NO163168B - Fremgangsmaate for fremstilling av stabile, plurilamellaerevesikler - Google Patents

Abstract

Ny og forbedret type lipid vesikler, her kalt stabile plurilamellære vesikler eller SPLV,. fremstilles ved å tildanno en dispersjon av minst en amfipatisk væske, slik som fosfatidyl cholin i et organisk oppløsningsmiddel, kombinering av dispersjonen med en tilstrekkelig mengde av en vandig fase for å tildanne en bifase-blanding hvor den vandige fase helt kan emulgeres, og emulgering av den vandige fase og fordamping av det organiske oppløsningsmiddel fra bifase-blandingen.De fremstilte SPLV er stabile under lagring og kan benyttes in vivo for forsinket frigjøring av forbindelser og ved behandling av sykdommer.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av liposomer og deres anvendelse som bærere i avgivelsessystemer. Mer spesielt angår den fremstilling av en ny type 1ipidvesikler med unike egenskaper og som gir spesielle fordeler som øket stabilitet og høy innfangningseffektivitet.

Vesiklene som her fremstilles, har et vidt anvendelsesområde for eksempel som bæresystemer og målrettede avgivelsessystemer. Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av eksempler for behandling av brucellose, behandling av okulærinfeksjoner og behandling av lymfocytisk meningitt-virusinfeksjoner.

Liposomer er helt lukkede bisjiktsmembraner inneholdende en innfanget vandig fase. Liposomer kan være en hvilken som helst type unilamellære vesikler (med et enkelt membranbisjikt) eller multilamellære vesikler (løkllgnende strukturer som karakteriseres ved konsentriske membranbisjikt, hver separert fra det neste ved et vannsjikt).

De opprinnelige liposompreparatene til Bangham et al., (1965, "J. Mol. Biol.", 13:238-252) involverte suspendering av fosfolipider i et organisk oppløsningsmiddel som derefter ble fordampet til tørr tilstand og efterlot en vokslignende avsetning av foslipid i reaksjonsbeholderen. Derefter ble en egnet mengde vandig fase tilsatt, blandingen ble tillatt å "svelle" og de resulterende liposomer som bestod av multilamellære vesikler (herefter kalt MLV) ble dispergert på mekanisk måte. Strukturen for det resulterende membranbisjIkt er slik at de hydrofobe eller ikke-polare "haler" for lipidet orienterte seg mot midten av blsjiktet, mens de hydrofile eller polare "hoder" orienterte seg mot den vandige fase. Denne teknikk ga basis for utvikling av små sonikerte unilamellære vesikler (herefter kalt SUV) som beskrevet av Papahadjopoulos og Miller (1967, "Biochim. Biophys. Acta. 135:624-638). Disse "klassiske liposomer", hadde imidlertid et antall mangler av hvilken den ikke minste var et lavt volum av Innfanget vandig masse pr. mol lipid, samt en begrenset evne til å innkapsle store makromolekyler.

Forsøk på å øke innfanget volum medførte først å danne inverse miceller eller liposomforløpere, det vil si vesikler inneholdende en vandig fase, omgitt av et monosjikt av lipidmolekyler orientert slik at de polare hodegrupper er rettet mot den vandige fase. Liposomforløpere oppnås ved å tilsette den vandige oppløsning som skal innfanges til en oppløsning av polart lipid i et organisk oppløsningsmiddel og sonikering. Liposomforløperen fordampes derefter i nærvær av overskytende lipid. De resulterende liposomer, bestående av en vandig fase innfanget av et lipidbis]ikt, er dispergert i vandig fase, se US-PS 4 224 179 i navnet M. Schneider.

I et annet forsøk på å maksimalisere effektiviteten av innfangningen, beskriver Papahadjopoulos i US-PS 4 235 871 en "reversfase-fordampningsprosess" for fremstilling av oligolamellære 1ipidvesikler, også kjent som reversfase-fordamp-ningsvesikler (herefter kalt REV). I henhold til denne prosedyre blir den vandige fase som skal innfanges tilsatt til en blanding av polart lipid i et organisk oppløsnings-middel. Derefter blir en homogen emulsjon av vann-i-olje-typen dannet og det organiske oppløsningsmiddel fordampet inntil det er dannet en gel. Gelen omdannes så til en suspensjon ved dispergering av den gellignende blanding i et vandig medium. REV-produktet består hovedsakelig av unilamellære vesikler og enkelte oligolamellære vesikler som karakteriseres ved kun noen få konsentriske bisjikt med et stort indre vannrom. Visse permeabilitetsegenskaper for REV ble angitt å være tilsvarende de til MLV og SUV, se Szoka og Papahadjopoulos, 1978, "Proe. Nati. Acad. Sei.", USA, 75:4194-4198.

Liposomer som innfanger et antall forbindelser kan fremstilles, imidlertid er stabiliteten for liposomene under lagring uunngåelig begrenset. Dette stabilitetstap resulterer i lekkasje av innfanget forbindelse fra liposomet inn i omgivende media, og kan også resultere i forurensning av liposominnholdet ved permeasjon av stoffer fra omgivende media inn i liposomet selv. Som et resultat er lagrings-levetiden for tradisjonelle liposomer meget begrenset. Forsøk på å forbedre stabiliteten involverte innarbeiding i liposommembranet av visse stoffer (herefter kalt "stablisa-torer") som påvirker de fysikalske egenskaper for lipidbisjiktene (for eksempel steroidgrupper). Imidlertid er mange av disse stoffer relativt kostbare og fremstillingen av slike liposomer er ikke kostnadseffektiv.

I tillegg til lagringsproblemene for tradisjonelle liposomer kan et antall forbindelser ikke innarbeides i disse vesikler. MLV kan kun fremstilles under betingelser over faseovergangs-temperaturen for lipidmembranet. Dette forstyrrer innarbeiding av varmelabile molekyler i liposomene som er sammensatt av fosfolipider som viser ønskelige egenskaper, men som har lange og sterkt mettede sidekjeder.

Anvendelse av liposomer for terapeutisk bruk er beskrevet i "Liposomes: From Physical Structures To Therapeutic Appli-cations" av Knight, utgitt av Elsevier, North-Holland Biomedical Press, 1981. Meget er skrevet med henblikk på mulighetene for å benytte disse membranvesikler for medikamentavgivelsessystemer selv om et antall problemer er tilbake i forbindelse med systemene. Se for eksempel det som er beskrevet i US-PS 3 993 754 samt i US-PS 4 145 410. I et liposom-medikamentavgivelsessystem blir medikamentet fanget inn under liposomdannelse og derefter inngitt til pasienten som skal behandles. Medikamentet kan være oppløselig i vann eller i et ikke-polart oppløsningsmiddel. Typisk for slike beskrivelser er US-PS 4 235 871 og 4 224 179.

Enkelte ønskelige trekk ved medikamentavgivelsessystemer er motstandsevne overfor for rask utvasking av medikamentet ledsaget av forsinket frigjøring av medikamentet som vil forlenge medikamentets virkningstid. Dette øker effektiviteten for medikamentet og tillater bruk av færre inngivelser. Enkelte av problemene i forbindelse med å anvende liposompreparater in vivo inkluderer følgende: (1) liposominnfangede materialer lekker ut når liposomene inkuberes i kroppsfluidet. Dette skyldes blant annet fjerning av liposomal-fosfollpidene på grunn av høydensi-tetsplasma lipoproteiner, HDL, eller nedbrytning av liposommembranet på grunn av fosfolipaser. Et resultat av nedbrytningen av liposomene in vivo er at så og si alt liposominnhold frigis i løpet av kort tid, og derfor oppnås ikke forsinket frigivelse og motstandsevne mot

medikamentutvasking.

(2) Hvis på den annen side et meget stabilt liposom benyttes in vivo, (det vil si liposomer som ikke lekker når de Inkuberes i kroppsfluider), vil liposominnholdet ikke frigis efter behov. Som et resultat er disse stabile liposomer ineffektive som bærere for terapeutiske stoffer in vivo på grunn av at den forsinkede frigjøring eller evnen til frigjøring av liposominnholdet når dette er nødvendig, ikke oppnås. Hvis man imidlertid behandler en intracellulær infeksjon, er bibehold av stabiliteten i biologiske fluider inntil det tidspunkt der liposomer

opptas av den infiserte celle, vesentlig.

(3) Omkostningseffektiviteten for 1iposombærerne som benyttes i avglvelsessystemet. For eksempel er en forbedret fremgangsmåte for kjemoterapi av leishmanielle-infeksjoner ved bruk av liposom-innkapslede antileishmanielle medikamenter, angitt i US-PS 4 186 183. Liposomene som benyttes i kjemoterapien inneholdt et antall stabilisatorer som øket stabiliteten for liposomene in vivo. Som nevnt tidligere, er imidlertid disse stabilisatorer kostbare og fremstillingen av liposomet inneholdende

slike er ikke omkostningseffektiv.

(4) Til slutt er et problem man må ta med i betraktning ved bruk av liposomer som bærere ved medikament-avgivelsessystemer, den manglende evne til å bøte på den sykdom som behandles. I tillegg til den manglende evne til å motstå hurtig utvasking og å bevirke forsinket frigjøring, er et antall andre forklaringer for den manglende evne til å bøte på sykdommer, mulig. Hvis for eksempel liposomene opptas i målcellene celler fagocytiske celler, for eksempel retikuloendoteliale celler, skylles de hurtig ut fra systemet og gjør det innfangede medikament vesentlig mer ineffektivt mot sykdommer som involverer celler andre enn REV. Efter fagocytose blir liposomal-innholdet pakket med lysosomer fra delfagocytiske celler. Meget ofte vil nedbrytende enzymer inneholdt i lysosomer bryte ned den innfangede forbindelse, eller gjøre forbindelsen inaktiv ved å forandre dens struktur, eller spalte forbindelsen på de aktive punkter. Videre kan så liposomene ikke avgi en dose som er effektiv på grunn av den lave innf angningsef f ektivitet for aktiv forbindelse i vesiklene ved fremstilling.

Liposomer har også vært benyttet av forskere som modell-membransystemer og har vært benyttet som "målceller" i komplementmedierte iminoprøver. Når de benyttes i slike prøver, er det imidlertid viktig at liposommembranet ikke lekker når det inkuberes 1 sera på grunn av at disse prøver måler frigivning av liposominnholdet som en funksjon av serum-komplementaktivering ved immunkompleksdannelse involvert visse immunoglobulintyper (for eksempel IgM- og visse IgG-molekyler).

Oppfinnelsen tilveiebringer en ny og vesentlig forbedret type lipldvesikler som herefter vil angis som stabile plurilamellære vesikler (SPLV). Bortsett fra at de er strukturelt forskjellige fra multilamellære vesikler, MVL, blir SPLV også ifølge oppfinnelsen fremstilt på en annen måte enn MLV, har unike egenskaper sammenlignet med MLV og oppviser et antall forskjellige fordeler sammenlignet med MLV. Som et resultat av disse forskjeller, overvinner SPLV mange av de problemer som foreligger med de konvensjonelle lipidvesikler som til nu har vært tilgjengelige.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av stabile, plurilamellære vesikler med en vesikkelstørrelse innen området 500 til 10 000 nm og et antall lipidbisjikt innen området fra noen til over 100; - med større stabilitet mot autooksydasjon under lagring i buffer; - større stabilitet i kroppsfluidet;

en større prosentandel lekkasje av innfanget, oppløst materiale ved eksponering mot urea, guanidin eller

ammoniumacetat;

en mindre prosentandel lekkasje av innfanget oppløst

materiale ved eksponering til saltsyre eller serum; og

en fordeling av innfanget innhold via cytosol i celler ved

administrering til cellene i kultur;

og denne fremgangsmåte karakteriseres ved:

a) å tildanne en dlspersjon av minst ett amfipatisk lipid i et organisk oppløsningsmiddel; b) å kombinere den under a) oppnådde dlspersjon med en vandig fase for å tildanne en tofaseblanding der den vandige fase helt kan emulgeres, idet volumforholdet mellom oppløs-ningsmiddel og vandig fase er fra ca. 3:1 til 100:1; og c) å emulgere den vandige fase og fordampe det organiske oppløsningsmiddel av tofaseblandingen,

idet det ved trinnene a), b) og c) arbeides ved en temperatur innen området 4-60°C, for derved å oppnå stabile plurilamellære vesikler i det vesentlige frie for MLV, SUV og REV.

En heterogen blanding av lipidvesikler realiseres når SPLV syntetiseres. Tegn tyder på at lipidene i SPLV er organisert i en ny supramolekylær struktur. Mange av lipidvesiklene har et høyt antall bisjikt, leilighetsvis helt opp til 100 sjikt. Det kan være mulig at denne høye grad av sjiktdannelse bidrar til mange av de overraskende egenskaper som SPLV har, selv om forklaringene er teoretiske.

Egenskapene til SPLV omfatter:

(1) Evnen til å helbrede visse sykdommer som andre metodo-logier ikke kan helbrede; (2) Sterkt øket stabilitet for SPLV under lagring i buffer; (3) Den økede stabilitet for SPLV til å motstå barske fysiologiske omgivelser; (4) Innfangningen av materialer med høy effektivitet; (5) Evnen til å klebe til vev og celler i forlengede tidsrom; (6) Evnen til å frigi innfangede stoffer langsomt til kroppsvæsker; (7) Avgivelse og endelig dispergering av liposominnholdet ut gjennom cytosolen i målcellen;

(8) Forbedret kostnadseffektivitet ved fremstilling; og

(9) Frigivelse av forbindelser i deres bioaktive form in vivo.

På grunn av de unike egenskaper for SPLV er de spesielt brukbare som bærere i avgivelsessystemer in vivo, fordi de er motstandsdyktige overfor utskilling og er i stand til forsinket frigjøring. Metoder for bruk av SPLV for avgivelse av bioaktive forbindelser in vivo og behandling av patologier, slik som infeksjoner, skal beskrives.

Oppfinnelsen skal illustreres nærmere under henvisning til de ledsagende tegninger, der: Figur 1 grafisk viser forskjellen i membranstabiliteten, uttrykt som % lekkasje, mellom MLV og SPLV, behandlet med forskjellige urea- eller NaCl-konsentrasjoner; Figur 2 grafisk viser retensjon av både lipidet og den vandige fase i SPLV i øyelokksvev hos mus, og den forsinkede frigjøring av gentamycin fra SPLV in vivo; Figur 3 viser elektronspinn-resonans-absorpsjons-spektret for SPLV, (A) sammenlignet med det til MLV, (B); Figur 4 grafisk viser forskjellene i evnen til askorbat til å redusere doksyl-spinnprobene i SPLV og MLV; Figur 5 grafisk viser effektiviteten av en to-trinns behandling av Brucella canis-infeksjoner hos mus ved bruk av SPLV-innfanget streptomycin basert på B. canis som kunne gjenvinnes fra milten hos infiserte mus; Figur 6 grafisk viser effektiviteten av en to-trinns behandling av B. canis-infeksjoner hos mus ved bruk av SPLV-innfanget streptomycin, beregnet på B. canis som kunne gjenvinnes fra organer fra infiserte mus;

og

Figur 7 grafisk viser effektiviteten av en to-trlnns behandling av Brucella abortus hos marsvin ved bruk av SPLV-innfanget streptomycin.

SPLV fremstilles ved en prosess som resulterer i et produkt som er unikt overfor andre tidligere beskrevne liposomer.

SPLV 'er lipidvesikler som har fra noen til over 100 lipid-bisjlkt. Membranbisjiktet består av et bimolekylært sjikt av et amfipatisk lipid, hvori de ikke-polare hydrofobe hydro-karbon-"haler" peker innover mot midten av bisjiktet, og de polare, hydrofile "hoder" peker mot den vandige fase. Okkludert av bisjiktene, er et vandig rom hvorav en del opptar vesiklens lumen, og hvorav en del ligger mellom ved siden av hverandre liggende sjikt. Kompleksdannet med lipidbisjiktene kan være et antall proteiner, glukoproteiner, glukolipider, mucopolysakkarider og hvilke som helst andre hydrofobe og/eller amfipatiske stoffer.

SPLV fremstilles som følger: Et amfipatisk lipid eller en blanding av lipider, oppløses i et organisk oppløsnings-middel. Mange organiske oppløsningsmidler er egnet, men dietyleter, fluorerte hydrokarboner og blandinger av fluorerte hydrokarboner og eter er foretrukket. Til denne oppløsning tilsettes en vandig fase og den aktive bestanddel som skal innfanges. Denne bifaseblanding omdannes til SPLV ved emulgering av det vandige materiale med oppløsningsmiddel under fordampning av oppløsningsmidlet. Fordampningen kan gjennomføres under eller efter sonikering ved en hvilken som helst fordampningsteknikk, for eksempel fordampning ved å føre en strøm av inert gass over blandingen, ved oppvarming, eller ved vakuum. Volumet av benyttet oppløsningsmiddel må være i overskudd av det vandige volum i en mengde tilstrekkelig til at det vandige materiale totalt kan emulgeres 1 blandingen. I praksis benyttes minimalt grovt regnet 3 volumer oppløsningsmiddel til 1 volum vandig fase. Således kan forholdet mellom oppløsningsmiddel og vandig fase variere helt opp til 100 eller flere volumer oppløsningsmiddel pr. 1 volum vandig fase. Mengden av lipid må være tilstrekkelig til å overskride den mengde som er nødvendig for å belegge emulsjonsdråpene (ca. 40 ml lipid pr. mg vandig fase). Den øvre grense er begrenset kun av anvendelse av omkostnings-effektivitet idet SPLV kan lages av 15 g gummi eller lipid pr. ml vandig fase.

Fremgangsmåten gir lipidvesikler med forskjellig supramolekylær organisasjon i forhold til konvensjonelle liposomer. I henhold til oppfinnelsen kan hele prosessen gjennomføres ved en temperatur innen området 4 til 60°C, uansett faseomdanningstemperaturen for det benyttede lipid. Fordelen ved dette sistnevnte punkt er at varmelabile produkter som har ønskelige egenskaper, for eksempel lett denaturerbare proteiner, kan innarbeides i SPLV-preparatet fra fosfolipid, slik som distearylfosfatidylcholin, men kan omdannes til konvensjonelle liposomer kun ved temperaturer over fase omdanningstemperaturen. Fremgangsmåten tillater vanligvis at mer enn 20% tilgjengelig vannoppløselig materiale kan innarbeides, og mer enn 40Sé tilgjengelig lipidoppløselig materiale kan innarbeides. Med MLV er innfangingen av vandig fase vanligvis ikke over 10%.

De fleste amfipatiske lipider kan være bestanddeler i SPLV. Egnede hydrofile grupper er fosfat-, karboksyl-, sulfat- og aminogrupper. Egnede hydrofobe grupper er mettede og umettede alifatiske hydrokarboner og alifatiske hydrokarboner erstattet med minst en aromatisk og/eller cykloalifatisk gruppe. De foretrukne amfipatiske forbindelser er fosfolipider og nær beslektede kjemiske strukturer. Eksempler på disse er lecltin, fosfatidyletanolamin, lysolecitin, lysofatidyletanolamin, fosfatidinsyre og cerebrosider. Spesifikke eksempler på egnede lipider som kan brukes ved fremstilling av SPLV er fosfolipider som inkluderer naturlige lecitiner (det vil si egglecitin eller soyabønnlecitin) og syntetisk lecltin som mettede syntetiske lecitiner, for eksempel dimyristoylfosfatidylcholin eller dipalmitoyl-fosfatidylcholin eller distearylfosfatidylcholin) og umettede syntetiske lecitiner (for eksempel dioloylfosfatidylcholin eller dilinoloylfosfatldylcholin). SPLV-bisJiktene kan inneholde en steroid komponent som kolesterol, koprostanol, kolestanol, kolestan og lignende. Ved bruk av forbindelser med sure hydrofile grupper (fosfato, sulfato og så videre) vil de oppnådde SPLV være anioniske; med basiske grupper, slik som amlno, vil det oppnås kationiske liposomer; og med polyetylenoksy- eller glykolgrupper, vil det oppnås nøytrale liposomer. Størrelsen for SPLV varierer innen vide grenser. Området strekker seg fra ca. 500 nm til ca. 10 000 nm (10 pm) og er vanligvis ca. 1000 til ca. 4000 nm.

Praktisk talt enhver bioaktiv forbindelse kan fanges inn inne i en SPLV (innfanget er definert som Innfanging innen det vandige rom eller innenfor membranbisjIktet). Slike forbindelser er nukleinsyre, polynukleoider, antibakterlelle forbindelser, antivirale forbindelser, antifungale forbin-deiser, antiparasittiske forbindelser, tumoriside forbindelser, proteiner, toksiner, enzymer, hormoner, neurotrans-mittere, glykoproteiner, immunoglobuliner, immunomodulatorer, farvestoffer, radiomerkede stoffer, radio-opake forbindelser, fluorescente forbindelser, polysakkarider, celle-reseptorbindende molekyler, antiinflammatoriske midler, antlglaukomiske midler, mydriatiske forbindelser, lokal-anestetika og så videre.

Det følgende er et eksempel på de andeler som kan benyttes ved SPLV-syntese: SPLV kan oppnås ved å tilsette 50 jjmol fosfid til 5 ml dietyleter inneholdende 5 pg BHT (butylert hydroksytoluen) og derefter tilsette 0,3 ml av en vandig fase inneholdende det aktive stoff som skal innkapsles. Den resulterende oppløsning som omfatter materialet som skal innfanges og det innfangede lipid, sonikeres mens man fører en lnertgass over blandingen for således å fjerne mesteparten av oppløsningsmidlet. Denne utførelsesform. gir spesielt stabilt SPLV, spesielt på grunn av innarbeidingen av BHT i vesiklene.

Se også Lenk et al., 1982, "Eur. J. Biochem.", 121: 475-482, som beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av liposom-innkapslede antistoffer ved sonikering og fordamping av en oppløsning av kolesterol og fosfatidylcholin I en blanding av kloroform og eter med tilsatt vandig fase, men som ikke gir de relative forhold mellom lipid og vandig fase.

SPLV er klart distinkte i sine egenskaper til forskjell fra liposomer med en eller flere lameller (for eksempel SUV og REV). Fryse-fraktur-elektronmlkroskopi antyder at SPLV-preparater er i det vesentlige frie for SUV og REV, det vil si at mindre enn 20% av vesiklene er unilamellære. De er derfor ikke å skille fra MLV ved elektronmikroskopiske teknikker selv om mange av de fysikalske egenskaper er forskjellige. Imidlertid er den følgende detaljerte sammenligning fokusert på å skille SPLV fra MLV.

Stabiliteten for en lipidvesikkel henviser til evnen for vesikkelen til å sekvestere sitt okkluderte rom fra den ytre omgivelse i et langt tidsrom. Skal en lipidvesikkel være brukbar, er det vesentlig at den er stabil ved lagring og behandling. For enkelte anvendelser er det imidlertid ønskelig at vesiklene lekker ut sitt innhold langsomt ved anvendelse. For andre anvendelser er det ønskelig at vesikkelen forblir intakt efter anvendelse inntil den når sitt ønskede virkningspunkt. Det vil sees at SPLV oppviser disse ønskede karakteristika, mens MLV Ikke gjør det.

Det er to faktorer som forårsaker at vesiklene lekker. Den ene er autooksydasjon av lipidene hvorved hydrokarbonkjedene danner peroksyder som destabiliserer bisjiktene. Oksydasjon kan reduseres drastisk ved tilsetning av antioksydanter, slik som butylert hydroksytoluen, BHT, til vesikkelpreparatet. Vesiklene kan også lekke på grunn av at midler 1 den ytre omgivelse forstyrrer bisjiktorganiseringen i lipidene, slik at lipidene forblir Intakt, men membranutvikler en pore.

Preparater av lipidvesikler er hvitfarvet når de er nylagede. Ved autooksydasjon blir preparatene misfarvet, de blir brunaktige. En sammenligning mellom MLV og SPLV, fremstilt ved bruk av det samme lipid og vandige komponenter, viser at MLV misfarves i løpet av 1 eller 2 uker, mens SPLV forblir hvit i minst 2 måneder. Dette understøttes ved tynnsjikt-kromatografi av konstituent-lipidene som viste nedbrytning av lipidene i MLV, men ikke av lipidene i SPLV. Når disse vesikler fremstilles ved tilsetning av BHT, så vel som de andre konstituenter, opptrer MLV lett misfarvet I løpet av 1 måned, mens SPLV forblir hvit og synes stabil i minst 6 måneder eller lenger.

Anbragt i en buffer inneholdende isotonisk saltoppløsnlng ved nøytral pH-verdi, er SPLV inneholdende antibiotika stabil i mer enn 4 måneder som vist I tabell I. Disse data indikerer at ingen av de antibiotika som opprinnelig er Innkapslet i SPLV har lekket ut i forsøksperioden.

Andre funn indikerer at SPLV er i stand til å sekvestere et innkapslet middel fra molekyler så små som kalsiumion i mer enn 6 måneder. Arsenazo III er et farvestoff som forandrer farve fra rødt til blått ved den minste mengde tilstede-værende divalent kation. Ved innkapsling av farvestoffet i SPLV og tilsetning av kalsiumklorid til lagrlngsbufferen, er det mulig å måle stabiliteten for vesiklene ved å se efter en farveforandring. Farven forblir upåvisbar forskjellig fra den opprinnelige farve i minst 6,5 måneder, noe som viser at hverken har farvestoffet lekket ut eller ioner lekket Inn. Disse forsøk viser at SPLV er tilstrekkelig stabil til å motstå lagrings- og behandlingsproblemer. Selv om det er mulig å fremstille MLV som er stabil så lenge, må de fremstilles fra syntetiske lipider, slik som DSPC og blir således prohibitivt kostbare.

Å anbringe lipide vesikler i et medium som inneholder membranperturberende midler, er en mulighet for utprøving av forskjellige molekylorganiseringer. Avhengig av hvordan membranet er organisert, vil forskjellige vesikler reagere forskjellig på slike midler.

I de følgende forsøk ble vesikler fremstilt inneholdende et radioaktivt spormolekyl (<3>H-inulin) 1 det okkluderte, vandige rom. Inulln, et polysakkarid, fordeles i den vandige fase og hvis molekylet er radioaktivt merket, kan det benyttes for å følge vanninnholdet i lipidvesiklene. Efter et egnet eksponeringsintervall til ethvert gitt middel, separeres vesiklene fra mediet ved sentrifugering og den relative mengde radioaktivitet som er unnsloppet fra vesiklene til mediet bestemmes. Disse resultater er angitt i tabell II; verdiene er uttrykt som % lekkasje, noe som betyr den andel av radioaktivt materiale i det omgivende medium I forhold til utgangsmengden som var innkapslet i vesiklene.

SPLV er mer stabil enn MLV i saltsyre. Tabell II viser at både MLV og SPLV, fremstilt fra egglecitin, destabiliseres ved eksponering til 0.125N saltsyre i 1 time. Imidlertid er det verd å merke seg at SPLV er betydelig mindre ømfintlig overfor syre enn MLV. Antageligvis reflekterer denne forskjellige respons en iboende differanse 1 den måte lipidene reagerer på med sine omgivelser.

SPLV responderer forskjellig fra MLV ved eksponering til urea (figur 1 og tabell II). Urea er et molekyl med både en kaotroplsk effekt (forstyrrer strukturen i vann) og et sterkt dipolmoment. Det er observert at SPLV er langt mer ømfintlig overfor urea enn de er til et osmotisk middel, slik som natriumklorid ved samme konsentrasjon, se figur 1. MLV lekker ikke vesentlig mer i urea enn de ville gjøre i natriumklorid. Selv om forklaringen for denne forskjellige oppførsel er teoretisk, synes det som om at responsen skyldes diolvirk-ningen heller enn en kaotropisk egenskap, fordi guanidin som er et molekyl lik urea, ikke destabiliserer SPLV, se tabell II. Selv om guanidin også er sterkt kaotropisk, har forbindelsen Ikke noe sterkt dipolmoment.

SPLV er også ømfintlig overfor ammoniumacetat, mens MLV ikke er det, se tabell II. Imidlertid er hverken ammoniumionet (i ammoniumklorid) eller acetat (1 natrlumacetat) spesielt effektive I å forårsake destabilisering av SPLV. Således synes det som om det ikke er ioner selv, men polariteten 1 ammoniumacetatet som er ansvarlig for den induserte lekkasje. Til å begynne med synes disse resultater overraskende fordi SPLV er meget mer stabile enn MLV når de inkuberes i kroppsvæsker som sera eller blod. Imidlertid kan det foreslås en teoretisk forklaring for disse resultater (selvfølgelig er andre forklaringer mulige). Hvis stabiliteten i SPLV skyldes den unike struktur i membranbisjIktene slik at de polare grupper av membranlipldene hydrat!seres av en sky av orienterte vannmolekyler, eller hydratiseringsskall, er det mulig at ethvert middel som avbryter eller griper inn i et slikt hydratiseringsskall, fremmer forandringer i den strukturelle membranintegritet, og derfor lekkasje.

Uavhengig av om de teoretiske forklaringer for destabilisering av SPLV i urea er riktige, tjener resultatene til å vise karakteristiske forskjeller mellom strukturen av MLV og SPLV. Denne forskjell har et meget brukbart formål ved anvendelse. Som beskrevet ovenfor, begynner SPLV langsomt å lekke ved anvendelse i øyet. Antageligvis skyldes denne ønskede langsomme frigjøring av innholdet en tilsvarende destabilisering av SPLV ved eksponering til tårevæsken.

SPLV er mer stabil i serum enn MLV. Mange anvendelser av lipidvesikler inkluderer inngivelse av disse intraperitonealt slik som ved behandling av brucellose. For å være effektiv må vesiklene overleve i et tidsrom som gjør at de når det ønskede mål. SPLV og MLV, begge fremstilt egglecitin, ble eksponert til fetal bovinserum som inneholdt aktivt komple-ment, se tabell II. Efter 48 timers eksponering ved 37"C var SPLV påvisbart mer stabilt enn MLV.

SPLV oppviser et antall karakteristika som gjør disse forbindelser spesielt egnet som bærere for avgivningssystemer in vivo: (A) SPLV er motstandsdyktige overfor utskylling. Når SPLV inngis til en organisme, blir både lipidkomponenten og den innfangne aktive bestanddel holdt tilbake i vevet og av cellene til hvilke de er inngitt; (B) SPLV kan konstrueres til å tilveiebringe forsinket frigjøring. Stabiliteten for SPLV er "justerbar" idet SPLV er meget stabile under lagring og er stabil i nærvær av kroppsvæsker, men ved Inngivelse in vivo tillater en langsom lekkasje av de aktive bestanddeler den forsinkede frigjøring av de aktive bestanddeler; (C) På grunn av det høye innfangningsnivå og stabiliteten ved inngivelsen, blir effektive doser av den aktive bestanddel frigitt; og (D) Fremstillingen av SPLV er meget omkostningseffektiv idet stabiliteten av vesiklene oppnås uten innarbeiding av

kostbare stabilisatorer i bisjiktene.

De følgende forsøk viser noen av SPLVs karakteristika ved inngivelse topisk til øynene på prøvedyr. De SPLV som ble benyttet i disse forsøk, ble fremstilt som beskrevet ovenfor, bortsett fra at lipldblsjIktet og den aktive bestanddel hver var radioaktivt merket for å spore disse komponenter i øyevevet over et tidsrom.

SPLV ble . fremstilt ved å bruke 100 mg eggfosfatidylcholin, EPC, og 100 mg gentamycinsulfat. Lipidkomponenten ble merket radioaktivt ved innarbeiding av spormengder av <125>I-fosfatidyletanolamin (<125>I-PE) i bisjiktene, mens den aktive bestanddel I den vandige fase ble merket radioaktivt ved tilsetning av 125I-gentamycinsulfat (125I-GS). Disse SPLV ble vasket med buffer gjentatte ganger for effektivt å fjerne Ikke-innarbeidede eller ikke-innkapslede stoffer.

En andel av SPLV-preparatet ble fjernet og ekstrahert for å separere den organiske fase fra den vandige fase. Radioaktiviteten for hver fase ble målt for å bestemme det opprinnelige forhold 12<5>0-PE:1<25>I-GS (cpm-tellinger pr. minutt I lipidfasen dividert med cpm i den vandige fase) som ble innarbeidet i SPLV.

Ekstraheringen skjedde som følger:

0,8 ml 0,4M NaCl (vandig), 1 ml kloroform og 2 ml metanol ble blandet for å oppnå en homogen fase. Derefter ble 4 pl av den merkede SPLV tilsatt og iblandet; når SPLV-komponentene var oppløst i den organiske fase og i den vandige fase ble blandingen som opprinnelig var turbid, klar. Fasene ble separert ved tilsetning og iblanding av 1 ml vandig 0,4M NaCl og 1 ml kloroform, og ble derefter sentrifugert ved 2800 g i 5 minutter. En 1 ml mengde av hver fase ble fjernet, og radioaktiviteten i cpm ble målt. Det opprinnelige forhold 125I_PE:<125>I_GS var 1,55:1. 15 voksne Swiss Webster-hun-mus ble bedøvet og fastholdt (for å forhindre at de tørket seg i øynene). Like mengder på 2 pl av radioaktivt merket SPLV i suspensjonen ble topisk tilført hvert øye. Grupper på 3 dyr ble derefter avlivet 1, 2, 3, 18 og 24 timer senere. 9 Swiss Webster-hun-mus som kontroller ble behandlet på identisk måte, bortsett fra at de tilsvarende mengder på 2 pl av en vandig oppløsning av radioaktivt merket gentamycinsulfat ble tilført topisk til hvert øye. Grupper på 3 kontrolldyr ble avlivet efter 1, 4 og 8 timer.

Umiddelbart efter avliving ble dyrenes øyelokk fjernet, skåret opp og ekstrahert ved bruk av den tidligere beskrevne prosedyre for å separere de vandige komponenter fra lipid-komponentene. Radioaktiviteten for hver fase ble bestemt (så vel om det totale antall radioaktive tellinger). Radioaktiviteten målt i lipidfasen er en indikasjon på retensjonen av SPLV-lipider av øyevevet, mens radioaktiviteten målt i den vandige fase er en indikasjon på retensjonen av gentamycin i øyevevet. Figur 2 viser grafisk retensjonen av hver komponent I øyelokksvevet (uttrykt som prosentandel av det opprinnelige antall tellinger pr. minutt tilført øyet). Figur 2 viser klart retensjonen for SPLV-lipidkomponenten i øyelokksvevet over en 24 timers periode, og den forsinkede frigjøring av gentamycin fra SPLV i løpet av en 24 timers periode (reflektert av prosentandelen gentamycin tilbakeholdt i øyelokksvevet i denne tidsperiode). Figur 2 viser også at ikke innkapslede gentamycin (vandig gentamycin inngitt topisk) hurtig skylles vekk fra øyelokksvevet. For eksempel ble gentamycin i oppløsning som kontroll skyllet vekk fra øyelokksvevet i løpet av 4 timer (mindre enn 5% av gentamycin forble I øyelokksvevet). På den annen side ble mer enn 50# av SPLV-innkapslet gentamycin holdt tilbake av øyelokksvevet i denne 4 timers periode; i virkeligheten var ved slutten av 24 timers perioden mer enn 15SÉ av det SPLV-innkapslede gentamycin holdt tilbake av øyelokksvevet. Dette antyder at ca. 8556 av det SPLV-innkapslede gentamycin ble frigitt i løpet av 24 timer, mens 95$ av det ikke innkapslede gentamycinsulfat ble skyllet bort i løpet av en 4 timers periode.

Tabell III sammenligner forholdet mellom SPLV-lipidfasen og den vandige fase som holdes tilbake i øyelokksvevet på ethvert tidspunkt. En økning i dette forhold indikerer frigjøring av gentamycin fra SPLV.

Bioakivitetene for SPLV-innkapslet gentamycinsulfat som ble holdt tilbake av øyelokksvevet ble også bedømt. Gentamycinsulfat ble gjenvunnet fra øyelokksvevet ved å fjerne en mengde fra den vandige fase av øyelokksekstraktene fremstilt efter 3 timer efter at SPLV-innkapslet gentamycinsulfat ble tilført til øyet. Den vandige fasen ble seriefortynnet og 2 pl-mengder ble anbragt på Staphylococcus aureus-kulturer på agarplater; efter 24 timers inkubering ble lnhiberlngssonene målt. Gentamycinsulfat som ble gjenvunnet fra øyelokksvev-ekstraktene fra dyr behandlet med SPLV-innkapslet gentamycinsulfat bibeholdt fullt ut sin bioaktivitet.

Selv om SPLV og MLV synes Identiske ved elektronmikroskopi, viser ESR- (elektronspinnresonans-) spektroskopiforskjeller i den supramolekylaere struktur. SPLV kan adskilles fra MLV på basis av den molare arkitektur, slik dette påvises ved deres økede molekylorden, økede molekylbevegelse og større gjennomtrengelighet for askorbat. Det er sannsynlig at disse forskjeller i molekylærarkitektur bidrar til deres forskjellige biologiske effekter.

Ved elektronspinnresonansspektroskopi, blir en spinnprøve, slik som 5-doksylstearat (5 DS) innarbeidet i lipidbisjiktet. Det uparrede elektron i doksylgruppen absorberer mikrobølge-energi når prøven innføres i et magnetisk felt. Absorpsjons-spektret tillater bestemmelse av tre empiriske parametre: S, ordensparameteren; AG, den hyperfine koblingskonstant; og t (Tau) rotasjonskorrelasjonstiden. En typisk avlesning er vist i figur 3, der A er SPLV-signalet og B er MLV-signalet, begge er angitt for 5-doksylstearat. Spektrene ble tatt ved romtemperatur, skanderingsområdet var 100 Gauss. Ordensparameteren (s) som er avhengig både av 2T^ og 2T^ måler avviket for det observerte ESR-signal fra total enhetlig orientering i prøven. For en enhetlig orientert prøve, S - 1,00, en tilfeldig prøve, S = 0. Den hyperfine koblingskonstant A0, som kan beregnes fra 2T± og 2Tn ansees å reflektere lokal polaritet og reflekterer således posisjonen for spinnprøven i membranet. Rotasjonskorrelasjonstiden (som er avhengig av W0, h0, h-1) kan settes til den tid som er nødvendig for molekylene å "glemme" hva deres tydeligere romorientering var. En typisk ESR-bestemmelse for differansene mellom SPLV og MLV med 5-DS som spinnprøve, er oppsummert i tabell IV.

Selv om i begge tilfeller spinnprøven rappportorer fra den samme dybde i bisjiktet, har SPLV en signifikant større grad av molekylorden og molekylbevegelse enn MLV.

En annen illustrasjon på forskjellen mellom SPLV og MLV ligger i askorbatets evne til å redusere doksyl-spinnprøvene. Det har en tid vært kjent at askorbat reduserer doksyldeler, antageligvis til deres hydroksylamin-analoger som ikke absorberer mikrobølgeenergi i et magnetisk felt. I vandige oppløsninger inntrer reduksjonene hurtig med samtidig tap av ESR-signal. Hvis spinnprøven er i en beskyttet omgivelse, slik som et lipidbisjikt, kan den reduseres langsommere eller ikke i det hele tatt av det hydrofile askorbat. Således kan hastigheten av nitroksydreduksjonen benyttes for å studere graden av gjennomtrengning av askorbatet inn i lipidbisjikt. Figur 3 viser prosentandelen gjenværende spinn mot tiden for SPLV og MLV, suspendert i en askorbatoppløsning. Efter 90 minutter har askorbatet redusert 25# av prøv-en innleiret i MLV, men 6056 av prøven innleiret i SPLV. SPLV tillater at det kan oppnås en drastisk høyere gjennomtrengelighet for askorbat enn MLV.

Et annet eksempel på overlegenheten av SPLV i forhold til tradisjonell MLV, er at SPLV innfanger en større prosentandel av det tilgjengelige aktive materiale, og derved konserver-ende materiale (se tabell V).

Ytterligere en fordel for SPLV er at SPLV har en gjensidig påvirkning med cellene, slik at en relativt stor andel av materialet som er innkapslet inne i vesiklene dispergeres ut gjennom cellenes cytoplasma i stedet for å bli begrenset til fagocytiske vesikler. Når SPLV blandes med celler synes de to å koalisere. Ved koalesens samvirker SPLV til forskjell fra MLV med cellene in vitro, slik at alle cellene inneholder minst noe materiale opprinnelig innfanget i SPLV. Dette materiale synes å fordeles ut gjennom hver celle, og er ikke begrenset til akkurat de fagocytiske vesikler. Dette kan vises ved å innarbeide ferritin i den vandige fase av et SPLV-preparat. Efter koalesens med en celle i kultur, viser ultrastrukturen analyse at ferritin er fordelt ut gjennom cytosolen og ikke er bundet til de Intracellulære membraner. Mens dette fenomen kan vises å opptre med MLV, kan en større mengde materiale overføres ved hjelp av SPLV.

I tillegg har SPLV en lavere oppdriftsdensitet enn MLV. Dette måles ved "banding" i en fikol-gradient (se tabell VI).

Videre danner SPLV når de samles i en pellet ved sentrlfugering under fra 1000 til 100 000 x g, en pellet som er vesentlig større enn MLV, gitt den samme fosfolipidkonsen-trasjon. Ved en kraft på 16 000 x g, danner SPLV en pellet som er omtrent 1/3 større enn MLV.

Fordi fosfolipidbisjiktene er gjennomtrengelige for vann, vil, når MLV plasseres i en hypertonisk omgivelse, okkludert vann drives ut på grunn av osmotiske krefter. SPLV krymper mer enn MLV. Efter krymping i 16 timer i en buffer; som er 20 ganger høyere enn den indre saltkonsentrasjon, krymper i tillegg SPLV ikke til det samme sluttvolum som MLV (SPLV-pellets forblir 1/3 større enn MLV-pellets). Dette indikerer at forskjellen 1 pelletstørrelse ikke skyldes differanser i innelukket volumvann.

SPLV er spesielt anvendelig i systemer der de følgende faktorer er viktige: stabilitet under lagring og kontakt med kroppsvæsken; en relativt høy grad av innkapsling; omkost-ningsef f ektivitet ; og frigjøring av Innfanget forbindelse i den biologisk aktive form.

Avhengig av inngivelsesmetoden in vivo, kan videre SPLV være motstandsdyktig overfor hurtig utskylling (for eksempel der forsinket avgivelse er viktig) eller kan avgis til cellene 1

RES.

Som et resultat kan SPLV ifølge oppfinnelsen med hell benyttes i et vidt spektrum av systemer. De kan benyttes for å øke den terapeutiske effektivitet av medikamenter, for å helbrede infeksjoner, for å øke enzymerstatning, avgivelse av orale og topiske medikamenter, for å innføre genetisk informasjon i celler in vitro og in vivo, for fremstilling av vaksiner, for innføring av rekombinant deoksyribonukleinsyre-segmenter i celler, eller som diagnostiske reagenser for kliniske prøver efter frigjøring av innfangede "rapportør"-molekyler. SPLV kan også benyttes for å innkapsle kosmetiske preparater, pesticider, forbindelser for forsinket langsom avgivelse for å bevirke plantevekst og lignende.

De metoder som følger vil på basis av anvendelsen av SPLV beskrive bruk av SPLV eller ethvert annet liposom, eller lipidvesikkel med funksjonelle karakteristika, tilsvarende de til SPLV.

Avgivelse av forbindelser til celler in vitro, (for eksempel animalceller, planteceller, protister og så videre) krever generelt tilsetning av SPLV inneholdende forbindelsen til cellene i kultur. SPLV kan imidlertid også benyttes for å avgi forbindelser in vivo i dyr (inkludert mennesker), planter og protister. Avhengig av formålet for avgivelsen, kan SPLV Inngis på et antall måter: hos mennesker og dyr inkluderer dette injeksjon (for eksempel intravenøst, intraperitonealt, intramuskulært, subkutant, intraaurikulært, lntramammært, intraaureteralt, og så videre), topisk anvendelse (for eksempel på besmittede områder), og ved absorpsjon gjennom epiteliske eller mukokutane hinner, (for eksempel okulærepitel, oral mukosa, rektal- og vaginal epitelhinner, respirasjonstrakthinner, nasofaryngealmukosa, intestinalmukosa og så videre) i planter og protister inkluderer dette direkte anvendelse til organismer, dlspersjon i organismens habitat, tilsetning til det omgivende miljø eller omgivende vann og så videre.

Anvendelsesmåten kan også bestemme punkter og celler i organismen, hvortil forbindelsen skal avgis. For eksempel kan avgivelse til et spesifikt infeksjonspunkt lettest oppnås ved topisk påføring (hvis infeksjonen er ekstern). Avgivelse til sirkulasjonssystemet (og således de retikuloendoteliale celler) kan lettest oppnås ved intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær eller subkutan injeksjon.

Fordi SPLV tillater forsinket frigjøring av forbindelsen, kan doser som ellers ville være toksiske mot organismen, anvendes i en eller flere inngivelser til organismen.

De avsnitt som følger nedenfor beskriver noen totale skjemaer der SPLV kan benyttes, og viser oppfinnelsens ramme.

Et antall patologiske tilstander som opptrer hos mennesker, dyr og planter kan behandles mer effektivt ved innkapsling av den egnede forbindelse eller forbindelser i SPLV. Disse patologiske tilstander inkluderer Infeksjoner (intracellulære og ektråcellulære), cyster, tumorer og tumore celler, allergier og så videre.

Mange strategier er mulig for anvendelse av SPLV ved behandling av slike patologier; et antall totale skjemaer er angitt nedenfor, som er spesielt brukbare idet at de trekker fordel av det faktum at SPLV når de er inngitt in vivo, opptas av makrofager.

I et skjema blir SPLV benyttet for å avgi terapeutiske midler til punkter med Intracellulære infeksjoner. Visse sykdommer involverer en infeksjon av celler i det retikuloendoteliale system, for eksempel brucellose. Disse intracellulære infeksjoner er vanskelige å helbrede av et antall grunner: (1) fordi den infiserte organisme ligger inne i cellene i det retikuloendoteliale system, der er sekvestert fra sirkuler-ende terapeutiske midler som ikke kan krysse cellemembranene i terapeutisk tilstrekkelige konsentrasjoner og er derfor sterkt motstandsdyktige overfor behandling; (2) ofte er inngivelse av toksiske nivåer av terapeutiske midler nødvendig for å bekjempe slike infeksjoner; og (3) behandlingen må være helt effektiv fordi enhver restinfeksjon efter behandlingen kan føre til ny infeksjon av vertsorganismen eller kan overføres til andre verter.

I henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen blir SPLV inneholdende en egnet biologisk aktiv forbindelse inngitt (fortrinnsvis intraperitonealt eller intravenøst) til vertsorganismen eller den potensielle vertsorganisme; (for eksempel kan i dyreflokker både de ikke-infiserte dyr og de infiserte dyr behandles). Fordi fagocytiske celler opptar SPLV, vil inngivelse av et SPLV-innkapslet stoff som er biologisk aktivt mot den infiserende organisme, resultere i en retting av bioaktive substans mot infeksjonspunktet. Således kan foreliggende oppfinnelse benyttes til å eliminere infeksjoner forårsaket av et antall mikroorganismer, bakterier, parasitter, fungi, mykoplasma og vira inkludert Brucella spp., Mycobacterium spp., Salmonella spp., Listeria spp. , Francisella spp., Histoplasma spp., Corynebacterium spp., Coccidiodes spp. og lymfocytisk koriomeningittvirus.

Det terapeutiske middel som velges vil avhenge av organismen som forårsaker infeksjonen. For eksempel kan bakterie-infeksjoner elimineres ved innkapsling av et antibiotikum. Dette antibiotikum kan være inneholdt i det vandig fluid i SPLV, og/eller innført i vesikkelbisjiktet. Egnede antibiotika inkluderer penicillin, ampicillin, hetacillin, carbencillin, tetracyklin, tetracyklinhydroklorid, oksytetra-cykllnhydroklorid, klortetracyklinhydroklorid, 7-klor-6-dimetyltetracyklin, doksycyklinmonohydrat, metacyklin-hydroklorid, minocyklinhydroklorid, rolitetracyklin, dihydrostreptomycin, streptomycin, gentamycin, kanamycin, neomycin, erytromycin, karbomycin, oleandomycin, troleando-mycin, Polymyksin B collistin, cefalotinnatrium, cefaloridin, cefaloglycindihydrat og cefaleksinmonohydrat.

Effektiviteten ved slik behandling for helbredelse av brucellose er vist se eksemplene nedenfor. Ved hjelp av oppfinnelsen blir effektiviteten og virkningsvarigheten forlenget. Det er overraskende at dette systemet er effektivt for behandling av infeksjoner som ikke gir respons på kjente behandlinger, slik som antibiotika innfanget i MLV. Vellykket behandlinger uventet, fordi enhver liten gjenværende infeksjon vil spre seg, og infeksjonscyklusen vil begynne igjen. Videre er den vellykkede behandling av lymfocytisk koriomeningittvirusinfeksjon vist.

Selvfølgelig er behandlingen ikke begrenset til intracellulære infeksjoner. SPLV kan rettes mot et antall infeksjons-punkter uansett om disse er intracellulære eller ekstracellu-lære. I en annen utførelsesform benyttes for eksempel makrofager for å bære et aktivt middel til punktet for en systemisk ekstracellulær infeksjon. I henhold til dette skjema, blir SPLV benyttet for å avgi et terapeutisk stoff til ikke-infiserte makrofager ved inngivelse av SPLV in vivo, fortrinnsvis intraperitonealt eller intravenøst. Makrofagene vil koalisere med SPLV og derefter bli "lastet" med terapeutisk substans; generelt vil makrofagene holde på substansene i ca. 3-5 dager. Med en gang de "lastede" makrofager når infeksjonspunktet, ville patogenet opptas av makrofagene. Som et resultat vil patogenet komme i kontakt med den terapeutiske substans inneholdt i makrofagen og ødelegges. Denne utførelsesform er spesielt brukbar ved behandling av Staphylococcus aureus mastitis hos mennesker og kveg.

Hvis infeksjons- eller affliksjonspunktet er eksternt eller tilgjengelig, kan det SPLV-innfangede terapeutiske middel påføres topisk. En spesielt brukbar anvendelse medfører behandling av øyelidelser. Når det gjelder okulære lidelser, kan SPLV inneholdende en eller flere egnede aktive bestanddeler, tilføres topisk til det betente øyet. Et antall organismer forårsaker øyeinfeksjoner hos dyr og mennesker. Slike organismer inkluderer Moraxella spp., Clostridium spp., Corynebacterium spp., Diplococcus spp., Flavobacterlum spp. , Hemophilus spp., Klebsiella spp., Leptospira spp., Mycobacterium spp., Neisseria spp., Propionibacterium spp. , Proteus spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., Escherichia spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. og bakterielignende organismer inkludert Mycoplasma spp. og Rickettsia spp. Disse infeksjoner er vanskelige å fjerne ved bruk av konvensjonelle metoder fordi enhver restinfeksjon som forblir efter behandling kan infisere på ny på grunn av lakrimal sekresjon. I eksemplene nedenfor er vist anvendelsen av SPLV ved helbredelse av okulær infeksjon forårsaket av Moraxella bovis.

Fordi SPLV er motstandsdyktig overfor utskilling og er i stand til forsinket frigjøring av innholdet, er SPLV også brukbar ved behandling av enhver lidelse som krever forlenget kontakt med det aktive behandlende stoff. For eksempel er glaukom en mangel som karakteriseres ved en gradvis stigning av det intraokulære trykk og forårsaker progressivt tap av perifert syn, og, hvis mangelen ikke kontrolleres, tapet av sentralsynet og til slutt blindhet. Medikamenter som benyttes ved behandling av glaukom kan tilføres topisk som øyedråper. Imidlertid krever behandlingen ved tilføring av dråper hvert 15. minutt på grunn av den hurtige utskilling av medikamentet fra øyet. Hvis en lidelse, slik som glaukom skal behandles, kan terapeutiske stoffer som pilokarpin, floropryl, fysostigmin, karcholin, acetazolamid, etozolamid, diklorfenamid, karbachol, demekariumbromid, diisopropylfosfofluorldat, ekotioplatjodid, fysostigmin eller neostigmin og så videre, innfanges i SPLV som derefter tilføres det betente øyet.

Andre midler som kan innkapsles i SPLV og anvendes topisk inkluderer mydriatica (for eksempel epinefrin, fenylepin-efrin, hydroksyamfetamin, efedrin, atropin, homatropin, skopolamin, cyklopentolat, topicamid, encatropin og så videre), lokalanestetlka; antivirale midler (for eksempel idoksuridin, adeninarabinosid, og så videre), antimykotiske midler (for eksempel amfoteracin B, natamycin, pimaricin, flucytosin, nystantin, thimerosal, sulfamerazin, tiobendazol, tolnaftat, grisiofulvin, og så videre); antiparasittiske midler (for eksempel sulfonamider, pyrimetamin, clindamycin og så videre); og antiinflammatoriske midler (for eksempel corticosteroider slik som ACTH, hydrocortison, prednison, medryson, P-metason, deksametason, fluormetalon, triamcinalon og så videre).

De følgende eksempler gis for å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

FREMSTILLING AV SPLV

Som forklart tidligere, involverer den prinsipielle metode for fremstilling av SPLV-oppløsning av et l<!>ipid eller en blanding av lipider i et organisk oppløsningsmiddel, tilsetning av en vandig fase og materiale som skal innkapsles, og sonikering av blandingen. I den foretrukne utførelsesform blir oppløsningsmidlet fjernet under eller efter sonikeringen med en hvilken som helst fordampningsteknikk. Det SPLV som ble benyttet i alle de her angitte eksempler, ble fremstilt som beskrevet i de følgende underavsnitt (imidlertid kan en hvilken som helst metode som gir SPLV, benyttes).

SPLV inneholdende antibiotika

En 5 ml dletyleteroppløsning av 100 mg lecltin ble fremstilt. Blandingen ble anbragt i en rundkolbe. Derefter ble 0,3 ml av en oppløsning inneholdende 100 mg streptomycinsulfat ved pH 7,4 i 5 mmol HEPES (4-[2-hydroksyetyl]piperazino-2-etan-sulfonsyre/0,0725M NaCl/0,0725M KC1 pipettert inn i glass-kolben inneholdende dietyleteroppløsningen av lipid. Blandingen ble anbragt i en badsonikator (Laboratory Supplies Co., Inc.), av type 10536 i flere minutter;, (frekvens 80 kHz:utgangseffekt 80 W) med samtidig tørking til en viskøs pasta ved å føre over en mild nitrogenstrøm.

Til den viskøse pasta som ble tilbake, ble det tilsatt 10 ml 5 mmol HEPES. Det resulterende SPLV-preparat inneholdende streptomycin ble suspendert i bufferoppløsningen, rystet i flere minutter på en hvirvelblander og befridd for ikke-innkapslet streptomycin ved sentrifugering ved 12 000 x g i 10 minutter ved 20°C. Den resulterende kake ble suspendert i 0,5 ml 5 mmol HEPES.

Den ovenfor beskrevne prosedyre ble fulgt, bortsett fra at streptomycin ble erstattet av de følgende: dihydrostrepto-mycln, gentamycinsulfat, ampicillin, tetracyklinhydroklorid og kanamycin.

SPLV inneholdende andre membrankonstituenter

Den nettopp beskrevne fremgangsmåte ble fulgt bortsett fra at en hvilken som helst av de følgende ble tilsatt med egglecitin: (1) f osf atidinsyre til et molforhold på 8:2 lecitin:dicetylfosfat; (2) stearylamin til et molforhold på 8:2 lecitin:stearylamin; kolesterol og stearylamin til et molforhold på 7:2:1 for lecitin:kolesterol:stearylamin; og (3) fosfatidinsyre og kolesterol til et molforhold på 7:2:1 for lecitin:fosfatidinsyre:kolesterol.

SPLV inneholdende pilokarpln

Den innledningsvis beskrevne fremgangsmåte ble fulgt, bortsett fra at streptomycin som antibiotikum ble erstattet av pilokarpln.

SPLV fremstilt med og uten BHT Ikke-destillert eter inneholder en antioksydant, 1 jJg/ml butylhydroksytoluen, BHT, for lagringsformål. Prosedyren beskrevet innledningsvis ble fulgt ved bruk av ikke-destillert eter som oppløsningsmiddel for å innarbeide BHT i SPLV-preparatet.

For å fremstille SPLV uten innarbeiding av BHT, ble prosedyren som beskrevet innledningsvis fulgt ved bruk av destillert eter som oppløsningsmiddel.

Eksempel 2

SPLV- MEDIERT AVGIVELSE IN VITRO

I det følgende eksempel ble SPLV-mediert avgivelse av antibiotika til makrofager i kultur demonstrert.

Peritoneale makrofager ble oppnådd vedperitoneal utskilling fra C57BLK voksne han-mus og suspendert i minimalt essensielt medium (M.E.M.) av pH 7,2 inneholdende 10% varmeinaktivert fetal kalveserum. Cellene ble suspendert i en konsentrasjon av 1 x 10^ celler pr. ml i 96 brønn-vevkulturskåler. Til kulturene inneholdende adherente peritoneale makrofager, ble det tilsatt B. canis i konsentrasjoner på 1 x 10^ CFU (kolonidannende enheter) pr. ml. Efter 12 timer ble bakterier som ikke var opptatt av peritoneale makrofager fjernet ved gjentatte vaskinger med M.E.M. Efter vasking av peritoneale makrofagkul turer, ble disse delt i 5 grupper, hver inneholdende 12 replikatkulturer pr. gruppe.

Gruppe 1, betegnet som kontroll, mottok ingen behandling. Gruppe 2, mottok vandig streptomycinsulfat i en konsentrasjon av 1 mg/ml.

Gruppe 3 mottok bufferfylt SPLV.

Gruppe 4 mottok vandig streptomycinsulfat (1 mg/ml) pluss på forhånd dannet bufferfylt SPLV.

Gruppe 5 mottok SPLV inneholdende streptomycinsulfat (1 mg/1).

Efter 24 timer ble supernatanten fjernet ved gjentatte vaskinger, og peritoneal-makrofagene ble brutt opp ved gjentatt frysing og tining. Seriefortynning av slike oppbrutte makrofager ble plantet på brucella-agar og efter 4 dager ble overlevende B. canis bestemt ved begrensende fortynningsteknikker. Resultatet som vises i tabell 7 antyder at SPLV-innfanget streptomycin, var tptalt effektiv med henblikk på å drepe og eliminere intracellulær B. canis-infeksjon in vitro.

Forsøket ble gjentatt med B. abortus nøyaktig som beskrevet ovenfor, bortsett fra at de peritoneale makrofager ble oppnådd ved peritoneal vasking fra voksne albino-hun-marsvin. Resultatene er også vist i tabell VII.

Eksempel 3

BEHANDLING AV INTRACELLULÆRE INFEKSJONER

De følgende eksempler viser hvordan SPLV kan benyttes ved behandling av intracellulære Infeksjoner. De viste data demonstrerer: (1) effektiviteten av å benytte antibiotika innkapslet i SPLV ved behandling av sykdom og (2) den større effektivitet som oppnås ved inngivelse av multippeldoser av SPLV-preparatet. En sammenligning mellom MLV og SPLV som bærere benyttet i protokollene er beskrevet.

Brucellose forårsaker verdensomspennende økonomiske problemer og helseproblemer. Brucellose forårsakes av Brucella spp. Den er tilpasset mange pattedyrarter inkludert mennesker, husdyr og et antall villdyr. Seks Brucella spp. forårsaker brucellose hos dyr, disse er B. abortus, B. canis, B. melltensis, B. neotomae, B. ovis og B. suis. Både husdyr og ville dyr tjener som reservoar for en potensiell spredning av brucellose til andre dyr og mennesker.

Slike Infeksjoner kan ikke avhjelpes med antibiotika fordi de infiserte organismer befinner seg inne i cellene 1 det retikuloendoteliale system og er sterkt motstandsdyktige overfor baktericide aktiviteter hos antibiotika. Mengden av antibiotika som er nødvendig og lengden av behandlingen resulterer enten i toksiske virkninger mot dyret eller en uakseptabel konsentrasjon av angjeldende antibiotikum i dyrets vev. Den ytterligere vanskelighet ved behandling av denne sykdom, er at behandlingen må være totalt effektiv fordi enhver gjenværende infeksjon ganske enkelt vil spre seg og sykdomscyklusen begynne en gang til. Den økonomiske belastning ved'slike sykdommer vises ved de millioner av dollar verdifullt kveg som tapes hvert år på grunn av spontan abort. Den eneste potensielle måte å bekjempe slike infek-tiøse utbrudd på, er karantene og derefter nedslaktning av dyrene.

Eksemplene som følger omfatter innarbeiding av et antibiotika i SPLV og derefter inngivelse av den innkapslede aktive substans til dyrene ved inokulering av de infiserte dyr intraperitonealt.

Virkningen av en enkelt behandling av B. canls-infeks. lon ved bruk av SPLV- innfanget antibiotikum

80 voksne Swiss-han-mus ble infisert intraperitonealt, I.P., med B. canis ATCC 23365 (1 x IO<7> CFU) og delt i 8 grupper på 10 mus hver. 7 dager efter inokulering med B. canis, ble

gruppene behandlet som følger:

Gruppe 1, betegnet kontroll, fikk ingen behandling;

Gruppe 2 fikk bufferfylt SPLV (0,2 ml I.P.);

Gruppe 3 fikk vandig streptomycinsulfat (1 mg/kg kroppsvekt i en total inngivelse av 0,2 ml I.P.);

Gruppe 4 fikk vandig streptomycinsulfat (5 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse av 0,2 ml I.P.;

Gruppe 5 fikk vandig streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse av 0,2 ml I.P.;

Gruppe 6 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat (1 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse av 0,2 ml I.P.

Gruppe 7 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat (5 mg/kg kroppsvekt) i en total Inngivelse av 0,2 ml I.P.; og Gruppe 8 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse av 0,2 ml I.P.

På den 14. dag efter inokulering med B. canis, ble alle dyr avlivet og miltene fjernet aseptisk. Miltene ble homogenisert og seriefortynnet på brucella-agar for å bestemme antall overlevende B. canis i milten efter behandling. Resultatene efter 4 dagers inkubering er vist i tabell VIII.

Virkningen av multlppelbehandling av B. canis-infeks. lon ved bruk av SPLV- innfanget antibiotikum

80 voksne Swiss-han-mus ble infisert med B. canis ATCC 23365

(1 x IO<7> CFU, I.P.) og oppdelt i 8 grupper på 10 mus hver. 7 dager og 10 dager efter inokulering med -B. canis, ble gruppene behandlet som følger: Gruppe 1, betegnet kontroller, fikk ingen behandling;

Gruppe 2 fikk bufferfylt SPLV (0,2 ml, I.P.);

Gruppe 3 fikk vandig streptomycinsulfat (1 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse på 0,2 ml, I.P.;

Gruppe 4 fikk vandig streptomycinsulfat (5 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse på 0,2 ml, I.P.;

Gruppe 5 fikk vandig streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse på 0,2 ml, I.P.;

Gruppe 6 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat (1 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse på 0,2 ml, I.P.;

Gruppe 7 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat (5 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse på 0,2 ml, I.P.; og Gruppe 8 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt) i en total inngivelse på 0,2 ml, I.P.

På den 14. dag efter inokulering med B. canis, ble alle dyrene avlivet og miltene fjernet aseptisk. Miltene ble homogenisert og seriefortynnet på brucella-agar for å bestemme antallet overlevende B. canis i milten efter behandling. Resultatene efter 4 dagers inkubering er vist i figur 5. Resultatene av forskjellige to-trinns behandlingsopplegg av B. canis-infeksjoner in vivo er vist i figur 5, og viser at hos grupper som mottok vandig streptomycin 7 og 10 dager efter inokulering, ble meget liten reduksjon av overlevende B. canis i milter observert. Kun i grupper som mottok SPLV-innfanget streptomycin i en konsentrasjon av 10 mg/kg inngitt på dag 7 og 10 efter inokulering, ble alle levende bakterier eliminert fra milten i infiserte dyr. 1 tillegg til det ovenfor beskrevne forsøk, ble forskjellige vev fra B. canls-infiserte mus efter to behandlinger med SPLV-innfanget streptomycin, prøvet som følger: 30 voksne Swiss-han-mus ble Inokulert med B. canis ATCC 23365 (1 x IO<7> CFU, I.P.). 7 dager efter inokulering ble dyrene delt i 3 grupper på 10 mus hver.

Gruppe 1 som ble angitt som kontroller, fikk ingen behandling;

Gruppe 2 fikk på dag 7 og 10 efter inokulering vandig streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt) i hver inngivelse på 2 ml, I.P. ;

Gruppe 3 fikk på dag 7 og 10 efter Inokulering SPLV-holdig streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt) i hver inngivelse på 0,2 ml, I.P.

På dag 14 til 75 efter inokulering med B. canis ble alle dyr avlivet og de følgende organer fjernet aseptisk, homogenisert og seriefortynnet på brucella-agar for isolering av B. canis; hjerte, lunger, milt, lever, nyrer, testikler. Resultatene som ble oppnådd efter 4 dagers inkubering med henblikk på overlevende B. canis pr. organ, er vist i figur 6.

Resultatet av prøvetaking av forskjellige vev hos B. canis-infiserte mus efter to behandlingsopplegg, med streptomycin, slik det er vist i figur 6, viser at hos dyr som behandles med SPLV-innfanget streptomycin, var alle vevsprøver fra 14 til 25 dager efter inokulering med B. canis totalt frie for enhver levende B. canis-organisme. I dyr som var ubehandlet eller behandlet med vandig streptomycin 1 konsentrasjoner og inngivelsesplaner identisk med det som gjaldt SPLV-innfanget streptomycin, kunne levende B. canls-organismer isoleres i alle vev som ble tatt fra 14 til 75 dager efter inokulering med B. canis.

Effektivitet av behandling ved bruk av MLV

som sammenligning til SPLV

15 voksne Swiss-han-mus ble inokulert med B. canis ATCC 23365 (1 x IO<7>CFU, I.P.). 7 dager efter inokulering ble dyrene delt I 3 grupper på 5 mus hver.

Gruppe 1, betegnet som kontroll, fikk ingen behandling;

Gruppe 2 fikk på dag 7 og 10 efter inokulering, MLV inneholdende streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt, I.P.). MLV ble fremstilt ved konvensjonelle teknikker ved bruk av 100 mg eggfosfatidylcholin, EPC, og 2 ml steril HEPES Inneholdende streptomycinsulfat (100 mg/ml). Forholdet mellom lipid og streptomycinsulfat var 100 mg EPC pr. 28 mg i streptomycinsulfat i 2 ml ferdig MLV-suspensjon;

Gruppe 3 fikk på dag 7 og dag 10 efter inokulering SPLV-holdig streptomycinsulfat (10 mg/kg kroppsvekt, I.P.), fremstilt som beskrevet i første del av eksempel 1 med de følgende modifikasjoner: Det ble benyttet 100 mg EPC og 0,3 ml HEPES inneholdende 100 mg streptomycinsulfat. Forholdet mellom lipid og streptomycinsulfat i denne SPLV var 100 mg EPC pr. 28 mg streptomycinsulfat i 2 ml ferdig suspensjon.

På dag 14 efter inokulering med B. canis, ble alle dyr avlivet og miltene fjernet aseptisk, homogenisert og seriefortynnet på brucella-agar for isolering av B. canis. Resultatene av overlevende B. canis pr. organ efter 4 dagers inkubering, er vist i tabell IX.

Virkning av forskjellige SPLV- innfangede antibiotika ved behandling av infeksjoner 50 voksne Swiss-han-mus ble inokulert med B. canis ATCC 23365 (1 x IO<7> CFU, I.P.). 7 dager efter inokulering ble dyrene delt i 10 grupper på 5 dyr hver.

Gruppe 1, angitt som kontroll, fikk Ingen behandling;

Gruppe 2 fikk bufferfylt SPLV (0,2 ml, I.P.) på dag 7 og dag 10 efter inokulering;

Gruppene 3, 4, 5 og 6 fikk vandige injeksjoner (0,2 ml I.P.) av dihydrostreptomycin, gentamycin, kanamycin eller streptomycin, 10 mg/kg kroppsvekt, I.P., på dag 7 og 10 efter inokulering. (NB! Hvert av disse antibiotika har vist å drepe B. canis in vitro.)

Gruppene 7,8, 9 og 10 fikk SPLV-holdig dihydrostreptomycin, gentamycin, kanamycin eller streptomycin i en mengde av 10 mg/kg kroppsvekt på dag 7 og 10 efter inokulering.

På dag 14 efter inokulering med B. canis, ble alle dyrene avlivet og miltene fjernet aseptisk, homogenisert og seriefortynnet på brucella-agar for isolasjon av B. canis. Resultatene er overlevende B. canis pr. organ efter 4 dagers inkubering, er vist i tabell X.

Resultatene fra prøver av forskjellige antibiotika på B. canis-Infiserte mus slik disse finnes i tabell X, viser at antibiotika som er effektive for utryddelse av B. canis in vitro (det vil sl i suspensjonskultur) også kun er effektive med henblikk på utryddelse av B. canis-infeksjoner in vivo når de er innkapslet i SPLV.. Dyr som fikk enten vandige antibiotika, bufferfylte SPLV eller ingen behandling, var ikke i noe tilfelle fri for overlevende B. canis i isolerte miltvev.

Behandling av hunder infisert med B. canis

Voksne hun -beagler ble inokulert med B. canis ATCC 23365

(1 x IO<7> CFU) oralt og vaginalt. 7 dager efter inokulering, ble hundene delt i 3 grupper.

Gruppe 1, som angis som kontroll, fikk ingen behandling; Gruppe 2 fikk på dagene 7 og 10 efter inokulering vandig streptomycinsulfat 1 en mengde av 10 mg/kg kroppsvekt, hver inngivelse 5 ml, I.P.;

Gruppe 3 fikk på dagene 7 og 10 efter inokulering SPLV inneholdende streptomycinsulfat i en mengde av 10 mg/kg kroppsvekt med hver inngivelse på 3,0 ml, I.P. Vaginalutskrap av hundene og hepariniserte blodprøver ble samlet I regulære intervaller før, under og ved avslutningen av studiet. Disse ble dyrket på brucella-agar for å Isolere B. canis. Resultatene er vist i tabell XI. Serumprøver ble samlet før, under og ved avslutningen av studiet for å bestemme serum antistoffer mot B. canis. Disse resultater er også vist i tabell XI. 21 dager efter inokulering med B. canis ble alle dyr eutanisert. De følgende vevsprøver ble fjernet aseptisk, homogenisert og seriefortynnet på brucella-agar for isolering av B. canis; heparinisert blod, vaginal-eksudat, lunger, milt, synovialfluid, uterus, ovarium, popllteal av lymfeknuter, spyttkjertler, mandler, mediastinale lymfeknuter, mesenteriske lymfeknuter, benmarg, superficlelle servikal lymfeknuter, og aksillære lymfeknuter. Resultatene av overlevende B. canis pr. vev efter 4 dagers inkubering er vist i tabell XII. Resultater av dyrking og serologiske prøver av hunder infisert med B. canis før, under og efter to-trinns antibiotikuminngivelse er angitt i tabell XI. Alle dyrene var serologlsk negative for tidligere eksponering til B. canis, målt ved negative serumtitere, og var kultur-negative fra blodkulturer og kulturer av vaginalutskrap. Alle dyrene ble bemerket å være kultur-positive for både blod- og vaginalkulturer før behandling på dag 7 og 10. Hunder behandlet med vandig streptomycin eller hunder som ikke fikk noen behandling, forble kultur-positive for blod- og vaginalkulturer under efterbehandlingsperioden før avslutning på dag 21. Gruppe 3 som fikk liposomer inneholdende streptomycin ble kultur-negative 1 dag efter den første behandling og forble negative under hele efterbehandllngsperloden. Hunder som ikke fikk noen behandling eller vandig streptomycin, utviklet påvisbare serumtitere mot B. canis-antigener innen dag 21 efter inokulering, mens de som var behandlet med SPLV inneholdende antibiotika på dagene 7 og 10 efter inokulering ikke utviklet noen påvisbare antilegemer mot B. canis-antigener .

Resultater fra isolasjonen av B. canis fra infiserte hunder behandlet ved to-trinns antibiotikuminngivelse og som er angitt i tabell XII, viser at hos hunder var kun behandling med SPLV inneholdende streptomycin effektiv med henblikk på å eliminere enhver levende B. canis i alle vev fra alle organprøver.

Behandling av B. abortus hos marsvin

15 voksne hun-marsvin ble inokulert med B. abortus ATCC 23451 (1 x IO<7> CFU.I.P.). 7 dager efter inokulering ble dyrene oppdelt i 3 grupper på 5 dyr hver.

Gruppe 1, kalt kontroll, fikk Ingen behandling.

Gruppe 2 fikk vandig streptomycinsulfat I.P. i injeksjoner på 0,2 ml ved 10 mg/kg kroppsvekt på dag 7 og dag 10 efter inokulering med B. abortus.

Gruppe 3 fikk SPLV inneholdende streptomycinsulfat, I.P. injeksjoner, på 0,2 ml ved 10 g/kg kroppsvekt på dagene 7 og 10 efter inokulering med B. abortus.

På dag 14 efter inokulering med B. abortus ble alle dyr avlivet og miltene ble fjernet, homogenisert aseptisk og seriefortynnet på brucella-agar for isolasjon av B. abortus. Resultatene av overlevende B. abortus pr. milt efter 4 dagers inkubering er vist i figur 7. Kun SPLV inneholdende streptomycin var effektiv med henblikk på å eliminere B. abortus i marsvinmilter. Hos dyr som fikk vandig streptomycin, eller som ikke fikk noen behandling, kunne levende B. abortus-bakterier identifiseres.

Behandling av B. abortus- infeksjoner hos kuer

9 sterkt infiserte dyr ble benyttet i dette forsøk. B. abortus-bakterieisolater fra melk og vaginalutskrap ble og forble negative 6 uker efter behandling med SPLV inneholdende streptomycin. Når infeksjon opptrådte igjen i disse dyr, ble bakterieisolater funnet kun i kvadranter av juret som var positive før behandling. 9 kryssaledede (Hereford-Jersey-Brangus), 22 måneder gamle ikke gravide, og bekreftede B. abortus-kultur-positive kviger ble benyttet. Minst 4 måneder før starten av studiet ble dyrene eksperimentelt utfordret pr. konjunktivum med 1 x IO<7 >CFU av B. abortus stamme 2302 midt i drektighetsperloden, noe som resulterte i abort og/eller B. abortus-kultur-positive lakteale eller uterlnsekreter og/eller fetalvev.

Kvigene ble holdt i individuelt isolerte båser, og separert i 3 grupper. Behandlingen omfattet et to-dose-opplegg med 3 dagers mellomrom som følger: (1) 3 kviger ble injisert Intraperitonealt med fysiologisk saltoppløsning. (2) 3 kviger ble Injisert intraperitonealt med vandig antibiotikum (streptomycin i en mengde av 10 mg/kg kroppsvekt) pluss på forhånd fremstilt bufferfylt SPLV. (3) 3 kviger ble injisert intraperitonealt med SPLV-innfanget streptomycin i en mengde av 10 mg/kg kroppsvekt. Det totale volum pr. injeksjon var 100 ml pr. dyr. Under de første to måneder ble det gjennomført duplikate bakteriologiske kulturer av lakteal- og uterinsekret, hver uke forutsatt at dette var tilgjengelig. Derefter ble alle kuene eutanisert med en overdose av natriumpentabarbitol og de følgende organer ble samlet i duplikat for bakteriologiske kulturer: (1) Lymfeknuter: venstre og høyre atlantale, venstre og høyre suprafaryngeale, venstre og høyre mandibu-lære, venstre og høyre parotide, venstre og høyre preskapu-lære, venstre og høyre prefemorale, venstre og høyre aksillaere, venstre og høyre popliteale, venstre og høyre interne iliak, venstre og høyre supramammære, venstre og høyre renale, bronkiale, mediastinale, mesenteriske og hepatiske; (2) Kjertler: Alle fire kvarter av brystkjertelen, venstre og høyre adrenalkjertel og thymus (hvis til stede); (3) Organer og annet vev: milt, lever, venstre og høyre horn av uterus, cervix, vagina, nyre og mandler.

Efter nekropsi ble alt vev frosset og holdt ved -70"C under transport. Vevet ble tint opp, alkoholavbrent og aseptisk trimmet før veiing. Efter at vektene var notert, (0,2 til 1,0

g) ble vevet homogenisert i 1 ml steril saltoppløsning og seriefortynnet med steril saltoppløsning til 1:10"<10> av den

opprinnelige homogenatsuspensjon. Mengder på 20 pl av hver fortynning fra seriesuspensjonene ble plattert på brucella-agar og anbragt ved 37°C for inkubering. Duplikatbestemmelser ble gjennomført for hvert vev.

Platene ble avlest daglig og notert for bakterievekst. Alle kolonier som oppstod før 3 dager ble isolert, analyse forberedt og gram-flekket for å bestemme identitet. På dagene 5, 6 og 7 under inkuberingen ble kolonier med morfologi, vekst og gram-flekkingskarakteristika konsistent med B. abortus tellet; CFU pr. g ble så bestemt. Representative kolonier ble så kjørt om igjen for bakteriell bekreftelse av B. abortus.

Bakteriologiske isolater skjedde på alle vevsprøver og kvantifisering av bakterier pr. g vev ble beregnet. Resultatene fra 4 dyr, en placebo-kontroll og tre dyr behandlet med SPLV-innfanget streptomycin, er angitt i tabell XIII.

Eksempel 4

BEHANDLING AV OKULÆR- LIPELSER

Bakterie- og lignende infeksjoner så vel som mange andre lidelser i øyet forårsaker verdensomspennende økonomiske og offentlige helseproblemer, og hvis dette Ikke behandles eller behandles på gal måte, kan det føre til tap av øyesynet og muligens død på grunn av septicemia. Bakterielle infeksjoner i øyet hos dyr og mennesker har vært angitt forårsaket av et antall bakterier inkludert Clostridium spp., Corynebacterium spp. , Leptospira spp., Moraxella spp., Mycobacterium spp. , Neisseria spp., Propionibacterium spp., Proteus spp., Pseudomonas spp., Serratia spp., E. coli spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp. og bakterielignende organismer inkludert Mycoplasma spp. og Sickettsia spp. Både dyr og mennesker tjener som reservoarer for potensiell spredning av infektiøse bakterier til hverandre.

Slike bakterielle infeksjoner kan ikke behandles med antibiotika uten langvarige og omhyggelige behandlingsplaner som resulterer i enten hyppig behandling, ofte helt opp til hvert 20. minutt hos mennesker med visse infeksjoner, eller uakseptabelt høye konsentrasjoner av angjeldende antibiotikum i vevet. Dagens behandlingsmetoder er vanskelige av mange andre grunner. Den infiserte organisme i overflatevevet i øyet, er i enkelte tilfeller meget resistente overfor de baktericide aktiviteter til antibiotika, og topisk inngivelse av antibiotika kan resultere i hurtig utskilling av medikamenter fra øyet, noe som gir varierende kontakttider. Som en generell regel må behandling av øyesykdommer være totalt effektive, fordi enhver gjenværende infeksjon vil gjeninfi-sere øyet ved lakrimalsekret, og cyklusen begynner igjen. Videre kan i mange tilfeller den medikamentkonsentrasjon som er nødvendig for å eliminere infeksjonen, forårsake for-ringelse av synet, og i visse tilfeller, resultere i total blindhet. Den økonomiske belastning ved slike sykdommer hos husdyr vises ved de enorme summer som tapes hvert år, fordi den eneste potensielle vei for å bekjempe slike infektiøse sykdommer er utstrakt terapi og karantene.

De følgende forsøk bedømmer effektiviteten ved behandling ved bruk av frie antibiotika i glycerin, sammenlignet med antibiotikum innfanget i SPLV for M. bovis-infeksjoner i øyet. M. bovis forårsaker infektiøse keratokonjunktivitis (rosaøye) hos kveg. Denne tilstand karakteriseres ved blefarospasmer, lakrimering, konjunktivitis og varierende grad av corneal opasitet og sårdannelse. Voksne dyr kan utvikle en mild feber med lett redusert apetitt og redusert melkeproduksjon. Selv om et antall antibiotika er effektive mot M. bovis, må de inngis tidlig og gjentas ofte ved topisk anvendelse eller subkonjunktival injeksjon.

I henhold til de heri beskrevne eksempler, forlenges effektiviteten og varigheten for det terapeutiske stoff. Det er overraskende at dette system er effektivt ved kun en eller to inngivelser, fordi slike injeksjoner ikke svarer til enkel ordinær behandling med antibiotika. De vanlige behandlinger efterlater ofte gjenværende infeksjoner som gjeninfiserer øyet, slik at infeksjonscyklusen begynner igjen hvis ikke infeksjonen totalt utryddes ved tallrike gjentagelser av behandlingen.

Behandling av infektiøs keratokon. lunktivitis hos mus

160 C57 svarte mus ble delt i 8 grupper. En halvpart av hver gruppe ble eksponert til ultrafiolett bestråling i hvert øye for å skape corneale lesjoner. Alle dyr ble derefter inokulert med M. bovis til kun det høyre øyet i konsentrasjoner på 1 x IO<6> bakterier pr. øye. 24 timer efter inokulering ble alle dyr bedømt med henblikk på grad av corneal opasitet. De 8 grupper ble behandlet ved topisk anvendelse av følgende medikament til hvert øye: Gruppene 1 og 2 fikk 10 pl SPLV-innfanget streptomycin, 30 mg/ml;

Gruppene 3 og 4 fikk 10 pl streptomycin, 100 mg/ml;

Gruppene 5 og 6 fikk 10 pl bufferfylt SPLV, suspendert 1 vandig streptomycin, 100 mg/ml; og

Gruppene 7 og 8 fikk 10 pl steril saltoppløsning.

(NB! Det ikke infiserte venstre øyet ble behandlet med den samme topiske oppløsning for å bestemme hvorvidt SPLV ville irritere øyet; det ble ikke observert irritasjon.) En gang

(laglig ble dyrene bedømt på progresjon eller regresjon av corneal-lesjoner, og på dagene .3, 5 og 7 efter behandling ble de høyre øyne tørket og isolater av M. bovis ble gjennomført på representative, dyr. M. bovis-kolonier ble bestemt ved kolonimorfologi og reaktivitet overfor fluorescent merkede antistoffer til M. bovis pili. Resultatene som er vist i tabell XIV viser at kun SPLV-innfanget streptomycin var effektiv med henblikk på å eliminere infeksjoner.

Behandling av kanin- kon. 1unktiva ved bruk

av SPLV- innfangede antibiotika

M. bovis ATCC-stamme 10900 ble fortynnet til en konsentrasjon på 1 x 10<7> celler pr. ml i steril saltoppløsning (0,58$ NaCl). Mengder på 0,1 ml av bakteriesuspensjoner ble Inokulert topisk i øyet av 10 voksne hun-kaniner. Prøver av kulturene ble tatt daglig ved tørking av konjunktive og plattert på blodagarplater for isolering av M. bovis. 3 dager efter inokulering ble kaninene delt i 3 grupper; 2 kontrolldyr fikk ingen behandling; 4 dyr fikk streptomycin i steril saltoppløsning, i en konsentrasjon av 10 mg/kg kroppsvekt; og 4 dyr fikk SPLV-innfanget streptomycin i en steril salt-oppløsning i en konsentrasjon av 10 mg streptomycin pr. kg kroppsvekt. Alle oppløsninger ble inngitt topisk i hvert øye. Efter 24 timer ble uttørking av konjunktivae for alle kaniner gjenopptatt, og fortsatt daglig i 7 dager. Resultatene av isoleringen med henblikk på M. bovis på blodagarplater er vist i tabell XV.

Behandling av kreatokonjunktlvitis fra

subkutane infeksjoner

M. bovis ATCC-stamme 10900 ble fortynnet til en konsentrasjon på 1 x IO<7> celler pr. ml i steril saltoppløsning. Mengder på 0,1 ml av bakterielle suspensjoner ble inokulert i øyene hos voksne kaniner som på forhånd var infisert som beskrevet i det foregående avsnitt, og ble ikke behandlet med SPLV. Det høyre øyet til alle ni kaniner ble inokulert med 0,1 ml M. bovis subkutant i det konjunktivale vev og det venstre øyet hos alle kaniner ble inokulert med 0,1 ml M. bovis topisk. Kulturer ble tatt daglig fra konjunktivae i begge øyne fra alle kaniner, og plattert på blodagarplater for Isolering av M. bovis. 3 dager efter inokulering ble kaninene delt i 3 grupper; 2 dyr fikk ingen behandling; 3 dyr fikk streptomycin i en standard oftalmisk glycerinsuspenjon (konsentrasjon av streptomycin var 10 mg/kg kroppsvekt); og 4 dyr fikk en saltsuspensjon av SPLV-innfanget streptomycin (10 mg streptomycin pr. kg kroppsvekt). Suspensjonen eller oppløs-ningen ble inngitt topisk i en mengde av 0,1 ml til hvert øye. Efter 24 timer og hver av de neste 5 dager, ble konjunktivalprøver tatt fra alle dyr. Resultatene av isoleringen av M. bovis på blodagarplater er vist i tabell XVI. Nekropsi ble gjennomført på alle dyr ved avslutningen av forsøkene, og konjunktivae ble fjernet fra alle dyr. Disse ble bedømt med henblikk på vaskularisering og ble hakket opp, homogenisert og plattert på blodagarplater for isolering av M. bovis. Resultatene er vist i tabell XVII.

Bedømmelse av effektiviteten av SPLV sammenlignet med

liposompreparater ved behandling av okulærinfeksjoner

M. bovis ATCC-stamme 10900 ble fortynnet til en konsentrasjon på 1 x IO<7> celler pr. ml i steril saltoppløsning. Mengder på 1 ml bakteriesuspensjoner ble inokulert subkutant I konjunk-tivalvevet i begge øyne hos voksne kaniner. Uttørk ble tatt daglig fra konjunktivae av begge øyne hos alle kaniner og plattert på blodagarplater for isolasjon av M. bovis. 5 dager efter inokulering ble dyrene delt i 6 grupper: 2 dyr fikk ingen behandling dette var kontrolldyr; 3 dyr fikk en suspensjon a SPLV-innkapslet streptomycin i en mengde av 10 mg streptomycinsulfat pr. kg kroppsvekt som i fortynnet tilstand 1:100 hadde en O.D.480 (optisk densitet ved 480 nm) lik 0,928; 3 dyr fikk en suspensjon av SPLV-innkapslet streptomycin i en mengde av 10 mg streptomycinsulfat pr. kg kroppsvekt som i fortynning 1:100 hadde en O.D.480 ™ 0,449; 3 dyr fikk en suspensjon av SPLV-innkapslet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg kroppsvekt) som fortynnet til 1:100 hadde en O.D.480 = 0,242; 3 dyr fikk en suspensjon av SPLV-innkapslet streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg kroppsvekt) som fortynnet til 1:100 hadde en O.D.480 = 0,119; og 2 dyr fikk en suspensjon av multllamellære vesikler, MLV, Inneholdende streptomycin (10 mg streptomycinsulfat pr. kg kroppsvekt) med en O.D.4<g>o på 0,940 for en 1:100-fortynning = 0,940. MLV ble fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Fountain et al. i "Curr. Micro.", 6:373 (1981) ved tilsetning av streptomycinsulfat til den tørkede llpldfilm som derefter ble heftig omrørt og tillatt å svelle i 2 timer; ikke-innfanget streptomycin ble fjernet ved gjentatt sentrlfugering.

Suspensjonene ble inngitt topisk til hvert øye. Efter 24 timer ble konjuhktivalprøver tatt fra alle kaniner daglig i 9 dager, og plattert på blodagar. Resultatene for isolering av M. bovis på blodagarplater er vist i tabell XVIII. Nekropsi ble gjennomført på alle dyr. Disse ble bedømt for lakrimal-sekresjon og konjunktivae ble fjernet aseptisk fra alle dyr. Disse ble bedømt med henblikk på vaskularisering og ble hakket opp, homogenisert og plattert på blodagarplater for isolasjon av M. bovis. Resultatene er vist i tabell XIX.

Eksempel 5

BEHANDLING AV VIRALINFEKSJONER

Lymfocytiske koriomeningittvirus, LCMV, som går Inn 1 Arena-virusgruppen, er kjent å forårsake sykdommer hos mennesker og LCMV-Infeksjon er fatal hos mus inokulert intracerebralt med denne virus. Musedøden forårsakes av immuncellene som reagerer mot virusinfiserte celler. Virusen dreper ikke cellene der den formerer seg, derfor må det terapeutiske middel som brukes på mus enten inhibere virusformering, slik at immuncellene ikke aktiveres, og/eller inhibere aktivering av immuncellene.

Det følgende eksempel viser effektiviteten av behandling av viralinfeksjoner ved inngivelse av SPLV-innkapslet antiviral-forbindelse.

Behandling av letallymfocytiske korio-meningittvirusinfeks. loner hos mus

To måneder gamle Swiss mus ble inokulert intracerebralt med en letal dose LCM-virus, det vil si 100 platedannende enheter, PFU, i 0,05 ml inokulum pr. mus. Musene ble delt i 4 grupper på 7 dyr i hver, og ble behandlet på dagene 2, 3 og 4 efter infeksjon med intraperitoneale injeksjoner på 0,1 ml pr. dose mus som følger: (1) "SPLV-R-gruppen" ble behandlet med en suspensjon av eggfosfatidylcholin SPLV inneholdende 3 mg RIbavarin/ml. SPLV ble fremstilt ved bruk av 100 mg lipider og 0,3 ml av 100 mg medikament pr.ml i PBS-buffer; innfangingen av medikamentet var 10% ; (2) "R-gruppen" ble behandlet med en oppløsning av Ribavarin 3 mg/ml i PBS; (3) "SPLV-gruppen" ble behandlet med bufferfylt SPLV (det vil si SPLV fremstilt som ovenfor, men uten Ribavarin); og (4) "kontrollgruppen" ble behandlet med PBS. På den 5. dag efter infeksjon, ble 2 mus fra hver gruppe avlivet og milten homogenisert (2 milter pr, gruppe ble homogenisert i PBS ved 1-20 vekt/volum buffer). De platedannende enheter, PFU, pr. ml ble bestemt for hver suspensjon. De gjenværende 5 mus i hver gruppe ble observert på letalitet 2 timer daglig i 30 dager. Resultatene er angitt i tabell XX.

Tabell XX antyder klart en reduksjon av letaliteten og en reduksjon av mengden virus som kan gjenvinnes fra de infiserte dyr. Det er ennu ikke bestemt hvorvidt disse resultater skyldes antiviral-aktiviteten av Ribavarin som frigis fra SPLV eller en immunomodulering av vertsmusen under den forsinkede frigjøring av Ribavarin fra SPLV.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av stabile, plurilamellære vesikler med en vesikkelstørrelse innen området 500 til 10 000 nm og et antall lipidbisj ikt innen området fra noen til over 100; - med større stabilitet mot autooksydasjon under lagring i buffer; større stabilitet i kroppsfluidet; en større prosentandel lekkasje av innfanget, oppløst materiale ved eksponering mot urea, guanidin eller ammoniumacetat; - en mindre prosentandel lekkasje av innfanget oppløst materiale ved eksponering til saltsyre eller serum; og en fordeling av innfanget innhold via cytosol i celler ved administrering til cellene i kultur; karakterisert ved: a) å tildanne en dlspersjon av minst ett amfipatisk lipid i et organisk oppløsningsmiddel; b) å kombinere den under a) oppnådde dlspersjon med en vandig fase for å tildanne en tofaseblanding der den vandige fase helt kan emulgeres, idet volumforholdet mellom oppløs-ningsmiddel og vandig fase er fra ca. 3:1 til 100:1; og c) å emulgere den vandige fase og fordampe det organiske oppløsningsmiddel av tofaseblandingen, idet det ved trinnene a), b) og c) arbeides ved en temperatur innen området 4-60"C, for derved å oppnå stabile plurilamellære vesikler i det vesentlige frie for MLV, SUV og REV.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at under punktene a) og b). holdes temperaturen under faseomdanningstemperaturen for minst et av lipidene.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det under trinn a) anvendes et fluorkarbon, en dietyleter eller blandinger derav som oppløsningsmiddel.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det som oppløsningsmiddel anvendes et som inneholder en antioksydant, fortrinnsvis butylert hydroksytoluen.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at emulgeringen Ifølge trinn c) gjennomføres før eller samtidig med fordampingen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det samtidig med den vandige fase i trinn b) tilsettes det materiale som skal innfanges I vesiklene, slik at minst 2056 av dette materialet Innfanges i vesiklene.