FI72140C - Foerfarande foer inneslutning av mikroorganismer i en matris. - Google Patents

Description

1 72140

Menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi matriisiin

Kyseessä oleva keksintö koskee menetelmää, jonka avulla voidaan sulkea mykoritsa- ja aktinoritsa-ryhmiin kuuluvia mikro-organismeja matriisiin, joka on polymeerigeeliä, erikoisesti maanviljelystarkoituksiin.

Jo aikaisemmin on ehdotettu mikro-organismien kiinnittämistä alustaan, kuten esimerkiksi US-patentissa 1 909 622, jonka mukaan voidaan siirtää Rhizobium-lajiin kuuluvia bakteereja, jotka yhteyttävät typpeä.

Mutta tavallisesti mikro-organismi-viljelmä adsorboidaan alustaan kuten belgialaisessa patentissa 521 850, joka suo-sittelee käytettäväksi piimaata ja kolloidista piidioksidia Rhizobium-bakteereille. On käytetty myös bentoniittiä, kuten GB 1 777 077, tai kipsigranuloita (FR 1 490 046), tai ligniittiä.

Mutta tällä adsorbtiotavalla on varjopuolensa, erikoisesti mitä tulee mikro-organismien elossa pysymiseen ja niiden suojaamiseen kuljetuksen, varastoinnin ja käsittelyn aikana.

On luonnollista, että tällä tavalla ei ole päästy kuin vain hyvin rajoitettuihin tuloksiin ja että on yritetty parantaa bakteerien kiinnittämistekniikkaa. Siten esimerkiksi ranska-laitessa patentissa 1 180 000 on käytetty typpibakteerien (Azotobakteerien) ryhmään kuuluvia bakteereja runsaasti sisältävien preparaattien valmistuksessa mäskiä, johon on lisätty aineita, joilla on adsorboiva vaikutus, kuten selluloosaa, luujauhoa, kaoliinia, piidioksidigeeliä. Mutta tässäkään tapauksessa ei tulos ole tyydyttävä. Sen vuoksi on yritetty parantaa sekä mikro-organismien elossa pysymistä esimerkiksi sulkeumien avulla että niiden siirtämistapaa omassa miljöössään kasveihin.

2 72140

Ranskalaisessa patentissa 77 10254 (joka vastaa US-patent-tia 4 155 737) on ehdotettu menetelmää, jossa käytetään polymeerigeeli-ymppiä, jossa mikro-organismi on suljettuna ja tämä ymppi siirretään kasvien juuristoon.

Tämän patentin mukaan voi polymeerigeeli olla polyakryyli-amidi-geeliä tai piidioksidigeeliä.

Mutta tiedetään, että alustan on pidettävä riittävän lujasti mikro-organismia kiinni sen säilyttämiseksi ja suojelemiseksi, sen on oltava helposti käsiteltävässä muodossa ja se on voitava siirtää miljöössä ja mahdollisesti sen on pystyttyvä verkkout-tamaan itseensä lisäaineita.

Lisäksi on alustan taattava mikro-organismin elossa pysyminen useiden viikkojen ajan hygrometrisesti hyvin vaihtele-vissa oloissa. Eli toisin sanoen alustan täytyy joko sisältää riittävä vesivarasto ja vapauttaa sitä tarpeen mukaan, tai tarvittava vesi on saatava miljööstä. Lopuksi alusta ei saa olla haitallinen miljöölle, eli se ei saa olla biologisesti hajottava eikä saastuttava.

Tämä pikainen luettelo, joka ei pyri olemaan tyhjentävä, selittää jo, minkä vuoksi tällä tiellä ei ole päästy kehityksessä eteenpäin, kuten oikeutetusti on odotettu.

Ranskalaisessa patenttihakemuksessa 79 08597 (EP 17 565) vaaditaan patenttia liuokselle, joka näyttää erikoisen houkut-televalta: menetelmässä suljetaan mikro-organismi polysakkaridien ryhmään kuuluvaan polymeeriin ja aikaansaadaan polymeerin verkkoutuminen ainakin osittain esimerkiksi termisesti tai metallisuolojen avulla tai synergisesti toisen polymeerin avulla.

Tämä liuos antaa yllättäviä tuloksia ja sillä on lisäksi se etu, että se on erittäin synerginen, kun käytetään lisänä vielä absorboivaa ja adsorboivaa yhdistettä kuten piidioksidia.

3 72140

Edellä mainitun patentin mukaisesti on suoritettu ensimmäiset tutkimukset erikoisesti ei-itiöitä muodostavan/ typpeä yhteyttävän bakteerin Rhizobium japonicum kanssa, joka on hyvin herkkä nimenomaan kuivumiselle, lämpötilalle ja fysikaalis-kemiallisille tekijöille.

Mutta joillakin mikro-organismeilla on lisävaikeuksia rih-mastoluonteensa vuoksi, kuten esimerkiksi ektomykoritsa-sienillä, (esimerkiksi: Pisolithus, Hebeloma, Tuber, Boletus), joilla ei lisäksi ole minkäänlaista resistenssiä, kun niitä viljellään puhdasviljelyssä.

Mykoritsa-assosioituminen on tuloksena jonkin sienen ja juuren assosioitumisesta, jolloin syntyy todellinen symbioosi. Assosioitumisen laadun mukaan erotetaan: ektotrofiset mykoritsat, joita on erityisesti metsän puissa (Pinaceae, Fagaceae) ja jotka ovat suurimmaksi osaksi korkeampia sieniä (Ascomycetes ja Bacidiomycetes); endotrofiset mykoritsat, jotka ovat useimmin alempia sieniä (Phycomycetes), paljon yleisempiäkuin edelliset sekä puissa ja pensaissa että ruohoxasveissa, kun kyseessä ovat haara-mykoritsat ja rakkulamykoritsat, ja rajoittuvat Ericaceae-heimoon, kun kyseessä ovat kerä-mykoritsat.

Näiden mykoritsa-sienien edullinen vaikutus kasvien kasvuun voi johtua niiden fytosanitäärisestä suojavaikutuksesta maaperän patogeenisiä aineita vastaan, kasvua edistävien aineiden muodostamisesta tai vitamiineista, kasvin kivennäis-ravinnon parantamisesta, erikoisesti fosforin,lisäämällä maaperän hyväksikäyttämiskykyä, ja lisäämällä veden absorptiota niissä tapauksissa, kun on veden puute.

Kun kyseessä ovat ei-palkokasvit, jotka yhteyttävät typpeä, on symbioottisille assosioitumisille, jotka ovat saman tyyppisiä kuin Rhizobium'in ja palkokasvien välillä, tyypillistä nystyröiden muodostuminen juuristosysteemiin, yhtä hyvin 72140 puissa kuin pensaissa tai ruohokasveissa. Näiden nystyröiden merkitystä ei tunneta kuin joissakin puumaisissa kasveissa, joita on yleensä köyhässä tai huonontuneessa maaperässä (hiekka, moreeni), ja joilla on osoitettu todellista atmosfäärin typen yhteyttämistä. Tunnetaan 137 Angiospermia-lajia, jotka kuuluvat 12 eri lajiin, jotka on luokiteltu 7 sukuun (Betulaceae, Casuarinaceae, Coriariaceae, Eleagna-ceae, Myricaceae, Rhamnaceae, Rosaceae) (Bond 1974). Näiden typpeä yhteyttävien nystyröiden aiheuttaja on Actinomyces-sukuun kuuluva endofyytti (Frankia), jota ei ole eristetty puhdas-viljelyssä sitten vuoden 1978, LALONDE et ai., (Laval-Yli-opisto, QUEBEC).

Näiden typpeä yhteyttävien metsäpuulajien käytön hyödystä metsänhoidollisesti ei ole epäilystä, varsinkaan marginaalisessa maaperässä, joka on typpiköyhää ja valinnaisesti rakenteeltaan muutettu; muistin varassa mainittakoon seu-raavat esimerkit: turvemaiden metsittäminen FRA (Aulne, Myrcia), jäätikkö-moreenit Alpeilla (Aulne), kaivosjätteet tai palavan kiven louhokset USA:ssa; - merenrannan ja mantereen hiekkadyynien sitominen Senegalissa (Casuarina);

James'in lahden patomistyöt Kanadassa;

Alnus-rubra - Douglas-assosiaatiot metsänhoitosysteemeis-sä Luoteis-Amerikassa;

Alnus glutinosa'n, A. cordata'n, A. incana'n ja A. cnspa'h käyttö tukikasveina (kasveina, jotka tukevat nuorta puuta tai oksaa) edistämään typpeä yhteyttämättömien lajien kehittymistä; lajien Ceanothus, Myrica, Hipophaea, Eleagnus käyttäminen assosiaatiossa typpeä yhteyttämättömien lajien kanssa tai vihantalannan tai biomassan tuottajina.

Ymppäystä käytetään traditionaalisesti taimitarha-asteella siirtämällä jauhettuja nystyröitä, ja pääasiallisena varjo- 5 72140 puolena on tällöin patogeenisten siementen mukana tulo, ja se ettei voida säilyttää niitä edes alhaisessa lämpötilassa johtuen tanniinien ja fenoliyhdisteiden nopeasta hapettumisesta, (jotka ovat toksisia yhdisteitä mikro-organismeille). Tähän asti ei ole voitu osoittaa ehdottomasti, että olisi mahdollista nostaa näiden lajien tuottavuutta ymppäämällä puhdasviljelyssä kehitettyä endofyyttiä. Sitä paitsi, kun kyseessä ovat ekto-mykoritsa-lajit, käytetään ymppäystä traditionaalisesti tuomalla maata jostakin toisesta taimitarhasta ja nykyään tavallisimmin mykoritsa-sienien puhdasviljelyistä vermikuliitin päällä; tällä tavoin suoritetussa ymppäyksessä on kolme varjopuolta: - on vaikeata kasvattaa sientä (Pisolithus tai Hebeloma): tarvitaan ainakin 6 viikkoa (GRAHAN-LINDERMAN 1980 Can. J. Microb. 26, II) ja tuloksena on heterogeeninen ja harva viljely nestemäisessä miljöössä: tarvitaan ainakin 8-10 viikkoa vermikuliitin päällä.

Kun kyseessä on nestemäinen viljely, on välttämätöntä ottaa talteen rihmasto (eli myseeli) ja jauhaa se ennen käyttämistä sillä riskillä, että leikkaaminen on liian voimakasta (erityisesti Tuber ei enää versoa uudelleen), sillä mikro-organismissa ei ole muuta kuin hyyfejä eikä minkäänlaista resistenssiä .

2 on käytettävä suuri määrä ymppiä, 2 1/m , kun kyseessä on vermikuliitin päällä kehitetty mikro-organismi, mistä johtuu varastointivaikeuksia; . on pakko käyttää ymppejä, jotka ovat juuri valmistettuja, tai joita on varastoitu 4°C:ssa.

Nämä probleemat ovat antaneet aiheen suorittaa tutkimuksia. Keksinnön eräänä kohteena on ymppi, joka voidaan varastoida ympäristön lämpötilassa ja joka on helppokäyttöinen.

Toisena kohteena on parantaa varsinkin mykoritsa- ja aktino- 7 214 0 6 ritsa-viljelyjen homogeenisuutta ja lyhentää viljelyaikaa (ektomykoritsat).

Kyseessä olevan keksinnön kohteena on menetelmä mikro-organismin sulkemiseksi matriisiin, joka on polymeerigeeliä, joka perustuu ainakin yhteen polysakkaridien ryhmän polymeeriin, ja verkkouttaa ainakin osittain mainitun polymeerin ja menetelmä on tunnettu siitä, että mikro-organismi kuuluu mykoritsa- ja aktinoritsa-ryhmään.

Kyseessä olevan keksinnön mukaan tarkoitetaan verkkoutumi-sella ainakin osittain sellaista käsittelyä, joka muuntaa polysakkaridin rakennetta, kuten termistä käsittelyä, tai käsittelyä metallisuolan avulla tai synergisesti jonkin toisen polymeerin avulla, ja etupäässä jonkin toisen polysakkaridin avulla.

Polymeeri perustuu edullisesti suuren molekyylipainon omaavaan hetero-polysakkaridiin, joka on saatu fermentoimalla hiilihydraattia mikro-organismin avulla, joka on heimoon Xantohomonas tai Arthrobacter kuuluva tai sienien avulla, jotka kuuluvat heimoon Sclerotium.

Voidaan käyttää myös polymeerejä, jotka ovat peräisin luonnonkumeista tai biosynteettisistä kumeista, jotka ovat erilaista alkuperää: levistä (alginaatit, karrageeni, agar), kasviuutteista (karaya-, tragantti-, arabikumit), siemenistä (guar-, Johanneksen leipäpuun siemenet).

Johanneksen leipäpuun siemenistä tehty jauhe (locust bean gum) saadaan Johanneksen leipäpuusta (Ceratonia siliqua L.), joka on Caesalpiniaceae sukuun kuuluva puu, jonka ·· maantieteellinen esiintymisalue on Välimeren maat. Johanneksen leipäpuun siemenistä tehty jauhe on siemenen endosper-missä. Endospermi erotetaan alkiosta mekaanisesti hankaamal-la tai kemiallisella prosessilla.

7 72140

Johanneksen leipäpuun siemenjauhe on polysakkaridi (galak-tomannaani), joka muodostuu β-D-mannopyranosyyii-yksiköistä (sidokset 1-4), ja yhdessä neljästä tai viidestä on substi-tuenttina C6:ssa α-D-galaktopyranosyyli.

Ksantaani-kumin ja Johanneksen leipäpuun siemenjauheen yhdistelmä nostaa synergisen vaikutuksen ansiosta geelin viskositeettia. Käsityksen mukaan muodostuu ksantaani-kumi kierukkamaisista ketjuista ja galaktomannaanin vaikutuksesta syntyy sidoksia ketjujen kesken ja täten muodostuu kolmi-dimensioinen verkko.

Alginaatit ovat ruskolevien Phaeophyceae puhdistettua uutetta.

Algiinihappo on suoraketjuinen polymeeri, jonka molekyyli-paino on suuri ja joka muodostuu peräkkäisistä β-D-manno-pyranosyyliuronihapon ja α-L- gulopyranosyyliuronihapon molekyyleistä.

Kalsiumsuoloja lisäämällä saadaan aikaan kahden karboksyyli-ryhmän välinen sidos ja silta kahden yhdensuuntaisen ketjun välille, varsinkin guluronihapon kohdissa. Tällä tavoin saadaan silmänräpäyksessä 25°C:ssa hyvin viskoosi geeli. Fosfaatti-ionien lisäys sitä vastoin aiheuttaa hyytymisen viivästymisen, mikä voi olla edullista preparaatin käsittelyssä ennen täydellistä geeliytymistä.

Kuten ranskalaisessa patenttihakemuksessa 79 08597 (EP 17 565) on ilmoitettu, voidaan mikro-organismien konsentraatiota preparaatissa nostaa suodattamalla tai sentrifugoimalla etukäteen viljelymiljöötä, suspendoida uudelleen suodos ja saada joutotilavuus pienempään tilavuuteen ja lisätä se polysakkaridin liuokseen.

Mikro-organismi tai -organismit voidaan siirtää erilaisin menetelmin, joille on tunnusomaista se, että valmistetaan ensiksi viljelymiljöö, johon ympätään mikro-organismi ja vie- 8 72140 dään sitten tämä viljelymiljöö, tai suodattamalla tai sentri-fugoimalla saatu mikro-organismin suspensio polysakkaridin liuokseen ja muodostetaan geeli jäähdyttämällä.

Käytännössä, ensimmäisen toteutusmuodon mukaan, muodostetaan ensiksi polysakkaridin liuos kuumana, joka sitten lasketaan lämpötilaan noin 40-45°C, ja siihen lisätään viljelymiljöö, joka sisältää mikro-organismin, tai mikro-organismin suspension, sen jälkeen jäähdytetään, niin että muodostuu geeli.

Toisen toteutusmuodon mukaan siirretään erikseen viljelymil-jöö tai mikrobisuspensio omaan polysakkaridiliuokseensa samoissa lämpötilaolosuhteissa, sekoitetaan ne keskenään ja jäähdytetään geelin muodostumiseksi.

Voidaan myös, kuten edellä on mainittu, käyttää metallisuo-laa, kuten rauta- tai aluminiumsuolaa, joka voi olla polyo-lin kanssa kompleksoitua.

Voidaan myös liuottaa polysakkaridi viljelymiljööseen, varsinkin ympäristön lämpötilassa ja muodostaa verkkoutuminen in situ.

Kuten edellä on mainittu, voi keksinnön mukainen mikro-organismi olla aktinoritsa kuten ei-palkokasvien endofyyttinen sädesieni (Actinomyces) tai mykoritsa, ektomykoritsa tai endomykoritsa.

Ympit voivat esiintyä eri muodoissa: geelinä, jauheena, kuulina tai jopa kuituina.

Kun kyseessä on sädesieni (Actinomyces), se voidaan siirtää nestemäisen viljelyn muodossa, tai jauhettujen nystyröiden muodossa.

Geeli kuivataan edullisesti. Kuten edellä on mainittu, ei mikro-organismia saa turmella ja tiedetään, että se on tavallisesti hyvin lämpöherkkä.

9 72140

Kuivaus sellaisenaan on pitkä, ja tällöin muodostuu kalvo, joka murenee helposti, ja se voidaan jauhaa vaivattomasti.

Geeliin lisätään edullisesti jotakin absorboivaa ainetta, jolla on suuri veden absorptiokyky, niin että jäännösveden pitoisuudeksi seoksessa geeli + absorboiva aine saadaan 70-250 g/100 g absorboivaa ainetta kohti ja edullisesti 100-150 g/100 g kohti.

Absorboiva aine on huokoista ainetta kuten esimerkiksi luonnon piidioksidia tai synteettistä piidioksidia, siliko-alu-minaattia, selluloosaa jne... pH on suunnilleen 7 ja kuivaus lämpötilat ovat niin alhaiset, ettei mikro-organismi tuhoudu, noin 20°-30°C.

Suoritus voi tapahtua eri tavoin.

Ensimmäisen toteutustavan mukaan geeli kuivataan, jauhetaan sitten hienoksi, siihen lisätään jotakin ainetta, kuten piidioksidia, sen jälkeen se homogenisoidaan. Näin saatu jauhe muodostetaan pastilleiksi.

Erään toisen toteutusmuodon mukaan pannaan kostea geeli ja jokin aine kuten piidioksidi sekoitinlaitteeseen tai jauha-tinlaitteeseen, ja jauhatuksen jälkeen joko levitetään ja kuivataan välittömästi seos, kunnes vesihäviö on noin 0-50 paino-%, mutta mieluimmin 30-40 %, ja saadaan jauhetta, jonka jäännösvesi on välillä 100-150 g/100 g kohti absorboivaa ainetta, tai seos pannaan pursotinlaitteeseen ja kuivataan saadut granulat ympäristön lämpötilassa kunnes vesihäviö on tällöinkin välillä 30-40 %.

Siinä tapauksessa, että mikro-organismi on mykoritsa, se siirretään sellaisen viljelyn muodossa, jossa myseeli eli sienirihmasto on homogeeninen. Ymppi voi olla kuulien, kosteiden säikeiden tai kuitujen muodossa.

10 721 40

Ensimmäisen toteutustavan mukaan voidaan nestemäisen viljelyn volyymi muuttaa volyymiksi, joka on lähes identtinen nesteen volyymin kanssa siten että saadaan edullisesti kosteita kuulia. Toisen toteutusmuodon mukaan lisätään saatuun geeliin, johon on suljettu viljely tai mikro-organismin suspensio, absorboivaa ainetta siten, että saadaan helposti käsiteltävää jauhetta. Absorboiva aine on edullisesti piidioksidia, jonka määrä paino-osissa geelistä on 10-120 %, ja etupäässä 30-50 %.

Näissä kahdessa toteutusmuodossa on keksinnöllä se huomattava etu, että myseeliä eli sienirihmastoa ei käsitellä lainkaan mekaanisesti kuten leikkaamalla tai jauhamalla. Tämän lisäksi menetelmä tekee mahdolliseksi ymppien varastoinnin, ei-steriileissä olosuhteissa, ilman kantaminaatista ympäristön lämpötilassa.

Mutta kyseessä oleva keksintö on helpommin ymmärrettävissä seuraavien esimerkkien avulla, jotka on annettu asian valaisemiseksi .

Esimerkki 1: Endofyytti ei-palkokasvien sädesieni Actinomyces 1. Bakteerikanta - eristäminen - viljely - säilytys Tutkittu symbioosi; Alnus glutinosa - Frankia Kannat: Frankia ARbNN4b ja AgNlag (LALONDE kokoelma, Metsätieteellinen ja Geodeettinen tiedekunta, LAVAL Yliopisto, Quebec)

Frankian eristäminen nystyrästä (LALONDE:n et ai tekniikka, Proc. Workshop 2,5/4-1979-Corvallis-Oregon).

Steriloidaan pinnalta korallimaisen nystyrän pää (H202 30 % 5 min ajan; sitten NaCIO 5 % 30 min ajan);

Huuhdotaan steriilillä vedellä

Pannaan nystyrä astiaan, jossa on 1 prosenttista liuosta, joka on steriloitu suodattamalla polyvinyylipyrrolidonia PVP + fosfaattipuskuri /PBS (g/1) = NaCl 0,8 Na2HPQ4, 7H20 1,14 - KH2P04 C,2_7; 721 40 11 - Leikataan nystyrän alapuoli ja siirretään pää toiseen astiaan, joka sisältää PBS:ä (joitakin pisaroita);

Murskataan nystyrä, irrotetaan sisäosa ja pannaan koeputkeen, joka sisältää alustan Xmodifioitu Q (QUISPEL 1960, modifioinut LALONDE 1979);

Xmodifioitu Q (g/1): K2HP04 0,3 - NaH2P04 0,2 - MgS04 7H20 0,2 - KC1 0,2 hiivauutetta (BBL) 0,5 -Bacto-peptonia (DIFCO) 5 - glukoosia 10 -ferrisitraattia (sitruunahappo + ferri-sitraatti-liuosta, joka on 1-prosenttis-ta) 1 ml, hivenaineita 1 ml - H20 1000 nl:an asti pH 6,8 - 7,0 - CaCO^ 0,1 lesitiiniä 5 mg - sterilointi 20 min lämpötilassa 120°C.

Inkuboidaan 2 viikkoa 27°C:ssa.

• Viljely

Inkuboinnin jälkeen jaetaan bakteeririhmasto ruiskun avulla ja ympätään uudelleen 6 putkea; tämä toistetaan samalla tavoin joka toinen viikko, ja tarkoituksena on moninkertaistaa te-hokaasti sädesieni (ennen jokaista uudelleenistutusta viljely pestään PBS:llä), viljely irrotetaan putken pohjasta pipetillä ja siirretään se modifioituun Q-liuoskeen.

. Säilytys - itiöiden itäminen

Useita kuukausia säilytetyn viljelyn itiöiden itämistä edistetään siten,että upotetaan bakteeriviljely liuokseen joka sisältää: alaniinia 45 mg + leusiinia 60 mg + PBS:ä 50 ml, 30 min ajaksi ja pannaan se uudestaan modifioitu Q alustaan sen jälkeen kun se on jaoteltu.

2. Kasvien viljely (Alnus Glutinosa) . Siementen esi-idättäminen Tämä operaatio sisältää neljä vaihetta: siementen valinta

Simenet asetetaan maljaan, joka sisältää heksaania (d = 0,66). Otetaan pois ja kuivataan suodatinpaperilla ne, jotka putoa- 721 40 12 vat pohjaan; päälläkelluvat siemenet heitetään pois; lepotila

Siemenet pannaan veteen 4 vrk ajaksi lämpötilaan +4°C; sterilointi

NaClO:ssa, joka on 5-prosenttista, 5 min ajan, jota seuraa pesu steriloidussa, tislatussa vedessä; esi-idättäminen

Siemenet pannaan geelimäiseen alustaan Petri-maljaan, jossa on 1 % geelimäistä aineita ja 1,5 % sakkaroosia; Petri-maljät asetetaan ylösalaisin kammioon, joka on veden kyllästämä ja niitä pidetään lämpötilassa 28°C pimeässä 6 vrk.

Itujen istuttaminen uudelleen Idut, jotka eivät ole saastuneita, istutetaan uudelleen "pusseihin" tai koeputkiin, joiden läpimitta on 22 mm.

. Uudelleen istuttaminen "pusseihin"

Polyetyleenipusseissa (10 x 20 cm) on suodatinpaperia, jonka yläpäässä on kouru; pannaan 8 ml CRONE:n liuosta (LALONDEn muunnosta - 1972 - J. Can. Botanic 5, 25-97) ilman typpeä, ja laimennetaan puoleen vahvuuteensa pussissa siten, että kostutetaan koko suodatinpaperi; kouruun pannaan reikiä ja idut pannaan siten, että pikku juuret tulevat vastapäätä reikää ja sirkkalehdet ovat kourun yläpuolella; pussit pannaan säädeltyyn huoneeseen (valaistus 15000 luxia, valotus-jakso 14 h, lämpötila välillä 19-23°C.

Uudelleen istuttaminen vermikuliitin päälle 22 mm läpimitaltaan olevat putket täytetään 40 ml:11a vedellä pestyä vermikuliittia; lisätään 20 ml CRONEn liuosta, joka on laimennettu puoleen, sitten steriloidaan kaikki 20 min ajan 120°C:ssa; idut istutetaan uudelleen ja inkuboidaan kuten edellä. 1 11

Ymppien valmistaminen 3.1. Ympit, joissa on Frankia - viljely suljettuna Frankian viljelyt, jotka ovat peräisin 10 koeputkessa 15 vrk ajan kehitetyistä viljelyistä, irrotetaan ja suspendoi-daan 55 ml:an PBS:ä ja jaotellaan; valmistetaan ymppejä täs- 721 40 13 tä konsentroidusta suspensiosta, joka sisältää hyyfejä, ititöitä ja itiöhaaroja, seuraavalla tavalla: . Ymppi, joka perustuu aliginaattiin (AlG)

Konsentraatiot ovat 45 g:n geelin valmistamista varten, liuotetaan 0,45 g alginaattia 36 ml:an suspensiota; lisätään 9 ml liuosta, jossa on CaSO^, 2^0 6 g/1, sekoittaen. Saatu geeli sen jälkeen joko kuivataan ilmassa kunnes vesi on haihtunut, tai lisätään 40 % sen painosta piidioksidia ja sekoitetaan kunnes saadaan kosteata homogeenista jauhetta; tämä jauhe kuivataan sitten ympäristön lämpötilassa, kunnes ymppi sisältää vain 125 g vettä/100 g kohti piidioksidia.

. Ymppiy joka perustuu seokseen ksantaanikumia + Johanneksen leipäpuun siemenjauhetta (XG)

Konsentraatiot ovat 45 g geelin valmistamista varten liuotetaan 225 mg ksantaanikumia 15 ml:an tislattua vettä, joka on suunnilleen 70-asteista; menetellään samalla tavoin mutta korvataan ksantaanikumi 225 mg:11a Johanneksen leipäpuun siemenjauhetta; kun nämä kaksi liuosta ovat noin 45-asteisia, lisätään kumpaankin sekoittaen 7,5 ml suspensiota; sen jälkeen kaadetaan seos suspensio + Johanneksen leipä-puun siemenet seokseen suspensio + ksantaanikumi; jäähdytetään ja saadaan geeli.

Tämä geeli joko kuivataan ilmassa kunnes vesi on haihtunut, tai siihen lisätään, kuten geeliin ALG, 40 % sen painosta piidioksidia; seos kuivataan ympäristön lämpötilassa siksi kunnes jäännösveden pitoisuus on 125 g/100 g kohti piidioksidia.

3.2. Ympit, joihin on suljettu jauhettuja juurinystyröitä 100 g Alnus glutinosan juurinystyröitä, jotka on otettu äskettäin, pestään ja jauhetaan sitten sekoitinlaitteessa siten, että saadaan suunnilleen 300 ml homogeenista suspensiota, josta valmistetaan geelejä, jotka perustuvat algi- 14 721 40 naattiin tai ksantaanikumiin, joissa on suljettuna jauhettuja juurinystyröitä.

Geelit kuivataan ilmassa ja sen jälkeen ne hienonnetaan jauheen muotoon.

Ympit, jotka perustuvat alginäattiin (AlG) 200 g:n geelin valmistamiseksi: . liuotetaan 2 g alginaattia 160 ml:an suspensiota lisätään 40 ml CaS04, 2H20 6 g/1, ja syntyy geeli.

Osa tätä geeliä kuivataan täysin vedettömäksi ympäristön lämpötilassa, toiseen osaan lisätään 40 % sen painosta samaa piidioksidia ja kuivataan sitten siksi kunnes jäännösve-den määrä on 125 g/100 g piidioksidia.

Ymppi, joka perustuu seokseen ksantaanikumia + Johanneksen leipäpuun siemenjauhoa 360 g:n geelin valmistamiseksi: . liuotetaan 1,8 g ksantaanikumia 120 ml:an vettä 70°C:ssa 20 min kuluessa sekoittaen, sitten palautetaan lämpötila noin 4 5°C:en; . tehdään samalla tavoin, mutta korvataan ksantaanikumi 1,8 g:11a Johanneksen leipäpuun siemenjauhoa; . kun molemmat liuokset ovat noin 45-asteisia, lisätään kumpaankin 60 ml jauhettujen juurinystyröiden suspensiota; . jäähdytetään ja saadaan geeli, jonka toinen osa kuivataan ja toiseen osaan lisätään piidioksidia kuten aliginaatti-geeliin.

4. Tulokset 4a. "Pussi"-koe

Mikro-organismien eloonjäämistä sen jälkeen kun ne on suljettu, kuivattu ja varastoitu ympäristön lämpötilassa (20°-25°C), kontrolloitiin Algus glutinosan iduilla edellä selostettua "pussi"-tekniikkaa noudattaen; idut, jotka oli pantu pusseihin, saivat kehittyä 10 vrk kontrolloiduissa olosuhteissa, sen jälkeen ne ympättiin panemalla pääjuurien kärjen 15 721 40 alle testattavaa ymppiä; mikäli ymppäys on tehokas ja mikäli mikro-organismi pysyy elävänä, nähdään 10-20 vrk:n kuluttua ymppäämisestä pullistumia ja sitten pieniä nystyröitä juuressa sillä kohdalla mihin ymppi oli pantu. Tulokset, jotka on saatu ympeillä, jotka perustuvat AlG-geeliin tai geeliin XG + piidioksidi ja jotka on varastoitu 10-20 vrk ympäristön lämpötilassa, ovat seuraavassa taulukossa.

Ymppityypin vaikutus Alnus glutinosan juuri-nystyröiden muodostumiseen Säilytys Määrä Kasvien lukumäärä, jois-

Ymppi (päiviä) (4) Ymppi/kasvi sa nystyröitä/kasvien _ _ _ kokonaismäärä_

Ei ympätty_-_0_0/18_

Jauhettujen nystyröiden 0 0,25 ml 5/6 suspensio(1)

Jauhetut nystyrät suljet- .

tuina kuivaan 20 noln 5 m9 4/4 XG:hen (2) ARbNN4b nestemäinen vil- 0 0,25 ml 1/5 jely (3)

Sulkeumana XG:ssä + pii- 70 5 mg 6/9 dioksidia (5)

Sulkeumana A1G:ssa + 70 5 mg 6/9 piidioksidia

AgNlag nestemäinen vil- 0 0,25 ml 6/6 jely (3)

Sulkeumana XG:s s ä + 20 5 mg 5/6 piidioksidia (5) (1) 150 mg tuoreita juurinystyröitä/5 ml H20 (2) kuivaus ilmassa, jonka kosteuspitoisuus H = 12 % 16 72140 (3) viljely, jota käytetty sulkeumassa (4) ympin säilytys ympäristön lämpötilassa (20-25°C) (5) saostunut piidioksidi - pinta BET = 200 m^/g - CTAB = 80 m2/g.

Todetaan, että juurinystyröiden syntyminen on suunnilleen 100 % siinä tapauksessa, että ympit on valmistettu lähtemällä suljetuista mikro-organismeista + piidioksidi, vaikka siihen pannun viljelyn määrä 5 mg:ssa on 50-100 kertaa pienempi kuin nestemäisessä ympissä 0,25 ml olevan.

4.b. Kokeet vermikuliitin päällä

On tutkittu infektoimiskykyä ja tehokkuutta mikro-organismissa (kanta ARbNN4b) sen jälkeen kun se on suljettu ja säilytetty ympäristön lämpötilassa (20°-25°C) Alnus glutinosalla, jota on kehitelty koeputkissa, joissa on vermikuliittia + ravinnemiljöö ilman typpeä (CRONEn liuos); saadut tulokset esiintyvät seuraavassa taulukossa:

Ymppityypin vaikutus Alnus glutinosan juurinystyröiden muodostumiseen ja kasvuun (itujen ikä 50 vrk) Säily- Nb.nysty- Vihreän ilmassa J^skimää-

Ymuui rä/6 olevan osan paino ramenkor-Kasvien (päiviä) kasvia mg:ssa/6 kasvia kohti keus ulkonä- _ (2) _ __ ταα:τ&_ ^_

Ei ym- 0 182 31 Kalvetus- pätty_0_195_42_tauti

Nestanäi- nen vil- 0 9 331 50 vihreä jely_;_

Sulkeumana päiäii- 15 30 468 56 vihrea dia

Sulkeumana

SidStei- 30 36 515 59 vihreä dia

Sulkeumana

AlGrssä + on oo ,,, „ ., piidioksi- 30 32 444 62 vihreä dia 17 7 214 0 (1) viljely, jota on käytetty sulkeumassa (2) ympin säilytys ympäristön lämpötilassa (20-25°C).

Näissä tuloksissa on jotakin aivan yllättävää tällä alalla, sillä ensimmäistä kertaa on onnistuttu valmistamaan ymppejä, joihin on suljettu endofyyttiä (Frankian puhdasviljelyä tai jauhettujen juurinystyröiden suspensiota), joilla on seuraavat ominaisuudet: ympit jauheen muodossa, jota on helppo käsitellä on mahdollista valmistaa niitä hyvin pieninä tilavuuksina - suljettujen mikro-organismien infektiokyky säilyy varastoinnin aikana ympäristön lämpötilassa ei minkäänlaista probleemaa ulkopuolisten aineiden aiheuttamasta saastumisesta.

Casuarinarn jauhettujen juurinystyröiden sulkemismenetelmää ilmassa kuivattuun alginaattigeeliin on käytetty varsinkin ymppäämään 600 000 Casuarina:n juurihaaraa Senegalissa erään projektin piirissä, jossa sidottiin merenrannan ja mantereen hiekkadyynej ä.

Esimerkki 2: Mykoritsat 1.1. : Käytetty kanta - Pisolithus tinctorius (Marx) 1.2. : Mikro-organismi-viljely nestemäisessä miljöössä Sientä elätetään ja viljellään tavallisesti Marx'in miljöössä, jonka on muunnellut MELIN-NORKRANS (MNN) fermentointiaika näissä olosuhteissa on 6-8 viikkoa.

(1) MUN (g/1) : CaCl2 0,05 - NaCl 0,025 - K2HPC>4 0,5 -(NH4)2HP04 0,25 - MgS04, 7H20 0,15 - ferrisitraatti 1 ml (1-prosenttinen ferrisitraatti) - tiamiini 100 ^um - mallas-uute 3,0- sakkaroosi 10,0 - H20 1000 ml:an asti pH = 5,5.

Pisolithus-sienen viljelysekvenssi on seuraavanlainen: 18 7 21 4 0

ALKUPERÄINEN KANTA

Uudelleen istutus geelimäisen aineen miljööseen (Marx) ~ ^

Ymppi-viljely I Varastointi + 4°C:ssa

Astia: erlemeyer 300 (PEG-miljöö)

Ymppiviljely II Astia: erlemeyer 300 (PEG-miljöö)

Tuottava viljely 2 litran fermentoimisastiassa (PEG-miljöö) - Sienikannan elatus: Geelimäisessä Marx-miljöössä (Petri- malja tai kaltevassa asennossa olevat putket)

Ymppiviljely I

astia: erlemeyermalja, 300 ml:n vetoinen ja suljettu poly-uretaanipumpulilla ja siihen_pantu 70 ml viljelymiljöötä; . PEG viljelymiljöö (g/1): peptonia 10 - hiivauutetta 5 -glukoosia 10 - geelimäistä ainetta 1, pH = suunnilleen 7, sterilointi 25 min 120°C:ssa, pH steriloinnin jälkeen noin 6,6; • ymppäys viljelystä, joka on geelimäisessä aineessa (osia geelimäisestä aineesta + sienirihmastoa); . olosuhteet: inkubointi 10-15 vrk pöydällä, pyöritys 100-140 kierr/min, levyn etäisyys keskipisteestä 25 mm, lämpötila 28°C.

Ymppiviljely II

Viljelyn olosuhteet ovat samat kuin edellä, mutta ympätään viljelystä I 5-10 %, inkubointiaika on vähennetty yhteen viikkoon.

Il 19 721 40 - Tuottava viljely fermentointiastiassa . täyttö: 1000 ml . miljöö: PEG, joka selitetty edellä . ymppäys: 1-10 % olosuhteet: sekoitus pyörivässä turbiinissa 250-300 kierr/min, tuuletus 20 1/h, lämpötila 25-30°C.

Tulokset 8-13 vrk:n kuluttua 2 litran vetoisessa fermentoimisastiassa saadaan homogeeninen ja tiheä viljely, minkä vuoksi ei tarvita sienirihmaston jauhamista lopuksi ennen ympin valmistusta; biomassan määrä (kuivapaino 105°C:ssa), joka saadaan litraa kohti miljöötä, on noin 2,5 g/1.

1.3. Ymppien valmistaminen, joissa on suljettuna mikro-organismej a

Koska ektomykoritsa-sienillä ei ole minkäänlaista resistenssiä, kun niitä viljellään puhdasviljelyssä, on välttämätöntä säilyttää ympin valmistuksen aikana jonkin suuruinen jäännös-vesipitoisuus sienirihmaston elossapysymiseksi; tämän tyyppinen ymppi valmistetaan joko lisäämällä piidioksidia geeliin kun sieni on suljettu geeliin, joka perustuu polysakkari-deihin, tai sekoittamalla rihmastosuspensio alginaattiin ja antamalla tämän seoksen tippua pisaroittain konsentroituun CaCl2-liuokseen periaatteen mukaan, jonka on selostanut HACKEL 1977 ja jota on sovellettu Rhizobiumin sulkemiseen (patentti FR 79.28956-1979).

Ympit jauheen muodossa

Viljely, joka on kehitetty 2 l:n fermentoimisastiassa suodatetaan tai sentrifugoidaan, pestään ja suspendoidaan fysiologiseen nesteeseen; tätä suspensiota käytetään valmistettaessa geelejä, jotka perustuvat alginaattiin tai ksantaaniku-miin menetelmien mukaan, jotka on selostettu edellä Frankian suhteen.

Näihin geeleihin lisätään sitten synteettistä piidioksidia 20 72140 tai luonnon piidioksidia, jauhetaan ja sen jälkeen kuivataan siksi kunnes jäännösveden pitoisuus on välillä 70-250°C siten, että saadaan kosteita tai osaksi kuivattuja jauheita, joita säilytetään suljetuissa pulloissa.

Ympit alginaattikuulien muodossa Liuotetaan sienirihmastosuspensioon 1-2 g/1 alginaattia ja sen jälkeen annetaan seoksen tippua pisaroittain konsentroituun CaCl^-liuokseen 170 g/1; otetaan nopeasti talteen muodostuneet kuulaset, jotka pestään vesijohtovedellä ja säilytetään suljetuissa pulloissa.

Pisolitus tinctorius-sienen elossa pysymisaika, erikoisesti kun kyseessä ovat alginaatti-kuulaset, on yli 6 kk ympäristön lämpötilassa; testi jota käytettiin arvioimaan elossa pysyminen, perustuu siihen periaatteeseen, että määrätään kalorimetrisesti respirometrinen teho pelkistää nitro-sini tetratsolium formatsaaniksi, joka on sininen yhdiste. Näiden ymppien infektoimis- ja tehokkuuskontrolli on suoritettu Pinus caribaea:lle tai Pinus pinasterille liuottamalla kuulaset uudelleen komplekseja purkavan aineen kuten fosfaattien, sitraattien, laktaattien ym. avulla.

Nämä kokeet valaisevat sitä ilmiömäistä kehitystä, joka on saavutettu ymppien valmistuksessa ektomykoritsojen kanssa: mykoritsa-sienen viljelyn olosuhteet nestemäisessä miljöössä ovat parantuneet: valmistetaan homogeenista biomassaa ja fermentoimisaikaa voidaan vähentää 4-6 viikkoa; valmistetaan ymppejä, joita on helppo käyttää ja jotka takaavat mikro-organismin elossa pysymisen useita kuukausia.

Mainitun keksinnön piiristä ei poistuta, jos sovelletaan Frankian ja ektomykoritsojen ymppien valmistusmenetelmää kerä-endomykoritsojen sulkemiseen, jotka on kehitetty puhdasviljelyssä ja jauhettujen juurien sulkemi- 21 72140 seen, joiden rihmasto on peräisin endomykoritsoista, joissa on rakkuloita tai haaroja; ympit, jotka on valmistettu sulkemalla infektoituja ja sitten jauhettuja juuria (juuririh-mastoa + itiöitä) XG- tai AlG-geeleihin, joihin on lisätty piidioksidia, säilyttävät infektoimiskykynsä: endomykoritsa-sieni, jossa on rakkuloita ja haaroja, on läsnä kasvin juurissa, joka ympättiin testissä tämän menetelmän avulla.

Claims (9)

22 7 214 0

1. Menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi matriisiin, joka on polymeerigeeliä, joka perustuu ainakin yhteen polysakkaridien ryhmän polymeeriin, ja mainittu polymeeri verk-koutetaan ainakin osittain, tunnettu siitä, että mikro-organismi kuuluu mykoritsa- ja aktinoritsa-ryhmään.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että polymeeri perustuu heteropolysakkaridiin, jolla on suuri molekyylipaino ja joka on saatu fermentoimalla hiilihydraattia mikro-organismilla, joka kuuluu lajiin Xanthomonas tai Arthrobacter tai sienillä, jotka kuuluvat lajiin Sclerotium.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että polysakkari-digeelissä on myös ainakin yhtä polysakkaridia, joka kuuluu ryhmään Johanneksen leipäpuun siemenjauhe ja luonnosta peräisin olevat kumit.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan ensiksi viljelymiljöö, joka ympätään mikro-organismilla ja sen jälkeen siirretään tämä viljelymiljöö tai mikro-organismien suspensio, joka on saatu sentrifugoimalla tai suodattamalla viljelymiljöö, polysakkaridiliuokseen ja että muodostetaan geeli jäähdyttämällä.

5. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että valmistetaan aivan ensiksi polysakkaridien liuos kuumana, ja lasketaan lämpötila sen jälkeen 40-45°C:en ja lisätään vil-jelymiljöö, joka sisältää mikro-organismin tai mikro-organismin suspension ja jäähdytetään sitten sillä tavoin, että muodostuu geeli. Il 23 72140

6. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että lisätään geeliin ainetta, jolla on voimakas vettä absorboiva kyky siten että saadaan jäännösveden pitoisuudeksi seoksessa geeli + absorboiva aine 70-250 g ja etupäässä 100-150 g/100 g kohti absorboivaa ainetta.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että mikro-organismi on mykoritsa, joka siirretään homogeenisen sieni-rihmasto-viljelyn muodossa.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että muutetaan nestemäisen viljelyn volyymi lähes yhtä suureksi kiinteäksi volyymiksi.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä mikro-organismien sulkemiseksi, tunnettu siitä, että ymppi on kosteiden kuulien, säikeiden tai kuitujen muodossa. 721 40