FI82836B - Ny tetraklorraffinos och dess anvaendning vid framstaellning av sucralos. - Google Patents

Description

82836 1 Uusi tetraklooriraffinoosi ja sen käyttö sukraloosin valmistamisessa Ny tetraklorraffinos och dess anvdndning vid framställning av sucralos 5 Tämä keksintö kohdistuu raffinoosin uuteen tetrakloorattuun johdannaiseen ja menetelmään sen valmistamiseksi sekä sen käyttöön hyvin tehokkaan, sakkaroosia noin 600-kertaa makeamman makeutusaineen, sukraloo-1Q sin, (4.1*.6* -trikloori-4.1'.6'-trideoksiealaktosakkaroosi. josta käytetään myös lyhennettä TGS) valmistamiseen.

Sukraloosiin johtavat reaktiot (katso esimerkiksi Khan et ai Carbohydrate Research, 39 (1975) 253; Fairclough et ai. Carbohydrate Research, jg 40 (1975) 285-298; US 4 362 869 sekä GB 2 065 648) käsittävät sakkaroosin 6-asemasta suojattujen johdannaisten muodostamisen, jolloin tämän aseman kloorautuminen saadaan estetyksi 4-, 1'- ja 6'-asemia kloorattaessa. US-patenttijulkaisussa 4 362 869 ja Fairclough:in julkaisussa esitetyissä reaktioissa sakkaroosi trityloidaan kolmesta primääristä 2q asemastaan (6-, 1'- ja 6'-), jonka jälkeen se perasetyloidaan. Sitten trityyliryhmät poistetaan 2,3,4, 3',4'-penta-asetaatin muodostamiseksi. Tämän jälkeen 4-aseman asetaatti siirretään 6-asemaan, patentoidussa menetelmässä käsittelemällä inertissä liuottimessa laimealla etikkaha-polla, jolloin sadaan 2,3,6,3',4'-penta-asetaatti, joka voidaan kloora-25 ta. Koska tämä menetelmä käsittää yhdessä tritylointi- ja asetyloin- ti-, detritylointi- ja isomerointivaiheet, niin selvää on, että olemassa on tarve saada kehitetyksi yksinkertaisempi menetelmä, jolla voidaan taata 6-aseman säilyminen kloorautumatta.

3Q Eräs toinen menetelmä (katso esimerkiksi US-patenttijulkaisu n:o 4 380 476 ja GB-patenttijulkaisu 2 079 749) käsittää 6-aseman selektiivisen asyloinnin, mitä seuraa 4-, 1'- ja 6'-asemien selektiivinen klooraaminen suojaamattomien hydroksiryhmien ollessa läsnä 2-, 3-, 3'- ja 4'-asemissa. Selektiivisen asyloinnin toteuttaminen ei ole kuitenkaan 35 helppoa.

2 82836 ^ Näin ollen alalla on edelleenkin olemassa tarve saada aikaan yksinkertainen menetelmä sukraloosin tuottamiseksi vaiheissa, joiden lukumäärä on rajallinen.

5 6-aseman selektiivisen asyloinnin vaihtoehtona saattaisi olla suuremman ryhmän, esimerkiksi sokerin, liittäminen 6-asemaan. Mikäli tällaista trisakkaridia pidetään lähtömateriaalina, niin tällöin todetaan välittömästi kaksi ongelmaa.

10 Ensinnäkin, trisakkaridi on voitava kloorata 4-asemastaan (jolloin tapahtuu inversio) sekä 1'- ja 6'-asemistaan, ja valinnaisesti 6-asemassa sijaitsevan sokerin muista asemista. Suuren sokeriryhmän läsnäolo 6-asemassa tarkoittaa kuitenkin sitä, että sokeriryhmä toimii kriittisen 4-aseman steerisenä esteenä, jolloin halogeeniatomin liittäminen 15 siihen olisi vaikeata.

Oikean tyyppinen ja suhteellisen yleinen trisakkaridi on raffinoosi, joka on Ο-α-β-galaktopyranosyyli-(1 -> 6)-O-a-D-glukopyranosyyli-(1 -> 2)-/?-E-fruktofuranosidi. Hough et ai. (Carbohydrate Research, 71 (1979) 20 85-93) ovat tutkineet raffinoosin klooraamista. He totesivat, ettei 4-asemastaan kloorilla substituoitunutta tuotetta muodostunut edes silloin, kun käytettiin sulfuryylikloridia, joka on voimakas klooraava aine, ja joka kykenee klooraamaan sakkaroosin sen 4-, 6-, 1'- ja 6'-asemista. Tällöin saatiin mono-, di- ja trisakkaridien seos sekä yllät-25 tävästi pieniä määriä kloorautuneita metyyliglykosideja.

Oheisen keksinnön puitteissa suoritetut tutkimukset ovat osoittaneet, että raffinoosin ja Vilsmeierrin reagenssin välisessä reaktiossa syntyy samoin reaktiotuotteiden monimutkainen seos.

30

Toisena vaikeutena on se, että vaikka käytettävissä olisikin sopivalla tavalla 4,1',6'-kloorattu trisakkaridi, niin käytettävissä olisi samoin välttämättä oltava jokin tehokas kemiallinen tai entsymaattinen tapa sokerin poistamiseksi 6-asemasta, jotta sukraloosi saataisiin vapaute-33 tuksi. Kuitenkin molekyylin klooraaminen muuttaa huomattavasti molekyylin polaarisuutta, konfiguraatiota ja erityisesti sen konformaatiota 3 82836 ^ klooraamattomaan sokeriin nähden, johon klooraamattomaan sokeriin entsyymin vaikutus tavallisesti kohdistuu. Tämä tarkoittaa sitä, että entsyymit, jotka vaikuttavat raffinoosiin galaktoosirenkaan poistaen, eivät kykene välttämättä vaikuttamaan raffinoosin kloorattuun johdan-5 naiseen, jossa kloorisubstituentti on läsnä glykosidisidoksen läheisyydessä sijaitsevassa asemassa (eli 4-asemassa). Sakkaroosi (sukroosi) eroaa analogisesti sukraloosista. Lukuisat mikro-organismit kykenevät pilkkomaan nopeasti sakkaroosin, mutta sukraloosi ei hajoa in vivo, vaikka eräät maaperän mikro-organismit hajottavatkin sitä hitaasti.

10 Täten, ne vaatimukset, jotka asetetaan sukraloosia tällä tavalla tuotettaessa, ovat, että trisakkaridi on voitava kloorata ainoastaan sak-karoosiryhmän 4-, 1'- ja 6'-asemista sekä mahdollisesti kolmannen renkaan yhdestä tai useammasta asemasta, ja että kloorattu tuote on voita-15 va pilkkoa ainoastaan (1 -> 6)-galaktosyylisidoksen kohdalta samalla kloorautunutta galaktosakkaroosia pilkkomatta tai poistamatta klooria tästä ryhmästä.

Oheisen keksinnön puitteissa todettiin yllättävästi, miten raffinoosi 20 voidaan kloorata 6-0-(6-kloori-6-deoksigalaktoosi)-substituoituneen sukraloosin saamiseksi. Samoin, keksinnön puitteissa on löydetty entsyymit, jotka pilkkovat tämän tetrakloorisokerin sukraloosia vapauttaen.

25 Keksinnön erään piirteen mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan uusi tetraklooriraffinoosi, nimittäin 0-o-D-6-kloori-6-deoksigalaktopyra-nosyyli-(l -> 6)-a-D-4-kloori-4-deoksigalaktopyranosyyli-(1 -> 2)-0-D-1,6-dikloori- 1,6-dideoksifruktofuranosidi, tai 4,1',6',6"-tetrakloo-ri-4.1'.6*-6"-tetradeoksigalaktorafflnoosi. joka on uusi yhdiste. Tästä 30 yhdisteestä käytetään ohessa myös lyhennettä TKR.

Keksinnössä saadaan samoin aikaan menetelmä TKR-yhdisteen valmistamiseksi, käsittäen raffinoosin ja tionyylikloridin välisen reaktion tria-ryylifosfiinioksidin, esimerkiksi trifenyylifosfiinioksidin, läsnäol-35 lessa.

4 82836 ^ Trifenyylifosfiinioksidin (TFFO) kanssa käytetään mielellään pientä määrää trifenyylifosfiinia (TFF), esimerkiksi käyttämällä seosta, joka sisältää 5-25 mooli-%, esimerkiksi 7,5-15 %, yhdistettä TFF ja 95-75 mooli-%, esimerkiksi 92,5-85 % yhdistettä TFFO. Myös itse yhdistettä 5 TFF voidaan käyttää, sillä yhdisteen ja klooraavana aineena toimivan tionyylikloridin sivutuotteena saadaan yhdistettä TFFO. Tämä tarkoittaa sitä, että reaktion edetessä muodostuu yhdisteiden TFFO ja TFF seosta.

Yhdiste TFFO voidaan korvata muilla triaryylifosfiinioksideilla, eri-10 tyisesti sellaisilla yhdisteillä, joissa yksi kolmesta fenyylirenkaasta on liittynyt polymeeriseen ketjuun, ja joista esimerkkinä mainittakoon reagenssit, jotka kuvataan julkaisussa Regen ja Lee, J. Org. Chem. 40, 1669-1690, 1975, ja joissa fenyyli on korvautunut styreenillä.

15 Samoin, TFFO voidaan korvata sulfidilla (TFFS), joka reagoi samalla tavalla.

Triaryylifosfiinin ja triaryylifosfiinioksidin tai -sulfidin muodostaman seoksen ja raffinoosin välinen suhde on mielellään 3-4 moolia yhtä 20 moolia kohden, esimerkiksi noin 3,2 moolia yhtä moolia kohden, ja tionyylikloridin ja raffinoosin välinen suhde on mielellään 8-15 moolia yhtä moolia kohden, esimerkiksi 10-11 moolia yhtä moolia kohden.

Reaktio toteutetaan ei-hydroksyylisen raffinoosia ja klooraavia rea-25 gensseja liuottavan aineen läsnäollessa. Tällaisia sopivia liuottimia ovat amiinit ja amidit, erityisesti aromaattiset tertiääriset amiinit, kuten pyridiini ja lutidiini, tai Ν,Ν-dialkyyliamidit, kuten DMF.

Reaktio aloitetaan mielellään noin 0°C:n lämpötilassa, joka tämän jäl-30 keen nostetaan yleisesti 110°C:een.

TKR eristetään vaivattomasti heptaesterinään, esimerkiksi hepta-ase-taattinaan, jonka jälkeen esteriryhmät poistetaan hydrolyysillä, esimerkiksi laimealla, alkoholiin valmistetulla natriumalkosidilla.

35 5 82836 ^ Keksinnön erään muun piirteen mukaisesti keksinnössä saadaan aikaan myös menetelmä sukraloosin tuottamiseksi, käsittäen TKR-liuoksen inku-boimisen sellaisen entsyymin läsnäollessa, joka entsyymi kykenee poistamaan 6-kloori-6-deoksi-galaktosyyliryhmän 6-asemasta.

5

Entsyymi voidaan valita lukuisten, saatavilla olevien entsyymien joukosta, joko suoraan tai viljelemällä mikro-organismeja, jotka kykenevät tuottamaan tällaisia entsyymejä. Erityisen kiinnostavia ovat galaktosi-daasit, vaikka melibiaaseja voitaisiinkin pitää vähemmän kiinnostavina 10 johtuen siitä, että vaikka melibioosi (Ο-α-fi-galaktopyranosyyli-(1 -> 6)-α-fi-glukopyranoosi) onkin raffinoosin komponentti, mutta kloorautu-neen TKR-yhdisteen konfiguraatio on käänteinen. Keksinnön puitteissa on todettu, että monilla näillä entsyymeillä ei ole lainkaan käyttökelpoista, TKR-yhdisteeseen kohdistuvaa aktiivisuutta, vaikka ne kykene-15 vätkin vapauttamaan sakkaroosin raffinoosista. Noin 20 erilaista, bakteeri-, home- ja kasviperäistä a-galaktosidaasi-entsyymiä testattiin, mutta vain 8 entsyymillä, jotka kaikki oli saatu homeista, todettiin TKR-yhdistettä hydrolysoivaa aktiivisuutta. Aktiivisimmat entsyymit saatiin kannoista Mortierella vinacea. Circinella muscae sekä Aspereil-20 lus niger-homeen eräästä kannasta (saatu yhtiöstä Novo A/S). Yllättäen melibiaasi, joka oli peräisin yhtiöstä Hokkaido Sugar Co. saadusta kannasta Mortierella vinacea var raffinoseutilizer (ATCC 20034), oli ak-tiivisinta. Tästä huolimatta TKR-yhdisteen reaktionopeus on vain muutama prosentti itse raffinoosin reaktionopeudesta. Kuitenkin, ottaen 25 huomioon raffinoosin ja TKR-yhdisteen väliset merkittävät, konformaati-on ja konfiguraation erot, joka tämänkin suuruinen aktiivisuus on odottamatonta, ja johtaa käytännöllisesti katsoen TKR-yhdisteen täydelliseen hydrolysoitumiseen sukraloosiksi.

Mikro-organismin M.vinaceae var raffinoseutilizer pelletoituja soluja on käytetty vuodesta 1968 lähtien Japanissa ja aikaisemmin USArssa juurikassokerin jalostamiseen (Obara J. & Hashimoto S., Sugar Technology Reviews 4, 209, 1976/77 sekä US-patentit n:o 3 867 256 ja n:o 3 957 578, nimellä Narita et ai.).

35 6 82836 1 Entsyymillä käsittely voidaan toteuttaa vaivattomasti vesiliuoksessa, mutta vaikka reaktiossa tarvitaan vettä, niin kuitenkin ollaan todettu, että α-galaktosidaasi voi hydrolysoida TKR-yhdisteen voimakkaasti suk-raloosiksi lukuisissa orgaanisissa liuottimissa. Täten, keksinnön puit-5 teissä todettiin, että entsyymi on stabiilein ja aktiivisin veteen sekoittumattomissa orgaanisissa liuottimissa, kun taas TKR on erittäin liukoinen pelkästään hydrofiilisiin liuottimiin. Näin ollen TKR-yhdisteen hydrolyysia ajatellen sopivimmiksi liuottimiksi todettiin hydro-fiiliset, mutta veteen sekoittumattomat orgaaniset liuottimet, kuten 10 etyyliasetaatti, β-butanoli ja metyyli-isobutyyliketöni. Esimerkiksi TKR-yhdisteen hydrolysoitumisnopeus, mikä määritellään katalyyttisena konversio lukuna (K^), veteen valmistetulla puskurilla etukäteen kyllästetyssä (millä liuotinseokseen saadaan tarpeeksi vettä hydrolyysia varten) etyyliasetaatissa on samankaltainen kuin hydrolyysin nopeus 15 veteen valmistetussa puskurissa. Tämän perusteella voidaan päätellä, että entsyymi säilyttää täysin katalyyttisen aktiivisuutensa jopa orgaaniseen liuottimeen suspendoitunakin. On tärkeätä korostaa, että kukin veteen valmistetulla puskurilla etukäteen kyllästetty orgaaninen liuotin pysyy yhtenä orgaanisena faasina. Keksinnössä ei puututa kaksi 20 faasia käsittäviin liuotinjärjestelmiin, ja entsyymi toimii orgaanisessa faasissa.

Edellä mainittujen liuottimien lisäksi useiden muiden liuottimien kyky pitää yllä TKR-yhdisteen hydrolyysia selvitettiin. Veteen hyvin sekoit-25 tuvat liuottimet (esimerkiksi dioksaani, asetoni, metanoli ja THF) eivät kyenneet pitämään yllä hydrolyysia edes siinä tapauksessa, että läsnä oli 30 % v/v veteen tehtyä puskuria. Hydrofobiset, veteen sekoittumattomat liuottimet (esim. n-oktanoli, nitrobentseeni ja butyronit-riili) kykenivät pitämään yllä TKR-yhdisteen hydrolyysia, mutta TKR-30 yhdisteen huono liukoisuus näihin liuottimiin (alle 5 % w/v) rajoittaa niiden käyttökelpoisuutta suuressa mittakaavassa toimittaessa. Hydro-fiiliset, veteen sekoittumattomat liuottimet (esim. etyyliasetaatti, n-butanoli ja metyyli-isobutyyliketöni) säilyttivät katalyyttisen aktiivisuuden hyvänä ja TKR-yhdisteen liukoisuuden suurena.

35 7 82836 ^ Taulukossa 1 esitetään sekä TKR-yhdisteen että sukraloosin liukoisuus 55°C:n lämpötilassa eri liuottimiin (jotka on kaikki kyllästetty etukäteen veteen tehdyllä puskurilla) veteen tehtyyn puskuriin verrattuna.

5 Taulukko 1

Liuotin TKR Sukraloosi vesi 15 % 30 % 10 n-butanoli >50 % >50 % metyyli-isobutyyliketoni >50 % 6 % etyyliasetaatti >50 * 5,7 % B-oktanoli 5 % <1 % nitrobentseeni <2 % <1 % 15 Nähdään selvästi, että TKR-yhdisteen liukoisuus on suurin hydrofiili-siin, veteen sekoittumattomiin liuottimiin. Toisaalta sukraloosin liukoisuus vaihtelee huomattavasti. Tämän havainnon perusteella sukraloosi voidaan kiteyttää selektiivisesti etyyliasetaatissa tai metyyli-isobu-20 tyyliketonissa panosreaktioita käytettäessä, tai jatkuvatoiminen prosessi pakattua petiä käyttäen voidaan toteuttaa n-butanolilla (johon kaikki reagoivat aineet ja tuotteet liukenevat).

Eduista, jotka saavutetaan toteutettaessa hydrolyysireaktio orgaanises-25 sa väliaineessa, mainittakoon parempi lämpöstabiilisuus (a-galaktosi-daasin stabiilisuus 55°C:n lämpötilassa etyyliasetaatissa on lähes 50 % suurempi kuin vesiliuoksessa) sekä substraatin parempi liukoisuus (TKR-yhdisteen liukoisuus edellä mainittuihin liuottimiin on yli 50 % w/v, kun taas sen liukoisuus veteen tehtyyn puskuriin on ainoastaan 15 % 30 w/v).

Sekä vettä sisältävissä että orgaanisissa järjestelmissä käsittely tulisi luonnollisestikin toteuttaa entsyymin optimilämpötilassa ja -pH-arvossa, jotka mikro-organismista M.vinacea saadun melibiaasin ta-^ pauksessa on noin 55”C ja pH 4,5-5,5. Vedellä kyllästetyissä orgaanisissa liuottimissa tarkoitetaan tällöin veteen tehdyn puskurin pH-arvoa.

» 82836 ^ Tässä lämpötilassa ja pH-arvossa voidaan todeta, etteivät tuotetun sukraloosin ominaisuudet ole heikentyneet.

Entsyymi voidaan liuottaa tai dispergoida vettä sisältävään järjestel-5 mään joko soluttomana uutteena, joka on valmistettu esimerkiksi soni-koimalla pelletit, tai sitä voidaan käyttää immobilisoidussa muodossa, esimerkiksi peteihin tai kolonneihin pakattuina palletteinä. Orgaanisessa järjestelmässä entsyymi pysyy liukenemattomassa muodossa, ja tässäkin tapauksessa sitä voidaan käyttää peteihin tai kolonneihin 10 pakattuna.

Sukraloosituotteen erottaminen voidaan toteuttaa millä tahansa vaivattomalla tavalla, esimerkiksi haihduttamalla ja uuttamalla orgaaniseen liuottimeen, kromatografisilla tekniikoilla, tai selektiivisellä kitey-15 tyksellä joko vettä sisältävistä tai vedettömistä järjestelmistä.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä edelleen:

Esimerkki 1 20 (a) 4,1',6',6"-tetrakloori-4,1',6'.6"-tetradeoksigalaktoraffinoosin hepta-asetaatti Jäähdytettyyn liuokseen, joka sisältää vedetöntä raffinoosia (4,0 g), 25 trifenyylifosfiinioksidia (5,9 g) ja trifenyylifosfiinia (0,66 g, 10 paino-% TFFO-yhdisteestä, jolloin yhdisteitä TFFO ja TFF on yhteensä 3 mooliekvivalenttia) pyridiinissä (40 ml), ja jonka lämpötila on noin 0°C, lisätään tionyylikloridia (8,6 ml, 15 mooliekvivalenttia) sekoittaen. Reaktioseoksen annettiin lämmetä ympäristön lämpötilaan 1 tunnin 30 aikana, jonka jälkeen sitä kuumennettiin 105-110eC:n lämpötilassa 4,5 tuntia. Hetanolin (10 ml) lisäämisen jälkeen liuos väkevöitiin siirapiksi. Liuosta, joka sisälsi tätä siirappia pyridiinissä (50 ml), käsiteltiin asetanhydridillä (5 ml) huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Ohutker-roskromatografisesti (eetteriasetoni 4:1) voitiin todeta nopeasti liik-35 kuva sivutuote ja hitaasti liikkuva varsinainen tuote. Liuos väkevöitiin ja eluoitiin eetterin ja asetonin seosta (2:1, v/v) käyttäen sili- i 9 82836 ^ kageelillä täytetyn kolonnin läpi, jolloin saatiin 4,1',6',6"-tetra-kloori-4,1',6'.6"-tetradeoksiealaktoraffinoosin hepta-asetaattia (4,75 g) siirappina. Näytteestä todettiin yhdisteen TFFO läsnäolo sekä jonkin verran hitaasti liikkuvia epäpuhtauksia ohutkerroskromatografisesti.

5 (b) 4,1',6',6"-tetrakloori-4,l',6'.6"-tetradeoksiealaktoraffinoosi

Edellä saatua siirappia (4,75 g) de-esteröitiin huoneen lämpötilassa 3 tunnin ajan pH-arvossa 9,5 käyttäen natriummetoksidia metanolissa (50 10 ml). Liuos neutraloitiin Amberlyst 15 (H)+-hartsilla, väkevöitiin puo-likiinteäksi jäännökseksi ja uutettiin vedellä. Liukenematon TFFO poistettiin suodattamalla, ja vesiuute puhdistettiin eluoimalla se etyyliasetaatin ja asetonin seoksella (2:1, v/v) silikageelillä (100 g) täytetyn kolonnin läpi, jolloin saatiin puhdasta 4,1',6',6"-tetrakloo-15 ri-4.1*.6'.6"-tetradeoksigalaktoraffinoosia (1,49 g, 32,6 % raffinoo-sista laskien) [a]D + 80® (c 0,7, asetoni).

Tuotteen tavanomainen asetylointi asetanhydridillä ja pyridiinillä tuotti vaiheen (a) perasetaatin [a]D + 132° (c 0,25, asetoni).

20

Hepta-asetaatista massaspektrometrisesti saadut tiedot: m/z, 753 [(M+l)+ - 2 AcOH, oktetti (4 Cl)], 571 [4-kloorigalaktopyranosyyli-(1 - 6)-4-kloorigalaktopyranosyylikatio-nit, tripletti 961 (2 Cl)], 307 25 [6-kloorigalaktopyranosyylikationi, dubletti 3:1, (1 Cl)] 283 [1,6-dikloorifruktofuranosyylikationi, tripletti 9:6:1 (2 Cl)].

Yhdisteestä TKR massaspektrometrisesti saadut tiedot: m/z 596 [M+NH4, oktetti 4 cl], 396 ja 398 (osittain päällekkäin menevät piikit) [6-kloorigalaktopyranosyyli-(l -> 6)-4-kloorigalaktopyranosyyli-kationi (2 Cl); l,6-dikloorifruktosyyli-(2 -> 1)-4-kloorigalaktopyranosyyli-kationi (3 Cl)], 198 [6-kloori-galaktopyranosyyli + NH4, dubletti (3:1) (1 Cl)].

35 ‘H-nmr-tiedot yhdisteelle 4,1',6',6"-tetrakloori-4,1',6',6"-tetradeoksi-ealaktoraffinoosin hepta-asetaatti.

10 82836 ^ Protoni Kemiallinen siirtymä Kytkentävakio (O (Hz) H-1 5,68 d, J 12 3,5 H-2 5,08 a, J w 10,0 5 H-3 5,41 a. 1 3,4 3,5 H-4 4,76 a, J 45 1,5 H-5 4,57 H-1'a, l'b 4,04 H-3' 5,41 a. 1 ,·.4· 6,5 10 H-4' 5,34 a. I 4·,3· 6,5 H-5' 4,27 m H-l" 5,43 d, J ,.2. 3,5 H-2" 5,16 a. J. rj- 11,° H-3" 4,94 a, J 2-,3· 3,5 15 H-4" 5,01

Asetaatti H 1,92, 2,03, 2,04 s 2,05, 2,06, 2,07 ^C-nmr-tiedot yhdisteelle 4,1',6',6"-tetrakloori-4,1',6',6"-tetradeok-20 siealaktoraffinoosi

Hiili Kemiallinen siirtymä (r) C-2' 103,05 25 c-1" 99,81 C-l 92,31 C-5' 82,40 C-3' 75,89 C-4' 75,40 30 C-5" 71,17 C-3" 69,12 C-4" 69,04 C-2" 68,24 C-2,3,5 67,88, 67,40, 67,32 35 C-6 67,04 C-4 65,42 π 82836 1 C-l' 46,35 C-6' 44,12

Esimerkki 2 5

Yhdisteen TKR eristäminen yhdisteen 4,1',6',6"-tetraklooriraffinoosin hepta-asetaatti kautta.

Liuokseen, joka sisälsi vedetöntä raffinoosia (10 g, 19,8 mmol) pyri-10 diinissä (35 ml, 434 mmol), liuotettiin trifenyylifosfiinioksidia (16 g, 57,5 mmol) ja trifenyylifosfiinia (1,6 g, 6,1 mmol) lämmittämällä ja sekoittamalla. Tämän jälkeen tähän seokseen, jonka lämpötila pidetään 0°C:ssa jää-suolahauteen avulla, lisätään tionyylikloridia (15 ml, 207 mmol) 30 minuutin aikana. Reaktioseoksen annetaan lämmetä huoneen läm-15 pötilaan (sekoitettaessa voidaan todeta eksoterminen ilmiö). Tämän jälkeen reaktioseosta kuumennettiin 105-110°C:n lämpötilassa. Eksoterminen reaktio käynnistyi 5 minuutin sisällä, jolloin sisäinen lämpötila kohosi 150°C:een. Sitten lämpötila laski hauteen lämpötilaan 0,5 tunnin aikana. Kuumentamista jatkettiin 4,5 tuntia. Sitten liuoksen annettiin 20 jäähtyä huoneen lämpötilaan, ja sitä käsiteltiin asetanhydridin (noin 25 ml) ylimäärällä huoneen lämpötilassa sekoittaen 24 tuntia. Vaihtoehtoisesti, asetylointireaktion aika voidaan lyhentää 1 tunniksi toteuttamalla reaktio 100°C:n lämpötilassa.

25 Tuote eristettiin uuttamalla seos kuumalla tolueenilla. Tolueenikerros pestiin natriumkarbonaatin vesiliuoksella, vedellä, kuivattiin yhdisteellä Na2S04 ja suodos väkevöitiin. Tolueeniuute sisälsi 26 g kiintoainetta, käsittäen hiilihydraatin ja trifenyylifosfiinioksidin muodostamaa seosta. Mustaa jäännöstä sekoitettiin edelleen tolueenissa ja 30 natriumkarbonaatin vesiliuoksessa, jonka jälkeen musta kiinteä jäännös suodatettiin, jolloin saatiin toinen tolueeniuute, joka erotettiin, kuivattiin (NajS04) ja väkevöitiin (4 g kiintoainetta). Yhdistettyihin uutteisiin lisättiin dietyylieetteriä trifenyylifosfiinioksidin (15 g) saostamiseksi. Eetteriuute väkevöitiin siirapiksi (noin 15 g), sekoi-35 tettiin metanoliin (noin 100 ml) ja käsiteltiin 2 tunnin ajan 1 M nat-rlummetoksidillä (pH 10). Liuos neutraloitiin happamalla hartsilla ja i2 82836 ^ se suodatettiin hiilipetin läpi. Liuos väkevöitiin ja kuivattiin vakuu-miuunissa 40°C:n lämpötilassa 24 tuntia (10,8 g). Tämän jälkeen jäännös uutettiin vedellä, jäljelle jäänyt TFFO suodattiin pois, ja suodos väkevöitiin, jolloin saatiin yhdistettä TKR (5,3 g). Ohutkerroskromato-5 grafisesti (etyyliasetaatti:asetoni:vesi, 8:6:1) voitiin todeta, että noin 80 % läsnäolevasta hiilihydraatista on yhdistettä TKR.

Esimerkki 3 10 "Yhdisteen TKR suora eristäminen

Liuosta, joka sisältää vedetöntä raffinoosia (20 g, 39,7 mmol) pyridii-nissä (70 ml, 868 mmol), käsiteltiin edellä olevassa esimerkissä kuvatulla tavalla trifenyylifosfiinioksidilla (32 g, 115 mmol), trifenyyli-15 fosfiinilla (3,2 g, 12,2 mmol) ja tionyylikloridilla (30 ml, 414 mmol). Reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan, jonka jälkeen sitä kuumennettiin 105-110°C:n lämpötilassa noin 4,5 tuntia. Sitten kuumaan (noin 70°C) reaktioseokseen lisättiin metyyli-isobutyyli-ketonia (MIBK, 300 ml), seosta sekoitettiin ja MIBK-kerros dekantoitiin. Mustaa 20 jäännöstä uutettiin edelleen kuumalla (noin 70°C) metyyli-isobutyylike-tonilla (100 ml). Yhdistetyt MIBK-uutteet pestiin natriumkarbonaatin kylmällä vesiliuoksella, kuivattiin (CaS04) ja väkevöitiin siirapiksi. Siirappi sekoitettiin metanoliin (50 ml) ja käsiteltiin natriummetok-sidilla (pH 10) huoneen lämpötilassa noin 1 tunnin ajan yhdisteen TKR 25 saamiseksi. Ohutkerroskromatografisesti (etyyliasetaatti:asetoni:vesi, 8:6:1) todettiin varsinainen tuote, jonka liikkumisnopeus oli sama kuin standardina käytetyn yhdisteen TKR liikkumisnopeus. Metanoliliuoksesta poistettiin ionit happamalla hartsilla, väri poistettiin aktiivihiilellä, suodatettiin ja suodos väkevöitiin kiinteäksi jäännökseksi. Jäännös sekoitettiin kuumaan veteen, suodatettiin ja suodos väkevöitiin, jolloin saatiin kiinteätä TKR-yhdistettä (9,8 g, jonka puhtaus oli 60,6 % HPLC-kromatografisesti määritettynä, saanto 26 %).

35 i3 82 836 1 Esimerkki 4

Sukraloosin valmistaminen (pienessä mitassa) vesiliuoksessa 5 Esimerkin 1 mukainen tetrakloorigalaktoraffinoosi (20 g) laitettiin kierresuiseen pulloon, johon lisättiin samoin 0,1 M sitraatti-fosfaatti-puskuria (pH 5,0) (2 ml), jolloin saatiin 1-prosenttinen (w/v) liuos. Veden tämä taso säilytettiin seuraavan inkubointijakson aikana lisäämällä pulloon tarvittaessa lisää vettä.

10

Mikro-organismin Mortierella vinacea var raffinoseutilizer (ATCC 20034; saatu yhtiöstä Hokkaido Sugar Co., Japani) pelletoitujen solujen muodossa olevaa melibiaasia lisättiin (10 mg) ja seosta inkuboitiin 55°C:n lämpötilassa jopa 100 tuntia. Hydrolysoitumisastetta seurattiin sään-15 nöllisin väliajoin ohutkerroskromatografisesti pullosta otetuilla 250 mikrolitran näytteillä, jotka eluoitiin etyyliasetaatin, etanolin ja veden seoksella (45:5:1), tai HPLC-kromatografisesti käyttäen yhtiön Waters käänteisfaasilla täytettyä Dextropak C18-kolonnia, jota eluoitiin 20-prosenttisella asetonitriilillä (v/v), ja josta saatujen tuot-20 teiden mittaamiseen käytettiin taitekerroin-ilmaisinta. Tulokset esitetään kuviossa 1. Tällöin todettiin esimerkiksi, että noin 53 % oli hydrolysoitunut 48 tunnin kuluttua ja noin 70 % 90 tunnin kuluttua. Tuotteet erotettiin kromatografisesti, ja sukraloosin ohella määritettiin 6-kloorigalaktoosin ja TKR-yhdisteen läsnäolo. Tässä järjestelmäs-25 sä TKR voi kulua 15 prosenttiin saakka (w/v). Vesiliuoksessa entsyymin Michael is-vakio (K*,) on 5,8 Mm ja K^-vakio 52,5 mg/gramma entsyymiä/-tunti.

Esimerkki 5 30

Mikro-organismin Mortierella vinacea var raffinoseutilizer (ATCC 20034) pellettejä (3 g) hydratoitiin 0,1 M sitraatti-fosfaatti-puskuriliuok-sessa, pH 5,0, joka sisältää 5 % w/v raffinoosia, ja pakattiin vesivai-palliseen kolonniin, jonka ulottuvuudet ovat 11 x 0,9 cm, ja jossa 35 petitilavuus on 7 cm3. Tämän kolonnin lämpötila pidettiin 55°C:ssa käyttäen vesikierrätystä pumpun avulla. Kun kolonnia käytettiin TKR-yhdis- i4 82836 ^ teen hydrolysoimiseen sukraloosiksl, niin kolonnin puoliintumisajaksi 50-prosenttisen konversion suhteen todettiin 13 vuorokautta.

Esimerkki 6 5

Organismit, jotka kykenevät hydrolysoimaan TKR-yhdisteen sukraloosiksi

Kantakokoelmasta ATCC saatiin mikro-organismeja, joilla tiedettiin olevan α-galaktosidaasin aktiviisuutta. Niitä kasvatettiin 500 milli-10 litran ravistelupulloissa, joiden sisältämät 100 ml mineraalisuola-alustaa (Jayasuria, 1955 Journal of General Microbiology 12 419-428) käsitti 1 g/1 hiivauutetta ja 5 g/1 raffinoosia, alustan lämpötilan ollessa 30°C. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla (5000 rpm 10 min.) eksponentiaalisen kasvuvaiheen edettyä pitkälle, ne suspendoitiin uu-15 destaan solujen tilavuuteen verrattuna viisinkertaiseen määrään sit-raatti-fosfaatti-puskuria, pH 5,0, ja suspension lämpötila pidettiin 0°C:ssa jäähauteessa, ja solut hajotettiin suspensiossa 3 x 20 sekunnin pituisilla sysäyksillä MSE-sonikaattorissa, käyttäen mahdollisimman suurta lähtötehoa (Dave Soniprobe Type 1130A). Tuloksena olevaa suspen-20 siota sentrifugoitiin nopeudella 17 000 rpm 30 minuuttia, ja a-galak-tosidaasin aktiivisuus yksiköissä yksikkö/g solujätteen kuiva-ainetta määritettiin sekä solujätteestä että supernatantista käyttäen p-nitro-fenyyli-a-D-galaktopyranosidia (Sigma). Supernatantista ei todettu itse asiassa lainkaan entsyymin aktiivisuutta. Positiivisiksi todettujen 25 viljelmien kyky hydrolysoida TKR-yhdistettä määritettiin esimerkissä 4 esitetyllä tavalla, ja tulokset esitetään yksikössä mg sukraloosia solujätteen kuivapainon grammaa kohden tunnissa (konversion ollessa 70 %). Tulokset olivat seuraavat: 30 Organismi ATCC-no. Entsvvmivksiköt TKR-vhdisteen hvdrolvvsi

Absidia griseola 20430 35,5 0

Absidia griseola 20431 18,6 <0,2

Absidia griseola 22618 43,7 0 35 Aspergillus awamori 44733 20,8 0

Aspergillus niger 36220 20,1 0,49 is 82 8 36 1 Circlnella muscae 16008 75,4 1,12

Circinella muscae 20394 28,9 <0,2

Circlnella muscae 22337 11,3 0

Mortierella vinacea 20034 18,2 1,09 5 Mortierella vinacea 34195 8,9 1,33

Mortierella vinacea 42425 10,6 1,06

Saccharomyces uvarum 42367 1,6 0

Talaromyces thermophilus 16461 <1,0 0

Mortierella vinacea Hokkaido 21,3 4,3 10 (pelletit)

Esimerkki 7

Sukraloosin tuotanto orgaanisessa alustassa 15

Esimerkin 1 mukainen TKR (23 mg) laitettiin 5 millilitran suuruiseen, kierresuiseen ampulliin, Johon lisättiin myös 2 ml veteen tehdyllä puskuriliuoksella (natriumasetaatti, 50 mM, pH 5,0) etukäteen kyllästettyä orgaanista liuotinta, jolloin saatiin 20 mM liuos (1,15 % w/v). 20 Kuhunkin ampulliin lisättiin mikro-organismin M. vinacea var raffino-seutilizer (ATCC 20034) pelletoituina soluina olevaa a-galaktosidaasia (100 mg) ja reaktiot käynnistettiin lisäämällä 1 % v/v veteen tehtyä puskuria, sekoittamalla voimakkaasti pyörittäen 30 sekuntia, ja laittamalla ampullit vesihauderavistelijaan, jonka lämpötila on 55°C ja nopeus 25 100 rpm. Ampulleista otettiin säännöllisin väliajoin näytteitä , ja 25 ui injektoitiin HPLC-järjestelmään, jossa käytettiin käänteisfaasi11a täytettyä kolonnia (Waters; Dextropak C18) ja eluenttina 20 % asetonit-riilin vesiliuosta, jolloin muodostunut sukraloosi ja jäljellä oleva TKR saatiin mitatuksi. Kuviossa 2 esitetään orgaanisen liuoksen vaiku-30 tus sukraloosin muodostumiseen 24 tunnin pituisen inkuboinnin aikana. Tässä kuvassa yhdisteen TKR hydrolysoituminen sukraloosiksi esitetään ajan funktiona veteen tehdyssä puskurissa (käyrä 1) sekä kolmessa li-uottimessa, metyyli-isobutyyli-ketonissa (2), etyyliasetaatissa (3) ja H-butanolissa (4). Hydrolyysireaktio oli samankaltainen metyyli-isobu-35 tyyliketonissa ja veteen tehdyssä puskurissa. Alhaisempia reaktio - nopeuksia ja konversioita saatiin etyyliasetaatissa ja n-butanolissa, i6 82836 1 vastaavasti. Kussakin tapauksessa todettiin yli 50-prosenttisia konversioita 24 tunnissa, konversion ollessa 70-prosenttinen veteen tehdyssä puskurissa ja metyyli-isobutyyliketonissa.

5 Erillisessä kokeessa entsyymi noudatti Michaelis-Menten-kinetiikkaa sekä veteen tehdyssä puskurissa että etyyliasetaatissa. !(„- ja K,^-vakiot etyyliasetaatissa olivat 16,4 mM TKR ja 56,3 mg sukraloosia/g pellettejä/ tunti, vastaavasti. Syynä, miksi TKR-yhdisteen hydrolyysi eteni hitaammin etyyliasetaatissa kuin veteen tehdyssä puskurissa TKR-10 yhdisteen pitoisuudessa 20 mM, oli TKR-yhdisteen suurempi K^,-vakio etyyliasetaatissa eikä alhaisempi katalyyttinen aktiivisuus. Käytettäessä TKR-yhdisteen pitoisuutta 50 mM TKR-hydrolyysin etenemisnopeus ja konversio etyyliasetaatissa olivat samankaltaiset kuin veteen tehdyssä puskurissa.

15 20 25 30 35

Claims (7)

1. 2. Menetelmä sukraloosin tuottamiseksi, käsittäen fi-a-D-6-kloori-6-deoksigalaktopyranosyyli-(1 -> 6)-a-D-4-kloori-4-deoksigalaktopyra-nosyyli-(l -> 2)-/3-D-l,6-dikloori-l,6-dideoksifruktofuranosidi (TKR)- 10 liuoksen inkuboimisen sellaisen entsyymin läsnäollessa, joka entsyymi kykenee poistamaan 6-kloori-6-deoksi-galaktosyyli- ryhmän 6-asemasta.
2. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on saatu mikro-organismin Mortierella vinacea. Circinella 15 muscae tai Aspergillus nicer kannasta.
3. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on saatu mikro-organismista Mortierella vinacea var raf-finoseutilizer. 20
4. 5. Jonkin patenttivaatimuksen 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 0-a-D-6-kloori-6-deoksigalaktopyranosyyli-(1 -> 6)-a-D-4-kloori-4-deoksigalaktopyranosyyli-(1 -> 2)-/3-D-l, 6-dikloori-l, 6-dideok-sifruktofuranosidi (TKR) liuotetaan vesiliuokseen tai veteen sekoittu- 25 mattoinaan hydrofiiliseen orgaaniseen liuottimeen.
5. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu liuotin on metyyli-isobutyyli-ketoni, etyyliasetaatti tai D-butanoli. 30
6. 7. Jonkin patenttivaatimuksen 2-6 mukainen menetelmä, joka toteutetaan noin 55°C:n lämpötilassa ja pH-arvossa 4,5-5,5. 1 Menetelmä yhdisteen 0-a-D-6-kloori-6-deoksigalaktopyranosyyli-(1 -> 6)-c*-D-4-kloori-4-deoksigalaktopyranosyyli-(1 -> 2)-/3-D-l, 6-dikloori- 1,6-dideoksifruktofuranosidi (TKR) tuottamiseksi, käsittäen raffinoo- ie 82836 ^ sin ja tionyylikloridin välisen reaktion triaryylifosfiinioksidin tai -sulfidin läsnäollessa. 5 10 15 20 25 30 35 Ί Patentkrav i9 82836