FI83161C - Stabila plurilamellaera blaosor. - Google Patents

Description

1 83161

Stabiilit plurilamelliset rakkulat Tämä keksintö koskee liposomeja ja niiden käyttöä kantajina lääkkeen antosysteemeissä. Erikoisesti se koskee uutta lipidi-rakkulatyyppiä, jolla on ainutlaatuiset ominaisuudet, jotka antavat erikoisetuja kuten suuremman stabiilisuuden ja aineiden sulkemistehon.

Seuraavassa selostettavilla seoksilla ja menetelmillä on hyvin laaja käyttöalue kuten kantajasysteemeissä ja lääkkeiden anto-systeemeissä määrättyyn kohteeseen. Kyseessä olevan keksinnön j

toteutusta havainnollistetaan esimerkeillä bruselloosin hoidos- I

ta, okulaari-infektioiden hoidosta ja lymfosyyttisen meningitis- j viruksen aiheuttamien infektioiden hoidosta.

i i

Liposomit ;

Liposomit ovat täysin suljettuja kaksikerroksisia membraaneja, j jotka sisältävät suljetun vesipitoisen faasin. Liposomit voivat olla erilaisia unilamellisia rakkuloita (joissa on yksi j ainoa membraani-kaksoiskerros), tai multilamellisia rakkuloita ! (sipulinkaltaiset rakenteet, joille ovat ominaisia samankeskei-set membraani-kaksoiskalvot, joista kukin on seuraavasta kalvosta vesikerroksen erottama).

Alkuperäiset liposomivalmisteet, Bangham et ai (1965, J.Mol.Biol. 13:238-252), olivat orgaaniseen liuottimeen suspendoituja fosfo-lipidejä, joista liuotin haihdutettiin kuiviin ja jäljelle jäi vahamainen fosfolipidisakka reaktioastian pohjalle. Sen jälkeen lisättiin sopiva määrä vesifaasia, seoksen annettiin "paisua" ja tuloksena olevat liposomit, jotka olivat multilamellisia rakkuloita (niitä nimitetään tästä lähtien MLVrksi) disper-goitiin mekaanisin keinoin. Tuloksena olevan membraani-kaksoiskerroksen rakenne on sellainen, että hydrofobiset (ei-polaariset) lipidin "häntäpäät" suuntautuvat kaksoiskerroksen keskustaan päin kun taas hydrofiiliset (polaariset) "etupäät" suuntautuvat kohti vesifaasia. Tähän tekniikkaan perustui 2 83161 pienten ääniaalloilla käsiteltyjen unilamellisten rakkuloiden kehittäminen (niitä nimitetään tästä lähtien SUV:ksi); tästä on tehnyt selkoa Papahadjopoulos ja Miller (1967, Biochim. Biophys.Acta 135:524-638). Näillä "klassisilla liposomeilla" oli kuitenkin useita negatiivisia puolia, joista ei ollut vähin sisään suljetun vesitilan pieni volyymi lipidimoolia kohti ja rajallinen suurten makromolekyylien kapseloimismahdollisuus.

Ensimmäisiä yrityksiä suurentaa pidätetty volyymi oli inversien misellien tai liposomien esiasteiden muodostaminen, so. vesi-faasin sisältävät rakkulat, joita ympäröi lipidimolekyylien yksittäiskerros, niin että polaaristen päiden ryhmät ovat suuntautuneet kohti vesifaasia. Liposomiesiasteet muodostetaan lisäämällä sisäänsuljettava vesiliuos polaarisen lipidin liuokseen jossakin orgaanisessa liuottimessa ja käsittelemällä ääniaalloilla. Liposomin esiasteet sitten haihdutetaan lipidiylimäärän läsnäollessa. Tuloksena olevat liposomit, jotka muodostuvat lipidi-kaksoiskerroksen sisäänsä sulkemasta vesifaasista, dispergoidaan vesifaasiin (ks. US-patenttia 4 224 179, julkaistu 23 päivänä syyskuuta 1980, M.Schneider).

Eräässä toisessa yrityksessä tällaisen sulkeuman tehokkuuden maksimoimiseksi Papahadjopoulos (US-patentti 4 235 871, 25 päivältä marraskuuta 1980) selostaa "käänteisfaasin haihdutusmenetelmää" oligolamellisten lipidirakkuloiden valmistamiseksi, jotka tunnetaan myös käänteis-faasi haihdutusrakkuloina (niitä kutsutaan tästä lähtien REV:ksi). Tämän menetelmän mukaan suljettava vesimateriaali lisätään polaarisen lipidin seokseen orgaanisessa liuottimessa. Sen jälkeen muodostetaan homogeeninen vettä-öljyssätyvppinen emulsio ja orgaaninen liuotin haihdutetaan, kunnes muodostuu geeli. Geeli muutetaan sitten suspensioksi dispergoimalla geelimäinen seos vesipitoiseen väliaineeseen. Saadut REV:t muodostuvat etupäässä unilamellisista rakkuloista ja joistakin oligolamellisista rakkuloista, joille on tunnusomaista vain harvat samankeskeiset kaksoiskerrokset ja suuri sisäinen vettä sisältävä tila. Jotkut REV:n permeabiliteetti- 3 831 61 ominaisuudet ilmoitetaan samanlaisiksi kuin MLV:n ja SUV:n (ks. Szoka ja Papahadjopoulos, 1978, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75:4194-4198).

Liposomeja, joihin voidaan sulkea suuri joukko yhdisteitä, voidaan siis valmistaa, mutta liposomien stabiilisuus varastoinnin aikana on aina rajoitettua. Tästä stabilisuuden menetyksestä on seurauksena suljetun yhdisteen vuotaminen liposomeista ympäröivään väliaineeseen ja seurauksena voi olla myös liposomin sisällön kontaminoituminen ympäröivässä väliaineessa olevien materiaalien päästessä itse liposomin sisään. Tästä on seurauksena traditionaalisten liposomien hyvin lyhyt varastointiaika. Stabiilisuutta on yritetty parantaa lisäämällä liposomin membraa-niin joitakin aineita (joita tullaan tästä lähtien kutsumaan "stabiloiviksi aineiksi"), jotka vaikuttavat lipidi-kaksois-kerrosten fysikaalisiin ominaisuuksiin (esimerkiksi steroidi-ryhmiä) . Monet näistä yhdisteistä ovat kuitenkin suhteellisen kalliita ja tällaisten liposomien valmistaminen ei ole kannattavaa .

Traditionaalisten liposomien varastointipulmien lisäksi on useita yhdisteitä, joita ei voida tuoda näihin rakkuloihin. MLV:tä voidaan valmistaa vain olosuhteissa, jotka ovat lipidinembraanin faasi-transitiolänpötilan yläpuolella.

Tämä sulkee pois kuumalabiilien molekyylien tuomisen liposomei-hin, jotka muodostuvat fosfolipideistä, joilla on haluttuja ominaisuuksia, mutta joissa on pitkiä ja hyvin tyydytettyjä sivu-ketjuja.

Liposomien käyttö

Liposomien käyttämistä terapeuttisiin tarkoituksiin on selostettu: Liposomit: From Physical Structures To Therapeutic Applications, Knight, toim. Elsevier, North-Holland Biomedical Press, 1981. On kirjoitettu paljon mahdollisuuksista käyttää näitä membraanirakkuloita lääkkeen antosysteemeissä, vaikka useita pulmakysymyksiä on vielä olemassa tällaisissa systeemeissä.

Ks. esimerkiksi selostuksia US-patentissa 3 993 754, julkaistu 4 83161 23 päivänä marraskuuta 1976, Yneh-Erh Rahman ja Elisabeth A.Cerny, ja US-patentissa 4 145 410, julkaistu 20 päivänä maaliskuuta 1979, Barry D. Sears. Liposomin lääkkeen antosysteemissä suljetaan lääke liposomin muodostamisen aikana ja annetaan sen jälkeen hoidettavalle potilaalle. Lääke voi olla vesiliukoinen tai liueta ei-polaariseen liuottimeen. Tyypillisiä tällaisia selostuksia on löydettävissä US-patentissa 4 235 871, 25 päivältä marraskuuta 1980, Papahadjopoulos ja Szoka, sekä US-patentissa 4 224 179, 23 päivältä syyskuuta 1980, M. Schneider.

Lääkkeen antosysteemille sopivia haluttuja ominaisuuksia ovat lääkkeen nopean ulosvuotamisen estokyky yhdessä lääkkeen viivytetyn vapautumisen kanssa, mikä pidentää lääkkeen vaikutusta.

Tämä lisää lääkkeen tehoa ja sallii harvemmat lääkkeen anto-kerrat. Liposomivalmisteiden in vivo-käyttöön liittyviä pulma-kysymyksiä ovat seuraavat; 1) liposomiin suljetut materiaalit vuotavat ulos, kun liposomeja inkuboidaan ruumiin nesteissä.

Tämän katsotaan johtuvan plasman suuren tiheyden omaavien lipo-proteiinien (HDL) aiheuttamasta liposomaalisten fosfolipidien lohkaisusta, tai fosfolipaasien aiheuttamasta liposomimembraanin degradaatiosta, muiden syiden ohella. Liposomien degradaation tuloksena in vivo on se, että lähes koko liposomien sisältö vapautuu lyhyessä ajassa, lääkkeen viivytetty vapautuminen ja lääkkeen ulospääsemisen estyminen jäävät siten saavuttamatta.

2) Toisaalta, jos käytetään hyvin stabiilia liposomia in vivo (so. liposomeja, jotka eivät vuoda kun niitä inkuboidaan ruumiin nesteissä), liposomien sisältö ei vapaudu silloin kun tarvittaisiin. Sen vuoksi ovat nämä stabiilit liposomit tehottomia terapeuttisten aineiden kantajina in vivo, koska viivytettyä lääkkeen vapautumista eli liposomien sisällön vapautumista, kun sitä tarvitaan, ei tapahdu. Kuitenkin silloin kun hoidetaan intrasellulaarista infektiota, on biologisten nesteiden stabili-suuden ylläpitäminen siihen pisteeseen saakka kun liposomi on tullut infektoidun solun sisään, kriittisen tärkeätä. 3) Anto-systeemeissä käytettyjen liposomikantajien edullisuus kustannuksiin nähden. Esimerkkinä mainittakoon parannettu menetelmä leismanialisten infektioiden kemoterapiassa käyttämällä liposomiin 5 83161 kapseloitua anti-leismanialista lääkettä, joka menetelmä on selostettu US-patentissa 4 186 183 Steck ja Alving, julkaistu 29 päivänä tammikuuta 1980. Kemoterapiassa käytetyt liposomit sisälsivät useita stabilisaattoreita, jotka lisäsivät liposomien stabilisuutta in vivo. Kuitenkin, kuten edellä on mainittu nämä stabilisaattorit ovat kalliita ja näitä stabilisaattoreita sisältävien liposomien valmistaminen ei ole edullista. 4) Lopuksi probleema, joka tulee vastaan liposomien käytössä kantajina lääkkeiden antosysteemeissä, on kykenemättömyys saada aikaan paranemista taudissa, jota hoidetaan. Paitsi kykenemättömyys estää nopeata lääkkeen ulosvuotamista niin, että lääke vapautuisi viivytetysti, ovat useat muutkin selitykset mahdollisia sille seikalle, ettei tauteja voida parantaa. Esimerkiksi, jos liposomit saadaan sisään kohdesoluihin tai fagosyyttisoluihin (so. retikuloendoteliaalisoluihin), ne poistuvat nopeasti systeemistä tehden suljetun lääkkeen hyvin tehottomaksi muiden kuin RES-solujen sairauksien suhteen. Fagosytoosin jälkeen liposomien sisällöt menevät sisään fagosyyttisolujen lysosomeihin. Hyvin usein lysosomin sisällä olevat degradoivat entsyymit degradoi-vat sisään suljetun yhdisteen tai tekevät yhdisteen inaktiiviseksi muuttamalla sen rakennetta tai lohkaisemalla yhdisteen sen aktiivisesta kohdasta. Lisäksi saattaa olla, että liposomit eivät luovuta annosta, joka olisi kyllin tehokas johtuen aktiivisen yhdisteen alhaisesta sulkemistehokkuudesta rakkuloihin valmistuksen aikana.

Liposomeja ovat tutkijat käyttäneet myös mallimembraanisystee-meinä ja "kohdesoluna" komplementin välittämissä immunokokeissa. Näissä kokeissa käytettyinä on kuitenkin tärkeätä, että liposomi-membraani ei vuoda, kun sitä inkuboidaan seerumissa, koska nämä kokeet mittaavat liposomin sisällön vapautumista seerumikomple-mentin aktivoitumisen funktiona immunikompleksin muodostumisen kautta, joihin kuuluu joitakin immunoglobuliiniluokkia (esimerkiksi IgM-ja jotkut IgG-molekyylit).

Tänä keksintö esittelee uuden ja olennaisesti parannetun lipidirakkuloiden tyypin, joita tästä lähtien tullaan nimittämään 83161 e stabiileiksi plurilamellisiksi rakkuloiksi (SPLV). Paitsi että ne ovat rakenteeltaan erilaisia kuin multilamelliset rakkulat (MLV), SPLV-rakkulat myös valmistetaan eri lailla kuin MLV:t, niillä on ainutlaatuisia ominaisuuksia verrattuna MLV-rakkuloihin ja niillä on useita etuja verrattuna MLV:n vastaaviin ominaisuuksiin. Näistä eroavaisuuksista johtuen SPLV:n ansiosta voidaan voittaa useita probleemeja, joita esiintyy aikaisemmin saatavissa olevien konventionaalisten lipidirakkuloiden yhteydessä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

Kun SPLV-rakkuloita syntetisoidaan, muodostuu heterogeeninen lipidirakkuloiden seos. On ilmeistä, että lipidit SPLV:ssa ovat järjestyneet aivan uudeksi supramolekulaariseksi rakenteeksi. Useissa lipidirakkuloissa on hyvin suuri lukumäärä kaksoiskerroksia, toisinaan jopa niin suuri lukumäärä kuin sata kerrosta. Saattaa olla mahdollista, että tämä korkea kerroslukuaste osaltaan vaikuttaa useihin SPLV:n yllättäviin ominaisuuksiin, vaikka selitykset ovat pelkästään teoreettisia.

SPLV:llä on seuraavia ominaisuuksia: 1) SPLV:n huomattavasti lisääntynyt stabiilisuus puskurissa säilytyksen aikana; 2) SPLV:n parempi kyky kestää kovia fysiologisia ympäristöjä; 3) materiaalien kapseloiminen erittäin tehokkaassa määrässä; 4) kyky kiinnittyä kudoksiin ja soluihin pitkiksi ajanjaksoiksi; 5) kyky vapauttaa suljetut materiaalit viivytetystä ruumiin nesteisiin; 6) liposomaali-sisällön tuominen ja lopuksi dispergoiminen kohdesolun sytosoliin kauttaaltaan; 7) valmistuksen edulliset kustannukset; ja 8) yhdisteiden vapautuminen biaktiivisissa muodoissaan in vivo.

SPLV:ien ainutlaatuisten ominaisuuksien ansiosta ne ovat erikoisen käyttökelpoisia kantajina antosysteemeissä in vivo, koska ne estävät lääkkeen poisvuotamista ja pystyvät vapauttamaan lääkkeen viivytetysti. Seuraavassa selostetaan menetelmiä SPLV:n käyttämiseksi bioaktiivisten yhdisteiden antamiseksi in vivo ja patologioiden, kuten infektioiden hoitoon.

7 83161

Kuvioiden selitys

Kuvio 1 esittää graafisesti membraanin stabilisuuden eroa (mikä käy ilmi vuotoprosentista) MLV:n ja SPLVrn välillä, joita käsitellään eri suuruisilla urean konsentraatioilla.

Kuvio 2 esittää graafisesti SPLV:n lipidi- ja vesifaasien pidätyskykyä silmäluomen kudoksissa hiirellä ja gentamysiinin viivytettyä vapautumista SPLV:stä in vivo.

Kuvio 3 esittää SPLVrn elektroni-spin-resonanssi-absorptio-spektriä A) verrattuna MLV:n vastaavaan.

Kuvio 4 esittää graafisesti askorbaatin erilaista kykyä pelkistää doksyyli-spin-näytteitä SPLVrssä ja MLVrssä.

Kuvio 5 esittää graafisesti kaksivaiheisen hoidon tehokkuutta hiirellä oleviin Brucella canis-infektioihin käyttämällä SPLVrin suljettua streptomysiiniä, joka infektio perustuu infektoituneiden hiirien pernasta saatavaan B.canikseen.

Kuvio 6 esittää graafisesti kaksivaiheisen hoidon tehokkuutta hiirellä oleviin B.canis-infektioihin käyttämällä SPLVrhen suljettua streptomysiiniä, joka infektio perustuu infektoituneiden hiirien elimistä saatavaan B.canikseen.

Kuvio 7 esittää graafisesti kaksivaiheisen hoidon tehokkuutta marsuilla oleviin Brucella abortus-infektioihin käyttämällä SPLVrn suljettua streptomysiiniä.

SPLVrden valmistus SPLVrtä valmistetaan menetelmän avulla, jolla saadaan tuotetta, joka on ainutlaatuista mihin muuhun tahansa edellä selostettuun liposomiin nähden.

SPLVrt ovat lipidirakkuloita, joissa on muutamasta harvasta yli sataan lipidi-kaksoiskerrosta. Membraanin kaksoiskerros muodostuu bimolekulaarisesta, amfipaattista lipidiä olevasta kerroksesta, jossa ei-polaariset hydrofobiset hiilivety-"häntä-päät" osoittavat sisäänpäin kohti kaksoiskerroksen keskusta ja polaariset, hydrofiiliset "etupäät" osoittavat kohti vesi-faasia. Kaksoiskerrosten sisäänsä sulkemana on vesilokero, jonka osa muodostaa rakkulan ontelon ja jonka yksi osa on viereisten kerrosten välissä. Lipidikerrosten kanssa kompleksoitu- 8 83161 neena voi olla useita proteiineja, glykoproteiineja, glykoli-pidejä, mukopolysakkarideja ja mitä muuta hydrofobista ja/tai amfipaattista ainetta tahansa.

SPLV:tä valmistetaan seuraavasti: amfipaattinen lipidi tai lipidien seos liuotetaan orgaaniseen liuottimeen. Monet orgaaniset liuottimet ovat sopivia, mutta parhaina pidetään dietyyli-eetteriä,fluorattuja hiilivetyjä ja fluorattujen hiilivetyjen ja eetterin seoksia. Tähän liuokseen lisätään vesifaasi ja aktiivinen, suljettava aineosa. Tämä bifaasinen seos konvertoidaan SPLViksi emulgoimalla vesimateriaali liuottimen kanssa ja haihduttamalla liuotin. Haihdutus voidaan suorittaa ääniaalloilla käsittelyn aikana tai sen jälkeen millä haihdutus-tekniikalla hyvänsä, esimerkiksi panemalla inertti kaasu virtaamaan seoksen yli, kuumentamalla tai vakuumissa. Käytetyn liuottimen volyymin tulee olla riittävästi suurempi kuin vesimäärä, niin että vesipitoinen materiaali voidaan täydelleen emulgoida seokseen. Käytännössä voidaan karkeasti käyttää ainakin noin 3 volyymiä+1 volyymiä kohti vesifaasia. Todellisuudessa voi liuottimen ja vesifaasin suhde vaihdella jopa 100 volyymiin tai useampaan volyymiin 1 volyymiä kohti vesifaasia. Lipidin määrän tulee olla riittävä, niin että se ylittää sen määrän, joka on tarpeen emulsiopisaroiden päällystämiseen (noin 40 mg lipidiä per ml vesifaasia) , Yläraja on vain käytännöllisistä kustannussyistä, mutta SPLV:tä voidaan tehdä käyttäen 15 g lipidiä per 1 ml vesifaasia.

Menetelmässä valmistetaan lipidirakkuloita, joissa on erilainen supermolekulaarinen järjestelmä kuin konventionaalisissa lipo-someissa. Kyseessä olevan keksinnön mukaan voidaan koko menetelmä suorittaa lämpötilavälillä 4-60°C huolimatta siitä, mikä on käytetyn lipidin faasin transitiolämpötila. Tämän jälkimmäisen seikan etu on siinä, että kuumalabiileja aineita, joilla on haluttuja ominaisuuksia,esimerkiksi helposti denaturoituvia proteiineja, voidaan tuoda SPLV:hen, jotka on valmistettu fosfolipidistä kuten distearyylifosfatidyylikoliinista, mutta joita voidaan muuttaa konventionaalisiksi liposomeiksi 9 83161 ainoastaan niiden faasin transitiolämpötilan yläpuolella. Menetelmä mahdollistaa tavallisesti yli 20 % käytettävissä olevasta vesiliukoisesta materiaalista kapseloitavaksi ja yli 40 % käytettävissä olevasta lipidi-liukoisesta materiaalista kapseloitavaksi. MLV:den avulla ei vesifaasin sulkeminen tavallisesti ylitä 10 %.

Useimmat amfipaattiset lipidit voivat olla SPLV:den aineksena. Sopivia hydrofiilisiä ryhmiä ovat, mutta eivät rajoitu niihin: fosfaatti-, karboksyyli,- sulfaatti- ja aminoryhmä. Sopivia hydrofobisia ryhmiä ovat, mutta eivät rajoitu niihin: tyydytetyt ja tyydyttämättömät alifaattiset hiilivetyryhmät ja alifaat-tiset hiilivetyryhmät, joissa on substituentteina ainakin yksi aromaattinen ja/tai sykloalifaattinen ryhmä. Parhaina pidettyjä amfipaattisia yhdisteitä ovat fosfolipidit ja läheistä sukua olevat kemialliset rakenteet. Esimerkkejä näistä ovat, mutta eivät rajoitu niihin: lesitiini, fosfatidyylietanoliamiini, lysolesitiini, lysofatidyylietanoliamiini, fosfatidyyliseriini, fosfatidyyli-inositoli, sfingomyeliini, kardiolipiini, fosfatidii-nihappo ja serebrosidit. Spesifisiä esimerkkejä sopivista lipideistä ovat SPLV:den valmistuksessa fosfolipidit, joita ovat luonnon lesitiinit (esimerkiksi munalesitiini tai soijapapu-lesitiini) ja synteettiset lesitiinit kuten tyydytetyt synteettiset lesitiinit (esimerkiksi dimyristyylifosfatidyylikoliini tai dipalmityyli-fosfatidyylikoliini tai distearyyli-fosfatidyy-likoliini) ja tyydyttämättömät synteettiset lesitiinit (esimerkiksi diolyyli-fosfatidyylikoliini tai dilinolyyli-fosfatidyyli-koliini). SPLV-kaksoiskerrokset voivat sisältää steroidikom-ponentin kuten: kolesteroli, koprostanoli, kolestanoli, koles-taani ym. Kun käytetään yhdisteitä joissa on hydrofiilisiä happamia ryhmiä (fosfaatti-, sulfaatti- jne.) on saatu SPLV anioninen; emäksisten ryhmien kanssa kuten amino, saadaan kationisia liposomeja; ja polyetyleenioksi- tai glykoliryhmien kanssa neutraaleja liposomeja. SPLV:den koko vaihtelee suuresti. Kokorajat ulottuvat noin 500 nm:stä noin 10 000 nm:iin (10 ^um) ja tavallisesti noin 1000 nm:stä noin 4000 nm:iin.

10 83161 Käytännöllisesti katsoen voidaan mitä tahansa bioaktiivista yhdistettä sulkea SPLV:den sisään (sulkeminen määritellään tarkemmin sulkemiseksi vesilokeron sisään tai membraani-kaksoiskerroksen sisään). Tällaisia yhdisteitä ovat, mutta eivät rajoitu niihin: nukleiinihapot, polynukleotidit, bakteereja, viruksia, sieniä, parasiitteja hävittävät aineet, tuumorin kehittymistä ehkäisevät aineet, proteiinit, toksiinit, entsyymit, hormonit, neurotransmitterit, glykoproteiinit, immunoglobuliinit, immunomodulaattorit, väriaineet, radioaktiiviset merkkiaineet, radioaaltoja läpäisemättämät aineet, fluoresoivat aineet, polysakkaridit, solun reseptoreja sitovat molekyylit, tulehduksia ehkäisevät aineet, glaukoomia hoitavat aineet, mydriaattiset yhdisteet, paikallispuudutusaineet jne.

Seuraavassa on esimerkki määräsuhteista, joita voidaan käyttää SPLV-synteesissä: SPLVstä voidaan valmistaa lisäämällä 50 mmol fosfolipidiä 5 ml:aan dietyylieetteriä, joka sisältää 5 ^ug BHT:tä (butyylihydroksitolueeniä) ja lisäämällä sitten 0,3 ml vesifaasia, joka sisältää aktiivisen, kapseloitavan aineen.

Saatava liuos, joka sisältää suljettavan materiaalin ja sulkemisessa käytettävän lipidin, käsitellään ääniaalloilla antamalla samalla inertin kaasun virrata seoksen yli ja poistamalla täten suurimman osan liuotinta. Tämän toteutusmuodon avulla saadaan erikoisen stabiileja SPLV:tä osittain sen vuoksi, että BHT:tä lisätään rakkuloihin.

Ks. myös Lenk et ai., 1982, Eur.J.Biochem. 121:475-482, jossa tehdään selkoa menetelmästä liposomiin kapseloitujen vasta-aineiden valmistamiseksi käsittelemällä ääniaalloilla ja haihduttamalla kolesterolin ja fosfatidyylikoliinin liuos kloroformin ja eetterin seoksessa, johon on lisätty vesifaasi, mutta selostuksessa ei ilmoiteta lipidin ja vesifaasin suhteellisia määriä.

SPLV:den karakterisoiminen SPLV:t ovat selvästi erilaisia ominaisuuksiltaan kuin liposomit, jotka ovat yksi- tai monilamellisia (esimerkiksi SUV:t ja REV:t). Pakaste-fraktuura-elektroni-mikroskopia ilmoittaa,

Xl 83161 että SPLV-valmisteet ovat käytännöllisesti katsoen vapaita SUV:stä ja REVrstä, eli alle 20 % rakkuloista on unilamellisia. Niitä ei voida kuitenkaan erottaa MLV:stä elektronimikroskooppi-tekniikalla, vaikka useat niiden fysikaalisista ominaisuuksista ovat erilaisia. Seuraava yksityiskohtainen vertailu on täten kohdistunut SPLV:den erottamiseen MLVrstä.

SPLV;den stabiilisuus varastoitaessa

Lipidirakkulan stabiilisuus viittaa rakkulan kykyyn sekvestroi-da sen suljettu tila ulkopuoliselta ympäristöltä pitkän ajanjakson. Lipidirakkulalle on kaikkein tärkeintä ollakseen käyttökelpoinen, että se on stabiili varastoitaessa ja käsiteltäessä. Joissakin muissa käyttötarkoituksissa kuitenkin on suotavaa, että rakkula antaa sisältönsä vuotaa hitaasti ulos, kun sitä pannaan kohteeseen. Joissakin muissa käyttötarkoituksissa on suotavaa, että rakkula pysyy ehjänä lääkkeeksi antamisensa jälkeen kunnes se pääsee haluttuun vaikutuskohtaansa. Seuraavassa tullaan näkemään, että SPLV:llä on nämä halutut ominaisuudet, kun taas MLVrllä ei ole niitä.

On olemassa kaksi syytä, miksi rakkulat rupeavat vuotamaan. Toinen on lipidien auto-oksidoituminen, jolloin hiilivetyketjut muodostavat peroksideja, jotka destabiloivat kaksoiskerrokset. Tätä oksidoitumista voidaan hidastaa äkkijyrkästä lisäämällä hapettumista ehkäiseviä aineita kuten butyylihydroksitolueeniä (BHT) rakkuloiden valmistuksessa. Rakkulat voivat vuotaa myös sen vuoksi, koska ulkopuolisessa ympäristössä olevat aineet hajottavat lipidien kaksikerrosjärjestelmän siten, että lipidit jäävät koskemattomiksi, mutta membraaniin kehittyy aukko.

Lipidirakkulavalmisteet ovat ensiksi valkoisia. Auto-oksidaa-tion tapahduttua valmiste muuttuu väriltään (ruskehtavaksi).

Kun verrataan MLV:tä SPLVrhen, jotka on valmistettu käyttäen samaa lipidiä ja vesipitoisia komponentteja, havaitaan että MLV:t muuttuvat väriltään yhden tai kahden viikon kuluessa, kun taas SPLV:t pysyvät valkoisina ainakin kaksi kuukautta.

i2 831 61 Tätä tukee ohutlevykromatografiatutkimus aineosina käytetyistä lipideistä, mikä paljasti lipidien hajoamisen MLVrssä mutta ei SPLV:n lipideissä. Kun näitä rakkuloita valmistetaan lisäämällä BHT:tä samoin kuin muita aineosia, MLV:t näyttävät hieman värjäytyneiltä yhden kuukauden kuluttua, kun taas SPLV:t pysyvät valkeina ja näyttävät stabileilta ainakin 6 kuukautta ja jopa kauemmin.

Kun ne pannaan puskuriin, joka sisältää isotonista suolaliuosta pH:n ollessa neutraali, ovat SPLV:t, jotka sisältävät antibiootteja, stabiileja yli neljä kuukautta kuten on esitetty taulukossa I. Nämä datat ilmoittavat, ettei mikään antibiootti, joka alunperin kapseloitiin SPLV:den sisään, vuotanut ulos kokeen ajanjakson kuluessa.

Myös muut tosiseikat vahvistavat, että SPLV:t pystyvät pidättämään kapseloidun aineen erillään niin pienistä molekyyleistä kuin kalsiumioneista yli kuuden kuukauden ajan. Arsenazo III on väriaine, jonka väri muuttuu punaisesta siniseksi silloin kun pienen pieni määrä kaksiarvoista kationia on läsnä. Kun kapseloidaan tätä väriainetta SPLV:hen ja lisätään kalsiumkloridia varastointipuskuriin, on mahdollista mitata rakkuloiden stabiilisuus tutkimalla värin vaihtumista. Väri pysyy jatkuvasti muuttumattomana alkuperäisestä väristään ainakin 6,5 kuukautta todistaen sen, ettei väriainetta ole vuotanut ulos, eikä ioneja ole päässyt sisään.

i3 831 61

Taulukko I

Munan fosfatidyylikoliinia sisältävien SPLV:den stabiilisuus sen jälkeen kun niitä on varastoitu suljetuissa säiliöissä 4°C:ssa 4 1/2 kk ajan3

Kapseloitu Kapseloimis- Vuoto päällä Kapseloidun lääke määrä %:ssa kelluvaan ^ lääkkeen määrä alussa nesteeseen %:ssa, joka on bioaktii- _ _ _ vista_

Streptomysiini- sulfaatti 34,1 O 97

Spektinomysiini 37,2 O 84

Klooriamfenikoli 35,2 0 89

Oksitetrasykliini 18,8 O 91

Erytromysiini 0,4 0 97

Sulfameratsiini 6,3 0 93 aSPLV:tä valmistettiin käyttäen 127 ^,uM munan fosf atidyylikoliinia (EPC) ja 25 ^uM lääkettä. 4,5 kk:n varastoinnin loppupuolella 4°C:ssa SPLV:t erotettiin varastointipuskuriliuoksesta sentrifugoimalla. SPLVsn sisällön ja päällä olevan nesteen sarjalaimennuksia pantiin bakteerikentille bioaktiivisuuden määräämistä varten ja verrattiin antibiootin standardilaimennuk-siin.

°0 ilmoittaa aineen määriä, jotka ovat havaitsemisen alapuolella.

Nämä kokeet osoittavat, että SPLV:t ovat riittävän stabiileja kestämään varastointia ja käsittelyvaikeuksia. Vaikka onkin mahdollista valmistaa MLVrtä, jotka ovat näin kauan stabiileja, ne täytyy tehdä synteettisistä lipideistä kuten DSPC ja ne tulevat täten liiallisen kalliiksi.

SPLVrden stabiilisuus muissa ympäristöissä

Lipidirakkuloiden paneminen väliaineeseen, joka sisältää membraa-nia hajottavia aineita, on tapa kokeilla erilaisia molekyyli-järjestelmiä. Riippuen siitä, kuinka membraani on rakentunut, eri rakkulat antavat erilaisen vasteen tällaisiin aineisiin.

i4 831 61

Seuraavissa kokeissa rakkuloita valmistettiin siten, että ne 3 sisälsivät radioaktiivisen merkkimolekyylin ( H inuliinin) suljetussa vesilokerossa. Inuliini, eräs polysakkaridi, jakaantuu vesifaasiin ja kun se on radioaktiivisesti merkitty, sitä voidaan käyttää lipidirakkuloiden sisällön seurantaan.

Kun rakkuloiden oli annettu olla jokin sopiva aika määrätyn aineen vaikutuksen alaisena, ne erotettiin väliaineesta sentrifu-goimalla ja määrättiin radioaktiivisuuden suhteellinen määrä, joka pääsi karkuun rakkuloista väliaineeseen. Nämä tulokset on ilmoitettu taulukossa II; arvot on ilmoitettu vuotoprosentteina, mikä merkitsee radioaktiivisen materiaalin suhteellista osuutta ympäröivässä väliaineessa suhteessa rakkuloihin kapseloituun määrään alussa.

SPLV:t ovat stabiilimpia kuin MLV:t kloorivetyhapossa. Taulukko II ilmoittaa, että sekä MLV:t että SPLV:t, kun ne on tehty muna-lesitiinistä, tulevat epästabiileiksi, kun niihin vaikuttaa 0,125 N kloorivetyhappo yhden tunnin ajan. On kuitenkin huomattava, että SPLV:t ovat selvästi vähemmän herkkiä hapolle kuin MLV:t. Oletettavasti tämä erilainen vaste kuvastaa lipidien luontaista erilaisuutta reagoinnissa ympäristön suhteen.

Taulukko II

SPLV;den stabiilisuus muissa ympäristöissä

Inkubointiväliaine3 _Vuoto-%_ MLV:t SPLV:t

Kloorivetyhappo O,125M 90,5 55,2

Urea IM 21,7 44,8

Guanidiini 0. 5M 5,7 7,4 1, OM 8,3 10,1

Ammoniumasetaatti 0,5M 27,0 67,0 1,OM 25,9 54,7-63,1

Seerumi 76,2 57,8 aInkubointiaika on 2-4 h, paitsi inkubointi HCl:ssä, joka oli 1 h.

is 83161 SPLV:den vaste on myös erilainen kuin MLV:llä, kun annetaan urean vaikuttaa niihin (kuvio 1 ja taulukko II). Urea on molekyyli, jolla on sekä kaotrooppinen vaikutus (hajottaa veden rakenteen) että voimakas dipolimomentti. On havaittu, että SPLV:t ovat paljon herkempiä urealle kuin jollekin osmoottiselle aineelle kuten natriumkloridille samassa konsentraatios-sa (kuvio 1). MLV:t eivät vuoda selvästi enemmän ureassa kuin mitä ne vuotavat natriumkloridissa. Vaikka tämän erilaisen käyttäytymisen selitykset ovat teoreettisia, näyttää siltä että vaste johtuu dipolivaikutuksesta ennemmin kuin kaotrooppi-sesta ominaisuudesta, koska guanidiini, samanlainen molekyyli kuin urean, ei tee SPLV:tä epästabileiksi (taulukko II). Vaikka guanidiini on myös voimakkaasti kaotrooppinen, sillä ei ole voimakasta dipolimomenttia.

SPLV:t ovat herkkiä myös ammoniumasetaatille, kun taas MLV:t eivät ole (taulukko II). Mutta ei ammoniumioni (ammoniumklori-dissa) eikä asetaatti (natriumasetaatissa) ole kumpikaan erikoisen tehokkaita SPLV:n destabiloimisessa. Täten näyttäisi siltä, että ei itse ioni vaan ammoniumasetaatin polaarisuus on syynä vuodon indusoimiseen.

Aluksi nämä tulokset näyttävät yllättäviltä, koska SPLV:t ovat paljon stabiilimpia kuin MLV:t kun niitä inkuboidaan ruumiin nesteissä kuten seerumissa tai veressä. Voidaan kuitenkin ehdottaa jotakin teoreettista selitystä näille tuloksille (muutkin selitykset ovat tietenkin mahdollisia). Jos SPLV:den stabiilisuus perustuu sen membraanin kaksoiskerrosten ainutlaatuiseen rakenteeseen, jossa membraanin lipidien polaariset ryhmät ovat suunnattujen vesimolekyylien pilven tai hydraatiokuoren hydra-toimia, silloin on mahdollista, että mikä tahansa aine, joka hajottaa tai häiritsee tällaisia hydratointikuoria, saa aikaan muutoksia membraanin rakenteen kokonaisuuteen, ja siten vuotamista.

Riippumatta siitä, ovatko teoreettiset selitykset SPLViden stabiilisuuden hajoamisesta ureassa oikeita, osoittavat tulokset ie 83161 karakteristisia eroavaisuuksia MLV:den ja SPLVrden rakenteessa. Tätä eroavaisuutta voidaan käyttää hyvin hyödylliseen tarkoitukseen käytännössä. Kuten edellä on selostettu, SPLV:t tulevat vain hitaasti vuotaviksi kun niitä pannaan silmään. Tämä haluttu sisällön hidas vapautuminen johtuu oletettavasti samanlaisesta destabiloitumisesta, kun SPLV:t joutuvat kyynelnesteen vaikutuksen alaisiksi.

SPLVrt ovat stabiilimpia seerumissa kuin MLV:t. Lipidirakku-loiden useihin käyttötapoihin kuuluu niiden antaminen intra-peritoneaalisesti kuten esimerkiksi brusellosiksen hoitamiseen. Ollakseen tehokkaita on rakkuloiden pysyttävä ehjinä riittävän kauan päästäkseen perille kohteeseensa. SPLV:t ja MLV:t, jotka on molemmat valmistettu munalesitiinistä, pantiin fetaali härän seerumiin, joka sisälsi aktiivisen komplementin (taulukko II). Kun se oli saanut vaikuttaa 48 h 37°C:ssa, olivat SPLVrt selvästi stabiilimpia kuin MLV:t.

SPLVrden tyypillisiä ominaisuuksia, kun niitä annetaan in vivo SPLV:llä on useita tyypillisiä ominaisuuksia, jotka tekevät ne erikoisen sopiviksi kantaja-aineiksi lääkkeen antosysteemeissä in vivo: A) SPLVrt ovat kestäviä vuotamisen suhteen. Kun SPLV:tä pannaan organismiin, sekä lipidikomponentti että sisään suljettu aktiivinen aineosa pysyvät kudoksissa niiden solujen pidättämi-nä, joihin ne on tuotu; B) SPLVrtä voidaan rakentaa sellaisiksi, että ne vapauttavat sisältönsä viivytetysti. SPLVrden stabiilisuutta voidaan "säädellä" siten, että SPLVrt ovat hyvin stabiileja varastoinnin aikana ja ovat samaten stabiileja ruumiin nesteiden sisällä mutta kun niitä annetaan in vivo, saadaan hitaan aktiivisen aineosan vuotamisen ansiosta aktiivisen aineosan viivytetty vapautuminen; i7 831 61 C) Sulkeutuneen määrän suuruuden ja stabiilisuuden ansiosta lääkettä annettaessa vapautuu aktiivista aineosaa tehokas määrä; ja D) SPLVrden valmistus on kustannuksiltaan edullista sen vuoksi, ettei tarvitse lisätä kalliita stabiloivia aineita kaksois-kerroksiin.

Seuraavat esimerkit osoittavat joitakin näistä SPLV:den tyypillisistä ominaisuuksista kun niitä annetaan ulkoisesti testi-eläinten silmiin. Näissä kokeissa käytetyt SPLV:t valmistettiin siten kuin edellä on selostettu paitsi että lipidikaksoiskerros ja aktiivinen aineosa tehtiin radioaktiivisiksi näiden komponenttien seuraamista varten silmäkudoksissa jonkin ajan kuluessa.

SPLV:t valmistettiin käyttäen 100 mg munan fosfatidyylikoliinia (EPC) ja 100 mg gentamysiinisulfaattia. Lipidikomponentti 125 tehtiin radioaktiiviseksi lisäämällä hivenmääriä I-fosfati- 125 dyylietanoliamiinia ( I-PE) kaksoiskerroksiin, kun taas vesi- faasin aktiivinen aineosa tehtiin radioaktiiviseksi lisäämällä * 125 125 V I-gentamysiinisulfaattia ( I-GS). SPLVrt pestiin puskuris- sa usein, jotta poistettaisiin tehokkaasti aineet, jotka eivät ’·*: olleet kapseloituneet tai menneet sisään.

»

Tasaosa SPLV-valmistetta poistettiin ja uutettiin orgaanisen faasin erottamiseksi vesifaasista. Kunkin faasin radioaktiivi- 125 125 suus mitattiin suhteen I-PE: I-GS määräämiseksi alussa eli cpm (signaaleja per minuutti) lipidifaasissa:spm vesifaasissa), mikä oli pantu SPLViden sisään.

Uuttaminen tapahtui seuraavasti: 0,8 ml 0,4 M NaCl (vesipitois-:·*’ ta) , 1 ml kloroformia ja 2 ml metanolia sekoitettiin keskenään ..V homogeeniseksi faasiksi. Sen jälkeen lisättiin 4 ^ul radio aktiiviseksi merkittyjä SPLV:tä ja sekoitettiin joukkoon; kun • *· SPLV-komponentit liukenivat orgaaniseen faasiin ja vesifaasiin, niin seos, joka oli alussa samea, muuttui kirkkaaksi. Faasit erotettiin lisäämällä ja sekoittamalla siihen 1 ml 0,4 M NaCl ιβ 83161 (vesipitoista) ja 1 ml kloroformia, joka sitten sentrifugoitiin 2800 x g 5 min ajan. Määräosa (1 ml) kustakin faasista poistet- 125 tiin ja radioaktiivisuus (cpm:nä) mitattiin. (Suhde I-PE: 125I-GS alussa oli 1,55:1).

Viisitoista täysikasvuista naaraspuolista sveitsiläistä Webster-hiirtä anestesoitiin ja sidottiin kiinni (jotta vältettäisiin silmien hierominen). Yhtä suuret tasamäärät (2 ^ul) radioaktiiviseksi merkittyjä SPLV:tä suspensiossa siveltiin ulkoisesti kuhunkin silmään. Kolmen eläimen ryhmiä tapettiin sen jälkeen seuraavissa ajankohdissa: 1, 2, 3, 18 ja 24 h kuluttua. Yhdeksää naaraspuolista sveitsiläistä Webster-hiirtä (kontrollit) käsiteltiin identisesti paitsi että kuhunkin silmään siveltiin ulkoisesti samat tasamäärät (2 ^,ul) radioaktiiviseksi merkittyä gentamysiinisulfaattia. Kolmen kontrollieläimen ryhmiä tapettiin 1, 4 ja 8 h kuluttua.

Heti tappamisen jälkeen eläinten silmäluomet poistettiin, jauhettiin ja uutettiin (käyttäen edellä selostettua menettelytapaa) , jotta erotettaisiin vesipitoiset komponentit lipidi-komponenteista. Tällaisen faasin radioaktiivisuus määrättiin (samoin kuin saatujen radioaktiivisten signaalien kokonaislukumäärä) . Lipidifaasista mitattu radioaktiivisuus ilmaisee silmä-kudoksen pidättämät, SPLV-tlipidit, kun taas vesifaasista mitattu radioaktiivisuus ilmaisee silmäkudoksessa olevan gentamysiinin pidättämisen. Kuvio 2 esittää graafisesti kummankin komponentin pidättämisen silmäluomen kudoksessa (ilmaistuna prosenteissa alkuperäisestä cpm-lukumäärästä, joka siveltiin silmään.

Kuvio 2 todistaa selvästi SPLV:n lipidikomponentin pysymisen silmäluomen kudoksessa yli 24 h ajan ja gentamysiinin viivytetyn vapautumisen SPLV:stä 24 h aikana (mikä kuvastuu gentamysiinin prosentuaalisesta määrästä, joka pysyy silmäluomen kudoksessa tämän ajan). Kuvio 2 esittää myös sen, että kapseloimaton genta-mysiini (vesipitoinen gentamysiini,jota annettiin ulkoisesti) poistui nopeasti silmäluomen kudoksesta. Esimerkiksi gentamysiini liuoksessa (kontrolli) poistui silmäluomen kudoksesta 19 831 61 4 h sisällä (alle 5 % gentamysiinistä jäi silmäluomen kudokseen). Toisaalta yli 50 % SPLV:hin kapseloidusta gentamysiinistä pysyi silmäluomen kudoksessa tänä 4 h aikana; 24 h kuluttua nimittäin yli 15 SPLVrhen kapseloidusta gentamysiinistä oli pysynyt silmäluomen kudoksessa. Tämä osoittaa, että noin 85 % SPLV:hin kapseloidusta gentamysiinistä vapautui 24 h kuluessa kun taas 95 % kapseloimattomasta gentamysiinisulfaatista poistui 4 h aikana.

Taulukko III vertaa suhdetta SPLV-lipidifaasi:silmäluomen kudoksen pidättämä vesifaasi kullakin hetkellä. Tämän suhteen lisääntyminen ilmaisee gentamysiinin vapautumista SPLVrstä.

Mitattiin myös SPLV:hin kapseloidun gentamysiinisulfaatin bio-aktiivisuutta, jonka silmäluomen kudokset pidättivät. Genta-mysiinisulfaattia otettiin talteen silmäluomen kudoksista ottamalla määräosa silmäluomen uutteen vesifaasista, joka valmistettiin 3 h sen jälkeen kun SPLV:hin kapseloitua gentamysiinisulf aattia oli sivelty silmään. Vesifaasista tehtiin sarja-laimennuksia ja 2 ^ul tasamääriä pantiin agarlevyillä olevien Staphylococcus aureus-kasvukenttien päälle; 24 h inkuboinnin jälkeen mitattiin inhiboidut alueet. Gentamysiinisulfaatti, joka oli otettu silmäluomen kudosuutteista eläimistä, joita oli käsitelty SPLV:hin kapseloidulle gentamysiinisulfaatilla, säilytti täysin bioaktiivisuutensa.

2o 83Ί 61

Taulukko III

SPLVshin kapseloidun gentamysiinin viivytetty vapautuminen sen jälkeen kun sitä on pantu ulkoisesti hiirien silmiin

Aika lääkkeen SPLV:den komponenttien Suhde SPLVrn lipidi: levittämisen kokonaismäärä, joka saa- vesifaasi, joka pysyi jälkeen tu silmäluomista_ silmäluomissa_

- (prosenteissa annok- (125T 125T

sesta alussa) I-PE: I-GS) 0 100 % 1,55 1 h 100 % 2,1 3 h 100 % 2,82 18 h 94 % 6,89 24 h 85,1 % 7,17

Elektroni-spin-resonanssi

Vaikka SPLV:t ja MLV:t näyttävät identtisiltä elektronimikros-kooppisesti, ESR (elektronin-spin-resonanssi)-spektroskopia paljastaa eroavaisuudet niiden supramolekulaarisessa rakenteessa. SPLV:t voidaan erottaa MLVsstä niiden molekyylin "arkkitehtuurin" perustalla, mikä todistaa, että niillä on kehittyneempi molekyyli-järjestys, lisääntynyt molekyylin liike ja askorbaatin parempi läpäisevyys. On hyvin luultavaa, että nämä eroavaisuudet molekyylin "arkkitehtuurissa" vaikuttavat osaltaan niiden erilaisiin biologisiin vaikutuksiin.

Elektroni-spin-resonanssi-spektroskopiassa tuodaan spin-näyte kuten esimerkiksi 5-doksyylistearaatti (5DS) lipidikaksoiskerrok-seen.

Doksyyliryhmän pariton elektroni absorboi mikroaaltoenergiaa kun näyte kytketään magneettiseen kenttään. Absorptiospektrin avulla voidaan määrätä kolme empiiristä parametriä:S, järjestys-parametri; Aq, hyperhieno kytkentäparametri; ja Tau, pyörähdys-korrelaatioaika. Tyypillinen lukema on esitetty kuviossa 3, jossa A on SPLV:n signaali ja B on MLV:n signaali ja molemmat on merkitty 5-doksyylistearaatin avulla. Spektrit otettiin huoneen lämpötilassa, pyyhkäisyalue oli 100 Gauss'ia. Järjestys-parametri s), joka on riippuvainen sekä 2 T^stä että 2 T^^sta, 2i 83161 mittaa havaitun ESR-signaalin deviaation näytteen täydellisen yhtenäisestä suuntauksesta. Yhtenäisesti suunnatulla näytteellä S = 1,00, umpimähkäisellä näytteellä S=0. Hyperhienon kyt-kentäparametrin, Aq, joka voidaan laskea 2 T^:stä ja 2 Teista, katsotaan kuvastavan paikallista polaarisuutta ja siten spin-näytteen kohtaa membraanin sisällä. Pyörähdys-korrelaatioaika (joka on riippuvainen WQ:sta, hQ:sta)th-l:stä, voidaan katsoa ajaksi, jonka molekyylit tarvitsevat "unohtaakseen" mitkä olivat niiden edelliset avaruussuunnat. Tyypillinen ESR-määräys eroavaisuuksista SPLV:den ja MLV:den välillä, joilla on 5-DS spin-näytteenä, on koottu taulukkoon IV.

Vaikka molemmissa tapauksissa spin-näyte raportoi samasta kak-soiskerroksen syvyydestä, SPLV:llä on selvästi kehittyneempi-asteinen molekyylijärjestys ja molekyylien liike suurempi kuin MLVrllä.

Vielä eräs eroavaisuuksien havainnollistamismahdollisuus SPLViden ja MLV:den välillä on askorbaatin kyky pelkistää doksyyli-spin-näytteitä. On tiedetty jo jonkin aikaa, että askorbaatti pelkistää doksyyliosat oletettavasti niiden hydrok-syyliamiini-analogeiksi, jotka eivät absorboi mikroaaltoenergiaa magneettisessa kentässä. Vesiliuoksissa pelkistyminen tapahtuu nopeasti ja samanaikaisesti häviää ESR-signaali. Jos spin-näyte on suojatussa ympäristössä kuten lipidi-kaksoiskerroksessa, se saattaa pelkistyä hitaammin tai ei lainkaan hydrofiilisen askorbaatin vaikutuksesta. Täten nitroksidi-pelkistysastetta voidaan käyttää askorbaatin penetraatioasteen tutkimiseen lipidi-kaksoiskerrokseen. Kuvio 3 esittää jäännös-spin'in prosentuaalista määrää versus SPLV:n ja MLV:n suspendoitumisaika askorbaat-tiliuokseen. 90 min kohdalla askorbaatti on pelkistänyt 25 % MLVthin suljetusta näytteestä, mutta 60 % SPLV:hin suljetusta näytteestä. SPLV:t mahdollistavat askorbaatin hyvin paljon voimakkaamman penetraation kuin MLV:t.

22 83161

Taulukko IV

SPLV;den ja MLViden ESR-karakterisointi TAU S Ao SPLV:t 2,65 x lO9 s 0,614 14,9 MLV:t 3,65 x 109 s 0,595 14,9

Aktiivisen materiaalin sulkeminen SPLV:hin

Vielä eräänä erinomaisena esimerkkinä SPLViden paremmuudesta traditionaalisten MLViden suhteen mainittakoon, että SPLVit pystyvät sulkemaan prosentuaalisesti enemmän käytettävissä olevaa aktiivista materiaalia ja säilyttävät materiaalin (ks. taulukkoa V).

SPLViden vuorovaikutus solujen kanssa

Vielä eräs SPLViden etu on siinä, että SPLVillä on solujen kanssa vuorovaikutusta siten, että suhteellisen suuri osa rakkulan sisään kapseloiduista materiaaleista dispergoituu läpi solujen koko sytoplasman, eikä rajoitu fagosyyttisiin rakkuloihin.

Taulukko V

MLViden ja SPLViden vertailu Käytettävissä olevasta materiaa-lista kapseloitu %,_

Kapseloidut aineet: MLVit SPLVit

Inuliini (vesipitoinen merkkiaine) 2-6 % 20-30 % Härän seerumialbumiini 15 % 20-50 %

Streptomysiini 12-15 % 20-40 %

Polyvinyylipyrrolidoni (vesipitoinen merkkiaine) 5 % 25-35 %

Kun SPLVit sekoitetaan solujen kanssa, nämä molemmat näyttävät sulautuvan yhteen. Yhteensulautumisessa SPLVit, päinvastoin kuin MLVit, ovat solujen kanssa vuorovaikutuksessa in vitro niin, että kaikki solut sisältävät ainakin jonkin verran materiaalia, joka on alunperin suljettu SPLVihin. Tämä materiaali näyttää jakautuvan läpi jokaisen solun, eikä rajoitu ainoastaan fagosyyttisiin rakkuloihin. Tämä voidaan osoittaa lisäämällä 23 831 61 ferritiiniä SPLV-valmisteen vesifaasiin. Yhteensulautumisen jälkeen viljelyssä olevan solun kanssa ultrarakenneanalyysi paljastaa, että ferritiini on jakautunut kauttaaltaan sytosoliin, eikä ole sitoutunut intrasellulaarisiin membraaneihin. Vaikka tämä ilmiö on osoitettu myös MLV:ssä esiintyväksi, SPLVrn avulla voidaan siirtää suurempi määrä materiaalia.

SPLViden kelluvuustiheys

Edellisten lisäksi on SPLV:llä alempi kelluvuustiheys kuin MLVillä. Tämä on mitattu sitomalla fikoligradienttiin (ks. taulukkoa VI).

SPLViden volyymi

Kun SPLV:t kootaan pelletteinä sentrifugoimalla 1000-100 000 x g, ne muodostavat pellettejä, joiden volyymi on huomattavasti suurempi kuin MLV:den samalla annetulla fosfolipidikonsentraa-tiolla. 16 000 x g voimalla ovat SPLV-pelletit suunnilleen kolmanneksen suurempia kuin MLV:t.

SPLV;den osmoottiset ominaisuudet

Fosfolipidi-kaksoiskerrokset ovat vettä läpäiseviä ja sen vuoksi MLVrden paneminen hypertoniseen ympäristöön ajaa sulkeutuneen veden ulos osmoottisen paineen vuoksi. SPLV:t kutistuvat enemmän kuin MLV:t. Lisäksi kutistuttuaan 16 h puskurissa, joka on 20 kertaa vahvempi kuin sisäinen suolakonsentraatio, SPLV:t eivät kutistu samaan lopulliseen volyymiin kuin MLV:t (SPLV-pelletit pysyvät 1/3 suurempina kuin MLV-pelletit). Tämä todistaa, että eroavaisuus pellettien koossa ei johdu vesipitoisen suljetun volyymin eroavuudesta.

SPLViden käyttötavat SPLVrt ovat erikoisen käyttökelpoisia systeemeissä, joissa seu-raavat tekijät ovat tärkeitä: stabiilisuus varastoinnin aikana ja kontaktissa ruumiin nesteiden kanssa; suhteellisen korkea-asteinen kapselointiaste; edulliset valmistuskustannukset; ja suljetun yhdisteen vapautuminen biologisesti aktiivisessa muodossaan .

24 83161

Taulukko VI Kelluvuustiheys MLV:t SPLV;t fikolissa kerrokset yli 1 % kerrokset yli 0,5 % g/ml 1,071 1,0274

Riippuen antotavasta in vivo, voivat SPLV:t myös olla kestäviä vuodon suhteen (esimerkiksi silloin kun viivytetty vapautuminen on tärkeätä) tai ne voidaan antaa RES:n soluihin.

Edellä olevasta johtuen ovat keksinnön mukaiset SPLV:t käyttökelpoisia hyvin useissa systeemeissä. Niitä voidaan käyttää parantamaan lääkityksen terapeuttista vaikutusta, infektioiden hoitoon, parantamaan entsyymin siirtymistä, oraaliseen lääkkeen antoon, ulkoiseen lääkkeen antoon, geneettisen tiedon viemiseen soluihin in vitro ja in vivo, rokotteiden tuottamiseen, rekombinant-tien deoksiribonukleiinihapposegmenttien tuomiseen soluihin, tai diagnostisina reagensseina kliinisissä kokeissa, jotka seuraa-vat suljettujen "tiedonantaja"-molekyylien vapautumista. SPLV:tä voidaan käyttää myös kapseloimiseen kosmeettisia valmisteita, pestisidejä, yhdisteitä, jotka viivytetysti vapautuessaan lisäävät kasvien kasvua ym.

Seuraavissa menetelmissä, jotka selostavat SPLViden käyttöä, tarkastellaan SPLV:den tai minkä muun liposomi- tai lipidirakku-lan käyttöä, joilla on funktionaalisia yhtäläisyyksiä SPLVrden kanssa.

Bioaktiivisten yhdisteiden antaminen lääkkeeksi Yhdisteiden tuominen soluihin in vitro (esimerkiksi eläinsolui-hin, kasvisoluihin, alkueliöihin jne.) vaatii tavallisesti että yhdistettä sisältävät SPLVrt lisätään viljelyssä oleviin soluihin. SPLV:tä voidaan kuitenkin käyttää myös antamaan yhdisteitä in vivo eläimille (myös ihmiselle), kasveille ja alkueliöille. Riippuen antamistarkoituksesta voidaan SPLVstä antaa hyvin useita anto-teitä; ihmiselle ja eläimelle seuraavasti, vaikka antotapa ei rajoitukaan näihin; injektion avulla (esimerkiksi intravenöötti-sesti, intraperitoneaalisesti, intramuskulaarisesti, subkutaani- 25 83161 sesti, intra-aurikulaarisesti, intramammaarisesti, intrauretraali-sesti jne.), ulkoisesti (esimerkiksi sairastuneisiin kohtiin) ja absorption kautta epiteelin tai limakalvon läpi (esimerkiksi okulaariepiteeli, suun limakalvo, rektaali- ja vaginaali-epiteelikalvot, hengitystiekalvot, nenä-nielu-limakalvot, suolen limakalvot jne.), kasveille ja alkueliöille, vaikka ei olekaan rajoitettu, antotapa on: suora antaminen organismiin, dispergoi-minen organismin olinpaikkaan, lisääminen ympäristöön tai ympäröivään veteen jne.

Lääkkeen antotapa saattaa myös määrätä kohdat ja solut organismissa, mihin yhdiste annetaan. Esimerkiksi johonkin määrättyyn infektiokohtaan antaminen voidaan suorittaa helpoimmin ulkoisesti sivelemällä (jos infektio on ulkoinen). Verenkiertosys-teemiin (ja siis retikuloendoteelisoluihin) anto voidaan suorittaa kaikkein helpoimmin intravenöösin, intraperitoneaalisen, intramuskulaarisen tai subkutaanisen injektion avulla.

Koska SPLV:t mahdollistavat yhdisteen viivytetyn vapautumisen, voidaan annoksia, jotka muuten voisivat olla toksisia organismille, antaa yhtenä tai useampana antokertana organismiin.

Seuraavissa jaksoissa selostetaan SPLVrden käyttämisen yleiskaavoja ja ne valaisevat, mutta eivät rajoita kyseessä olevan keksinnön piiriä.

Patologisten tilojen hoito

Useita patologisia tiloja, joita esiintyy ihmisellä, eläimillä ja kasveilla,voidaan hoitaa tehokkaammin kapseloimalla sopiva yhdiste tai yhdisteet SPLVrhin. Näitä patologisia tiloja ovat, mutta eivät rajoitu niihin, infektiot (intrasellulaarinen ja ekstrasellulaarinen), kystat, tuumorit ja tuumorisolut, allergiat jne.

On mahdollista käyttää useampaakin strategiaa SPLV:den käyttämisessä tällaisten patologisten tilojen hoidossa; seuraavassa selostetaan joitakin yleiskaavoja, jotka ovat erikoisen käyttö 26 83 1 61 kelpoisia sen seikan ansiosta, että SPLV:t annetaan in vivo makrofagien sisään.

Erään suunnitelman mukaisesti käytetään SPLVttä terapeuttisten aineiden antamiseksi intrasellulaarisiin infektiokohtiin. Joissakin sairauksissa esiintyy retikuloendoteelisysteemin solujen infektiota, esimerkiksi bruselloosissa. Nämä intrasellulaa-riset infektiot ovat vaikeita parantaa useista syistä: 1) koska infektoituneet organismit sijaitsevat solujen sisällä retikulo-endoteelisysteemissä, ne ovat sekvestroituneina kiertäviltä terapeuttisilta aineilta, jotka eivät voi läpäistä solumembraa-nia terapeuttisesti riittävässä konsentraatiossa ja sen vuoksi ne ovat erittäin resistenttejä hoidon suhteen; 2) usein tarvitaan toksisia määriä terapeuttisia aineita tällaisten infektioiden voittamiseksi; ja 3) hoidon on oltava täysin tehokas, koska mikä tahansa jäännösinfektio hoidon jälkeen voi infektoida uudelleen isäntäorganismin tai voi siirtyä toisiin isäntiin.

Erään kyseessä olevan keksinnön toteutusmuodon mukaisesti annetaan SPLV:tä, jotka sisältävät sopivaa biologisesti aktiivista yhdistettä (mieluimmin intraperitoneaalisesti tai intravenöötti-sesti) isäntäorganismiin tai potentiaaliseen isäntäorganismiin (esimerkiksi eläinlaumoja, yhtä hyvin infektoitumattomia kuin infektoituneita eläimiä voidaan hoitaa). Koska fagosyyttisolut ottavat sisäänsä SPLV:t, voidaan antamalla SPLVrtä, jotka sisältävät kapseloitua biologisesti infektio-organismia hävittävästi vaikuttavaa ainetta, suunnata bioaktiivinen aine infektiokohtaan. Kyseessä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan siten käyttää eliminoimaan infektio, jonka voi aiheuttaa jokin seuraa-vista useista mikro-organismeista, bakteereista, parasiiteistä, sienistä, mykoplasmoista ja viruksista, mutta ei näihin rajoittuen: Brucella spp., Mycobacterium spp., Salmonella spp., Listeria spp., Francisella spp., Histoplasma spp., Corynebacterium spp., Coccidiodes spp. ja lymfosyyttinen koriomeningitis-virus.

Valittu terapeuttinen aine riippuu infektiota aiheuttavasta organismista. Bakteeri-infektiot voidaan esimerkiksi torjua 27 83161 kapseloimalla antibioottia. Antibiootti voi olla jossakin vesipitoisessa nesteessä SPLV:den sisällä ja/tai kiinnittyneenä rakkulan kaksoiskerrokseen. Sopivia antibiootteja ovat, mutta eivät rajoitu näihin: penisilliini, ampisillii-ni, hetasilliini, karbensilliini, tetrasykliini, tetrasykliini -hydrokloridi, oksitetrasykliini-hydrokloridi, kloori-tetrasykliini -hydrokloridi, 7-kloori-6-dimetyylitetrasykliini, doksisykliini-monohydraatti, metasykliini-hydrokloridi, minosykliini-hydrokloridi, rolitetrasykliini, dihydrostrep-tomysiini, streptomysiini, gentamysiini, kanamysiini, neo-mysiini, erytromysiini, karbomysiini, oleandomysiini, tro-leandomysiini, polymyksiini-B-kollistiini, natriumkefalotii-ni, kefaloridiini, kefaloglysiini-dihydraatti ja kefaleksii-ni-monohydraatti.

Tällaisten hoitojen tehokkuus on osoitettu parantamalla bruselloosi (ks. esimerkkejä jäljempänä). Tämän keksinnön mukaisten stabiilien plurilamellisten rakkuloiden avulla voidaan toimenpiteen tehokkuutta ja kestoaikaa pidentää.

On yllättävää, että tämä systeemi on tehokas sellaisten infektioiden hoitamisessa, joihin eivät tunnetut hoidot, kuten MLVrhin suljetut antibiootit tehoa. Tuloksellinen hoito on odottamatonta, koska mitkä tahansa vähäiset jään-nösinfektiot leviävät ja infektiosykli alkaa uudestaan. Samoin on osoitettu menestystä lymfosyyttisen koriomeningi-tis-virus infektion hoidossa.

SPLV:t voidaan ohjata useihin eri infektiokohtiin, intra-ja ekstrasellulaarisiin. Eräässä toisessa kyseessä olevan keksinnön toteutustavassa esim. käytetään makrofageja aktiivisen aineen kantajana systeemisen ekstrasellulaarisen infektion kohtaan. Tämän ohjelman mukaisesti käytetään SPLV:tä terapeuttisen aineen antamiseen ei-infektoituneille makrofageille siten, että SPLV:t annetaan in vivo (mieluimmin intraperitoneaalisesti tai intravenööttisesti). Makrofa-git yhtyvät SPLV:den kanssa ja "kuormittuvat" terapeuttisella aineella; makrofagit pidättävät aineen tavallisesti 3-5 päivän ajan.

28 831 61

Kun "kuormitetut" makrofagit pääsevät infektiokohtaan, makro-fagit ottavat sisäänsä patogeenin. Tästä johtuen patogeeni joutuu kontaktiin terapeuttisen aineen kanssa, joka on makrofagin sisällä ja se tuhotaan. Tämä keksinnön toteutusmuoto on erikoisen hyödyllinen Staphylococcus aureus mastitiksen hoitamiseen ihmisellä ja karjassa.

Jos infektoitunut tai sairastunut kohta on ulkoinen tai siihen päästään helposti, voidaan SPLVrhin suljettua terapeuttista ainetta sivellä ulkoisesti. Erikoisen edullinen sovellutus on myös silmätautien hoito. Okulaaritautien tapauksessa voidaan yhtä tai useampaa sopivaa vaikuttavaa ainetta sisältäviä SPLV:tä sivellä ulkoisesti sairastuneeseen silmään. Hyvin useat organismit aiheuttavat silmäinfektioita ihmisellä ja eläimillä. Sellaisia organismeja ovat, mutta eivät rajoitu näihin:

Moraxella spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp.,

Diplococcus spp., Flavobacterium spp., Hemophilus spp.,

Klebsiella spp., Leptospira spp., Mycobacterium spp.. Neisseria spp., Propionibacterium spp., Proteus spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Escherichia spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. ja bakteerien kaltaiset organismit kuten esimerkiksi Mycoplasma spp. ja Rickettsia spp. Näitä infektioita on vaikeata saada kokonaan häviämään konventionaalisia menetelmiä käyttämällä, koska vähäinenkin infektion jäännös hoidon jälkeen voi uusia infektion kyynelerityksen kautta. SPLVrden käyttöä on havainnollistettu parantamalla okulaari-infektioita, jotka aiheuttaa Moraxella bovis (ks. esimerkkejä jäljempänä).

Koska SPLVrt ovat vuodon kestäviä ja niiden sisältö vapautuu viivytetysti, voidaan SPLV:tä käyttää myös minkä tahansa sairauden hoitamiseen, joka vaatii pitempiaikaista kontaktia aktiivin hoitoaineen kanssa. Esimerkiksi glaukooma on sairaus, jolle on tunnusomaista intraokulaarisen paineen asteettainen nousu, joka aiheuttaa perifeerisen näkökyvyn progressiivista häviämistä ja hoitamattomana sentraalisen näkökyvyn häviämistä ja lopuksi sokeuden. Glaukooman hoidossa käytettäviä lääkkeitä voidaan antaa ulkoisesti silmätippoina. Joissakin tapauksissa hoito 29 831 61 vaatii kuitenkin tippojen antamista joka viidestoista minuutti, koska lääke poistuu nopeasti silmäkuopasta. Jos esimerkiksi glaukoomaa hoidetaan tämän keksinnön mukaisesti, voidaan terapeuttisia aineita kuten: pilokarpiini, floropryyli, fysostigmiini, karkoliini, asetatsolamidi, etotsolamidi, dikloorifenamidi, karbakoli, demekariumbromidi, di-isopropyyli-fosfofluoridaatti, ekotioplaattijodidi, fysostigmiini, tai neostigmiini, jne. sulkea SPLV:den sisään, joita sitten pannaan sairastuneeseen silmään.

Muita aineita, joita voidaan kapseloida SPLV:den sisään ja antaa ulkoisesti ovat mm. seuraavat ilman rajoituksia: mydriatii-nit (esimerkiksi epinefriini, fenyyliepinefriini, hydroksi-amfetamiini, efedriini, atropiini, homatropiini, skopolamiini, syklopentolaatti, tropikamidi, enkatropiini, jne.); paikallispuudutusaineet; viruksia hävittävät aineet (esimerkiksi idoksuridiini, adeniini-arabinosidi, jne.); antimykoottiset aineet (esimerkiksi amfoterasiini B, natamysiini, pimarisiini, flusytosiini, nystantiini, timerosali, sulfameratsiini, tio-bendatsoli, tolnaftaatti, grisioflulviini,jne.); parasiitteja hävittävät aineet (esim. sulfonamidit, pyrimetamiini, klindamy-siini jne.); ja tulehduksia ehkäisevät aineet (esimerkiksi kortikosteroidit kuten ACTH, hydrokortisoni, prednisoni, medrysoni, beta-metasoni, deksametasoni, fluorometaloni, triamsinaloni, jne.).

Seuraavat esimerkit on annettu asian valaisemiseksi, eikä niiden tarkoituksena ole rajoittaa keksinnön piiriä.

Esimerkki: SPLV:den valmistaminen

Kuten jaksossa "SPLV:den valmistus" on selostettu, käsittää SPLV:den perusvalmistusmenetelmä lipidin tai lipidien seoksen liuottamisen johonkin orgaaniseen liuottimeen, jonka jälkeen lisätään vesifaasi ja kapseloitava materiaali, ja seos käsitellään ääniaalloilla. Parhaassa toteutusmuodossa liuos poistetaan ääniaalloilla käsittelyn aikana; orgaaninen liuotin voidaan 30 83161 kuitenkin poistaa ääniaalloilla käsittelyn aikana tai sen jälkeen millä tahansa haihdutustekniikalla. Kaikissa oheisissa esimerkeissä käytetyt SPLV:t on valmistettu siten kuin on selostettu seuraavissa alajaksoissa (mitä tahansa menetelmää, jonka tuloksena on SPLVrtä, voidaan kuitenkin käyttää).

Antibioottia sisältävät SPLVrt 5 ml etyylieetteriliuosta, jossa on 100 mg lesitiiniä, valmistettiin. Seos pantiin pyöreäpohjäiseen pulloon. Sitten liuos (0,3 ml), joka sisälsi 100 mg streptomysiinisulfaattia, pH 7,4, 5 mMtssa HEPES'iä (4-/2-hydroksietyyli7-piperatsino-2-etaani-sulfonihappoa)/0,0725 M NaCl/0,0725 M KC1, pipetoitiin lasias-tiaan, joka sisälsi lipidin dietyylieetteriliuosta. Seos pantiin sonikaattoriin (Laboratory Supplies Co., Inc.) tyyppiä 10536, useiksi minuuteiksi (80 kHz taajuus:lähtöteho 80 W) ja kuivattiin viskoosiksi tahnaksi antamalla heikon typpivirran kulkea sen yli.

Jäännöksenä olevaan viskoosiin tahnaan lisättiin 10 ml 5 mM HEPES'iä. Saatu SPLV-valmiste, joka sisälsi streptomysiiniä, suspendoitiin puskuriliuokseen, ravisteltiin useita minuutteja pyörresekoittimessa ja vapautettiin ei-kapseloituneesta streptomysiinistä sentrifugoimalla 12 000 x g lO min ajan 20°C:ssa.

Saatu paakku suspendoitiin 0,5 ml:aan 5 mM HEPES'iä.

Edellä selostettua menettelytapaa noudatettiin paitsi että streptomysiini korvattiin jollakin seuraavista: dihydrostrepto-mysiini, gentamysiini-sulfaatti, ampisilliini, tetrasykliini-hydrokloridi, ja kanamysiini.

SPLVrt, jotka sisältävät muita membraanin aineosia Noudatettiin menetelmää, joka on selostettu jaksossa "Antibioottia sisältävät SPLVrt", paitsi että munalesitiinin kanssa lisättiin jotakin seuraavista: 1) fosfatidiinihappoa, niin että moolisuhteeksi tuli 8:2 (lesitiinirdisetyylifosfaatti); 2) stearyy-liamiinia, niin että moolisuhteeksi tuli 8:2 (lesitiini:stearyy-liamiini); kolesterolia ja stearyyliamiinia, niin että mooli- 3i 83161 suhteeksi tuli 7:2:1 (lesitiini:kolesteroli:stearyyliamiini); ja 3) fosfatidiinihappoa ja kolesterolia, niin että moolisuh-teeksi tuli 7:2:1 (lesitiini:fosfatidiinihapporkolesteroli) .

Pilokarpiinia sisältävät SPLV:t

Noudatettiin menetelmää jaksosta "Antibioottia sisältävät SPLV:t", paitsi että antibiootti streptomysiini korvattiin pilokarpiinilla.

SPLV:t, jotka valmistettiin BHT:n kanssa tai ilman sitä Tislaamaton eetteri sisältää hapettumista ehkäisevää ainetta 1 ^ug/ml butyylihydroksitolueenia (BHT) varastointitarkoituksiin. Jaksossa "Antibioottia sisältävät SPLV:t" selostettua menetelmää noudatettiin käyttäen tislaamatonta eetteriä liuottimena BHT:n lisäämiseksi SPLV-valmisteeseen.

Valmistettaessa SPLV:iä ilman BHT-lisäystä, noudatettiin jaksossa "Antibioottia sisältävät SPLV:t" selostettua menetelmää käyttäen tislattua eetteriä liuottimena.

Esimerkki: Lääkkeen antaminen in vitro SPLV:n välityksellä Seuraavassa esimerkissä osoitetaan, kuinka antibioottia voidaan antaa viljelyssä oleviin makrofageihin SPLV:den välityksellä.

Peritoneaalisia makrofageja saatiin pesemällä peritoneum täysikasvuisilta Cj-^BLK-koirashiiriltä ja suspendoitiin ne "minimal essential medium'iin" (M.E.M.), pH 7,2, joka sisälsi 10 % kuumassa inaktivoitua vasikan fetaaliseerumia. Solut suspendoitiin konsentraatiolla 1 x 10^ solua per ml 96-syvennyksisiin kudos-viljelyastioihin. Viljelyihin, jotka sisälsivät adherentteja peritoneaalimakrofageja, lisättiin B.canis-organismeja konsentraatiolla 1 x 10° CFU (kolonioita muodostavia yksiköitä) per ml.

12 h kuluttua ne bakteerit, jotka eivät olleet menneet sisään peritoneaalisiin makrofageihin, poistettiin useilla pesukerroilla M.E.M:llä. Kun peritoneaaliset makrofagiviljelyt oli pesty, ne jaettiin 5 ryhmään, joista kukin sisälsi 12 replikaatti-viljelyä ryhmää kohti. Ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, 32 831 61 ei saanut mitään käsittelyä. Ryhmä 2 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia konsentraatiolla 1 mg/ml. Ryhmä 3 sai puskurilla täytettyjä SPLV:iä. Ryhmä 4 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia (1 mg/ml) sekä esivalmistettuja pusku-ritäytteisiä SPLV:tä. Ryhmä 5 sai SPLVrtä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (1 mg/ml). 24 h kuluttua poistettiin päällä kelluvat nesteet useiden pesujen avulla ja peritoneaali-set makrofagit särjettiin pakastamalla ja sulattamalla ne useita kertoja. Särjettyjen makrofagien sarjalaimennuksia pantiin brucella-agarlevyille ja 4 vrk kuluttua laskettiin elossa olevat B.canikset käyttäen rajoittavan laimennuksen tekniikkaa. Taulukossa VII esitetyt tulokset osoittavat, että SPLV:hin suljettu streptomysiini oli täysin tehokasta tappamaan ja poistamaan intrasellulaarisen B.canis-infektion in vitro.

Koe toistettiin käyttäen B.abortus'ta täsmälleen samoin kuin on selostettu edellä paitsi että peritoneaalisia makrofageja saatiin pesemällä peritoneum täysikasvuisilta naaraspuolisilta albino marsuilta. Tulokset on myös esitetty taulukossa VII.

Taulukko VII

Kolonioita muodostavat yksiköt intrasellulaarista brusellaa, jotka eristetty sen jälkeen kun infektoituja makrofageja on käsitelty streptomysiiniä sisältävillä SPLVtllä_ B ,canisa B .abortus*3

Kontrollit 2,6+1,13xl03 3,1+0,81x10^

Puskurilla täytetyt _ .

SPLV: t 2,82+0,10x10"* 2,9+0,17xl04

Vapaa streptomy- 3 .

siinic 3,11+0,40x1ο·5 3,3jK), 25xl04

Streptomysiini plus puskurilla ^ .

täytetyt SPLV:tC 2,76+0,20xl0J 2,8+0,42xl04 SPLV:hin suljettu streptomysiini O 0 a

Kolonioita muodostavia yksiköitä (CFU) B.caniksesta (keskiarvo +_ standardipoikkeama 12:sta replikaatista) eristettiin samasta lukumäärästä aikaisemmin infektoitujen hiirien (C^^Blk) peritoneaalisia makrofageja.

33 831 61 .abortuksen CFU (keskiarvo + standardipoikkeama 12:sta replikaatista) eristettiin samasta lukumäärästä aikaisemmin infektoitujen marsujen peritoneaalisia makrofageja.

Q

Streptomysiinin konsentraatio 1 mg/ml.

Esimerkki; Intrasellulaaristen infektioiden hoito Seuraavat esimerkit osoittavat, kuinka SPLV:tä voidaan käyttää intrasellulaaristen infektioiden hoitamiseen. Esitetyt datat todistavat: 1) SPLV:hin kapseloitujen antibioottien käyttämisen tehokkuutta sairauden hoitamisessa ja 2) suurempaa tehokkuutta, mikä saavutetaan antamalla multippeleita annoksia SPLV-valmis-teita. Menetelmissä käytettyjen MLVrden ja SPLViden vertailu kantaja-aineina menetelmissä on myös selostettu.

Bruselloosi aiheuttaa koko maailmanlaajuisia taloudellisia ja yleisiä terveysprobleemeja. Bruselloosin aiheuttaa Brucella spp.. Se on mukautunut useihin mammalia-lajeihin, myös ihmiseen, kotieläimiin ja useihin villieläimiin. Kuusi Brucella-lajia aiheut-taa bruselloosia eläimissä; ne ovat: B.abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis ja B. suis. Sekä koti-V että villieläimet toimivat varastoina bruselloosin potentiaa lista leviämistä ajatellen muihin eläimiin ja ihmisiin.

Näitä infektioita ei voida poistaa antibiooteilla, koska infektio-organismit sijaitsevat retikuloendoteliaalisysteemin solujen sisällä ja ne ovat erittäin resistenttejä antibioottien bakteereja hävittävälle vaikutukselle. Vaadittavan antibiootin määrä ja hoidon pituus antavat tulokseksi joko toksisen efektin eläimessä tai vaarallisen korkeita antibiootin konsentraatioita eläimen kudoksissa. Lisävaikeutena tämän sairauden hoidossa on se, että hoidon tulee olla täysin tehokas, koska mikä tahansa jäljelle jäävä infektio yksinkertaisesti leviää ja sykli alkaa taas alusta. Näiden tautien taloudellista vaikutusta kuvaavat miljoonien dollarien arvoiset karjat, jotka joka vuosi menetetään spontaanisina abortteina. Tällaisten infektioiden puhkeamisen 34 831 61 ainoa torjuntakeino on karanteeni ja eläinten teurastaminen.

Seuraavissa esimerkeissä kapseloidaan antibioottia SPLVrhin ja annetaan sitten kapseloitua aktiivista ainetta eläimille ymppäämällä sitä infektoituihin eläimiin intraperitoneaalisesti.

B.canis infektion yhden hoitokerran vaikutus käytettäessä SPLV:hin kapseloitua antibioottia_ 80 täysikasvuista sveitsiläistä koirashiirtä infektoitiin intra- 7 peritoneaalisesti (i.p.) B.canis ATCC 23365:llä (1 x 10 CFU) ja jaettiin ne 8 ryhmään, joissa kussakin 10 hiirtä. Seitsemän päivää ymppäyksestä B.canis'ta käyttäen ryhmiä käsiteltiin seuraavasti: ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, ei saanut mitään käsittelyä; ryhmä 2 sai puskurilla täytettyjä SPLV:tä (0,2 ml i.p.); ryhmä 3 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia ( 1 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kokonaisuudessaan 0,2 ml i.p.; ryhmä 4 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia (5 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p.): ryhmä 5 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti), kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ryhmä 6 sai SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (1 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ryhmä 7 sai SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (5 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ja ryhmä 8 sai SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p. Päivänä 14 ymppäyk-sen jälkeen B.canis'ta käyttäen, kaikki eläimet tapettiin ja pernat otettiin irti aseptisesti. Pernat homogenoitiin ja laimennettiin sarjaksi brucella agar-levyille, jotta voitiin määrätä elossa olevien B.canis'ten lukumäärä pernoissa käsittelyn jälkeen. Tulokset 4 päivää kestäneen inkuboinnin jälkeen on esitetty taulukossa VIII.

35 83 1 61

Taulukko VIII

B.canis-organisimin kanssa infektoitujen hiirien yhden ainoan käsittelyt teho eri konsentraatioilla vapaata streptomysiiniä tai SPLV:hin suljettua streptomysiiniä_

Kolonioita muodostavia yksiköitä B.canis orga-nismeja per perna_ ^

Ei käsittelyä Puskurilla täytetyt SPLV:t

Kontrolli 3,46xl06+2,7xl06 4,lxl06+O,66xl06

Streptomysiinin Vapaa streptomysiini SPLV.-hin suljettu konsentraatio streptomysiini (mg/kg ruumiinpaino) _ __ 1 l,5jO,45xl06 1,01+0,25xl03 5 2,12+l,71xl05 l,52+0,131xl04 10 9,66+3,68xl04 1,32+I,00xl04 ^traperitoneaalinen ruiske kaikkiaan 0,2 ml (steriili suolaliuos) ^Elossa olevat B.canikset määrättiin CFU:n lukumääränä, jotka eristettiin per perna ja se ilmaistaan keskiarvo j+ standardi-poikkeama. 10 eläintä kohti per koe (triplikaattikokeet).

B.canis infektion multippelin käsittelyn teho käytettäessä antibioottia, joka on kapseloituna SPLV:hin__ 80 täysikasvuista sveitsiläistä koirashiirtä infektoitiin 7 B.canis ATCC 23365:llä (1 x 10 CFU, i.p.) ja jaettiin 8 ryhmään, joissa kussakin 10 hiirtä. 7 päivän ja 10 päivän kuluttua ymp-päämisestä B.caniksella, ryhmiä käsiteltiin seuraavasti: ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, ei saanut mitään käsittelyä; ryhmä 2 sai puskurilla täytettyjä SPLV:tä (0,2 ml i.p.); ryhmä 3 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia (1 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ryhmä 4 sai vesipitoista strepto-mysiinisulfaattia (5 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ryhmä 5 sai vesipitoista streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ryhmä 6 sai SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (1 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml, i.p.; ryhmä 7 sai SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (5 mg/kg ruumiinpainoa kohti) 36 831 61 kaikkiaan 0,2 ml i.p.; ja ryhmä 8 sai SPLVrtä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) kaikkiaan 0,2 ml i.p. Päivänä 14 ymppäämisen jälkeen B.caniksen kanssa, kaikki eläimet tapettiin ja pernat poistettiin aseptisesti. Pernat homogenoitiin ja tehtiin sarjalaimennukset brucella agar-levyille eloonjääneiden B.canisten lukumäärän laskemista varten pernoissa käsittelyn jälkeen. Tulokset 14 päivän inkuboinnin jälkeen on esitetty kuviossa 5.

Tulokset useista kaksivaiheisista käsittelyohjelmista B.canis-infektioiden suhteen in vivo, jotka on esitetty kuviossa 5 osoittavat että ryhmissä, jotka saivat vesipitoista streptomysiiniä 7 ja 10 päivää ymppäämisen jälkeen oli havaittavissa vain hyvin vähän eloonjääneiden B.caniksien vähenemistä pernoissa. Vain ryhmissä, jotka saivat SPLVihin kapseloitua streptomysiiniä konsentraatiolla 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, joka annettiin 7 ja 10 päivänä ymppäämisen jälkeen, kaikki elinkykyinen bakteeri oli hävitetty pernoista infektoiduilla eläimillä.

Edellä selostetun kokeen lisäksi otettiin useista B.caniksella infektoitujen hiirien kudoksista näytteitä kahden käsittelyn jälkeen SPLV:hin kapseloidun streptomysiinin kanssa seuraavasti: 30 täysikasvuista sveitsiläistä koirashiirtä ympättiin B.canis 7 ATCC 23365:llä (1 x 10 CFU, i.p.). 7 päivää ymppäyksen jälkeen eläimet jaettiin 3 ryhmään kussakin 10 eläintä. Ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, ei saanut mitään käsittelyä; ryhmä 2 sai (päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen) vesipitoista streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) joka kerta 0,2 ml i.p.; ryhmä 3 sai (päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen) SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) joka kerta 0,2 ml i.p. Päivinä 14-75 B.caniksella ymppäyksen jälkeen kaikki eläimet tapettiin ja seuraavat elimet poistettiin aseptisesti, homogenisoitiin ja laimennettiin sarjoiksi brucella agar-levyille B.caniksen eristämistä varten: sydän, keuhkot, perna, maksa, munuaiset, kivekset. 4 vrk inkuboinnin 37 831 61 jälkeen eloonjääneiden B.canisten lukumäärien tulokset per elin on esitetty kuviossa 6.

Tulokset eri kudoksista B.caniksen infektoimista hiiristä otetuista näytteistä kahden käsittelyn jälkeen streptomysiinillä, jotka on esitetty kuviossa 6, osoittivat että kaikki SPLVrssä kapseloidulla streptomysiinillä käsiteltyjen hiirien kudosnäytteet 14-75 vrk ymppäyksen jälkeen B.caniksella olivat täysin vapaita elinkelpoisista B.canis organismeista. Eläimistä, joita ei oltu käsitelty tai joita oli käsitelty vesipitoisella streptomysiinillä, sellaisilla konsentraatioilla ja lääkkeen-anto-ohjelmilla, jotka olivat identtisiä niiden kanssa, jotka saivat SPLV:hin kapseloitua streptomysiiniä, voitiin eristää elinkelpoisia B.canis organismeja kaikista kudosnäytteistä, jotka oli otettu 14-75 vrk ymppäyksen jälkeen B.canis organismin kanssa.

Hoidon tehokkuus käytettäessä MLV:tä ja SPLV:tä keskenään verrattuina_ 15 täysikasvuista koiraspuolista sveitsiläistä hiirtä ympättiin B.canis ATCC 23365:llä (1 x 10^ CFU, i.p.). 7 vrk ymppäyksen jälkeen eläimet jaettiin 3 ryhmään kussakin 5 hiirtä. Ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, ei saanut mitään käsittelyä; ryhmä 2 sai (päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen) MLV:tä, joissa oli streptomysiinisulfaattia (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, i.p.). MLV:t oli valmistettu konventionaalisella tekniikalla käyttäen 100 mg muna-fosfatidyylikoliinia (EPC) ja 2 ml steriiliä HEPES'iä, joka sisälsi streptomysiinisulfaattia (100 mg/ml).

Suhde lipidi:streptomysiinisulfaatti oli 100 mg EPC; 28 mg streptomysiinisulfaattia 2 ml:ssa lopullista MLV-suspensiota; ryhmä 3 sai (päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen) SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiini-sulfaattia (lO mg/kg ruumiinpainoa kohti i.p.), jotka oli valmistettu kuten jaksossa "Antibioottia sisältävät SPLV:t" on selostettu seuraavin muunnoksin; käytettiin 100 mg EPC;tä ja 0,3 ml HEPES'iä, joka sisälsi 100 mg streptomysiinisulfaattia. Suhde lipidi:streptomysiinisulfaatti SPLVissä oli 100 mg EPC;28 mg streptomysiinisulfaattia 2 ml:ssa 38 831 61 lopullista suspensiota. Päivänä 14 ymppäyksen jälkeen B.caniksen kanssa kaikki eläimet tapettiin ja pernat poistettiin aseptisesti, homogenoitiin ja laimennettiin sarjoiksi brucella agar-levyille B.canis organismin eristämiseksi. Tulokset elossa olevista B.canis organismeista per elin 4 vrk inkuboimisen jälkeen on esitetty taulukossa IX.

Taulukko IX

Streptomysiinisulfaattia sisältävien MLVrden ja SPLVrden B.canis organismeja hävittävän tehon vertailu in vivo kahden käsittelyn jälkeen5_

Kolonioita muodostavia yksiköitä B.canis organismeja per perna”

Kontrolli 2,7^1,0x10^ MLV:t l,8+0,4xl04

SPLV:tC O

g

Intraperitoneaalisten injektioiden, 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, antovälit olivat 3 vrk. Kontrollieläimet eivät saaneet käsittelyä.

Eloonjääneet B.canikset määrättiin CFU:n lukumääränä, jotka eristettiin per perna ja ilmaistaan keskiarvo +_ S.D. 5:ltä eläimeltä per ryhmä (duplikaattimääritykset per eläin) .

Q

Suhde muna-fosfatidyylikoliini:streptomysiinisulfaatti oli 100 mg lipidiä:28 mg streptomysiinisulfaattia.

SPLVrhin suljettujen eri antibioottien tehokkuus infektion hoidossa_____ 50 täysikasvuista sveitsiläistä koirashiirtä ympättiin käyttäen 7 B.canis ATCC 23365:tä (1 x 10 CFU, i.p.). Seitsemän päivää ymppäyksen jälkeen eläimet jaettiin 10 ryhmään, kussakin 5 eläintä. Ryhmä 1, jota kutsutaan kontrolliksi, ei saanut käsittelyä; ryhmä 2 sai puskuritäytteisiä SPLV:tä (0,2 ml i.p.) päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen; ryhmät 3, 4, 5 ja 6 saivat vesipitoisia ruiskeita (0,2 ml i.p.), jotka sisälsivät dihydrostreptomysiiniä, gentamysiiniä, kanamysiiniä tai streptomysiiniä 10 mg/kg ruumiin- 39 83 1 61 painoa kohti i.p. päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen (huom. jokainen näistä antibiooteista tappaa tunnetusti B.canis organismin in vitro). Ryhmät 7, 8, 9 ja 10 saivat SPLVrtä, jotka sisälsivät dihydrostreptomysiiniä, gentamysiiniä, kanamysiiniä tai streptomysiiniä 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen. Päivänä 14 B.canista käyttäen tapahtuneen ymppäyksen jälkeen kaikki eläimet tapettiin ja pernat otettiin aseptisesti, homogenoitiin ja liuotettiin sarjana brucella agar-levyille B.caniksen eristämistä varten. Tulokset eloonjääneistä B.caniksista per elin 4 päivää inkuboinnin jälkeen on esitetty taulukossa X.

Taulukko X

Vertailu eri antibioottien B.caniksen hävittämiskyvyn välillä in vivo, kahden käsittelyn jälkeen5_

Kolonioita muodostavia yksiköitä B.canis organismeja per perna*3_

Vesiliuokset SPLVrhin suljettu _ antibiootti_ Käsittelemätön 3,93^1,51x10^ 4,66+0,87x10^

Antibiootti0

Dihydrostreptomysiini 1,13^0,30x10^ O

Gentamysiini 7,06+2,53xl05 0 5

Kanamysiini 2,72_+0,91x10 0

Streptomysiini 1,01^0,17x10^ O

Intraperitoneaalisten käsittelyjen, 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, väliä oli 3 vrk. Kontrollieläimet eivät saaneet mitään käsittelyä.

bEloonjääneet B.canikset per elin määrättiin per perna eristettyjen CFU:den lukumääränä ja ilmoitettiin keskiarvo _+ standardipoik-keama viidestä eläimestä ryhmää kohti (duplikaattimääritykset eläintä kohti).

°Tehokkaasti B.canis organismeja tuhoavat antibiootit suspensio-viljelyssä .

\ 4o 83161

Testitulokset eri antibioottien tehokkuudesta B.canis-organis-min avulla infektoitujen hiirien suhteen taulukossa X osoittavat, että antibiootit, jotka tuhoavat B.caniksen tehokkaasti in vitro (esimerkiksi suspensioviljelyssä) ovat myös vain silloin tehokkaita tuhoamaan B.canis-infektioita in vivo, kun ne on kapseloitu SPLV:den sisään. Eläimet, jotka saivat joko vesipitoisia antibiootteja, puskuritäytteisiä SPLV:tä tai ei lainkaan käsittelyä, eivät missään tapauksessa selvinneet vapaiksi elossa olevista B.caniksista eristetyissä pernakudoksissa.

B.canis organismin avulla infektoitujen koirien käsittely Täysikasvuisia naaraspuolisia beagle-koiria ympättiin käyttäen 7 B.canis ATCC 23365:tä (1 x 10 CFU) oraalisesti ja vaginaalisesti.

7 päivää ymppäyksen jälkeen koirat jaettiin 3 ryhmään. Ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, ei saanut mitään käsittelyä; ryhmä 2 sai (päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen) vesipitoista streptomysiinisulfaattia 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti (kukin antomäärä oli 5,0 ml, i.p.); ryhmä 3 sai (päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen) SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti (kukin antomäärä oli 3,0 ml, i.p.). Koottiin vagina-pyyhkäisytukkoja ja hepariinipitoisia verinäytteitä koirilta tasaisin väliajoin ennen tutkimuksen alkua, sen aikana ja sen päätyttyä. Nämä pantiin viljelyyn brucella agar-levyille B.caniksen eristämistä varten. Tulokset on esitetty taulukossa XI. Kerättiin seeruminäytteitä ennen tutkimuksen alkua, sen aikana ja sen päätyttyä seerumi-vasta-aineen eristämiseksi B.canikselle. Nämä tulokset ovat myös taulukossa XI. 21 päivää B.caniksen kanssa tapahtuneen ymppäyksen jälkeen kaikki eläimet tapettiin. Seuraavat kudokset poistettiin aseptisesti, homogenoitiin ja laimennettiin sarjaan brucella agar-levyille B.caniksen eristämiseksi: hepariinia sisältävä veri, vaginaerite, keuhkot, perna, nivelvoide, uterus, ovarium, polvitaipeen imusolmukkeet, sylkirauhaset, kitarisat, välikarsinan imusolmukkeet, suoliliepeen imusolmukkeet, luuydin, kohdunkaulan pinnalliset imusolmukkeet, ja auksiliaariset imusolmukkeet. Tulokset eloonjääneistä B.caniksista per kudos 4 vrk inkuboinnin jälkeen on esitetty taulukossa XII.

4i 83161

Taulukko XI

Tulokset viljelyistä ja serologisista kokeista B. canis-infektoiduissa koirissa, joita käsiteltiin kaksivaihe- antibioottiohjelmalla_ Päiviä B.canis- SPLV:hin sul- infektion jettu Strepto- jälkeen Kontrolli Streptomysiini*3 mysiinic_

R M B V_R M B V_R 24 B V

Esi-käsi-telty_ 0 0000 0000 0000 2 ND ND + + ND ND + 0 ND ND + + 4 ND ND + + ND ND + + ND ND + + Jälki käsitelty 8 000 + oo + o'oooo 10 000 + 000 + 0000 21 1,5 2 + + 1 2 + + 0000 a R (nopea lasilevy agglutinaatiotesti) ilmaisee seerumitiit- 2 terin ja B.canis antigeenin resiprookkisuutta (xlO ); 0 = ei havaittavaa tiitteriä.

M (2-merkaptoetanoliputki agglutinaatiotesti) ilmeisee seerumitiitterin ja B.canis antigeenin resiprookkisuuden (xl0z); 0 = ei havaittavaa tiitteriä.

Kohdassa B (veriviljely) ja V (vaginaviljely) brucella agarissa: + = suurempi tai yhtä suuri kuin 1 CFU; 0 = ei havaittu kolonioita. Kontrollit eivät saaneet mitään käsittelyä.

b Streptomysiinisulfaatti (vesipitoinen) 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, i.p.

c SPLVrt, jotka sisältävät strcptomysiinisulfaattia 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, i.p.

42 83161

Taulukko XII

Viljelytulokset kudosnäytteistä B.canis-infektoiduilla koirilla, jotka olivat saaneet kaksivaiheisen antibiootti- hoito-ohj elman_ SPLV:t, jotka k sisältävät Strepto- Kontrol-

KudosP_ streptomysiiniä0 mysiinid lie_ Täysveri 0 + +

Vaginapyyhkäisy 0 + +

Keuhkot 0 + +

Perna 0 + +

Nivelvoideneste N.D. 0 0

Uterus 0 + +

Ovarium 0 + +

Polvitaipeen imusolmukkeet N.D. + +

Sylkirauhanen 0 00

Kitarisat 0 + + Välikarsinan imusolmukkeet 0 N.D. +

Suoliliepeen imusolmukkeet N.D. 0 0

Luuydin 0 + +

Kohdunkaulan imusolmukkeet N.D. N.D. +

Auksilaariset imurauhaset 0 + + a Eläimiä käsiteltiin päivinä 7 ja 10 infektion jälkeen.

b Nekropsiassa otetut näytteet laimennettiin sarjoiksi brucella-agarlevyihin; + = yhtä suuri tai suurempi kuin 1 CFU; 0 - ei kolonioita.

c SPLV:t, jotka sisälsivät streptomysiinisulfaattia, 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, i.p.

d Streptomysiinisulfaatti (vesipitoinen), 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti, i.p.

e Kontrollit eivät saaneet mitään käsittelyä.

43 83161

Tulokset viljely- ja serologisista testeistä koirilla, jotka oli infektoitu B.caniksella ennen kaksivaiheista antiobioo-tin antoa, sen aikana ja jälkeen, on esitetty taulukossa XI. Kaikki eläimet olivat serologisesti negatiivisia aikaisemman B.canis-infektion suhteen mitattuna negatiivisina seerumi-tiittereinä, ja viljelynegatiivisia veriviljelyjen ja vagina-pyyhkäisyjen viljelyjen suhteen. Kaikki eläimet havaittiin viljelypositiivisiksi sekä veri- että vaginaviljelyille ennen käsittelyjä päivinä 7 ja 10. Koirat, joita käsiteltiin vesipitoisella streptomysiinillä tai koirat jotka eivät saaneet mitään käsittelyä, pysyivät viljelypositiivisina veri-ja vaginaviljelyjen suhteen jälkikäsittelyn aikana ennen sen lopettamista päivänä 21. Ryhmä 3, joka sai liposomeja, jotka sisälsivät vesipitoista streptomysiiniä, tuli viljelynegatiivi-seksi ensimmäisenä päivänä ensimmäisen käsittelyn tapahduttua ja pysyi negatiivisena läpi koko jälkikäsittelyvaiheen. Koirat, jotka eivät saaneet mitään käsittelyä tai vesipitoista streptomysiiniä, antoivat havaittavat seerumitiitterit B.canis-antigeeneja vastaan päivänä 21 ymppäyksen jälkeen, kun taas ne, joita käsiteltiin SPLVrllä, jotka sisälsivät antibiootteja päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen, eivät kehittäneet mitään havaittavaa vasta-ainetta B.canis-antigeenille^

Tulokset B.canis-organismin eristämisestä infektoiduista koirista, joita käsiteltiin kaksivaiheisesti antamalla antibiootteja, ovat taulukossa XII ja ne osoittavat, että ainoastaan käsittely SPLV:llä, jotka sisälsivät streptomysiiniä, oli tehokasta koirilla eliminoimaan elinvoimaiset B.canis-organismit täydellisesti kaikista elinnäytteiden kudoksista .

B.abortuksen käsittely marsuilla

Viisitoista täysikasvuista naaraspuolista marsua ympättiin 7 käyttäen B.abortus ATCC 23451 (1 x 10 CFU, i.p.). Seitsemän päivää ymppäyksen jälkeen eläimet jaettiin 3 ryhmään, 5 eläintä kussakin. Ryhmä 1, jota nimitettiin kontrolliksi, ei saanut mitään käsittelyä. Ryhmä 2 sai vesipitoista streptomysiini-sulfaattia, i.p. injektioina (0,2 ml) 10 mg/kg ruumiinpainoa 44 831 61 kohti päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen B.abortus-organis-min kanssa. Ryhmä 3 sai SPLV:tä, jotka sisälsivät streptomy-siinisulfaattia i.p. injektioina (0,2 ml) 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti päivinä 7 ja 10 ymppäyksen jälkeen B.abortuksen kanssa. Päivänä 14 ymppäyksen jälkeen, joka suoritettiin B.abortuksen kanssa, kaikki eläimet tapettiin ja pernat poistettiin ja homogenoitiin aseptisesti ja laimennettiin sarjaksi brucella agarlevyille B.abortuksen eristämistä varten. Tulokset eloonjääneistä B.abortuksista per perna 4. päivänä inku-boinnin aloittamisesta, on esitetty kuviossa 7. Ainoastaan streptomysiiniä sisältävät SPLV:t olivat tehokkaita eliminoimaan B.abortukset, joita oli marsun pernassa. Eläimissä, jotka saivat vesipitoista streptomysiiniä tai jotka eivät saaneet mitään käsittelyä, identifioitiin elinvoimaisia B.abor-tus-bakteereja.

B.abortus-infektion hoitaminen lehmillä

Yhdeksää pahoin infektoitunutta eläintä käytettiin tässä kokeessa. B.abortus-bakteerin eristysnäytteet maidosta ja va-ginatupoista tulivat negatiivisiksi ja pysyivät negatiivisina 6 viikon ajan SPLV:llä käsittelyn jälkeen, jotka sisälsivät streptomysiiniä. Kun infektio uusi näillä eläimillä, bak-teerieristysnäytteitä löydettiin vain utareen neljänneksistä, jotka olivat positiivisia ennen käsittelyä.

Yhdeksän ristisiitettyä (hereford-jersey-Brangus), 22 kk ikäisiä, ei-graviideja, B.abortus-positiivisiksi todettuja lehmiä käytettiin testissä. Ainakin 4 kuukautta ennen tutkimuksen alkua eläimet ympättiin per conjunctivum käyttäen 1 x 10 CFU B.abortusta, kanta 2308 tiineyden keskivaiheilla, mikä päättyi aborttiin ja/tai B.abortus-viljelyn positiivisuuteen maito- tai uteruseriteessä ja/tai fetaalikudoksissa.

Lehmiä pidettiin individuaalisesti eristetyissä pilttuissa ja ne erotettiin kolmeksi ryhmäksi. Käsittely oli kaksi annosta käsittävä, 3 päivän välein, seuraavasti: 1) 3 lehmää injektoitiin intraperitoneaalisesti fysiologisella suolaliuoksella. 2) 3 lehmää injektoitiin intraperitoneaalisesti 45 831 61 vesipitoisella antibiootilla (streptomysiiniä 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) plus esivalmistettuja puskuritäytteisiä SPLVrtä. 3) 3 lehmää injektoitiin intraperitoneaalisesti SPLV:hin suljetun streptomysiinin kanssa (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti. Koko injektion volyymi oli per injektio 100 ml per eläin.

Kahden ensimmäisen kuukauden aikana suoritettiin duplikaatti bakteeriviljelyjä maito- ja uteruseritteistä viikottain, mikäli eritteitä oli käytettävissä. Sitten kaikki eläimet tapettiin yliannoksella natriumpentabarbitolia ja seuraavat elimet otettiin talteen duplikaatteina bakteriologisia viljelyjä varten: 1) imusolmukkeet seuraavista kohdista: vasen ja oikea atlasnikama, vasen ja oikea nielun yläpuolinen, vasen ja oikea alaleuka, vasen ja oikea korva, vasen ja oikea lapaluu, vasen ja oikea reisi, vasen ja oikea kainalokuoppa, vasen ja oikea polvitaive, vasen ja oikea suoliluu sisäpuolelta, vasen ja oikea nisärauhanen yläpuolelta, vasen ja oikea munuainen, keuhkoputki, välikarsina, suolilieve ja maksa; 2) rauhaset: kaikki neljä nisärauhasen neljännestä, vasen ja oikea lisämunuainen ja kateenkorva (mikäli jäljellä); 3) elimet ja muut kudokset: perna, maksa, vasen ja oikea uteruksen sarvi, kohdunkaula, vagina, munuaiset ja kitarisa.

Nekropsia jälkeen kaikki kudokset jäähdytettiin ja pidettiin -70°C:ssa kuljetuksen aikana. Kudokset sulatettiin, liekitettiin alkoholilla ja siistittiin aseptisesti ennen punnitusta. Kun painot oli merkitty muistiin (0,2-1,0 g) kudos homogenoitiin 1 ml:aan steriiliä suolaliuosta ja laimennettiin steriilin suolaliuoksen kanssa 1:10 ^ alkuperäisestä homo-genaatin suspensiosta. Tasamääriä (20 ^ul) kustakin laimennuksesta sarjasuspensioista pantiin brucella agarlevyille ja asetettiin 27°C:een inkuboitumaan. Kustakin kudoksesta tehtiin duplikaattmääritykset.

Levyt tutkittiin joka päivä ja arvioitiin niiden bakteeri-kasvu. Kaikki koloniat, jotka ilmestyivät ennen 3. päivää, 46 831 61 eristettiin, siirrettiin ja gramvärjättiin identtisyyden määräämiseksi. Päivinä 5, 6 ja 7 inkuboinnin aikana laskettiin ne koloniat, jotka olivat morfologian, kasvun ja gram-värjäyksen puolesta karakteristisia B.abortukselle: CFU per gramma kudosta määrättiin sen jälkeen. Tyypillisiä kolonioita siirrettiin uudelleen B.abortus-bakteerin vahvistamiseksi.

Bakteriologiset eristykset tehtiin kaikista kudosnäytteistä ja laskettiin bakteerien määrä per gramma kudosta. Tulokset neljästä eläimestä - yksi plasebo-kontrolli ja kolme eläintä, joita käsiteltiin SPLV:hin suljetun streptomysiinin kanssa -on esitetty taulukossa XIII.

47 831 61

Taulukko XIII

Tulokset B.abortus-injektoitujen lehmien kudos-viljelynäytteistä_ Käsittelemätön SPLV:hin suljettu streptomysiini „ , kontrolli 1 23

Kudos - -

Lisämunuaisrauha- nen, vasen 0 0 0 0

Lisämunuaisrauha- nen, oikea ++ 0 0 +

Atlasnikaman oikea imusolmuke ++ + 0 +

Atlasnikaman vasen imusolmuke 0 0 0 +

Kainalokuopan oikea imusolmuke +++ 0+0

Kainalokuopan vasen imusolmuke ++ 0 0 0

Keuhkoputken imusolmuke 0 0 0 0

Kohdunkaula 0 000

Maksa ++++ 000

Uteruksen vasen sarvi 0 00+

Uteruksen oikea sarvi 0 0 0 0

Suoliluun oikea imusolmuke ++ 0 0 0

Suoliluun vasen imusolmuke ++++ 0 + 0

Munuaiset 0 000

Maksa 0 0 0 0

Keuhkot 0 000

Utareet vasen etu 0 + + 0

Utareet vasen taka 0 00+

Utareet oikea etu ++ 0 0 0

Utareet oikea taka ++ 0 0 0

Alaleuan imusolmuke oikea +++ 000

Alaleuan imusolmuke vasen +++ 0 0 0 Välikarsinan imusolmuke ++ 0+0

Suoliliepeen imusolmuke +++ 0 0 0

Korvan imusolmuke vasen +++ 0 0 0

Korvan imusolmuke oikea +++ 0 0 0

Polvitaipeen imusolmuke, vasen + 0 0 0

Polvitaipeen imusolmuke, oikea + 0 0 0

Reiden imusolmuke vasen + 0 0 0

Reiden imusolmuke oikea 0 0 0 0

Lapaluun imusolmuke vasen 0 0 0 +

Lapaluun imusolmuke oikea ++++ 0 0 0

Munuaisten imusolmuke 0 0 0 0

Perna +++ 0 0 0

Utareen yläosan imusolmuke vasen +++ + 00

Utareen yläosan imusolmuke oikea 0 0 0 0

Nielun yläosan imusolmuke vasen + 0 0 0

Nielun yläosan imusolmuke oikea 0 0 0 0

Kateenkorva 0 000

Vagina +++ 000 48 831 61 O Ei havaittavia bakteereja 0,3-1 g:n kudoksen vilje lyssä.

+ Alle 200 koloniaa/g kudosta.

++ Yli 300 koloniaa/g.

+++ Yli 1000 koloniaa/g.

++ + + Yli 100 000 koloniaa/g.

Esimerkki: Qkulaarisairauksien hoito

Bakteerin aiheuttamat ja muut sen kaltaiset infektiot samoin kuin useat muut silmäsairaudet aiheuttavat maailmanlaajuisia taloudellisia ja yleisiä terveysprobleemeja ja johtavat, mikäli niitä ei hoideta tai hoidetaan väärin, näön menetykseen ja mahdollisesti kuolemaan septisemian vuoksi. Bakteeri-infektioiden ihmis- ja eläinsilmissä ilmoitetaan aiheutuvan useista bakteereista kuten seuraavat, mutta ne eivät rajoitu ainoastaan näihin: Clostridium spp., Corynebacterium spp., Leptospira spp., Moraxella spp., Mycobacterium spp., Neisseria spp., Propionibacterium spp., Proteus spp., Pseudomonas spp., Serratia spp:t., E. Coli spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. ja bakteerien kaltaiset organismit kuten Mycoplasma spp. ja Rickettsia spp. Sekä eläimet että ihmiset toimivat varastoina, joista infektiota aiheuttava bakteeri saattaa levitä toisesta toiseen.

Tällaisia bakteeri-infektioita ei voida hoitaa antibiooteilla ilman pitkällistä ja rasittavaa hoito-ohjelmaa, jossa on joko taajoja hoitokertoja jopa kahdenkymmenen minuutin välein ihmisillä joissakin infektioissa, tai vaarallisen korkeita antibiootin konsentraatioita kudoksissa. Nykyiset hoitomenetelmät ovat vaikeita useista muistakin syistä. Infektion aiheuttavat organismit silmän pintakudoksissa ovat joissakin tapauksissa erittäin resistenttejä antibioottien bakteereja hävittävälle vaikutukselle ja antibioottien ulkoisen antamisen tuloksena voi olla lääkkeen nopea häviäminen silmäkuo « 83161 pasta kontaktiajän jäädessä hyvin erilaiseksi. Yleisenä sääntönä on, että silmän infektion hoidon on oltava täysin tehokas, koska mikä tahansa jäljelle jäänyt infektio voi yksinkertaisesti infektoida uudelleen kyynelerityksen kautta ja sykli alkaa taas uudestaan. Lisäksi useissa tapauksissa infektion poistamiseen tarvittavat lääkekonsentraatiot voivat aiheuttaa näön heikentymistä ja joissakin tapauksissa voi tuloksena olla täydellinen sokeus. Tällaisten sairauksien taloudellinen merkitys kotieläinten tapauksessa on miljoonissa dollareissa, jotka vuosittain menetetään, koska ainoa mahdollinen tapa taistella tällaisia infektiosairauksia vastaan on viivytetty lääkehoito ja karanteeni.

Seuraavissa esimerkeissä arvostellaan hoidon tehokkuutta käytettäessä vapaata antibioottia glyseriinissä verrattuna SPLVrhin suljettuun antibioottiin M.bovis silmäinfektioissa.

M.bovis aiheuttaa keratoconjunctivitis-infektion (pink eye) karjassa. Tälle tautitilalle on ominaista blefarospasmi, kyynelten eritys, conjunctivitis ja erilaiset cornean sameudet ja ulceraatiot. Täysikasvuisilla lehmillä voi kehittyä lievää kuumetta ja hieman heikentynyt ruokahalu ja heikentynyt maidon tuotanto. Vaikka useat antibiootit tehoavat M.bovikseen, niitä on annettava varhain ja hyvin usein paikallisesti tai subkonjunktiivisesti injektoimalla.

Selostettujen esimerkkien mukaan terapeuttisen aineen vaikutuksen kesto ja tehokkuus ovat pidentyneet.

On yllättävää, että tämä systeemi on tehokas vain yhden tai kahden antokerran jälkeen, sillä tällaiset infektiot eivät anna vastetta yksinkertaiseen tavalliseen antibioottihoitoon. Tavalliset hoidot jättävät usein pieniä infektion jäännöksiä, jotka infektoivat silmän uudelleen, niin että infek-tiosykli alkaa uudestaan, ellei infektiota ole juuriaan myöten hävitetty usein toistetulla hoidolla.

so 83161

Infektoituneen keratoconjunctivitiksen hoitaminen hiirillä 160 kpl C 57 mustaa hiirtä jaettiin 8 ryhmään. Puolet kustakin ryhmästä joutui molempiin silmiin kohdistetun U.V.-säteilyn alaisiksi(cornealeesioiden synnyttämiseksi). Kaikkiin eläimiin ympättiin sitten M.bovis-bakteereja tiputtamalla /: oikeaan silmään konsentraatiolla 1 x 10 bakteeria per silmä. 24 h ymppäyksen jälkeen arvioitiin kaikkien eläinten cornean opaakkisuusaste. Kaikkia 8 ryhmää käsiteltiin antamalla ulkoisesti seuraava lääkitys kumpaankin silmään: ryhmät 1 ja 2 saivat 10 ^ul SPLVihin suljettua streptomysiiniä (30 mg/ml); ryhmät 3 ja 4 saivat 10 ^ul streptomysiiniä (100 mg/ml); ryhmät 5 ja 6 saivat 10 ^ul puskuritäytteisiä SPLV:tä suspen-doituina vesipitoiseen streptomysiiniin (100 mg/ml); ja ryhmät 7 ja 8 saivat 10 ^ul steriiliä suolaliuosta (huom. infek-toitumatonta vasenta silmää käsiteltiin samoilla ulkonaisilla liuoksilla jotta voitaisiin määritellä, ärsyttääkö SPLV:den käyttö silmää; mitään ärsytystä ei havaittu). Kerran päivässä tarkastettiin olivatko eläinten comealeesiot lisääntyneet vai vähentyneet ja päivinä 3, 5 ja 7 käsittelyn jälkeen oikeat silmät pyyhkäistiin tukolla ja M.boviksen eristykset suoritettiin eläimiltä. M.bovis-koloniat tutkittiin kolonioiden morfologian ja reaktiivisuuden perusteella fluoresoivasti merkittyyn M.bovis-nukan vasta-aineeseen. Tulokset, jotka on esitetty taulukossa XIV, paljastavat, että ainoastaan SPLV:hin suljettu streptomysiini oli tehokasta poistamaan infektion.

Kanin conjunctivitiksen hoitaminen käyttämällä SPLVihin suljettua antibioottia M.bovis, ATCC kanta 10900, laimennettiin konsentraatioon 7 1 x 10 solua per ml steriiliin suolaliuokseen (0,085 %

NaCl). Tasamääriä (0,1 ml) bakteerisuspensiota ympättiin ulkoisesti kymmenen täysikasvuisen naaraskaniinin silmiin. Viljely-näytteitä otettiin päivittäin pyyhkäisemällä conjunctiivat ja panemalla tupot levyille, joissa oli verta agarissa M.boviksen eristämiseksi. Kolme päivää ymppäyksestä kanit jaettiin 3 ryhmään: 2 eläintä ei saanut lainkaan käsittelyä (kontrollit); 4 eläintä sai streptomysiiniä steriilissä suolaliuoksessa (konsentraatio 10 mg/kg ruumiinpainoa) ja 4 eläintä 51 83161 sai SPLVrhin suljettua streptomysiiniä steriilissä suolaliuoksessa (konsentraatio 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti). Kaikki liuokset annettiin ulkoisesti jokaiseen silmään.

24 h kuluttua uudistettiin kaikkien kanien conjunctiivojen pyyhkäisyt ja niitä jatkettiin päivittäin 7 päivän ajan.

M.boviksen eristämistulokset veri-agarlevyiltä on esitetty taulukossa XV.

52 83161

Taulukko XIV

Tulokset M.bovis-okulaari-infektion aiheuttaman hiiren infektoituneen keratoconjunctivitiksen hoidosta_

Hiirien lukumäärä per 20 hiiren M-bovis-ryhmä_ viljelyta

Ennen käsittelyä Käsittelyn jäi-Päiviä Cornean sameus- keinen Cornean käsittelyn aste*3_ sameusaste*3 jälkeen 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 __3 5

Ei-säteilyte- tyt hiiret

Kontrollit 16 3 0 1 0 18 2 0 0 0 4/5 4/5

Vapaa streptomysiini0 18 1 1 0 0 18 2 0 0 0 2/5 2/5

Puskuritäyt-teiset SPLV:t + vapaata streptomysiiniä0^ 17 2 1 0 0 18 1 1 0 0 2/5 3/5 SPLVshin suljettu streptomysiini0 17 3 000 20 0000 0/5 0/5 UV-säteilytetyt hiiret_

Kontrollit 1 1 5 9 4 10 3 1 2 4 5/5 5/5

Vapaa streptomysiini^ 0 4 9 7 0 14 3 2 1 0 3/5 4/5

Puskuritäyttei-set SPLV:t + vapaata streptomysiiniä^ 0 3 5 10 2 11 2 4 3 0 3/5 3/5 SPLV:hin suljettu streptcny- siini° 0 1 5 11 3 19 1 0 0 0 0/5 0/5 a Silmäviljely positiivinen M.boviksen läsnäolon suhteen, määrättynä fluoresoivan vasta-aineen värjäyksen avulla.

Normaalin cornean tutkimus: 1 = normaalin kiillon menetys; 2 = pieniä sameita pisteitä; 3 = osittainen cornean samentuminen; 4 = cornean täydellinen samentuminen.

Q

Annettu kaikkiaan 10 ^ul (1,0 mg streptomysiiniä silmää kohti) .

53 8 3 1 61

Taulukko XV

Tulokset kanin conjunctivasta otetuista eristeistä sen jälkeen kun oli ulkoisesti infektoitu M.boviksen kanssa ja käsitelty vesipitoisen streptomysiinin tai SPLV:hin kapse-loidun streptomysiinin kanssa_ M. bovis-viljelyta

Eläimen Päiviä infektoitumisesta_

Ryhmä numero Esikäsittelyt Jälkikäsittely0 - "j " —2 3 4' - -g- - j 7

Kontrolli 1 0 + +++++ 2 0 + + + + + +

Streptomy- siinid 1 0 + + + + + + 2 0 0 + + + + + 3 0 + + + + + + 4 0 + + + + + + SPLV:hin suljettu streptomysiini6 1 0 0 + 0000 2 0 + + 0000 3 0 + + 0000 4 0 + + 0000 3i

Viljelyistä tutkittiin M.bovis-kolonioiden läsnäolo veri-agarlevyillä 24 h 37°C:ssa. Plus (+) merkitsee suurempaa tai yhtä suurta kuin 1 CFU M.bovis'ta per isolaatti; 0 merkitsee: ei havaittavia kolonioita.

Kaikki eläimet ympättiin 1 x 10b CFU M.bovis'ta ulkoisesti molempiin silmiin.

Q

Eläimiä käsiteltiin 0,1 ml :11a liuosta ulkoisesti kumpaankin silmään.

^ Streptomysiiniä (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) steriilissä suolalioksessa.

SPLV:hin suljettua sterptomysiiniä (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) steriilissä suolaliuoksessa.

7 54 831 61

Keratoconjunctivitiksen hoito, joka on aiheutunut subkutaani-sesta infektiosta M.bovis, ATTC-kanta 10900 laimennettiin konsentraatioon 1 x 10 solua per ml steriiliin suolaliuokseen. Tasamääriä (0,1 ml) bakteerisuspensioita ympättiin täysikasvuisten kanien silmiin, jotka oli aikaisemmin infektoitu kuten otsakkeen "Kanin conjunctivitiksen hoitaminen käyttämällä SPLV:hin suljettua antibioottia" alla on selostettu ja joita ei oltu käsitelty SPLVtllä. Kaikkien 9 kanin oikeaan silmään ympättiin 0,1 ml M.bovis'ta subkutaanisesti conjunctiiva-kudokseen ja kaikkien kanien vasempaan silmään ympättiin 0,1 ml M.bovis'ta ulkoisesti. Viljelyä otettiin päivittäin molempien silmien conjunc-tiivoista kaikilta kaneilta ja pantiin veri-agarlevyille M.boviksen eristämiseksi. Kolme päivää ymppäyksen jälkeen jaettiin kanit 3 ryhmään: 2 eläintä ei saanut mitään käsittelyä; 3 eläintä sai streptomysiiniä standardi oftalmisena glyserii-nisuspensiona (streptomysiinin konsentraatio 10 mg/kg ruumiinpainoa kohti); ja 4 eläintä sai suolaliuossuspensiota, jossa oli SPLV:hin suljettua streptomysiiniä (10 mg streptomysiini-sulfaattia per kg ruumiinpaino). Suspensio tai liuos annettiin ulkoisesti (0,1 ml) kuhunkin silmään. 24 h kuluttua ja kunakin viitenä seuraavana päivänä otettiin pyyhkäisy con-junetiivoista kaikilta kaneilta. M.boviksen eristystulokset veri-agarlevyiltä on esitetty taulukossa XVI. Kaikille eläimille suoritettiin nekropsia kokeiden päätyttyä ja conjunctii-vat poistettiin kaikilta eläimiltä. Niistä suoritettiin vas-kulaaritutkimus ja ne jauhettiin, homogenoitiin ja pantiin veri-agarlevyille M.boviksen eristämistä varten. Tulokset on esitetty taulukossa XVII.

55 83161

Taulukko XVI

Tulokset kanin conjunctiivasta otetuista eristeistä sen jälkeen kun oli ympätty M.boviksen avulla conjunctiivamembraanei-hin ja käsitelty streptomysiinillä oftalmisissa glyseriini-liuoksissa tai SPLV:hin suljetulla streptomysiinillä suolaliuoksessa__ M.bovis-viljelyt E1... Päiviä infektoitumisen jälkeen0 _

Ryhmä numero13 Esikäsitelty Jälkikäsitelty 1 2 _3_4_5_

Kont- 1 + + + + + rolli 2 + + + + +

Streptanysiini 1 + + + + + glyseriiniliuck- 2 + + + + + sessa d 3 + + + + + SFLV:hin kapse- 1 + + 0 0 0 loitu streptomy- 2 + + 0 0 0 siinie 3 + + 0 0 0 4 + + 0 0 0 a Viljelyistä laskettiin M.bovis-kolonioiden lukumäärät veri-agarlevyillä 24 h jälkeen 37°C:ssa. Plus (+) esittää suurempaa tai yhtä suurta kuin 1 CFU M-boviksia per isolaatti; 0 esittää: ei havaittavia kolonioita.

Id 6

Kaikki eläimet ympättiin käyttäen 1 x 10° CFU M.hovista ulkoi- £ sesti molempiin silmiin 1 x 10 CFU M.hovista injektoitiin conjunctiivamembraaneihin oikeanpuolisiin silmiin; ja 1 x 10 CFU M.hovista pantiin ulkoisesti vasemmanpuoleisiin silmiin.

Q

Eläimiä käsiteltiin 0,1 ml:n kanssa liuosta ulkoisesti molempiin silmiin.

^ Eläimiä käsiteltiin ulkoisesti kumpaankin silmään käyttäen streptomysiiniä (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) oftalmises-sa glyseriiniperusliuoksessa.

Eläimiä käsiteltiin ulkoisesti kumpaankin silmään käyttäen SPLV:hin suljettua streptomysiiniä (10 mg/kg ruumiinpainoa kohti) steriilissä suolaliuoksessa.

0 56 8 3 1 61

Taulukko XVII

Tulokset kanien silmäkuopan ja siihen liittyvien kudosten nekropsiasta ymppäyksen jälkeen käyttäen M.hovista conjunctii-vakudoksiin ja joko oftalmisessa glyseriiniliuoksessa olevalla tai SPLV:hin suljetulla streptomysiinillä steriilissä suola-liuoksessa tapahtuneen käsittelyn jälkeen5__ M.bovis- Oikean silmän vasku- viljelyjen laarisysteemin arvioi- eristäminen minen*3___

Kontrolli A + 2+ B +2 +

Streptomysiini glyse-riiniliuoksessa_ A +2+ B +1 + C +2+ D +2 + SPLV:hin kapseloitu streptomysiini_ A 0 0 B 0 0 C 0 0 D 0 0

Merkkien selitykset ovat samat kuin taulukossa XII, suoritettu päivänä 5 infektion jälkeen.

Vaskulaarisysteemi arvioitu seuraavasti: 0 = suonet normaaleja; 1 = jotkut suonet selvästi laajentuneet ja pienemmät suonet sulautuneet niihin; 2 = hajanaista punaista, yksityiset suonet eivät helposti erotettavissa; 3 = diffuusia häränpunaista, vaskulaarivuotoa ja veren vuotamista conjunc-tiivaan.

SPLV:den tehokkuuden arvostelu verrattuna liposomi-valmis- teisiin okulaari-infektioiden hoidossa__ M.bovis (ATCC kanta 10900) laimennettiin konsentraatioon 7 1 x 10 solua per ml steriiliin suolaliuokseen. Tasamääriä (0,1 ml) bakteerisuspensiota ympättiin täysikasvuisten kanien molempien silmien conjunctiivakudoksiin. Pyyhkäistiin joka 57 831 61 päivä molempien silmien conjunctiivoja kaikilta kaneilta ja pantiin veri-agarlevyille M.boviksen eristämistä varten.

5 vrk ymppäämisen jälkeen kanit jaettiin 6 ryhmään: 2 eläintä ei saanut mitään käsittelyä (kontrollit); 3 eläintä sai SPLV:hin suljetun streptomysiinin suspensiota (10 mg strepto-mysiinisulfaattia per kg ruumiinpainoa) jonka- laimennettuna suhteessa 1:100, O.D.4qq (optinen tiheys 480 nm:llä) oli = 0,928; 3 eläintä sai SPLV:hin kapseloidun streptomysiinin suspensiota (10 mg streptomysiinisulfaattia per kg ruumiinpainoa kohti), jonka O.D.^qq oli = 0,449, kun laimennus oli suhteessa 1:100; 3 eläintä sai SPLV:hin kapseloidun streptomysiinin suspensiota (10 mg streptomysiinisulfaattia per kg ruumiinpainoa), jonka, laimennettuna suhteessa 1:100, O.D.^gg oli = 0,242; 3 eläintä sai SPLV:hin kapseloitua streptomysiinin suspensiota (10 mg streptomysiinisulfaattia per kg ruumiinpainoa) , jonka, laimennettuna suhteessa 1:100, O.D.^qq oli = 0,119; ja 2 eläintä sai multilamellisten rakkuloiden (MLV:t) suspensiota, jotka sisälsivät streptomysiiniä (10 mg streptomysiinisulfaattia per kg ruumiinpainoa), jonka O.D.^qq oli = 0,940 laimennuksessa 1:100. MLV:t tehtiin Fountain et ai. menetelmän mukaisesti, Curr. Micro, 6:373 (1981) lisäämällä streptomysiinisulfaattia kuivaan lipidikalvoon, joka sen jälkeen pantiin pyörreliikkeeseen ja annettiin paisua 2 h ajan; ei-kapseloitunut streptomysiini poistettiin useiden sentri-fugointien avulla.

Suspensioita annettiin ulkoisesti kuhunkin silmään. 24 h kuluttua otettiin pyyhkäisynäytteitä conjunctiivoista kaikista kaneista joka päivä 9 päivän aikana ja pantiin veriagariin levyille. Tulokset M.boviksen eristämisestä veriagarlevyillä on esitetty taulukossa XVIII. Kaikille eläimille suoritettiin nekropsia. Niissä tutkittiin kyyneleritykset ja conjunctiivat poistettiin aseptisesti kaikilta eläimiltä. Näistä tutkittiin vaskulaarisysteemi ja ne jauhettiin, homogenoitiin ja pantiin veriagarlevyille M.boviksen eristämistä varten. Tulokset on esitetty taulukossa XIX.

ss 83161

Esimerkki; Virusinfektioiden hoito

Lymfosyyttinen koriomeningitis-virus (LCMV), Arenavirus-ryhmään kuuluva, tunnetaan sairauksien aiheuttajana ihmisellä, ja LCMV-infektio on kuolettavan vaarallinen hiirillä, jotka ympätään intrakerebraalisesti tämän viruksen avulla. Hiirien kuoleman aiheuttavat immuunisolut, jotka reagoivat virusin-fektoituneita soluja vastaan. Virus ei tapa soluja, joissa se moninkertaistuu, sen vuoksi täytyy terapeuttisen aineen, jota käytetään hiirille, joko inhiboida viruksen lisääntyminen niin että immuunisolut eivät aktivoidu, ja/tai inhiboida immuunisolujen aktivoituminen.

Seuraava esimerkki havainnollistaa virusinfektioiden hoidon tehokkuutta annettaessa SPLVshin kapseloitua viruksia hävittävää yhdistettä.

Letaalin lymfosyyttisen koriomeningitis-virusinfektion hoito hiirillä__

Sveitsiläisiin, 2 kk:n ikäisiin hiiriin ympättiin intrakerebraalisesti letaali annos LCM-virusta, so. 100 plakkia muodostavaa yksikköä (PFU) 0,5 ml ymppäysmäärä per hiiri. Hiiret jaettiin 4 ryhmään, joissa 7 eläintä kussakin, ja niitä käsiteltiin päivinä 2, 3 ja 4 infektion jälkeen intraperito-neaalisin injektioin 0,1 ml/annos/hiiri seuraavasti: 1) "SPLV-R ryhmä" sai muna-fosfatidyylikoliini-suspensiota SPLV;ssä, jotka sisälsivät 3 mg ribavariinia/ml. SPLV:t valmistettiin käyttämällä 100 mg lipidiä ja 0,3 ml liuosta, jossa oli 100 mg lääkettä/ml PBS-puskuria; lääkkeen kapseloimisas-te oli 10 %; 2) "R-ryhmää" käsiteltiin ribavariiniliuoksella 3 mg/ml PBS; 3) "SPLV-ryhmää" käsiteltiin puskuritäytteisillä SPLV:llä (so. SPLV:t valmistettiin kuten edellä, mutta ilman ribavariinia); ja 4) "kontrolliryhmää" käsiteltiin PBSillä. Päivänä 5 infektion jälkeen tapettiin 2 hiirtä kustakin ryhmästä ja niiden pernat homogenoitiin (2 pernaa/ryhmä homogenoitiin PBStssä 1/20 paino per volyymi puskuria). Plakkia muodostavat yksiköt (PFU) per ml määrättiin kustakin suspensiosta.

59 8 3 1 61 Jäljelle jääviä 5 hiirtä kussakin ryhmässä tarkkailtiin le-taalisuuden suhteen kaksi kertaa päivässä 30 vrk aikana. Tulokset on esitetty taulukossa XX.

Taulukko XX osoittaa selvästi letaalisuuden lisääntymisen ja infektöiduista hiiristä löydettävien virusten lisääntymisen. Vielä ei tiedetä, johtuvatko nämä tulokset ribavariinin viruksia hävittävästä vaikutuksesta joka vapautuu SPLV:stä vai johtuvatko ne isäntähiiren immuunimoduloitumisesta ribavariinin viivytetyn vapautumisen aikana SPLV:stä.

60 831 61

Taulukko XVIII

M.boviksen eristäminen infektoidusta kanin cinjunctiivasta käsittelyn jälkeen SPLV:hin kapseloidun streptomysiinin laimennusten kanssa suolaliuoksessa tai MLVshin kapseloidun streptomysiinin kanssa suolaliuoksessa__ _M.boviksen eristäminen5_ Päiviä infektoimisen jälkeen Eläimen Esikäsittely Jälkikäsittely

Ryhmä_ numero 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Kontrolli 1 + + + + + + + + + + + + + + 2 + + + + + + + + + + + + + + MLVrhin kap- 1 + + + + + + + 00 + + + 0 + seloitu strep- 2 + + + + + +0 + +00 + + 0 tcnysiini SPLV:hin kap- 1 + + + + + 000000000 seloitu strep- 2 + + + + + 000000000 tcxnysiini 3 + + + + + 000000000 (laimentama ton) SPLVjhin kap- 1 + + + + + + 0 + + + + + + + seloitu strep- 2 + + + + + 00 + 000000 tomysiini 3 + + + + + 0000 + 0000 (laimennus 1:2) SPLV:hin kap- 1 + + + + + + + 0000000 seloitu strep- 2 + + + + + +000 + 0000 tcnysiini 3 + + + + + 00 + + + + + + + (laimennus 1:4) SPLV:hin kap- 1 + + + + + 00 + + + + + + + seloitu strep- 2 + + + + + 000000000 tcnysiini 3 + + + + + + + + 0 + + + + + (laimennus 1:6) a 6

Kaikki eläimet ympättiin käyttäen 1 x 10 CFU M.hovista injektoimalla molempien silmien conjunctiivamembraaneihin. Conjunctivan pyyhkäisyjä pantiin veri-agarlevyille. Viljelyistä tutkittiin M.bovis-kolonioiden läsnäoloa veri-agarlevyillä 24 h kuluttua 37°C:ssa; (+ ) = suurempi tai yhtä suuri kuin 1 CFU; 0 = ei havaittavia viljelyjä.

61 83161

Taulukko XIX

Tulokset kanin silmäkuoppa- ja siihen liittyvien kudosten nekropsiasta M.bovis-bakteerien kanssa suoritetun ymppäyksen jälkeen conjunctiivakudokseen ja joko MLVrhin kapseloidun streptomysiinin, SPLVrhin kapseloidun streptomysiinin tai SPLV:hin kapseloidun streptomysiinin laimennusten kanssa suoritetun käsittelyn jälkeen_

Silmien vas- M.bovixsen kulaarisysteemin Kyynelten Eläin eristäminen arviointi*3_ vuotaminen0

Kontrolli 1 + 1+ 1+ 2 + 1+ 1+ MLV:hin kapseloi- 1 + 1+ 1+ tu streptomysiini 2 0 1+ 0 SPLV:hin kapseloi- 10 0 0 tu streptomysiini 2 0 1+ 0 (laimentamaton) 30 0 0 SPLV:hin kapseloi- 1 + 2+ 2+ tu streptomysiini 2 0 0 0 (laimennus 1:2) 3 0 1+ 0 SPLVrhin kapseloi- 10 0 0 tu streptomysiini 2 0 1+ 0 (laimennus 1:4) 3 + 1+ 0 SPLVrhin kapseloi- 1 + 1+ 1+ tu streptomysiini 2 0 1+ 0 (laimennus 1:6) 3 + 1+ 0 a Merkit ovat samat kuin taulukossa XIV, joka suoritettiin päivänä 14 infektoimisen jälkeen.

b Vaskulaarisysteemi arvioitiin seuraavasti: 0 = suonet normaaleja; 1 = jotkut suonet laajentuneita ja pienemmät suonet sulautuneet niihin; 2 = hajanaista punaista, yksityiset suonet eivät helposti erotettavissa; 3 = hajanaista härän-punaista, vaskulaarivuotoa ja verenvuotoa conjunctiivaan.

Kyynelten valuminen arvioitiin seuraavati: 0 = ei valumista; 1 = valuminen kasteli luomet ja luomien lähellä olevat karvat; 2 = valuminen kasteli luomet, silmien lähellä olevat karvat ja alueet.

62 831 61

Taulukko XX

Letaalin LCM-virusinfektion hoito hiirellä5

Ryhmä Letaalisuusc Pernasta löydetyt virukset (PFU x 103/ml)c

Kontrolli 5/5 7,0 SPLV-ryhmä 5/5 6,9 R-ryhmä 5/5 5,2 SPLV-R-ryhmä 3/5 3,4 a Kaksi kuukautta vanhoihin hiiriin ympättiin intrakerebraa-lisesti letaali annos, so. 100 PFU LCM-virusta 0,05 ml:ssa ymppiä.

Letaalisuus ilmoitetaan numerona kuolleita/ryhmän lukumäärä.

c Viidentenä päivänä infektoimisesta 2 hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin ja niiden pernat homogenoitiin konsentraa-tioon 1 g pernaa/20 ml homogenaattia.

Claims (7)

63 831 61

1. Stabiilit plurilamelliset rakkulat, joiden rakkulakoko on 500 - 10 000 nm, tunnetut siitä, että niillä on muutamasta yli 100:aan lipidikaksoiskerrosta, jotka sulkevat väliinsä vähintään yhden veteen liuenneen aineen, ja joilla lipi-dikaksoiskerroksilla on järjestäytynyt molekyyliarkkiteh-tuuri, joka luo supermolekulaarisen rakenteen, joka eroaa toisten multilamellisten rakkuloiden rakenteesta siten, että verrattaessa stabiileja plurilamellisia rakkuloita muihin multilamellisiin rakkuloihin, jotka koostuvat samanlaisesta lipidistä ja vesipitoisesta aineosasta, niin niillä on seuraavat ominaisuudet: (a) korkeampi liuenneen aineen sisäänsulkemisprosentti, (b) alempi kelluvuustiheys, (c) noin 1/3 suurempi tilavuus, (d) suurempi stabiilisuus auto-oksidaatiota vastaan varastoitaessa puskurissa, (e) suurempi stabiilisuus ruumiinnesteissä, (f) suurempi sisältävän liuenneen aineen vapautumispro-sentti altistettaessa urealle, guanidiinille tai *:· ammoniumasetaatille, (g) alhaisempi sisältävän liuenneen aineen vapautumis-prosentti altistettaessa suolahapolle tai seerumille, ja (h) annettaessa viljeltäville soluille jakautuu sisään suljettu sisältö kauttaaltaan solujen sytosoliin, ja että niitä voidaan valmistaa seuraavasti: (a) muodostetaan dispersio vähintään yhdestä amfipaatti-sesta lipidistä orgaaniseen liuottlmeen, (b) yhdistetään kohdan (a) dispersio vesipitoisen faasin :...r kanssa kaksifaasiseoksen muodostamiseksi, johon • vesipitoinen faasi voidaan emulgoida täydellisesti, ja (c) poistetaan orgaaninen liuotin kaksifaasiseoksesta samanaikaisesti, kun vesipitoinen faasi emulgoidaan, jolloin vaiheet (a), (b) ja (c) suoritetaan lämpötilassa alueella 4-60eC ja saadaan stabiileja plurilamellisia rakkuloita, jotka ovat oleellisesti vapaita 64 83161 multilamellisista rakkuloista (MLV), unilamellisista rakkuloista (SUV) ja käänteisfaasihaihdutusrakkuloista (REV).

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset rakkulat, tunnetut siitä, että lämpötila menetelmän kohdissa (a) ja (b) on alempi kuin ainakin yhden mainituista lipideistä transi-tiolämpötila.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukaiset rakkulat, tunnetut siitä, että menetelmässä liuotin on hiilifluoridi tai di-etyylieetteri tai niiden seos.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukaiset rakkulat, tunnetut siitä, että menetelmässä liuottimena käytetään hapettumista ehkäisevää ainetta sisältävää liuotinta, edullisesti butyy-li-hydroksitolueenia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset rakkulat, tunnetut siitä, että menetelmän vaiheessa (b) ainakin 20 % mainitusta materiaalista saadaan suljetuksi rakkuloihin.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset rakkulat, tunnetut siitä, että liuottimen ja vesipitoisen faasin välinen tilavuussuhde on välillä 3:1 ja 100:1.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukaiset rakkulat, tunnetut siitä, että aine, joka suljetaan rakkuloihin, lisätään vesipitoisen faasin kanssa. 65 831 61