla tavalla, esim. liuottamalla tai suspendoimalla vaikuttava aine perustaan tai sen 10 osaan tarvittaessa. Käsiteltäessä vaikuttavaa ainetta liuoksena tämä liuotetaan yleensä ennen emulgointia jompaankumpaan faasiin; käsiteltäessä sitä suspensiona se sekoitetaan emulgoinnin jälkeen perustan osan kanssa ja lisätään sitten valmisteen loppuosaan.

15 Erittäin edullista on farmaseuttisten valmisteiden käyttö liposomimuodossa. Lipopeptidi lisätään liposomien muodostuksessa. Liposomien valmistus ja vaikuttavan aineen sisällyttäminen voi tapahtua erilaisilla tavoilla ja sitä on esitetty yleiskatsauksessa Kaye, St. B., Cancer Treatment 20 Reviews (1981), 8, 27-50. Muita menetelmiä liposomien valmistamiseksi, joita käytetään vaikuttavan aineen kantoainei-na, on esitetty samoin julkaisuissa Barenholz et ai., Bio-: - chemistry, Voi. 16, No 12, 2806-2810 sekä saksalaisissa ha kemus julkaisuissa (DOS) 28 19 655, 29 02 672, 25 32 317 ja 25 28 42 608, US-patenttijulkaisussa 4 053 585 ja eurooppalai- ·; sessa patenttihakemuksessa 36 6 76.

Liuotetaan esimerkiksi lipidikomponentti, esim. fos-folipidi, esim. fosfatidihappo, lesitiini tai kefaliini ja mahdollisesti neutraalit lipidit, esim. kolesteroli yhdessä 30 lipopeptidin kanssa orgaaniseen liuottimeen, esim. kloroformi /metanol iin. Haihduttamisen jälkeen jää jäljelle homogee-- -- ninen kalvokerros. Tämä dispergoidaan vesipitoisessa faasis sa, esim. ravistamalla. Näin saadaan multilamellaarisia liposome ja. Käsiteltäessä tämän jälkeen ultraäänellä voi muo-- 35 dostua riippuen ultraäänen kestosta unilamellaarisia liposo me ja, jotka sisältävät vaikuttavan aineen. Liposomisuspen-siota voidaan käyttää etenkin parenteraalisesti, esim. sub- 29 83524 kutaanisesti tai intraperitoneaalisesti tai myös tooppises-ti, esim. intranasaalisesti, etenkin käytettäessä uusia li-popeptidejä antiviraalisena aineena.

Uusia kaavan I mukaisia lipopeptidejä ja niiden mainittuja johdannaisia voidaan käyttää immuunistimuloivan vaikutuksen aikaansaamiseksi, tai profylaktisina tai terapeuttisina aineina infektiosairauksia vastaan tai antiviraalisi-na aineina ihmisissä tai eläimissä, jolloin uudet yhdisteet annetaan mieluimmin yllä esitettyjen farmaseuttisten valmisteiden muodossa.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä tai niiden johdannaisia voidaan myös yhdistää yhteen tai useampaan antibioottiin. Tällaisia yhdistelmiä on esitetty esim. kuten jo mainittiin, parantuneen antibioottisen vaikutuksen aikaansaamiseksi erilaisissa infektiotiloissa. Nämä yhdistelmät voivat sisältää antibiootteja ryhmästä β-laktaamit, aminoglykosidit, tetrasykliiniä makrolidit, linkomysiinit, polyeeni- tai polypep-tidiantibiootit, antrasykliinit, kloori- tai tiamfenikolit, sykloseriinit, rifamysiinit tai fusidiinihappo. Tällaisia yhdistelmiä voidaan käyttää mieluimmin farmaseuttisten valmisteiden muodossa, jotka sisältävät molemmat komponentit yhdessä farmaseuttisten kantomateriaalien kanssa, kuten sellaisten, joita on yllä erityisesti korostettu.

Kaavan I mukaisia yhdisteitä voidaan käyttää myös menetelmässä antibioottien antibioottisen vaikutuksen parantamiseksi, joissa annetaan antibiootti yhdessä kaavan I mukaisen lipopeptidin tai jonkin sen mainitun johdannaisen kanssa, jolloin tämä voi tapahtua erikseen tai simultaanisesti, esim. yllä mainittujen yhdistelmävalmisteiden muodossa. Tässä menetelmässä käytetään tehokas tai sub-tehokas annos antibioottia, riippuen viimeksi mainitun laadusta, esim. n. 50 - n. 500 mg yksittäisannosta kohden. Kaavan I mukaisia lipopeptidejä käytetään tässä menetelmässä yksittäisannoksina, jotka ovat n. 5 mg - puolet antibiootin määrästä. Tällöin 3o 83524 lipopeptidi voidaan antaa korkeintaan 24 tuntia ennen tai jälkeen, mieluimmin kuitenkin suunnilleen samanaikaisesti antibioottin kanssa.

Tässä menetelmässä voidaan käyttää yksittäisiä anti-5 biootteja, kuten myös antibioottiseoksia. Parhaimpina pidettyjä antibiootteja mainittakoon β-laktaameista penisilliinit, kefalosporiinit, peneemit, nokardisiinit, tienamyysii-nit ja klavulaanihapot. Penisilliini-antibiooteista mainittakoon ensisijassa amoksisilliini, ampisilliini, karbeni-10 silliini, gloksasilliini, syklasilliini, digloksasilliini, mesillinami, metisilliini, penisilliini G, pensisilliini V, pivampisilliini, sulbenisilliini, atslosilliini, tikarsil-liini, metslosilliini, pivmesillinami tai 6-(4-endo-atsatri-syklo—(5.2.2.0Z' )undek-8-enyyli)-metyleeniaminopenisillaa-15 nihappo. Ryhmästä kefalosporiinit voidaan mainita esim. ke-faklori, kefatsafluri, kefatsoliini, kefadroksiili, kefosi-tiini, kefuroksiimi, kefasetriili, kefaleksiini, kefalogly-siini, kefaloridiini, kefalotiini, kefamandoli, kefanoni, kefapiriini, kefatritsiini, rafradiini, kefroksadiini (78— 20 (D-2-amino-2-(1,4-sykloheksadienyyli)-asetamido)-3-metoksi- 3-kefem-4-karboksyylihappo), kefsulodiini, kefotaksiimi, ke-fotiami, keftetsoli tai kefatsedoni. Nokardisiineistä mainittakoon esim. Nokardisiini A ja tienamyysiineistä ja kla-vulaanihapoista esim. tienamysiini tai vast, klavulaanihappo. : '25 Aminoglykosideistä mainittakoon etenkin streptomysiinit, esim. streptomysiini ja streptomysiini A, neomysiini, esim. neomysiini B, tobramysiinit, esim. tobramysiini tai dibeka-siini, kanamysiinit (esim. kanamysiini A:n, B:n ja C:n seokset) sekä amikasiinit, gentamysiinit (esim. gentamysiini 30 A:n, :n, C2:n tai C^a:n seokset) tai sisomisiinit, kuten sisomisiini tai netilmisiini, edelleen lividomysiini, ribo-kamysiini tai paromomysiini. Tetrasykliineistä mainittakoon etenkin tetrasykliini, doksisykliini, klooritetrasykliini, oksitetrasykliini tai metasykliini. Makrolideinä mainitta-.· 35 koon esim. maridomysiini, spiramysiini, kuten spiramysiini I, II ja III, erytromysiinit, esim. erytromysiini, oleaani-domysiinit, esim. oleaanidomysiini ja tetra-asetyylioleaa- 31 83524 nidomysiini, ja linkomyseeneistä esim. linkomysiini ja klin-damysiini.

Polyeeni-antibiootteina mainittakoon etenkin amfoteri-siini B ja sen metyyliesterit tai nystatiini. Polypeptidi-5 antibiootteina voidaan mainita erityisesti esim. kolistrii-ni, gramisidiini S, polymyksiini B, virginamysiini, tyrotri-siini, viomysiini tai vankomysiini. Rifamysiineistä tulevat kysymykseen ensisijassa rifamysiini S, rifamysiini SV tai rifamysiini B tai niiden puolisynteettiset johdannaiset, 10 etenkin rifampisiini.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat yllä esitettyä keksintöä. Niiden tarkoituksena ei ole kuitenkaan rajoittaa keksinnön laajuutta millään tavoin. Lämpötilat on esitetty Celsius-asteina, R^-arvot selvitetään piihappogeeli-ohut-15 kerroslevyillä (Merck, Darmstadt, Saksa). Liuottimien koos tumus on esitetty tilavuusosina,mikäli toisin ei ole esitetty. Liuottimessa (liuotinseoksessa) olevan aineen konsentraa- tio, c, on optisessa kierrossa esitetty prosentteina (paino/ tilavuus).

20 Lyhenteet:

Boc tert.-butyylioksikarbonyyli

Bz bentsyyli DMA dimetyyliasetamidi DMF dimetyyliformamidi ...25 EEDQ 2-etoksi-N-etoksikarbonyyli-1,2-dihydro-kinoliini

Et etyyli

Me metyyli nBu n-butyyli

Rotavap kiertohaihdutin 30 RT huoneen lämpötila sp. sulamispiste

Su sukkinimidyyli tBu tert.-butyy1i Z bentsyylioksikarbonyyli 35 Esimerkki 1: a) 4,1 g (3,89 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilau-royylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:a liuotetaan seok- 32 83524 seen, jossa on 18 ml trifluorietikkahappoa ja 42 ml metylee-nikloridia. Pidetään 6 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan tyhjössä siirapiksi, hierretään eetterin kanssa ja saadaan väritön, kiteinen jäännös. Tämä 5 uutetaan vielä kerran eetterillä ja kiteytetään kaksi kertaa uudelleen etanolista, minkä jälkeen saadaan palmitoyyli-Cys-(2(r),3-dilaurovylioksi—propyyli)-Ala-D-Glu-NH2, Rf = 0,23 (CHC13:EtOH = 9:1), sp. 158-161°, (α)^° = -12° (CHCl3:

MeOH = 1:1; c = 1 ,04).

10 Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti: b) 5,4 g (6,67 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(R),3-dilau-royylioksi—propyyli), 2,2 g (7,1 mmoolia) Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:a x HCl ja 1,1 g (8,1 mmoolia) N-hydroksi-bentstriatso-lia liuotetaan seokseen, jossa on 120 ml absoluuttista di-15 metyyliformamidia ja 180 ml metyleenikloridia, lisätään 1,67 g (8,1 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja saatetaan liuoksen pH arvoon n. 7 1 ml:11a trietyyliamiinia. Pi detään 16 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan tyhjössä kuivaksi. Jäännös uutetaan vedellä, uut-20 teet heitetään pois, ja jäännös kiteytetään kaksi kertaa uudelleen metanolista. Saadaan värittömiä palmitoyyli-Cys(2(r), 3-dilauroyylioksi—propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:n kiteitä, sp. 196-198°, (ct)p° = -11° (CHCl3:MeOH = 1:1, c = 0,98), Rf ^ = 0,44 (CHCl3:EtOH = 9:1).

··· 25 c) Lähtömateriaalina käytetty palmitoyyli-Cys (2 (r) , 3- dilauroyylioksi-propyyli) saadaan vastaavasta bentshydryy-liesteristä trifluorietikkahapon kanssa: 8 g bentshydryyliesteriä annetaan seistä 3 tuntia huoneen lämpötilassa seoksessa, jossa on 20 ml trifluorietikka-30 happoa ja 80 ml metyleenikloridia, haihdutetaan tyhjössä siirapiksi ja uutetaan tämä jäävedellä. Aine puhdistetaan kromatografiällä 300 g:ssa piihappogeeliä, Merck, eluointi-aineilla metyleenikloridi/etanoli = 95:5, metyleenikloridi/ etanoli = 9:1, kloroformi/metanoli = 7:3.

35 Ennen aineen laittamista pylväälle saatetaan pH tri- etyyliamiinilla suunnilleen arvoon 5. Haihdutetaan ensin siirappimaiset puhtaan aineen fraktiot, joiden R^ = 0,22 33 83524 (CHCl^iMeOH = 9:1), minkä jälkeen ne kiteytyvät lisättäessä metanolia, jolloin saadaan palmitoyyli-Cys(2(R),3-dilauroyy-lioksi-propyyli); sp. 52-55°, (a)^0 = -7° (dioksaani; c = 0,65).

5 Esimerkki 2: a) 300 mg palmitoyyli-Cys(2(r),3-dipalmitoyylioksi-propyyli)-Ala-D-glu-(Ala-OBz)-NH2:a hydrataan 50 ml:ssa di-metyyliformamidi-tetrahydrofuraania (7:3) 200 mg:lla Pd-mus-taa 50 tuntia 45°:ssa. Suodatetaan katalysaattorilta pois 10 ja uutetaan 30 ml:11a lämmintä liuotinseosta. Liuokset haihdutetaan tyhjössä ja jäännös puhdistetaan 10 g:ssa piihappo-geeliä, Merck, käyttämällä eluointiaineena kloroformi-metano-lia (9:1). Puhtaiden fraktioiden haihduttamisen jälkeen saadaan värittömiä palmitoyyli-Cys(2(r),3-dipalmitoyylioksi-15 propyyli)-Ala-D-Glu(Ala)-NH2:n kiteitä, hajaantumisalue 224-229°, (a)£° = -12° (CHCl3:MeOH = 1:1; c = 0,91), Rf = 0,31 (CHCl3:MeOH = 8:2).

Lähtömateriaalina käytetty bentsyyliesteri saadaan seuraavasti : 20 b) 0,6 g (0,659 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(r) ,3-dipal- mitoyylioksi-propyyli):ä, 257,6 mg (0,659 mmoolia) Ala-D-Gly(Ala-OBz)-NH2:a c HCl, 106,9 mg (0,79 mmoolia) N-hydrok-si-bentstriatsolia ja 92 yl trietyyliamiinia liuotetaan seokseen, jossa on 20 ml absoluuttista dimetyyliformamidia ja ... 25 50 ml metyleenikloridia ja lisätään tähän 164 mg (0,79 mmoo lia) disykloheksyylikarbodi-imidiä. Pidetään 16 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen reaktioliuos haihdutetaan kuivaksi tyhjössä ja jäännös sekoitetaan 50 ml:aan metanolia 50°:ssa. Saadaan ensimmäinen kidefraktio, emäliuoksesta ki-30 teytyy toinen fraktio. Molemmat fraktiot kiteytetään vielä uudelleen metanolista. Näin saadaan palmitoyyli-Cys(2(r),3-• ‘ dipalmitoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(Ala-OBz)-NH2:n värit tömiä kiteitä; sp. 180-184°, R^ = 0,61 (CHCl3:EtOH = 9:1).

c) Tripeptidin kanssa tapahtuvaan liitäntään käytetty 35 palmitoyyli-Cys(2(R),3-dipalmitoyylioksi-propyyli) saadaan esimerkin 1 c) mukaisesti vastaavasta bentshydryyliesteris-tä värittömänä, kiteisenä aineena, sp. 71-75°, R^ = 0,45 83524 34 (CHC13:MeOH ) 9:1), (α]ρ° = "4° (dioksaani; c = 0,89). Esimerkki 3: 500 mg (0,34 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(R),3-dilauro-yy 1 ioksi-propyy 1 i)-Ala-D-Glu{Lys (Boc)-Lys (Boc) -QMeJ-NH^:a liuotetaan seokseen, jossa on 5,3 ml 1,7 N suolahappoa absoluuttisessa etikkahappoetyyliesterissä ja 12 ml abs. metyleeniklori-dia. Pidetään tunnin ajan huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan kuivaksi ja tämä tapahtuma toistetaan kolme kertaa kulloinkin 10 ml:11a metyyli-tert.-butyylieet-teriä. Jäännös hierretään asetonilla, imetään sakka pois ja toistetaan tämä tapahtuma lämpimällä etikkahappoetyyliesterillä, johon lisätään ennen imemistä vielä sama tilavuusosa asetonia, minkä jälkeen saadaan palmitoyyli-Cys(2(r),3-di-lauroyylioksi—propyyli)-Ala-D-GluiLys-Lys-OMel-N!^ x 2 HC1 värittömien kiteiden muodossa, jotka sisältävät 0,5 moolia kidevettä; sp. 250-260° (haj.), (a)p^ = -18° + 1° (c = 0,849, CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,22 (CHC13:MeOH:H20:etikkahappo = 75:25:2:2) .

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 3.1: 1 g (1,002 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyy- 35 8 3 5 2 4 lioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2:a, 0,15 g N-hydroksi-bents-triatsolia, 0,15 g N-hydroksi-sukkinimidiä ja 0,5 g disyklo-heksyylikarbodi-imidiä sekoitetaan 3 tuntia huoneen lämpötilassa seoksessa, jossa on 5 ml dimetyyliformamidia, 20 ml 5 kloroformia ja 5 ml asetonitriiliä. Tämän jälkeen lisätään 0,55 g (1,05 mmoolia) Lys(Boc)-Lys(Boc)-OMe x HCl ja 0,3 ml trietyyliamiinia. Pidetään 40 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se haihdutetaan tyhjössä, sekoitetaan jäännös 20 ml saan vettä ja imetään pois. Tämä toistetaan metanolil-10 la ja jäljelle jäävä sakka kiteytetään uudelleen MeOHssta.

Näin saadaan palmitoyyli-Cys(2(R),3-dilauroyylioksi-propyy-li)-Ala-D-GluiLys(Boc)-Lys(Boc)-OMe}-NH0:n värittömiä kitei- ΛΛ 2, tä; sp. 180-182°, (a)^ = -25° ± 1° (c = 1,395; CHC13), Rf = 0,69 (CHCl3:MeOH = 9:1).

15 Esimerkki 4: 1 g (1,002 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyy-lioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2:a, 0,23 g N-hydroksi-sukkin-imidiä, 0,07 g N-hydroksi-bentstriatsolia ja 0,52 g disyklo-heksyylikarbodi-imidiä liuotetaan 15 ml saan abs. dimetyyli-20 formamidia ja annetaan seistä 5 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen lisätään liuos, jossa on 0,274 g glysyylitau-riinia ja 173 μΐ tetrametyyliguanidiinia 10 mlsssa dimetyy-; · liformamidia. Pidetään 24 tuntia huoneen lämpötilassa, min kä jälkeen lisätään vielä 100 mg disykloheksyylikarbodi-imi-25 diä, 100 mg N-hydroksi-sukkinimidiä, 50 mg glysyylitaurii-·; nia ja 90 yl tetrametyyliguanidiinia. Pidetään vielä 24 tun- -·- tia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se viimeistellään.

Haihdutetaan tyhjössä, pestään jäännös 50 ml :11a heksaania, sitten 30 ml:11a asetonitriiliä, tämän jälkeen digeroidaan 30 3 kertaa kulloinkin 20 ml :11a kyllästettyä NaCl-liuosta, min kä jälkeen 40°:ssa jäännös, joka liuotetaan CHCl3~MeOH-vesi-seokseen (85: 15: 1 ) 40°:ssa ja kromatografoidaan piihappogee-.·.· Iin läpi. Eluoidaan CHCl3-Me0H-H20:11a (70:30:3) ja haihdu- / - tetaan tyhjössä, minkä jälkeen saadaan palmitoyyli-Cys(2(r) ,3- '·‘ 35 dilauroyylioksi—propyyli)-Ala-D-Glu(Gly-tauriininatriumsuo- '·. la)-NH2 x 0,82 H20; hajaantumispiste 250° , (a)p^ = -24° (c "· = 1,052; CHC13:MeOH = 1:1), Rf = 0,256 (CHCl3:MeOH = 8:2).

36 83524 Käytetty glysyylitauriini saadaan tunnetulla tavalla hydrolysoimalla N-(Boc-Gly)-tauriini-natriumsuola trifluori-etikkahapolla. N-(Boc-Gly)-tauriini-Na-suola saadaan puolestaan Boc-Gly-O-Su:sta ja tauriini-natriumsuolasta 90 %:sessa 5 vesipitoisessa metanolissa.

Esimerkki 5; 521 .mg (0,588 mmoolia) oktanoyyli-Cys(2(R,s),3-didekano-yylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:a sekoitetaan huoneen lämpötilassa 6 tunnin kuluessa 5 ml:aan metyleenikloridia, 10 joka sisältää 20 til.-% trifluorietikkahappoa. Tämän jälkeen liuotin tislataan pois kiertohaihduttimessa 40°:n haudelämpö-tilassa, jäännös hierretään veden kanssa, imusuodatetaan, pestään neutraaliksi imusuodattimen päällä ja kuivataan 40°: ssa/0,1 torrissa 4 tunnin kuluessa. Näin saatu raakatuote 15 kiteytetään uudelleen etyylimetyyliketonista, minkä jälkeen saadaan oktanoyyli-Cys(2(R,s) ,3-didekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2, sp. 170-171°, (a) = -13° (c = 1,723; CHCl3: metanoli = 1:1), R^ = 0,5 (CHCl^:metanoli = 9:1).

Lähtömateriaali voidaan valmistaa seuraavasti: 20 Vaihe 5.1: 20 g:aan (0,16 moolia) L-kysteiiniä, joka on 150 ml:ssa pyridiiniä ja 120 ml:ssa metyleenikloridia, lisätään tipoit-tain 20-25°:ssa typpiatmosfäärissä 26,8 g (0,16 moolia) kap-ryylihappokloridia, joka on 30 ml:ssa metyleenikloridia, tä-25 män jälkeen sekoitetaan 17 tuntia huoneen lämpötilassa. Reak-tioseoksesta tislataan n. 40°:ssa tyhjössä metyleenikloridi pois ja siihen lisätään 150 ml pyridiiniä, 150 ml DMA:ta ja 150 ml vettä, jolloin muodostuu homogeeninen liuos. Reaktio-seoksen pH saatetaan nyt 30 %:sella NaOH:lla arvoon 9, sekoi-30 tetaan 2 tuntia huoneen lämpötilassa, saatetaan 2N suolahapolla pH-arvoon 5, uutetaan etikkahappoetyyliesterillä, kuivataan orgaaninen faasi natriumsulfaatin päällä ja haihdutetaan kiertohaihduttimessa 40-45°:ssa, jolloin jäljelle jää oktanoyyli-Cys keltaisena viskoosina öljynä; R^ = 0,31 (klo-35 roformi:metanoli = 7:3), (u)^ = -16° (c = 1,06; CHCl3:MeOH = 1:1).

37 83524

Vaihe 5.2: 40,4 g:aan (0,163 moolia) oktanoyyli-Cys :iä ja 52,8 g: aan (0,383 moolia) kaliumkarbonaattia, jotka ovat 375 ml:ssa etanolia, lisätään typpiatmosfäärissä 13,9 g (0,189 moolia) 5 glyseriiniglysidiä. Heikossa typpivirrassa sekoitetaan 4 tuntia 75-80°:ssa, jäähdytetään huoneen lämpötilaan, suspensioon sekoitetaan 150 ml vettä, saatetaan 2N HClilla suunnilleen pH-arvoon 3 ja uutetaan etikkahappoetyyliesterillä. Orgaaninen faasi kuivataan natriumsulfaatin päällä, suodate-10 taan ja suodos haihdutetaan, jolloin jäljelle jää oktanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihydroksi-propyyli) keltaisena öljynä. = 0,23 (CHCl3:Me0H:H20 = 65:35:2), (a)*0 = -6° (c = 0,995; CHCl3:MeOH = 1:1).

Vaihe 5.3: 15 2,01 g:aan (6,32 mmoolia) oktanoyyli-Cys(2(r,s),3-di hydroksi-propyyli) , joka on 40 ml:ssa dimetyyliasetamidia, lisätään 2,28 g (9,22 mmoolia) EEDQ:ta, 1,95 g (6,32 mmoolia) Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:a x HC1 ja 0,77 ml (6,32 mmoolia) trietyyliamiinia, minkä jälkeen reaktioseoksen pH-arvo on 7. 20 Sekoitetaan 16 tuntia 40-45°:ssa, minkä jälkeen liuotin tislataan pois 40-45°:ssa suurtyhjössä. Jäännös hierretään 3 kertaa dietyylieetterillä ja 3 kertaa etikkahappoetyyliesterillä ja dekantoidaan kulloinkin nestemäinen faasi pois. Liukenematon jäännös kuivataan tunnin kuluessa 40°:ssa ja 1 25 torrissa, liuotetaan 30 ml:aan THF-H20:ta (9:1) huoneen lämpötilassa ja saostetaan jälkeen 100 ml:lla H20:ta sekoittaen.

; Tämä sakka imetään pois ja kuivataan 40°:ssa ja 1 torrissa,

jolloin saadaan oktanoyyli-Cys(2(R,S),3-dihydroksi-propyy-li)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2; sp. 184-186°, Rf = 0,61 (metyleeni-30 kloridi:metanoli = 8:2), (a)^° = -4° (c = 0,479; CHCl3:MeOH

= 1:1).

Vaihe 5.4: .. 2,5 g (3,6 mmoolia) oktanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihydrok si-propyyli) -Ala-D-Glu (OtBu) -NH2 :a, joka on seoksessa, jos-35 sa on 18,9 ml (0,23 moolia) pyridiiniä ja 18,9 ml hiilitet-rakloridia, lämmitetään 55-60°:seen ja siihen lisätään täs-sä lämpötilassa 37,8 g (0,31 mmoolia) 4-dimetyyliaminopyri- 38 83524 diiniä ja 1,7 ml (8,1 mmoolia) kapriinihappokloridia. Reak-tioseosta sekoitetaan 20 tuntia 55-60°:ssa, jäähdytetään, laimennetaan 200 ml:11a metyleenikloridia, ravistetaan 3 kertaa kulloinkin 50 ml:11a 2N HCl:a, sitten pestään I^O:11a 5 neutraaliksi, kuivataan orgaaninen faasi Na2S0^:n päällä ja haihdutetaan. Ruskea, hartsimainen jäännös puhdistetaan pien-painekromatografiällä piihappogeelin kautta (0,040-0,64 mm) käyttämällä ajoaineena CH2Cl2:metanolia = 96:4, minkä jälkeen saadaan oktanoyyli-Cys(2(R,S),3-didekanoyylioksi-pro-10 pyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2, sp. 144-146°, (a)= -10° (c = 1,017; CHCl^:metanoli = 1:1), R^ = 0,64 (CHCl^:metanoli = 9:1).

Esimerkki 6: 0,972 g (1,03 mmoolia) oktanoyyli-Cys(2[R,S) ,3-dido-15 dekanoyylioksi-propyyli)-AlaD-Glu(OtBu)-NH2 muunnetaan esimerkin 1 a) mukaisesti oktanoyyli-Cys(2(R,s),3-didodekano-yylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2:ksi, sp. 162°, (a)= +12° (c = 0,855; kloroformi:metanoli = 1:1), R^ = 0,2 (klorofor-mi:metanoli = 92:8).

20 Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Vaihe 6:1: 1.1 g (1,90 mmoolia) oktanoyyli-Cys(2(r,s) ,3-dihydrok-si-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:a muunnetaan vaiheen 5.4 mukaisesti lauriinihappokloridilla oktanoyyli-Cys(2(R,s) ,3- 25 didodekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2;ksi, sp.

140-141°, (ot)^ = "9° (c = 1,352; kloroformi :metanoli = 1:1), R^ = 0,37 (kloroformi:metanoli = 92:8).

Esimerkki 7; 900 mg (0,902 mmoolia) oktanoyyli-Cys(2(r,s),3-ditet- 30 radekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 muunnetaan esimerkin 1 a) mukaisesti oktanoyyli-Cys(2 R,S ,3-ditetra- 2 0 dekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2:ksi; sp. 166°, (a)D -11° (c = 1,457; CHCl^:metanoli = 1:1), Rf = 0,11 (CHCl^i metanoli = 92:8).

35 Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Vaihe 7.1; 1.1 g (1,90 mmoolia) oktanoyyli-Cys (2 (r,s) , 3-dihydrok- 39 83524 si-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NHj saatetaan reagoimaan myris-toyylikloridin (1/03 g, 4,18 mmoolia) kanssa vaiheen 5.4 mukaisesti oktanoyyli-Cys(2(r,s),3-ditetradekanoyyliokso-pro-pyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi, sp. 140-141°, (a)^ = -10° 5 (c = 0,648; CHCl^:metanoli = 1:1), = 0,5 (CHCl^:metano- li = 92:8).

Esimerkki 8: 995,3 g (0,971 mmoolia) dekanoyyli-Cys(2(R,s),3-ditet-radekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-Nt^ muunnetaan 10 esimerkin 1 a) mukaisesti dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-ditetra-dekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NI^:ksi, sp. 154-155°, (a)2° = -12° (c = 0,922; CHC13:metanoli = 1 :1) , Rf = 0,41 (CHC13:metanoli = 1:1).

Lähtötuote saadaan seuraavasti: 15 Vaihe 8.1; 20 g L-kysteiiniä (0,1652 moolia) saatetaan reagoimaan kapriinihappokloridin (28,2 g, 0,1487 moolia) kanssa vaiheen 5.1 mukaisesti dekanoyyli-Cys:iksi; sp. 57-58°, Rf = 0,21 (CHC13 :metanoli = 85:15), (°0^° = -15° (c = 0,814; CHCL3: 20 MeOH = 1:1).

Vaihe 8.2: 6,1 g (22,2 mmoolia) dekanoyyli-Cys:ä muunnetaan vaiheen 5.2 mukaisesti dekanoyyli-Cys(2(R,s),3-dihydroksi-pro-pyyli):ksi. Saadaan viskoosi, keltainen öljy, R^ = 0,25 25 (CHCl3:MeOH = 65:35), (a)£° = -4° (c = 0,946; CHCl3:MeOH = 1:1).

Vaihe 8.3: 2,62 g (7,49 mmoolia) dekanoyyli-Cys(2(R,s),3-dihyd-roksi-propyyli):ä saatetaan reagoimaan Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 30 x HCl:n (2,31 g, 1,49 mmoolia) kanssa esimerkin 1 b) mukaisesti dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu (OtBu) -NH2: ksi, sp. 166-167°, (01)^ = “27° (c = 0,804; CHC13:metanoli = 1:1), R^ = 0,48 (CHgC^:metanoli = 85:15). Vaihe 8.4: 35 907 mg (1,5 mmoolia) dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihydrok si-propyyli) -Ala-D-Glu (OtBu) -NH2 : a saatetaan reagoimaan my-ristoyylikloridin (814 mg, 3,3 mmoolia) kanssa dekanoyyli- 40 8 3 5 2 4

Cys(2(R,S),3-ditetradekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi, sp. 138-139°, (a)£° = -9° (c = 1,234; CHCl3:meta-noli = 1:1), = 0,51 (CHCl^:metanoii = 9:1).

Esimerkki 9: 5 987 mg dekanoyyli-Cys{2(R,s),3-didodekanoyylioksi-pro- pyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 muunnetaan esimerkin 1 a) mukaisesti dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-didodekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2:ksi, sp. 180°, (u)p0 = -12° (c = 1,066; CHC13: metanoli = 1:1), R^ = 0,4 (CHC13:metanoii = 92:8).

10 Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 9.1: 604 mg (1 mmoolia) dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 saatetaan reagoimaan lauriini-happokloridin (480 mg; 2,2 mmoolia) kanssa vaiheen 5.4 mu-15 kaisesti dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-didodekanoyylioksi-propyy-li)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi, sp. 146-147°, (a)^° = -8° (c = 1,246; CHC13:metanoli = 1:1), Rf = 0,62 (CHC13:metanoli = 9:1).

Esimerkki 10: 20 1,5 g (1,75 mmoolia) dekanoyyli-Cys(2(R,S),3-diokta- noyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 muunnetaan esimerkin 1 a) mukaisesti dekanoyyli-Cys(2 R,S ,3-dioktanoyyliok-si-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2 ;ksi, sp. 154-155°, (°0p° = -15° (c = 0,958; CHC13:metanoli = 1:1); R^ = 0,375 (CHCl3:meta-25 noli:H20 = 80:20:1).

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 10.1: 955,5 mg (1,58 mmoolia) dekanoyyli-Cys(2 (r,s),3-dihyd-roksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 saatetaan reagoimaan vai-30 heen 5.4 mukaisesti kapryylihappokloridin (565 mg, 3,475 mmoolia) kanssa dekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dioktanoyylioksi-propyy-li)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH^ksi, sp. 165-167°, (a)^° = -12° (c = 0,930; CHCl.,: metanoli = 1:1), Rf = 0,454 (tolueeni-etanoli = 85:15).

35 Esimerkki 11: 2,912 g (2,841 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2 (r,S),3-didodekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 muunnetaan 4! 83524 esimerkin 1 a) mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2(r,s),3-di-dodekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NI^ :ksi, sp.( 160-162°, (a)p° = -12° (c = 1,333; CHC13rmetanoli = 1:1), Rf = 0,39 (CHC13:Me0H:H20 = 80:20:1).

5 Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 11.1: 20 g (0,1652 moolia) Cys:iä saatetaan reagoimaan myri-stoyylikloridin (36,6 g, 0,1487 moolia) kanssa vaiheen 5.1 mukaisesti tetradekanoyyli-Cys:ksi, sp. 63-65°, R^ = 0,13 10 CHjClj :asetoni = 8:2).

Vaihe 11.2: 31.0 g (93,5 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys:iä saatetaan vaiheen 5.2 mukaisesti reagoimaan glyseriiniglysidin (8,3 g, 108 mmoolia) kanssa tetradekanoyyli-Cys(2(R,S],3-dihydroksi- 15 prolyyli):ksi (hartsi), R^ = 0,19 (CHC13:metanoli = 65:35), (a)p° = +3° (c = 1,183; CHCl3:MeOH = 1:1).

Vaihe 11.3: 3.0 g (7,39 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(R,S),3-di-hydroksi-propyyli) saatetaan reagoimaan Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 20 x HCl:n (2,28 g, 7,39 moolia) kanssa vaiheen 5.3 mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi, sp. 161-162°, R^ = 0,52 (tolueeni:etikka-happoetyyliesteri:isopropanoli:2N etikkahappo = 10:35:35:20), [a]™ = -19° (c = 1,112; CHCl3:MeOH = 1:1).

25 Vaihe 11.4: 3.29 g (5,21 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(R,S),3-di-hydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-ΝΗ2 saatetaan reagoimaan lauriinihappokloridin (2,5 g, 11,4 mmoolia) kanssa vaiheen 5.4 mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2(R,S),3-didodekanoyyli-30 oksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 :ksi, sp. 129-131°, = -7° (c = 1,194; CHC13:metanoii = 1:1), Rf = 0,55 (CHC13:me-tanoli = 9:1).

Esimerkki 12: 1,02 g (1,06 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(R,S),3-di-35 dekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-ΝΗ2 muunnetaan esimerkin 1 a) mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2 R,S ,3-dideka-noyylioksi-propyyli) -Ala-D-Glu-NI^ :ksi, sp. 166-167°, (°0q^ = 42 8 3 5 2 4 -13° (c = 1,13; CHC13metanoli = 1:1), Rf = 0,3 (CHCl3:me-tanol^I^O = 75:25:1).

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 12.1: 5 997,7 g (1,5 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(r,S),3- dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NI^ saatetaan reagoimaan vaiheen 5.4 mukaisesti kapriinihappokloridin (629 mg, 3,3 mmoolia) kanssa tetradekanoyyli-Cys(2(r,s),3-didekano-yylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi, sp. 132-133°, 10 (a)^° = "10° (c = 0,943; CHC13:metanoli = 1:1), Rf = 0,64 (CHC13:metanoli = 9:1).

Esimerkki 13; 1,311 g (1,41 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dioktanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH^ muunnetaan 15 esimerkin 1 a) mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2(r,s),3-di-oktanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2 :ksi, sp. 170°, (a)^ = -13° (c = 1,201; CHC13-.metanoli = 1:1), Rf = 0,43 (CHC13: metanoli:H20 = 80:20:0,5).

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti: 20 Vaihe 13.1: 998,2 mg (1,58 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(R,S),3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu-Nl·^ saatetaan reagoimaan kap-ryylihappokloridin (565 mg, 3,47 mmoolia) kanssa vaiheen 5.4 mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2(R,s),3-dioktanoyylioksi-25 propyyli)-Ala-D-Glu (OtBu)-NH2 :ksi, sp. 136-138°, (cx)^ = “9° (c = 0,990; CHC13metanoli = 1:1), Rf = 0,54 (CHC13metanoli = 9: 1 ) .

Esimerkki 14: 565 mg (0,659 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(R,S),3-30 diheksanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 muunnetaan esimerkin 1 a) mukaisesti tetradekanoyyli-Cys(2(R,s),3-di-heksanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NI^:ksi, sp. 176-177°, (ct)p° = -14° (c = 1,130; CHC13 metanoli = 1:1), Rf = 0,31 (CHC13metanoli = 8:2).

35 Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 14.1: 1 g (1,58 mmoolia) tetradekanoyyli-Cys(2(r,s),3-dihyd- 43 8 3 5 2 4 roksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 saatetaan reagoimaan vaiheen 5.4 mukaisesti kapronihappokloridin (466 mg, 3,48 mmoolia) kanssa tetradekanoyyli-Cys(2(R,s),3-diheksanoyyli-oksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi, sp. 144-145°, (a)^ 5 = -12° (c = 1,281; CHC13imetanoli = 1:1), Rf = 0,43 (CHC13: metanoli = 95:5).

Esimerkki 15:

Esimerkin 1 a) mukaisesti saippuoidaan palmitoyyli-Cys (2 (r) ,3-dilauroyylioksipropyyli)-Abu-D-Glu(OtBu)-NH2 liuok-10 sella, jossa on 3 til.osaa trifluorietikkahappoa 7 til.osassa metyleenikloridia, huoneen lämpötilassa 3 tunnin kuluessa. Vastaavan viimeistelyn jälkeen saadaan palmitoyyli-Cys-(2(r),3-dilauroyylioksi—propyyli)-Abu-D-Glu-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 176-179°, = -15° (c = 0,818, 15 CHC13:MeOH = 1:1), Rf = 0,155 (CHCl3:MeOH = 9:1).

Lähtöaine valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 15.1:

Esimerkin 1 b) mukaisesti saadaan Abu-D-Glu(OtBu)-NH2 x HCl:stä ja palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyy-20 li):stä EEDQ:11a palmitoyyli-Cys(2(r) ,3-dilauroyylioksi-pro-pyyli)-Abu-D-Glu(OtBu)-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 139-141°, (a)£° = -14° (c = 0,865; CHCl3:MeOH = 1:1), Rf ; = 0,7 (CHCl3:MeOH = 9:1).

"· Esimerkki 16: 25 Esimerkin 1 a) mukaisesti saippuoidaan palmitoyyli-

Cys (2(r) ,3-dilauroyylioksi-propyyli)-Val-D-Glu(OtBu)-NH2 liuoksella, jossa on 3 tilavuusosaa trifluorietikkahappoa ja 7 tilavuusosaa metyleenikloridia, huoneen lämpötilassa 3 tunnin kuluessa. Vastaavan viimeistelyn jälkeen saadaan palmi-30 toyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Val-D-Glu-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 173-175°, = “16° (c = 0,985; CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,25 (CHCl3:MeOH = 9:1).

.·.· Lähtöaine valmistetaan seuraavasti: - - Vaihe 16.1: 35 Esimerkin 1 b) mukaisesti saadaan Val-D-Glu(OtBu)-NH2 x HCl:stä ja palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyy-li):stä EEDQ: 11a palmitoyyli-Cys (2 (r) ,3-dilauroyylioksi-pro- 44 83524 pyyli)-Val-D-Glu(OtBu)-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 142-144°, (α)ρ° = -10° (c = 0,791; CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,77 (CHCl3:MeOH = 9:1).

Esimerkki 17: 5 Esimerkin 1 a) mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys(2(r), 3-didekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NI^ :sta trifluo-rietikkahapolla metyleenikloridissa dodekanoyyli-Cys(2(r),3-didekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 152-154°, (u)p0 = -16° (c = 1,185; CHC13: 10 MeOH = 1:1), Rf = 0,35 (CHCl3:MeOH = 85:15).

Lähtöaine valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 17.1:

Vaiheen 5.3 mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys(2(r), 3-dihydroksi-propyyli):stä ja Ala-D-Glu(OtBu)-N^ x HCl:stä 15 dodekanoyyli-Cys(2(R),3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 177-179°, (a)^ = -27° (c = 0,864; CHC13:MeOH = 1:1), Rf = 0,605 (CHCl3:MeOH = 5:1). Vaihe 17.2:

Vaiheen 5.4 mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys(2(r), 20 3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:sta dekanoyyli-kloridilla pyridiinissä dodekanoyyli-Cys(2(r),3-didekanoyylioksi-propyyli) -Ala-D-Glu (OtBu) -NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 129-132°, (a)= -13° ( c = 0,882; CHC13:

MeOH = 1:1), Rf = 0,59 (CHCl^MeOH = 9:1).

2 5 Esimerkki 18:

Esimerkin 1 a) mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys(2(R) , 3-didodekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:sta tri-fluorietikkahapolla metyleenikloridissa dodekanoyyli-Cys(2(r), 3-didodekanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-N^, sp. 149-150°, 30 (°0d° = -15° (c = 1,1019; CHC13 :metanoli = 1:1), Rf = 0,44 (CHCl3:MeOH = 85:15).

Lähtöaine valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 18.1:

Vaiheen 5.4 mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys(2(R),3-35 dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:sta dodekanoyyli-kloridilla pyridiinissä dodekanoyyli-Cys(2(r),3-didodekanoyylioksi-propyyli) -Ala-D-Glu (OtBu) -NH2 värittömien kiteiden 45 8 3 5 2 4

muodossa, sp. 125-128°, (°0^ = “12° (c = 0,951; CHCL^MeOH

= 1:1), Rf = 0,425 (CHCl^MeOH = 95:5).

Esimerkki 19;

Esimerkin 1 a) mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys(2(r), 5 3-dioktanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2;sta dodekanoyyli-Cys (2 (r),3-dioktanoyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 156-158°, (°0^ = -17° (c = 0,969; CHCl^MeOH = 1:1), Rf = 0,355 (CHCl^MeOH = 85:15) .

10 Lähtöaine valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 19.1:

Vaiheen 5.4 mukaisesti saadaan dodekanoyyli-Cys (2 (r) , 3-dihydroksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NI^ :sta oktanoyyli-kloridilla pyridiinissä dodekanoyyli-Cys(2(r),3-dioktanoyy-15 lioksi-propyyli)-Ala-Glu(OtBu)-NH2 värittömien kiteiden muodossa, sp. 130-132°, (a)p° = -13° (c = 0,874; CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,565 (CHCl3:MeOH = 95:5).

Esimerkki 20:

Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksipropyyli) ja Ala-20 D-Glu-(Arg-OMe)-NH2 x HCl:stä saadaan esimerkin 1 b) mukaisesti palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu (Arg-OMe) -N^ x HCl; = “8° (c = 0,493; klorofor- mi:metanoli = 1:1), R^ = 0,39 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), R^ = 0,74 (kloroformi:metanoli:vesi:etikkahappo = 25 55:47:13:5).

Lähtöaine saadaan seuraavasti:

Vaihe 20.1: 29,79 g (75 mmoolia) Boc-Ala-D-Glu-N^: a, 9,49 g (82,5 mmoolia) N-hydroksi-sukkinimidiä ja 19,59 g (75 mmoolia) Arg-30 OMe x 2 HCl:a liuotetaan 300 ml:aan abs. dimetyyliformamidia, sitten siihen sekoitetaan kylmässä ensin 8,26 ml (75 mmoolia) N-metyyli-morfoliinia ja lopuksi 81,57 g (90 mmoolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä. Sekoitetaan 22 tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen keltainen suspensio laimennetaan 35 150 ml :11a etikkahappoetyyliesteriä, liukenematon sakka ime tään pois ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös suspen-:y doidaan 300 ml:aan tislattua vettä kylmässä, disykloheksyy- 46 8 3 5 2 4 livirtsa-aine imetään pois ja suodos haihdutetaan kuiviin. Raakatuote puhdistetaan vastavirtajaolla (ala- ja yläfaasi kulloinkin 25 ml) järjestelmässä n-butanoli:vesi = 1:1, K-ar-vo (jakokerroin) = 0,40. 326 jakovaiheen astiassa 84-120 5 saatu materiaali kerätään, liuotin haihdutetaan 30°:ssa tyhjössä ja jäännös puhdistetaan kiteyttämällä se kaksi kertaa isopropanolista ja etikkahappoetyyliesteri-dietyylieet-teristä (1:2). Saadaan Boc-Ala-D-Glu (Arg-OMe) -NH2 x HC1 värittömien kiteiden muodossa, sp. 71°, (a)^ = -18° (c = 10 0,549; metanoli), = 0,28 (etikkahappoetyyliesteri:n-buta- noli:pyridiini:etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10), R^ = 0,64 (kloroformi:metanoli:vesi:etikkahappo = 55:47:13:5).

Vaihe 20.2:

Boc-Ala-D-Glu(Arg-OMe)-NH2 x HCl:sta saadaan lohkai-15 semalla 5N HCl:lla etikkahappodietyyliesterissä Ala-D-Glu(Arg-OMe)-NH2 x 2 HCl; (m)^ = -4° (c = 0,407; metanoli), R^ = 0,16 (kloroformi:metanoli:vesi:etikkahappo = 55:47:13:5), R^ = 0,03 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli;pyridiini: etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10).

20 Esimerkki 21:

Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-MeAla-D-Clu(OtBu)-NH2:sta ja trifluorietikkahaposta me- tyleenikloridissa saadaan esimerkin 1 a) mukaisesti palmi-toyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-MeAla-D-Glu-NH2; 25 (°0d^ = "12° (c = 0,592; kloroformi:metanoli 1:1); R^ = 0,67 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), R^ = 0,36 (kloroformi : isopropanoli : etikkahappo = 70:8:2).

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 21.1: 30 Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli):sta ja Me-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:sta saadaan esimerkin 1 b) mukaisesti palmitoyyli-(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-MeAla-D-Glu(OtBu)-NH2; R^ = 0,31 (kloroformi:dimetoksietaani = 4:1), R^ = 0,90 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5).

35 Esimerkki 22:

Palmitoyyli-Cys(2(R) ,3-dilauroyylioksi-propyyli):sta ja Ser-D-Glu(OMe)-OMe:stä saadaan esimerkin 1 b) mukaisesti 47 83524 palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ser-D-Glu(OMe)-OMe; (°0q° = ”12° (c = 0,470; kloroformi), = 0,91 (kloroformi :metanoli:vesi = 70:30:5), = 0,27 (kloroformi: dimetoksietaani = 4:1).

5 Esimerkki 23:

Palmitbyyli-Cys(2(r,s),3-dilauroyylioksi-propyyli):stä ja Ala-D-Glu(NH2)-OnBu x HCl:stä saadaan esimerkin 1 b) mukaisesti palmitoyyli-Cys(2(r,s),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(NH2)-OnBu; sp. 156-159°, (a)£° = -8° (c = 0,631; 10 kloroformi), Rf = 0,82 (n-butanoli:etikkahappo:vesi = 75:7,5: 21), Rf = 0,12 (kloroformi:dimetoksietaani = 4:1).

Esimerkki 24:

Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-GlaI(OtBu)2t-NH2:a saatetaan reagoimaan trifluorietikka-15 hapon kanssa metyleenikloridissa esimerkin 1 a) mukaisesti.

Saatu jäännös liuotetaan pieneen määrään pyridiiniä, liuos laimennetaan suhteessa 1:10 kaksinkertaisesti tislatulla vedellä, suodatetaan Millipore-suodattimen (0,45 y) läpi ja lyofilisoidaan, minkä jälkeen saadaan palmitoyyli-Cys(2(r),3-20 dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Gla-NH2, sp. 172-174°, (oc)^ = -7° (c = 0,64; pyridiini), R^ = 0,26 (kloroformi:metano-li:vesi = 70:30:5), R^ = 0,40 (n-butanoli:etikkahappo:vesi = 75:7,5:21). R^ = 0,64 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli: pyridiini:etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10).

25 Saatu happo liuotetaan abs. pyridiiniin ja titrataan sulkien kosteus pois 2 ekvivalentilla 0,1 M metanolista nat-riummetylaattiliuosta. Laimennetaan suhteessa 1:10 kaksinkertaisesti tislatulla vedellä, suodatetaan Millipore-suodattimen (0,45 y)kautta ja lyofilisoidaan, minkä jälkeen saa-30 daan palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Gla-NH2-dinatriumsuola.

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Vaihe 24.1: Z-Ala:sta ja D,L-Gla{(OtBu)2}-NH2:sta saadaan EEDQ-35 menetelmän avulla Z-Ala-D,L-Gla{(OtBu)0}-NH~ värittömien neu-lasten muodossa, sp. 119-120°, (a)D = -13° (c = 0,891; me-tanoli), R^ = 0,74 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), 48 83524 = 0-68 (n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi = 38:24:8: 30) .

Vaihe 24.2: 10,2 g (20 mmoolia) Z-Ala-D,L-Gla{(OtBu)2}-NH2:a 300 5 ml:ssa metanolia hydrataan normaalipaineessa sen jälkeen, kun on lisätty 2 g Pd/C:a (10 %:sta). Katalysaattori suodatetaan pois, suodos haihdutetaan ja saatu diastereomeeri-seos kromatografoidaan "vapaana emäksenä" piihappogeelissä (60, Merck, 1:100; 15 ml fraktiot) järjestelmässä klorofor-10 mi:metanoli = 9:1. Fraktioihin 106-200 sisältyvät diastereo-meerit voidaan saada puhtaina kiteyttämällä varovasti dime-toks ii't aan ista (19 ml). Annetaan seistä 3 tuntia -10°:ssa, minkä jälkeen kidemassa imetään pois ja pestään ensin kylmällä dimetoksietaanilla, sitten petrolieetteri-dietyylieette-15 rillä (9:1). Fraktiot 60-105 sisältävät Ala-L-Gla{(OtBu)2}-NH2 värittömän öljyn muodossa, = + 1° (c = 0,944; metanoli), = 0,52 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5).

Fraktioihin 106-200 sisältyvät diastereomeerit voidaan saada puhtaina kiteyttämällä varovasti dimetoksietaanista (19 20 ml). Annetaan seistä 3 tuntia -10°:ssa, minkä jälkeen kide-massa imetään pois ja pestään ensin kylmällä dimetoksietaanilla, sitten petrolieetteri-dietyylieetterillä (9:1). Kuivatuksen jälkeen saadaan Ala-D-Gla (OtBu)2 -NH2 värittömien neulasten muodossa, sp. 139-140°, (°0q^ = +13° (c = 0,931, 25 metanoli), R^ = 0,60 (n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi = 38:24:8:30), R^ = 0,38 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5). Vaihe 24.3: 1.08 g (2,5 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(r),3-dihydrok-si-propyyli), 1,13 ml (2,75 mmoolia) Ala-D-Gla{(OtBu)2}-NH2:a 30 ja 0,80 g (3,25 mmoolia) EEDQ:ta liuotetaan seokseen, jossa on 4,5 ml dimetyyliformamidia ja 1,5 ml kloroformia ja annetaan seistä 22 tuntia typpiatmosfäärissä huoneen lämpötilassa. Reaktioliuos haihdutetaan kuivaksi. Jäännös kromatografoidaan 60-kertaisessa määrässä piihappogeeliä (60, Merck, 35 raekoko: 0,063-0,200 mm (70-230 mesh ASTM)) järjestelmässä kloroformi:metanoli = 95:5 (50 ml fraktiot). Tuotteen sisältävät fraktio kerätään. Helposti haihtuvien osien haihdutta- 49 83524 misen jälkeen jäljelle jää palmitoyyli-Cys(2(R),3-dihydrok-si-propyyli)-Ala-D-Gla{(OtBu)2}~NH2 värittömän öljyn muodossa, joka seistessä kylmässä kiteytyy sikeröinä, (a) 1° -30° (c = 1,004; kloroformi), = 0,42 (kloroformirmetanlli = 5 9:1), R^ = 0,88 (kloroformi:metanoli:vesi:etikkahappo = 55:47:13:5).

Vaihe 24.4: 1,42 g (1,80 mmoolia) palmitoyyli-Cys(2(R),3-dihydrok-si-propyyli)-Ala-D-Gla{(OtBu)2}~NH2:a liuotetaan 12 ml:aan 10 abs. pyridiiniä ja siihen sekoitetaan typpiatmosfäärissä ja sulkemalla kosteus pois 1,28 ml (5,4 mmoolia) lauriinihap-pokloridia 3 ml:ssa kloroformia. Happokloridi lisätään ti-poittain siten, että lämpötila ei kohoa yli 20°:en. Annetaan seistä 24 tuntia, minkä jälkeen reaktioliuokseen lisätään 15 3 ml metanolia ja haihdutetaan 30 minuutin kuluttua kuivak si. Hartsimainen jäännös, joka muodostuu kahdesta pääkompo-nentista (mono- ja dilauroyyli-yhdisteestä) alistetaan 200 g:ssa piihappogeeliä (60, Merck, raekoko 0,040-0,063 mm (230-400 mesh ASTM)) ensin kloroformin ja sitten kloroformi-me-20 tanoliseosten (99:1 - 97:3) kanssa pikakromatografiaan (flash-chromatographie) (W.Clark Still et ai., J.Org.Chem. £3, 2923 (1978), 17 ml fraktiot, 0,4 baaria). Yhdistetyistä fraktiois- - ta 17-190 saadaan palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-

*. .* 2 Q

propyyli)-Ala-D-Gla{(OtBu)2}-NH2 värittömänä öljynä, (a)D 25 -16° (c = 0,762; kloroformi), R^ = 0,42 (kloroformi^etano li = 9:1), R^ = 0,93 (kloroformirmetanoli:vesi = 70:30:5), R^ = 0,84 (n-butanoli:etikkahappo:vesi = 75:7,5:21).

Yhdistetyistä fraktioista 215-262 saadaan palmitoyyli-Cys (2(r)-hydroksi-2-lauroyylioksi-propyyli)-Ala-Gla{ (OtBu)^^ ~ 30 (a) = ”23° (c = 0,864, kloroformi), R^ = 0,32 (kloro formi :metanoli = 9:1), Rf = 0,84 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5).

Esimerkki 25:

Palmitoyyli-Cys(2(R]-hydroksi-3-lauroyylioksi-propyy-; 35 li)-Ala-D-Glai(OtBu)2}~NH2:sta saadaan esimerkin 1 a) mukai sesti trifluorietikkahapon kanssa metyleenikloridissä palmitoyyli-Cys (2(r)-hydroksi-3-lauroyylioksi-propyyli)-Ala-D- so 83524

Gla-NH2; Rf = 0,30 (kloroformi:metanoli:vesi = 70:30:5), = 0,42 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyridiini:etikka-happo:vesi = 42:21:21:6:10), (a)^ = -22° (c = 0,318; dime- tyylisulfoksidi) .

5 Esimerkki 26:

Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu(OtBu)-OtBu:sta saadaan esimerkin 1 a) mukaisesti palmitoyyli-Cys (2 (r) ,3-dilauroyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu; sp. 93-94° (hierretään sykloheksaani:etyylimetyyliketonin = 9:1 10 kanssa), --- -7,1° (c = 0,577; DMF) , (a)^° = -9,4° (c = 0,448; CHCl^:MeOH = 1:1), Rf = 0,54 (CHC13:MeOH:H20 = 70:30: 5), Rf = 0,86 (CH2C12:Me0H:H20 = 5:5:1).

Lähtömateriaali valmistetaan seuraavasti:

Vaihe 26.1: 15 Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli):sta ja Abu-D-Glu(OtBu)-OtBu x HCl:stä saadaan esimerkin 1 b) mukaisesti lisättäessä 4-dimetyyliamino-pyridiiniä palmitoyy-li-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu(OtBu)-OtBu; sp. 44-45° (CHCl^:MeOH = 7:3:sta), (u)j?° = -2,9° (c 20 = 0,381 ; DMF), (a)p = -7,1° (c = 0,325; CHCl^MeOH = 1:1),

Rf = 0,46 (CH2Cl2:MeOH = 95:5), Rf = 0,10 (CHC13), Rf = 0,91 (etikkahappoetyyliesteri).

Esimerkki 27:

Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-D-Ala-25 Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:sta saadaan esimerkin 1 a) mukaisesti palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-D-Ala-Ala-D-G1u-NH2; sp. 173-174° (asetonitriilistä), (a)^ = -6,4° (c = 1,018; DMF), (a)= -6,8° (c = 0,989; CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,67 (CHC13:Me0H:H20 = 70:30:5), Rf = 0,40 (CECl^: 30 MeOH = 4:1).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Vaihe 27.1:

Palmitoyyli-Cys(2(r) ,3-dihydroksi-propyyli):stä ja D-Ala-Ala-D-Glu (OtBu)-Nfl2 x IICl:stä saadaan vaiheen 5.3 mukai-35 sost.1 pa 1 miloyy 11-Cys (2 (R) , 3-d ihydroksi-propyyl i) -D-Ala-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2; sp. 209-210° (etikkahappoetyyliesteristä).

(a)2° = +o 12° (c = 0,655; DMF), (a)£° = -7,8° (c = 0,934; si 83524 CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,77 (CHCl3:MeOH:H20 = 70:30:5),

Rf = 0,82 (CHC13:MeOH = 7:3).

Vaihe 27.2:

Palmitoyyli-Cys(2(r),3-dihydroksi-propyyli)-D-Ala-Ala-5 D-Glu(OtBu)-NH2:sta saadaan vaiheen 5.4 mukaisesti palmito-yyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-D-Ala-Ala-D-Glu.(OtBu)-NH2; sp. 147-148° (asetonista), (α)ρ^ = -5,3° (c - 1 ,079; DMF) , (a)p0 = -7,8° (c = 1,128; CHCl^MeOH = 1:1), = 0,42 (CHCl3:MeOH = 9:1), R^ = 0,51 (etikkahappoetyyli-10 esteri).

Esimerkki 28:

Palmitoyyli-Cys(2(R,s) ,3-dilauroyylioksi-propyyli) :stä ja Abu-D-Gly(OMe)-OMe x HCl:stä saadaan esimerkin 1 b) mukaisesti lisättäessä N-metyyli-morfoliiniä palmitoyyli-15 Cys(2(R,s),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu(OMe)-OMe; sp. 89-91° (asetonitriilistä), (a)p° = -1,8° (c = 0,569; DMF), (a)p° = -9,5° (c = 0,474; CHCl3:MeOH = 1:1), Rf = 0,34 (CHC13:etikkahappoetyyliesteri = 7:3), R^ = 0,95 (CHCl3:MeOH = 9:1) .

20 Esimerkki 29: 1,01 g:aan (0,001 moolia) palmitoyyli-Cys(2(r),3-di-lauroyylioksi-propyyli)-Abu-D-Glu:a 30 ml:ssa absoluuttista metanolia lisätään sekoittaen ja jäällä jäähdyttäen eetteri-nen diatsometaaniliuos, kunnes keltainen väri pysyy. Seos 25 jätetään vielä 30 minuutiksi jäähauteeseen ja ylimääräinen diatsometaani hajotetaan lisäämällä sitten muutamia pisaroita jääetikkaa. Haihdutetaan tyhjössä, minkä jälkeen näin saatu raaka dimetyyliesteri kiteytetään uudelleen kaksi kertaa asetonitriilistä. Saadaan palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyy-30 lioksi-propyyli)-Abu-D-Glu(OMe)-OMe värittömien kiteiden muo dossa; R^ = 0,34 (CHC13:etikkahappoetyyliesteri = 7:3), R^ = 0,95 (CHCl3:MeOH = 9:1).

Esimerkki 30:

Palmitoyyli-Cys(2(R,S),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-35 D-Glu(Lys(Boc)-D-Ala—OtBu)—OtBu:sta ja trifluorietikkahapos-ta metyleenikloridissa saadaan esimerkin 1 a) mukaisesti palmitoyyli—Cys(2(R,S),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D- 52 8 3 5 2 4

Glu (Lys-D-Ala) -OH; (°0q^ = “14° (c = 0,163; dikloorimetaani: etanoli = 1:1), R^ = 0,15 (kloroformi:metanoli:vesi = 70: 30:5), = 0,16 (etikkahappoetyyliesteri:n-butanoli:pyri- diini:etikkahappo:vesi = 42:21:21:6:10), R^ = 0,58 (kloro-5 formi:metanoli: vesi:etikkahappo = 55:47:13:5).

Lähtömateriaali saadaan seuraavasti:

Vaihe 30.1:

Palmitoyyli-Cys(2(r,s),3-dilauroyylioksi-propyyli):stä ja Ala-D-Glu(Lys(Boc)-D-Ala-OtBul-OtBu:sta saadaan esimer-10 kin 1 b) mukaisesti palmitoyyli-Cys(2 R,S ,3-dilauroyyliok-si-propyyli)-Ala-D-GluiLys (Boc)-D-Ala-OtBu }-0tBu; (°0q^ = -14° (c = 1,9? dikloorimetaani), R^ = 0,94 (kloroformi:me-tanoli:vesi = 70:30:5), R^ = 0,28 (kloroformi:dimetoksietaa-ni = 4:1).

15 Esimerkki 31: 615 mg (1 mmooli) palmitoyyli-Cys-Ala-D-Glu(OtBu):a, 645 mg (1,1 moolia) 1 -tosyyl :i-2,3-didodekanoyy.l i-D-Glyserii-niä ja 1,4 g kuivaa kaliumkarbonaattia kuumennetaan 30 ml: ssa absoluuttista asetonitriiliä typpiatmosfäärissä 15 tun-20 nin ajan 75°:seen. Seos haihdutetaan, otetaan metyleeniklo-ridiin ja ravistetaan useita kertoja vedellä, jolloin saadaan orgaanisessa faasissa oleva reaktioseos, joka kuivataan Na2SO^:llä, suodatetaan ja haihdutetaan, minkä jälkeen se puhdistetaan piihappogeelin avulla CHCl^-EtOH:11a (9:1) kro-25 matografisesti, minkä jälkeen saadaan esimerkissä 1 b) esi tetty palmitoyyli-Cys(2(r),3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2· Lähtömateriaali, palmitoyyli-Cys-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2 saadaan tunnetulla tavalla palmitoyyli-Cys(tri-tyyli)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:sta käsittelemällä elohopea(II)-30 kloridilla et ikkahapossa (J.Am.Chem.Soc. 8J7, 4922 (1965); J.Org.Chem. 3J3, 4148 (1970)) ja lohkaisemalla tämän jälkeen elohopeamerkaptidi l^S^lä. Yhdiste käytetään raakana edelleen reaktioon glyseriinitosylaatin kanssa.

1-tosyyli-2,3-didodekanoyyli-D-glyseriini saadaan tun-35 netulla tavalla 1,2-isopropylideeni-glyseriinistä ja to-syylikloridistä pyridiinissä, minkä jälkeen saippuoidaan 80 %:sella etikkahapolla 1-tosyyli-D-glyseriiniksi, joka asy-

Claims (6)

53 8 3 5 2 4 loidaan tunnetulla tavalla dodekaanihappokloridiksi. Yhdiste muodostaa siirapin, joka kiteytyy jäähauteessa, mutta sulaa kuitenkin nopeasti jälleen yli 0°:ssa.

1. Menetelmä farmakologisesti vaikuttavan N-[N-alkano-yyli-S-(2,3-dialkanoyylioksi-propyyli)kysteinyyli]-peptidin valmistamiseksi, jolla on kaava I R1-C0-0-CH„ a 1 Rb -CO-O-CH ch2 co-z2 * . R ' ' 3 S CH-Z ** = R tai S * * *** = R ch2 ch2 9 ^ * ° i '*** i R CO-NH-CH-CO-(As) -As -NH-CH—CO-Z1 n jossa R3^ ja tarkoittavat kumpikin 7-21 C-atomia sisältävää alkyylitähdettä, R2 tarkoittaa 7-21 C-atomia sisältävää alkyylitähdettä, n = 0 tai 1, As° on kaavan -NH-Kw-CO-mukainen tähde, jossa Kw tarkoittaa alkylideenitähdettä, jossa on korkeintaan 6 C-atomia, As1 on L-alaniini-, L-a-amino-voihappo-, L-valiini-, N-metyyli-L-alaniini- tai L-seriini-tähde, z1 on amino tai hydroksi, Z2 on amino, hydroksi, L-alanyyli, L-lysyyli-L-lysiini, glysyyli-tauriini, L-arginyy-li tai L-lysyyli-D-alaniini ja Z3 tarkoittaa vetyä tai kar-boksia, tai tällaisen yhdisteen, jossa on vähintään yksi kar-boksyyliryhmä, alempialkyyliesterin valmistamiseksi, jolloin merkeillä *, ** tai vastaavasti *** merkityillä asymmetria-keskuksilla on esitetyt absoluuttiset konfiguraatiot, ja konfiguraatio ryhmän Z3 sisältävässä asymmetrisessä C-atomis-sa voi olla R tai S, tai vastaavan diastereomeeriseoksen tai tällaisen, vähintään yhden suolanmuodostavan ryhmän sisältä- 54 83524 vän yhdisteen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kaavan I mukainen yhdiste, jossa ainakin yksi tähteistä R-’-g-CO-, R-^-CO- ja R2-CO- tarkoittaa vetyä ja muut substituentit tarkoittavat samaa kuin edellä, edellyttäen, että tässä lähtöaineessa esiintyvät vapaat funktionaaliset ryhmät lukuunottamatta reaktioon osallistuvaa hydroksi- ja/ tai aminoryhmää (-ryhmiä) esiintyvät tarvittaessa suojatussa muodossa, tai sen suola asyloidaan hapolla R^-g-COOH, R1}-,-COOH tai vastaavasti R2-COOH tai sen reaktiokykyisellä kar-boksyylihappojohdannaisella ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, tai b) kaavan Ha mukainen karboksyylihappo R^CO-O-CH., * « R a , 2 1 ** « Il tai s R^-CO-O-CH CHo I 1 (Ha) S CH-I 2 R2-CO-HN-CH-CO-[ (Aee)n-Asl-]qOH jossa kaavassa q on 0 tai 1 ja muut symbolit ja tähteet tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin, kun As1 tarkoittaa L-seriinitähdettä, seriinitähteessä esiintyvä hydroksiryhmä on tarvittaessa suojattu helposti lohkaistavalla hydroksisuoja-ryhmällä, tai sen reaktiokykyinen karboksyylihappojohdannai-nen saatetaan reagoimaan kaavan Hb mukaisen amiinin kanssa 2 CO~Z *** m R CH-Z3 ' (Hb) I 2 H[ - (As°)^-Ae 1^,-NH--CH—CO-Z1 jossa kaavassa r on 1, kun kaavan Ila mukaisessa reaktiopart- 55 83524 nerissa q on 0, ja jossa r on 0, kun q on 1, ja jossa muut symbolit tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin vapaat kar-boksyyliryhmät -COZ1, -COZ2 ja Z3 ja tähteessä Z2 mahdollisesti esiintyvät vapaat amino- ja karboksyyliryhmät on suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, tai c) kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi, jossa Z2:lla on edellämainitut merkitykset lukuunottamatta hydrok-sia, kaavan lie mukainen karboksyylihappo R^CO-O-CH * - R a l 2 1 ** ** - R tai S R -CO-O-CH ° I *** = R CH, CO-OH ' '3 S CH-ZJ I I (Ile) CH, CH I 2 I 1 2 * 1 *** 1 R -C0-HN-CH-C0-(As°) -As -NH-CH—CO-Z D jossa symbolit ja tähteet tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin vapaat karboksyyliryhmät -COZ1 ja Z3 on suojattu helposti lohkaistavilla karboksyylisuojaryhmillä, tai sen reaktiokykyinen karboksyylijohdannainen saatetaan reagoimaan kaavan Ild H-Z2 (Ild) mukaisen yhdisteen kanssa, jossa kaavassa Z2:lla on edellämainitut merkitykset lukuunottamatta hydroksia, jolloin siinä esiintyvät vapaat amino- ja karboksyyliryhmät, lukuunottamatta reaktioon osallistuvia aminoryhmiä, on suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, tai d) kaavan III mukainen yhdiste 56 83524 Ra“c°-°~^H2 ** *= R tai S R^-CO-O-CH (III) fH2 Y jossa R1a ja R1^ tarkoittavat samaa kuin edellä ja ϊ on nuk-leofuginen ryhmä, saatetaan reagoimaan kaavan IV mukaisen yhdisteen kanssa h co-z2 I I 3 S CH-ZJ * = R I I CH9 CH-, *** = R (IV) I 1 I l j k 1 *** 1 R -CO-HN-CH-CO—(As0) -As -NH-CH-CO-Z n jossa substituentit tarkoittavat samaa kuin edellä, jolloin vapaat funktionaaliset ryhmät, lukuunottamatta reaktioon osallistuvia merkaptoryhmiä, on tarvittaessa suojattu helposti lohkaistavilla suojaryhmillä, tai kaavan IV mukaisen yhdisteen reaktiokykyisen johdannaisen kanssa ja lohkaistaan esiintyvät, haluttuun kaavan I mukaiseen lopputuotteeseen kuulumattomat suojaryhmät, ja, haluttaessa jonkin menetelmävaihtoehdoista a) - d) suorittamisen jälkeen saadussa kaavan I mukaisessa yhdisteessä, jossa on ainakin yksi vapaa karboksyyliryhmä, vapaa(t) karboksyyli-ryhmä(t) esteröidään tai saatu kaavan I mukainen yhdiste, jossa on ainakin yksi suolanmuodostava ryhmä, muutetaan suolaksi tai saatu suola muutetaan vapaaksi yhdisteeksi, ja haluttaessa erotetaan saatu diastereomeeriseos.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että valmistetaan palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu(Gly-tauriini)-NH2:n farmaseuttisesti käyttökelpoinen suola.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että vai- 57 83524 mistetaan natriumsuola.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että palmitoyyli-Cys(2[R],3-di-lauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2 saatetaan reagoimaan glysyylitauriinin kanssa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineet valitaan niin, että valmistetaan palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2.

6. Patenttivaatimuksen l tai 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauro-yylioksi-propyyli) saatetaan reagoimaan Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:n kanssa palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyy-li)-Ala-D-Glu(OtBu)-NH2:ksi ja saatu tuote muutetaan trifluo-rietikkahapon avulla palmitoyyli-Cys(2[R],3-dilauroyylioksi-propyyli)-Ala-D-Glu-NH2iksi. Patentkrav;