FI76378C

FI76378C - Foerfarande foer framstaellning av xanthomonas-heteropolysackarid, med detta foerfarande framstaelld heteropolysackarid och anvaendning av den.

Info

Publication number: FI76378C
Application number: FI842617A
Authority: FI
Inventors: John David Downs
Original assignee: Shell Int Research
Priority date: 1983-06-29
Filing date: 1984-06-28
Publication date: 1988-10-10
Also published as: IE841647L; EG17121A; FI76378B; ATE41446T1; DK316884D0; EP0130647A3; HU198101B; FI842617A; RO89428A; DK316884A; GB8317696D0; SG41890G; JPH0536033B2; JPS6047694A; AU2997784A; KR850000531A; SU1389683A3; ZA844936B; IE57693B1; NO842615L

Description

1 76378

Xanthomonas-heteropolysakkaridin valmistusmenetelmä, tällä menetelmällä valmistettu heteropolysakkaridi ja sen käyttö Käsiteltävänä oleva keksintö koskee menetelmää 5 Xanthomonas-heteropolysakkaridin valmistamiseksi fermentoi-malla määrättyä Xanthomonas-lajia.

US-patenttijulkaisusta 3 485 719 tunnetaan hetero-polysakkaridien valmistus fermentoimalla hiilihydraatti-lähde organismilla Xanthomonas campestris NRRL B-1459.

10 Tässä patenttijulkaisussa esitetään, että Xanthomonas campestris NRRL B-1459:n tuottama heteropolysakkaridi on osoittautunut erittäin tehokkaaksi aineeksi öljyn välillisessä talteenotossa ja sitä voidaan käyttää sakeuttamis-aineena elintarvikkeissa, kosmeettisissa tuotteissa ja 15 vastaavissa, myös syötävänä, kalvon muodostavana aineena, emulgointiaineena esim. painoväreissä sekä sakeuttamis-aineena tekstiilien painotahnoissa.

Patentinhakijat ovat nyt eristäneet Xanthomonas campestris-lajin uuden alakannan, joka on talletettu laitok-20 seen National Collection of Industrial Bacteria, Torry

Research Station, Aberdeen, tulonumerolla 11854. Verrattuna mikro-organismiin Xanthomonas campestris NRRL B-1459 käsiteltävänä olevan mikro-organismin NCIB 11854 ominaiskasvu-nopeus määrätyssä kasvualustassa näyttää olevan paljon 25 suurempi, polymeerin ominaistuottonopeus näyttää olevan merkittävästi suurempi ja sitä voidaan ylläpitää huomattavan pitkiä aikoja jatkuvatoimisena viljelmänä tai toistuvana täyttö- ja poisto-viljelmänä ilman polymeerin tuottamiskyvyn huononemista.

30 Laitoksen National Collection of Industrial Bacteria suorittama organismien Xanthomonas campestris NCIB 11854 ja Xanthomonas campestris NCIB 11803 = NRRL B-1459 karakterisointi, joita organismeja kutsutaan seuraavassa nimillä NCIB 11854 ja NCIB 11803.

35 Tulokset olivat samat NCIB 11803:lie ja NCIB 11854: lie, jollei muuta ilmoiteta.' 2 76378

Solumorfologia A. Oxoid CMI ravintolientä + 0,75 % Difco agarmal-joja inokuloitiin "nuorella” viljelmällä ja inkuboitiin 7,5 tuntia 25°C:ssa. Soluja, jotka sijaitsivat n. 0,2 mm:n 5 laajuisten kasvutäplien reunoissa, tutkittiin ja valokuvattiin in situ peitelasin alla faasikontrastilla. Liikkuvuus ja muut tunnusmerkit määritettiin lammikoista, jotka ympäröivät muille täplille asetettuja 0,1 mm:n la-sihelmiä. Kasvun reunamilla solut esiintyivät yksittäin 10 ja pareina ja NCIB 11803-solujen koko oli leveys 0,4- 0,5 jim x pituus 1,2-2,5 jim ja NCIB 11854-solujen koko 0,5-0,6 |im x 1,2-2,5 jim. NCIB 11803:11a nähtiin usein kasvun reunamissa, jotka rajoittuivat lammikoihin, aggregaatteja (symplasmaa, ks. Graham ja Hodgkiss, 1967), joissa oli 15 n. sadasta useaan tuhanteen solua, mutta NCIB 11854:llä tämä ilmiö oli harvinaisempi. Liikkuvuus oli positiivinen.

B. Kun käytettiin kohdan A olosuhteita, mutta lisäten kasvualustaan 0,5 % glukoosia ja inkuboiden 7 tun- 20 tia, tulokset olivat samoja sillä erolla, että solut olivat 0,1 jim leveämpiä ja NCIB 11854: llä ei havaittu aggregaatteja .

Pesäkemorfoloqia A. 48 tunnin kasvun jälkeen 30°C:ssa Oxoid CM3 25 ravintoagarmaljoissa kasvu todettiin hyväksi ja erilliset pesäkkeet olivat väriltään keltaisia, pyöreitä, ehyitä, limaisia, sileitä, sitkeitä ja kuperia. 11803:n pesäke-halkaisija oli 1-1,5 mm ja NCIB 11854:n 1,5 mm.

B. 72 tunnin kasvun jälkeen 30°C:ssa kasvualustal-30 la, joka oli sama kuin kohdassa A, mutta sisälsi lisäksi 1 % glukoosia, kasvu todettiin hyväksi ja erilliset pesäkkeet olivat väriltään vaalean kermanvärisiä, pyöreitä, ehyitä, hyvin limaisia, sileitä ja kuperia. Yhtenäinen kasvu oli vaalean kermanvärinen-keltainen. NCIB

3 76378 11803:n pesäkehalkaisija oli 2 mm ja 11854:n 2-2,5 mm. Käytetty morfologia

Epäorgaaninen substraatti Palleroni & Doudorff 1972, modifioitu (PD) (A. Rev. Phytophethol. 10, 73) 5 Na2HP04.12H20 6,0 g KH2P04 2,4 g NH4C1 1,0 g

MgS04-7H20 0,5 g

FeCl3.6H20 0,01 g 10 CaCl2.6H20 0,01 g deionoitua vettä 1 litra pH on 6,8.

PD on epäorgaaninen substraatti +0,1 % suodattamalla steriloitua glukoosia (PDG).

15 Gelatiiniputket

Ravintolientä n:o 2 (Oxoid) 2,5 %

Gelatiinia (Difco) 12,0 %

Gelatiinimaljät

Ravintoagaria Oxoid CM3 2,8 % 20 Gelatiinia 1,0 %

Maitomaljät

Rasvatonta maitoa (Difco), steriloitu erikseen 3 %

Peptonia (Difco) 0,1 % 25 Lihauutetta Lab-Lemco 0,1 %

NaCl:ää 0,5 %

Agaria 1,5 % pH 7,4 ennen autoklavointia

Biokemialliset tunnusarvot: 30°C:ssa, jollei muuta 30 ilmoiteta

Kasvu eri lämpötiloissa CM3-maljoissa Lämpötila 5°C 30°C 37°C

Kasvu (ei-kvanti- tatiivinen) + + 4 76378

Kasvun PH-a lue CMI-liemessä (säädetty pH) pH 3 5 7,2 8 9 10

Kasvu - 3+ 3+ 3+ 3+ 3 +

Kasvu suolan läsnäollessa 5 Valmistettiin peruskasvualustoja, jotka sisälsivät 2, 3, 4 ja 5 % NaCl:ää, Haywardin ja Hodgissin (1961) menetelmän mukaan. Viljelmiä inkuboitiin 3 vrk.

NCIB 11854:n toleranssi oli pienempi kuin NCIB 11803:n seuraavan taulukon mukaisesti: 10 NaCl % 2345 NCIB 11803:n kasvu 3+ 3+ 3+ NCIB 11854:n kasvu 3+ 3+ +

Gelatiinin ja kaseiinin hydrolyysi

Viljelmiä inkuboitiin 7 vrk. Gelatiiniputket olivat 15 20°C:ssa. NCIB 11854:n proteolyyttinen aktiivisuus oli pienempi kuin NCIB 11803:n seuraavan taulukon mukaisesti:

Gelatiiniputki Gelatiinimalja Maitomalja NCIB 11803 + + + NCIB 11854 - + heikko + 20 Kasvutekijävaatimustestit

Valmistettiin osaviljelmiä siirrostamalla suoraan silmukalla kolmasti PDG-kasvualustaan, joka oli valmistettu lasiastiassa tislatun veden avulla. Hyvä kasvu saavutettiin noin neljän vuorokauden kuluttua merkkinä siitä, että ei 25 ollut mitään ehdotonta kasvutekijätarvetta.

Metioniinistimulointitesti

Yksi pisara jokaista heikosti sameaa, nuoren kasvuston muodostamaa viljelmää PDG-elatusalustassa, joka oli valmistettu lasiastiassa tislatun veden avulla, inokuloitiin 30 PDG:hen lisäyksen 10 yag/ml L-metioniiniä kera tai ilman sitä. PDG:tä oli 1 ml 16 mm:n putkissa. L-metioniini ei stimuloinut kasvunopeutta.

Hiililähteen hyväksikäyttö PD-elatusalusta, jossa oli 0,1 % taulukosta 1 ilmene-35 viä suodattamalla steriloituja yksinomaisia hiililähteitä, inkuboitiin 14 vrk. Kantojen kasvuissa voitiin havaita kolme c 76378 5 ilmeisen pientä eroa.

Hapon tuotto hiilihydraateista

Haywardin ja Hodgkissin (1961) hapetus-fermentointi-kasvualustaan lisättiin 1 % taulukosta 1 ilmeneviä suodatta-5 maila steriloituja hiililähteitä. Putket inokuloitiin ja niitä inkuboitiin 14 vrk. NCIB 11854, mutta ei NCIB 11803, muodosti happoa galaktoosista ja melibioosista. Tämän havainnon merkitsevyys on kyseenalainen ja erityisesti siksi, että sekä NCIB 11854 ja NCIB 11803 käyttivät molempia yhdis-10 teitä ainoina hiililähteinään.

Taulukko 1

Hiililähteen hyväksikäyttö - Taulukon yhdisteet ovat samat kuin Pseudomonaksen yhteydessä teoksessa Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 1974 ja samassa järjes-15 tyksessä kuin Pseudomonaksen yhdeydessä julkaisussa R.Y. Stanier et ai. (1966) J. Gen. Microbiol. 43, 159.

Hapon tuotto hapetus Kasvu ainoasta hiili-2o -ferm. kasvualustasta lähteestä NCIB 11803 NCIB 11854 NCIB 11803 NCIB 11854

Hiilihydraatteja ia sokeri-iohdannaisia 25 D-riboosi D-ksyloosi jälki - heikko heikko L-arabinoosi heikko heikko L-ramnoosi D-glukoosi + + + + 30 D-fruktoosi + + + +

Sakkaroosi + + + +

Trehaloosi + + + +

Sellobioosi heikko + + + 2-ketoglukonaatti 35 Sakkaraatti 6 76378

Taulukko 1 (jatkoa)

Rasvahappoj a 5 Asetaatti heikko heikko

Propionaatti Butyraatti

Dikarboksyylihappoja 1Q Malonaatti heikko <+

Hydroksihappoj a D-(-)-tartraatti

Mesotartraatti DL-3-hydroksibutyraatti 15 DL-laktaatti Glykolaatti

Erilaisia orgaanisia happoja Levu1inaatti 2Q Sitrakonaatti Mesakonaatti

Sokeripolyalkoholeja ja glykoleja Erytritoli

Sorbitoli ~ - - 25

Mesoinositoli - - -

Adonitoli

Propyleeniglykoli 2,3-butyleeniglykoli D-mannitoli* heikko + - <heikko 30 Glyseroli* + + <heikko

Alkoholeja

Metanoli*

Etanoli 35 Geranioli 7 76378

Taulukko 1 (jatkoa)

Typettömiä aromaattisia ja muita syklisiä yhdisteitä 5 Meta-hydroksibentsoaatti Para-hydroks ibentsoaatti Testosteroni

Alifaattisia aminohappoja 10 L -väliini L-arginiini -f ~

Rengasrakenteen sisältäviä aminohappoja Histidi ini " L-tryptofaani*

Antranilaatti*

Ami ineja

Bentsyyliamiini*

Tryptami ini 20 -amyyliamiini

Erilaisia typpiyhdisteitä

Betai ini Pantotenaatti 25 Hiilihydraatteja ja sokeri johdannaisia (jatkoa)

Galaktoosi* - + + +

Mannoosi* + + + +

Laktoosi* ~

Maltoosi* + + + + 30 Melibioosi* - + + + * Lisäyhdiste \ DL- asemasta 8 76378

^ I

m JL,

00 O + + · 1++ + + + +++, φ I

co co ro co co oo co co , c — =3 +. :<T3 fO > <4- —

o I *M +J

GOO ++, ,++ + + + +++, UO+>

^“CO cococococorocococo φ C

*”* ΚΛ +J - φ

Ό T3 (/) ^ «o E

«* «Λ ·· x its cn

«/> U> —. 3 (U .M

• · · · o I -X Q.

U 31 «O (/) O CL Z C 3 Ό O 1- ro <TJ Φ tB fc- > 3 3 Z3 f> W 3

> > > a w 4J

to O O ^ C\i (/) *4 »« >,«/)·<·*

«O O O C*» ro » O iT3 V W O

i^lftfOCO Μ ΙΛ N 03 Φ »- ^ (Vi O IT) K-EO

ΙΛ +

GOO II I I 1+ fv + O + I I + I

«Μ *- CO \

Φ »“ .X

Φ ·« +* Φ (Λ CO ^ —« o Ό CO O II I I ,+ p-s. + ++|, + , .C CO + >» *-

+» O

<o —« o

ε «Λ CSJ C

0 O CO ·« CSJ+> O C- i- t- I CM Ο — (X3 — <λ

+» -X ΦΦΦ O CvJ Z .X ·.-> (/) +J fD

O 03 ZJ —« ^ Z Z —. <T3 -X ΕΞ —· ^ —· —* l/l t/> 3 ro C — (/1 Q.

-x 3 σ> T 'Too α e — φ φ ^ 3·*-» =3 Σ Σ Σ 1 lc« -4— .X — — ^-* --· to cd ci—« —* φ .χ »o ro o

30 fl CL σι (Λ C ICO I CO :Π3 «C ΦΦ ι/) S_ CC CO "O

ro +* ro Z C- >> l~ O O :π3 Z ΦΦ ro :rO —! —i ~)~ r-

►“ e O Z ZOO CD CD ^ h- Σ X Z

Φ ε «- ** Φ LO ++ + +- GO Ο ΙΌ ,+ ++ + + — CO (Λ (O +++ + • *- n > •M i~ 33 Φ +> iΛ :<0 —

—* «/> O

> to Ό —· Φ e ε 3 +> CO φ + :ro »O O ·»-« ^ — 01 CO O — — +·> ++ + Φ ^ CO >ιΌ +-> ,+ +++ + C — -h C + + + I Φ ·» Φ ε ··“5 ό έ »O *—· ro O) fc. Φ —.

CD > .X CL

O

3

fO

— O — **j CO

+> +-> =3 =3 C ^ * 4-> :0 — 3 => 40 (O O C —. —.

«O CL — uo 40 (O O O C— Λ μη CC

«O E C to C3 cj co — — «— — :«T> — C 3 — -~h — 30 C —« O —« — Φ CO — ·— +·* +J OO «g <1> _X OO 00 ΙΛ C tO O C 00 +J +> >»— O M-J >·» O .X —

· Π3 φ O ro (O S to -* >> C

l^3>)UO>— O (O ro .X LO Q. IQ iO -Q E O 03 CD "D (/> O L. <o .X +i +> ^ — φ L-J O >) (VJ Ό ·—· O 3 «O ♦-» 3 JX φ U CU 0*-> > ^ *- > O C >> — I Φ — «O tO φ Φ+-» rH φ OO \ φ

2 M Q. L· J CO CD —I C 3C Q-CO txl I— Z CV O I

9 76378 ir>

CD O

*- en

MO I

en Cl φ ro O C Φ ·η *»—> CO O ♦· ~ » *-00 co e — e *- 00 — > «3 — e e *- e «a pa <D CO f • U CO u h Ό (1) 3

Q- en 0Q

»O *—· P (O E · ro

pj fO UJ O

+ Φ > O · — o «/>+-> OC Ό ** ^ » ro <o Φ uo ^ e ji > · Σ

00 O I — I I I O 3 E

*- en 4> φ — *+-

*- XZ *0 tn pJ O O

C rq + o - —> ^ e O fc- <O o en >c φ tn o. · —· P» O J* uo E *-* P> φ 00 o l ·— II» «O ΓΟ '.ro UJ* to Φ v- en o e +-> > r*·*» o +j*- £ oj (Λ y, ' w ·η UI U0 3 00 *— P- T3 I — >o ·—· <0 Ω. P> x: φ i- φ ^ 3 cc >> in QJ *—· ro > C Ό Φ z-' ra Q e — tn o Φ Ό pj i-x >ί (Ό O W tn (O *—·

—» «O CO ··—Ϊ Cl 00 O ro .* Φ -C

ro e ►— — *— .e mo tn 4-» a>

OO ·—^>>4-»C H- :tO :rO CO .C

J* Ρ> *-» -H Φ O. uo Π3 p* p> p> CO CO Φ CT) en··—J · (O (O <\J + (O 2 OC CL. t- Λ3>, >, i-

*—> E X P> h- X > < m-> —* IO CT O

<w-- 3 ·—« Ui O <P- pj ««-4 mo cu en *—· · CM-n^ co * — +j φ O tn —· 0 m o*—· tn « co ·-« ^ — e «o O+J00 O 10=3 · — pj ·***- — U 3 e *- m ^eco e oo mo no o φ e

Φ *— 30 o — .e MO MO PJ <—· «O

3 E ^ +->.*£ MO E C υ — x C. CD CP —« > VO IO 2 34) φ 4) ^ JO CD·· «e<*- Q. CP P* CP — ββ^-vco

h- 35 «E · d) «t W

* oo 3 >φ <o > tn r*v φ pj O +J >, o l. + (Λ — E CD t- 4» m — +J ro X co p> ro *- CL· co O ^ o P* P> Cl Z <o « — ·— —* CO O I CO | CO φ o +-» e ·—« >· > — en o — pj u e — <n — · +-> — *- o C CO Φ O P> 3 E — ^ ·— y O·— «n»—· l. 2 · io p> 3 p ^ pJ rO Φ ro Φ ^ L- (O «— Q - :fl ^ (Λ 3 P-3 * Φ O) 3» φ Φ > -^ — > Φ Φ - > 4) «— CP CP Φ — >. co O I- —· —·

C e — p> «O O 4) C

1 φ4-> — Χ<Ρ*ΕΦ=)

E £ Φ S- O ·— +J

IO O C ·—· C Φ :*O 4-> 00 Φ k. o Φ O ·— —* co ·— — σ> CD > co «to «J Ό UJ Ό rt3 C. C :<0 C >> 3 00 ·*-, — —· ro φ en C Φ C L.

^ en o Q. — ro ♦ · X)

-M -f-» co — 4-> >« Φ ·»— E

pj .O C ^ φ O pJ CO « ro

ro O. :rd S- O P->3— tn C CO CP

ro £ ·—) XZ 4-J co pJ e t- -O

·—· :iO — O — φ — φ :*0 >» -Q · · O — ro pJ(.cO:iO PJ Φ X5 C: Ό tn φ ···· E φ E Φ C7> — <o ·«*-· · pJ tn tn :rO φ C Φ t- CD 2 t- I -O 3 ro 3 CO E ro :rO PJ Φ 04) CD· 3 > ro e tn^«oc0P»CD*CJp» jx tn Φ —· — en co uj o CP C ro i- ro :<0 O t- >·, — · . · ro

Z·— 3 —l Z CP O > ·— Z CM CQ

10 7 6 3 7 8 Käytettäessä NCIB 11854 mikro-organismin tuottamaa heteropolysakkaridia parantamaan öljyn talteenottoa tämän heteropolysakkaridin mahdollinen injektoitavuus määritettynä suodatustestien avulla on yhtä hyvä tai jopa parempi 5 kuin Xanthomonas campestris NRRL B-1459:n tuottamalla he-teropolysakkaridilla, erityisesti liuotettuna paljon suolaa sisältäviin keittosuolaliuoksiin. Käsiteltävänä oleva keksintö tarjoaa menetelmän Xanthomonas-heteropolysakkari-din valmistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään or-10 ganismia Xanthomonas campestris NCIB 11854 vedellisessä ravintoalustassa, jolloin fermentoidaan aerobisesti yh-teyttämiskelpoista hiilihydraattia ja typpilähdettä ja eristetään heteropolysakkaridi. Menetelmä on sopivasti toteutettavissa eräprosessina tai syötepanosprosessina käyt-15 täen täyttöä ja poistoa tai ilman näitä toimenpiteitä tai jatkuvatoimisena prosessina.

Tuottavuussyistä on suositeltavaa käyttää jatkuvatoimista prosessia tai täyttö- ja poisto-prosessia. Poiketen monista yleisesti saatavissa olevista Xanthomonas-20 kannoista Xanthomonas campestris NCIB 11854-organismi näyttää pystyvän ilman monimutkaisia kasvutekijöitä tai vitamiineja tyydyttäviin kasvunopeuksiin ja polymeerin tuotto-nopeuksiin nesteviljelyalustassa. Voidaan saavuttaa erittäin hyviä tuloksia, jos organismia viljellään yksinkertai-25 sessa, kemiallisesti määritellyssä kasvualustassa, joka sisältää typpilähdettä kuten natriumglutamaattia tai ammonium- tai nitraattisuolaa. Niinpä tällainen kasvualusta on suositeltava.Suositeltava typpilähde on natriumgluta-maatti.

30 Lisäksi kemiallisesti määritellyn kasvualustan käyttö mahdollistaa mikrobin kasvuolosuhteiden paremman kontrollin, mikä johtaa kontrolloituun polymeerisynteesiin ja toistettavissa olevaan tuotanoprosessiin ja näin saadaan tasalaatuinen tuote. Heteropolysakkaridin tuotan-35 non ja laadun tämän tyyppinen kontrolli ei yleensä ole 11 76378 mahdollinen käytettäessä esim. mikrobia Xanthomonas campestris NRRL B-1459 viljeltynä kasvualustoissa, jotka sisältävät vaihtelevampia ja monimutkaisempia typpiläh-teitä kuten hiivauutetta tai kuivattua rankkiuutetta.

5 Lisäksi käsiteltävänä oleva keksintö koskee yllä kuvatun prosessin avulla valmistettua heteropolysakkaridia ja vesiliuoksena olevan heteropolysakkaridin käyttöä viskositeetin modifiointiaineena.

Käsiteltävänä olevan keksinnön lisäkohteena on po-10 rausneste, joka sisältää vettä ja 0,06-1,5 paino-% yllä mainittua heteropolysakkaridia. Käsiteltävänä oleva keksintö käsittää myös menettelyn porausreiän käsittelemiseksi, jolle on tunnusomaista, että porausreikään syötetään vesipitoista väliainetta, joka sisältää vettä ja 15 0,05-1,5 paino-% yllä mainittua heteropolysakkaridia, sekä menettelyn nesteen työntämiseksi porausreiän ja/tai läpäisevän, porausreikään yhteydessä olevan pinnanalaisen kerrostuman kautta injektoimalla porausreikään yllä mainittua heteropolysakkaridia sisältävää vesiliuosta.

20 Lisäksi käsiteltävnä oleva keksintö käsittää Xanthomonas campestris NCIB 11854:n biologisesti puhtaan viljelmän.

Seuraava esimerkki selventää keksintöä.

Esimerkki

Heteropolysakkaridin valmistus organismia Xanthomo-25 nas campestris Sp. NCIB 11854 viljelemällä sekä sen ja Xanthomonas campestris B-1459:n suorituskyvyn vertailu

Organismia Xanthomonas campestris NCIB 11854 viljeltiin kolmella erilaisella, kemiallisesti määriteltyjä suoloja sisältävällä kasvualustalla (ilmenevät taulukos-30 ta 3) Chemap GF seitsemän litran fermentointiastiassa panosolosuhteissa, joista yhteenveto ilmenee taulukosta 4.

Ensimmäisessä kokeessa käytettiin mikrobikasvun ainoana typpilähteenä ammonium-ionia (24 millimoolinen liuos) ja annettiin solujen kasvaa eksponentiaalisesti 35 maksimikonsentraatioon 3 gl \ Toisessa ja kolmannessa 12 76378 kokeessa korvattiin ammonium vastaavasti nitraatilla (24 millimoolinen liuos) ja glutamaatilla (24 millimoo-linen liuos). Tulokset ilmenevät kuvista 1-3.

Näiden arvojen vertailusta ilmenee selvästi, että 5 glutamaatti on suositeltava typpilähde, koska sillä saavutetaan |\^}ζ3-3Γνο eli solujen maksimikasvunopeus 0,12 h , qp-arvo eli polymeerituoton ominaisnopeus 0,35 (g ^)h ^ ja polymeerin lopullinen saanto 0,59 g g Tällä suuren Flmaks-arvon suuren qp-a:rvon yhdistelmällä saavutettiin 10 lopullinen polymeerituotto 0,49 g (1 ^)h \ joka oli yli kaksi kertaa suurempi kuin heteropolysakkaridin tuotto fermentoitaessa organismilla Xanthomonas campestris B-1459.

Taulukon 5 sarake A ilmoittaa yllä kuvatuilla, 15 määriteltyjä suoloja sisältävillä kasvualustoilla viljellyn Xanthomonas campestris NCIB 11854:n arvo ^1ina3CS^ <3P» gg eli glukoosin ominaiskäyttönopeus, Yp eli polymeeri-saanto glukoosista laskettuna sekä p eli polymeerituotto, ja sarake B ilmoittaa Xanthomonas campestris NRRL B-20 1459:n vastaavat arvot.

13 76378

Taulukko 3

Xanthomonas campestris NCIB 11854:n viljelyn kemiallisesti määriteltyjä suoloja sisältävät kasvualustat 5 Konsentraatio (mmol)

Komponentti Kasvualusta 1 Kasvualusta 2 Kasvualusta 3

Glukoosi 24,5 (gl-1) 24,3 (gl"1) 23,4 (gl"1) (NH4)2S04 12 (24 mmol N) -

NaN03 - 24 10 Na-glutamaatti - - 24 KHoP0, 25 25 25 2 4

Na~HPO. 25 25 25 2 4

MgS04*7H20 22 2

CaCl2-2H20 11 1 15 FeS04-7H20 0,2 0,2 0,2

MnS04-7H20 20 x 10-3 20 x 10~3 20 x 10-3

ZnS04*7H20 20 x 10~3 20 x ΙΟ-3 20 x 10~3

CuSO-·5Ho0 20 x 10~3 20 x 10~3 20 x ΙΟ-3 4 2

CoC12-6H20 10 x 10“3 10 x 10_3 10 x 10-3 20 h3bo3 10 x 10"3 10 x 10~3 10 x 10-3

Na2Mo04-2H20 10 x 10~3 10 x 10~3 10 x 10~3 KI 10 x 10-3 10 x 10-3 10 x 10“3 mmol = millimoolinen 2 5 — 1 gl = grammaa per litra mmol N = millimoolinen typen suhteen

Taulukko 4

Xanthomonas campestris NCIB 11854-viljelmän kasvu-3® olosuhteet

Lämpötila 28°C

pH 6,8

Juoksupyörä 3x4 siipinen Rushton tur piini 76378 14

Taulukko 4 (jatkoa)

Juoksupyörän kiertoluku 1000 kierr./min.

Viljelmän tilavuus 4,3-5,0 litraa

pH:n säätö 1-n NaOH + 1-n KOH

5 Liuenneen 02:n paine > 80 mm Hg

Ilman virtausnopeus 1,0 litraa minuutissa

Taulukko 5

Xanthomonas campestris NCIB 11854:n viljelmän (A) ja 10 Xanthomonas campestris NRRL B-1459:n viljelmän (B) kineettiset arvot määriteltyjä suoloja sisältävillä kasvualustoilla

^maks qp gg Yp P

Ajo Typpilähde ,,-1. , . -1,,-1, , -1,,-1 . -1. ,,-1.,-1 (h ) (g(g )h ) g (g )h g(g ) g (1 )h 15 1 Ammoniakki 0,09 0,275 0,60 0,53 0,39 A 2 Nitraatti 0,084 0,35 0,60 0,52 0,38 3 Glutamaatti 0,12 0,36 0,68 0,59 0,49 1 Ammoniakki 0,03 0,08 em 0,51 0,13 20 B 2 Glutamaatti 0,07 0,11 em 0,41 0,21 em = ei määritelty 25 Tämä taulukko osoittaa selvästi, että Xanthomonas campestris NCIB 11854:n suorituskyky on parempi kuin Xanthomonas campestris NRRL B-1459:n suorituskyky.

Taulukossa 6 verrataan Xanthomonas campestris NCIB 11854:n ja Xanthomonas campestris NRRL B-1459:n muodosta-30 mien liemien suodatettavuutta laimennettuina vakiovisko-siteetin omaaviksi, vaihtelevia määriä suoloja sisältäviksi liuoksiksi.

is 7 6 3 7 8

Taulukko 6 20 cP liuosten suodatettavuus (viskositeetti mitattu leikkuunopeudella 7,5 s A. Liuos 1 % NaCl + 0,1 % CaCl2 30°C:ssa ja 1 atm:n ylipaineessa 5 Kanta Näyte 200 ml:n suodatusaika (s) _5 μ+Ρ/F*_1,2 μ** NGIB 11854 Liemi 11,0 63,0

Entsyymikäs. 9,5 29,3 NRRL B-1459 Liemi 17,5 59,6 10 Entsyymikäs. 19,0 188,0 B. Liuos 1 % NaCl + 0,1 % CaCl2 70°C:ssa ja 1 atm:n ylipaineessa NCIB 11854 Liemi 7,5 37,3

Entsyymikäs. 5,5 17,0 NRRL B-1459 Liemi 35,8 50,7 15 Entsyymikäs. 8,5 40,9 C. Liuos 15 % NaCl + 1,5 % CaCl2 30°C:ssa jalatm:n ylipaineessa NCIB 11854 Liemi 14,5 330

Entsyymikäs. 22,1 101 NRRL B-1459 Liemi 30,8 81,7 20 Entsyymikäs. > 1000 > 1000 D. Liuos 15 % NaCl +1,5 % CaCl2 70°C:ssa ja latmtn ylipaineessa NCIB 11854 Liemi 17,0 299

Entsyymikäs. > 1000 > 1000 NRRL B-1459 Liemi > 1000 > 1000 25 Entsyymikäs. > 1000 > 1000 * P/F = Esisuodatin karkean aineksen poistamiseksi ** Ilman esisuodatinta, mutta liuos esisuodatettu 5 yj + P/F läpi.

Ko. suodatuksissa käytettiin Millipor^(tavaramerkki) 30 suodattimia, halkaisija 47 mm. 5 ji ja 1,2 ovat näiden suodattimien huokoskokoja.

Yllä olevasta taulukosta käy selvästi ilmi, että Xanthomonas campestris NCIB 11854-liemen suodatettavuus ennen entsyymikäsittelyä ja sen jälkeen on merkittävästi parempi 35 kuin Xanthomonas campestris NRRL B-1459-liemen.