CN102241708B - 一种半乳糖苷化合物及其制备方法 - Google Patents

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本发明涉及一种半乳糖苷化合物及其制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶合成半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的方法，属于糖工程技术领域。其化学名称为：1，6-二氯-1，6-二脱氧-β-D-呋喃果糖基-4-氯-4-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖，分子式为C18H29O13C13。

Description

一种半乳糖苷化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种半乳糖苷化合物及其制备方法，特别涉及一种利用β-半乳糖苷酶合成半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的方法，属于糖工程技术领域。
技术背景
三氯蔗糖是以蔗糖为原料而制成的一种性质优良的甜味剂，其甜度可达蔗糖的600倍、糖精的2倍、阿斯巴甜的4倍。除了极高的甜度，该糖还具有热量低、甜味纯正、高度安全以及稳定易溶解等诸多优点，现在逐渐被广泛应用于食品饮料行业。
如公开号为CN101812095A(申请号为201010166831.8)的中国专利申请，公开了一种采用了新的乙酰化试剂来制备三氯蔗糖的方法，包括三个步骤：(一)酰化反应，蔗糖与乙酰化试剂反应生成蔗糖-6-乙酸酯，(二)氯化反应，将上一步得到的蔗糖-6-乙酸酯经氯化反应得到三氯蔗糖-6-乙酸酯，(三)脱乙酰基反应，将上一步得到的三氯蔗糖-6-乙酸酯经脱乙酰基反应得到三氯蔗糖。酰化反应的中选用乙烯酮气体作为乙酰化试剂。此法能有效提高三氯蔗糖的收率，且反应时间较短，反应温度容易控制，易于工业化生产。
但随着人们对食品品质要求的提高，单一的三氯蔗糖已经无法满足人们的需要，因此，以三氯蔗糖为原料，通过糖苷酶进行糖基化修饰，开发新的化合物，在食品业具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种新型半乳糖苷化合物及其制备方法。
一种半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖，化学名称为：1，6-二氯-1，6-二脱氧-β-D-呋喃果糖基-4-氯-4-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖，其分子式为C18H29O13C13，化学结构式如下：
Figure BDA0000060311480000011
上述半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的制备方法，步骤如下：
(1)分别用缓冲液配制浓度为0.6M的乳糖溶液、浓度为0.1M～0.6M的三氯蔗糖溶液和浓度为20～50U/mL的β-半乳糖苷酶溶液；
(2)将步骤(1)制得的乳糖溶液、三氯蔗糖溶液和β-半乳糖苷酶溶液按体积比9∶9∶2的比例混合，37～45℃水浴中反应2～10小时后，100℃煮沸10分钟终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，将上清液用0.4μm滤膜过滤，取上清液，得滤液；
(3)将步骤(2)制得的滤液，经分离、干燥后，制得半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖。
所述步骤(1)中的β-半乳糖苷酶溶液中的β-半乳糖苷酶选用专利ZL2005 1 0044897.9所述基因序列或GenBank登录号为CAI98003的基因序列按照专利ZL2005 1 0044897.9所述方法制得。上述β-半乳糖苷酶具有β(1→6)糖苷键合成活性。
所述步骤(1)中的缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液。优选的所述步骤(1)中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
所述步骤(2)中的反应条件为45℃水浴反应10小时。
所述步骤(3)中的分离为用规格15mm ID×100cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，收集洗脱样品，薄层层析检测，合并迁移距离相同的三氯蔗糖转糖基产物。
上述色谱分离的样品上样量为1～2mL，洗脱流速为0.2～0.3mL/分钟。优选的所述步骤(3)中，样品上样量为1mL，洗脱流速为0.2mL/分钟。
上述薄层层析检测步骤如下：取1μL洗脱液，薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
上述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5∶3∶2混合配制；显色剂是含有终浓度为20wt％的硫酸和终浓度为0.5wt％的3，5-二羟基甲苯的溶液。
所述步骤(3)中的干燥为冷冻干燥。
上述步骤(1)中的酶活测定方法为：取β-半乳糖苷酶酶液50μL，加2mM邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)溶液450μL(pH5.4、50mM醋酸-醋酸钠缓冲液配制)，37℃反应10分钟，加0.5M Na2CO3溶液1mL终止反应，离心，上清液测OD400。酶活单位定义：以1分钟水解ONPG释放1μM邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位(U)。
本发明新合成的半乳糖苷化合物与其原材料三氯蔗糖相比，含有益生寡糖低聚半乳糖中的β(1→6)半乳糖苷键，易被肠道益生菌如双歧杆菌等乳酸菌选择性水解利用，促进肠道微生态平衡，具备了三氯蔗糖原有的甜味素和益生寡糖的双功能。
附图说明
图1为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的质谱图；
图2为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的氢谱；
图3为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的氢氢COSY核磁图谱；
图4为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的碳氢直接相关核磁图谱；
图5为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的碳氢远程相关核磁图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一种新型半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖，其制备步骤如下：
1.β-半乳糖苷酶的制备
按专利ZL2005 1 0044897.9所述方法制备β-半乳糖苷酶。
2.β-半乳糖苷酶催化合成β-6-半乳糖基-三氯蔗糖
测定上述β-半乳糖苷酶酶液的酶活，用pH7.0、50mM磷酸钾缓冲液将其稀释到30U/mL。用pH7.0、50mM磷酸钾缓冲液配制0.6M的乳糖溶液和0.3M的三氯蔗糖溶液。取2mL稀释酶液，9mL乳糖溶液和9mL三氯蔗糖溶液混合，在45℃反应10小时后，100℃煮沸10分钟，终止反应。
3.β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的纯化
将煮沸后的反应液12000转/分钟离心20分钟，将上清液用0.4μm滤膜过滤后，吸取1mL，用Bio-gel P2色谱柱(15mm ID×100cm)分离，以水为流动相，流速0.2mL/分钟，收集洗脱样品，薄层层析检测，合并迁移距离相同的三氯蔗糖转糖基产物，冷冻干燥后制成粉末，即为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖。
4.β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的结构鉴定
取上述白色粉末用水稀释成质量体积百分比为1％的溶液，进行质谱分析，目标产物的分子离子峰(m/z)主峰[M+Na]+为583.2，[M+K]+为599.2(如图1所示)，判断产物分子量为560，与预期产物分子量一致。将10mg粉末溶于氘代水中，进行核磁解析，综合氢谱(如图2所示)，氢氢COSY谱(COSY)(如图3所示)，碳氢直接相关谱(HSQC)(如图4所示)，碳氢远程相关谱(HMBC)(如图5所示)，确定各位置C，H的化学位移和偶合常数，化学位移4.29ppm处可观测到H-1″的双峰信号，偶合常数为7.8Hz，推断半乳糖基通过β键与三氯蔗糖分子相连，在HMBC图中可以观测到C-6′和H-1″的偶合信号，可以推断半乳糖基连接在三氯蔗糖的C-6′处，综合以上分析，新合成的产物为β-6-半乳糖基-三氯蔗糖。
上述质谱分析所用仪器为API 4000质谱仪Applied Biosystems MDS Sciex(加拿大)；核磁分析所用仪器为AVANCE 600型超导超屏蔽傅立叶变换核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)。
实施例2
一种新型半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖，其制备步骤与实施例1相比，不同之处在于：
利用GenBank登录号为CAI98003的基因，按照专利ZL2005 1 0044898.3所述方法制得β-半乳糖苷酶。

Claims (2)

1.一种半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖，化学名称为：1,6-二氯-1,6-二脱氧-β-D-呋喃果糖基-4-氯-4-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基-β-D-吡喃半乳糖，其分子式为C18H29O13Cl3，化学结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.权利要求1所述半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）分别用缓冲液配制浓度为0.6M的乳糖溶液、浓度为0.1M～0.6M的三氯蔗糖溶液和浓度为20～50U/mL的β-半乳糖苷酶溶液；
（2）将步骤（1）制得的乳糖溶液、三氯蔗糖溶液和β-半乳糖苷酶溶液按体积比9:9:2的比例混合，37～45℃水浴中反应2～10小时后，100℃煮沸10分钟终止反应，10000～12000 转/分钟离心20分钟，将上清液用0.4μm滤膜过滤，取上清液，得滤液；
（3）将步骤（2）制得的滤液，经分离、干燥后，制得半乳糖苷化合物β-6-半乳糖基-三氯蔗糖；
所述步骤（1）中的缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；
所述步骤（3）中的分离为用规格15mm ID ×100cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，收集洗脱样品，薄层层析检测，合并迁移距离相同的三氯蔗糖转糖基产物。
3. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中的缓冲液为50mM，pH7.0的磷酸钾缓冲液。
4. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的反应条件为45℃水浴反应10小时。
5. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，色谱分离的样品上样量为1～2mL，洗脱流速为0.2～0.3mL/分钟。
6. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，色谱分离的样品上样量为1mL，洗脱流速为0.2mL/分钟。
7. 如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，薄层层析检测步骤如下：取1μL洗脱液，薄层层析板点样，在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂是含有终浓度为20wt%的硫酸和终浓度为0.5wt%的3,5-二羟基甲苯的溶液。
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The Pharmacokinetics and Metabolism of Sucralose in the Dog;S. G. WOOD,等;《Food and Chemical Toxicology》;20000731;第38卷;第S105页Fig.5 *

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