CA1179618A - Procede d'inclusion de micro-organismes du groupe des mycorhizes et des actinorhizes - Google Patents
Procede d'inclusion de micro-organismes du groupe des mycorhizes et des actinorhizesInfo
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Abstract
La présente invention a trait à un procédé de préparation d'un produit sec contenant des microorganismes inclus dans une matrice d'un gel de polymère comprenant les étapes suivantes: - la formation d'un gel de polymère en combinant au moins un polymère du groupe des polysaccharides avec une composition contenant un microorganisme du groupe des mycorhizes et des actinorhizes et - la réticulation au moins partielle dudit polymère, ladite réticulation renfermant lesdits microorganismes dans la matrice dudit gel de polymère; et - le séchage dudit gel de polymère. Ce procédé est utile en agronomie.
Description
`' ~l L'~
La présente invention a trait à un procéde dl:inclu-sion de micro-organismes du groupe des mycorhizes e-t des acti-norhizes dans une matrice consti~uee par un gel de polymere, notamment ~ des fins ag~onomiques.
On a dejà propose depuis longtemps de fixer des micro-organismes sur un support comme par exemple dans l'US
1 909 622 depose en 1923 selon lequel on apporte des bacteries fixant l'azote, du genre Rhizobium.
Mais en general la culture de micro-organismes est adsorbee sur un support comme dans le brevet belge 521 850 qui preconise l'utilisation de terre de diakomees et de silice colloidale pour des Rhizobium. On a aussi fait appel à de la r bentonite comme dans le GB l 777 077, à des granules de plâtre (dans le FR 1 490 0~6), voire à de la lignite.
Mais ce mode par adsorbtion presente des inconve-nients notamment en ce qui concerne la survie du micro-organisme et sa protection lors du transport, du stockage et de la mani-pulation.
On comprend que cette voie n'a abouti qu'à des resul-tats très limites, et que l'on ait cherche à ameliorer les techniques de fixation. C'est ainsi que dans le brevet fran~ais 1 180 000 dans le cas de la fabricaiton des preparations riches en b~cteries du groupe des Azotobacter on a fait appel a un moût auquel on ajoute des substances a action adsorbante comme la cellulose, la farine d'os, le kaolin, du gel de silice.
Mais là encore la solution n'est pas satisfaisante. On a donc cherche à ameliorer à la fois la survie des micro-organismes, par exemple par inclusion, et la manière de les amener dans le milieu aux plantes.
C'est ainsi que dans le FR 77 102S4 du 5 Avril 1977 F
(correspondant à l'US 4 155 737) on a propose un procede qui fait appel à un inocuIum constitue par un gel de polymère dans " 1 ~
, ~ .- : :- -: .
lequel est inclus le micro-organisme, cet inoculum étant apporte dans la rhizosphère des plantes.
Selon ce brevet, le gel de polymere peut être consti-tue par un gel de polyacrylamide ou un gel de silice.
Mais l'on sait que le support doit retenir suffi-sa~nent le micro-organisme pour le conserver, le protéger, le présenter sous une forme manipuIable, tout en permettant son essaimage dans le milieu, et eventuellement en autorisant une aptitude au greffage d'additifs.
Par ailleurs ce support doit assurer la viabilite du micro-organisme mëme après des periodes de temps égales à plu sieurs semaines et ce dans des conditions d'hygrometrie varia-ble. Ceci veut dire que ce support doit etre a meme soit de contenir une reserve d'eau suffisante et la libérer à bon escient, soit de se procurer l'eau necessaire a partir du mi-lieu. Enfin le support ne doit pas etre gênant pour le milieu, c'est-à-dire qu'il doit etre soit biodegradable, soit non~ ~;
polluant. -Cette rapide enumeration qui ne pretend pas être exhaustive permet de comprendre pourquoi cette voie n'a pas ~
connu le developpement que l'on etait en droit d'esperer. -`
Or, dans le brevet français N 2.453.215 publie le 30 octobre 19~0, la Demanderesse a revendique une solution particuliare-ment attrayante qui consiste a inclure le micro-organisme dans un polymere du groupe des polysaccharides et a provoquer une reticulation au moins partielle du polymère par exemple par voie thermique, ou par un sel metallique ou par synergie grâce à un autre polymère.
Cette solution donne des resultats etonnants, et pre~
sente en outre l'avantage de montrer une synergie remarquable lorsque l'on fait appel en plus a un compose absorbant et adsorbant tel qu'une silice. -~
,~
- , ,, , . ; . .:
', . ., ' ' . .: ~ ' , . :
~'7~
La Demanderesse a e~Eectué ses premiers travaux en - particulier sur Rhizo~ium japonicum, bactérie non sporulée fixatrice d'azote, tres sensible notamment ~ la dessiccation, la temperature et aux facteurs physico-chimiques.
Mais certains micro-organismes presentent des diffi-cultes supplementaires en raison de leur nature filamenteuse comme par exemple les champignons ectomycorhiziens (exemple:
_solithus, Hebeloma, Tuber, Boletus ...) qui entre autres ne presentent aucune ~orme de résistance lorsqu'ils sont cultivée en culture pure.
Les associations mycorhiziennes sont le résultat de l'association d'un champignon et d'une racine qui realise une symbiose vraie. Selon la nature de l'association, on distin-gue:
- les mycorhizes ectotrophes, se rencontrant surtout chez les arbres forestiers (Pinacees, Fagacees), et dont la plupart sont des champignons superieurs (Ascomycètes et sasidiomycètes);
- les mycorhizes endotrophes, qui sont le plus souvent I des champignons inférieurs (Phycomycètes), beaucoup plus répandues que les precedentes aussi bien chez les arbres et les arbustes que les plantes herbacees, dans le cas des mycorhizes à arbuscules e-t à vesi-cules, et limitees aux Ericacées, dans le cas de mycorhizes à pe1otons.
L'action bénéfique de ces champignons mycorhiziens sur la croissance des plantes peut être attribuée à une protec- `
tion phytosanitaire contre les pathogènes du sol, à la produc- ~ ~
tion de substances de croissance ou de vitamines, à l'améliora- `
tion de la nutrition minérale de la plante, en particulier du phosphore par augmentation de la possibilite d'exploration du sol, amélioration de l'absorption en eau en condition de ~1'7~
deficit hydrique.
Par ailleurs, dans le cas des non légumineuses fixa-trices d'azote, des associations s~mbiotiques de m~me type que celles existant entre Rhizobium et :Légumineuses se caractérisant par la formation de nodosites sur le système racinaire, se rencontrent aussi bien chez des arbres que chez des arbustes ou des plantes herbacees. Le role de ces nodules n'est connu que pour certaines plantes ligneuses, colonisant en general les sols pauvres ou degrades ~sables, moraines), où il a été mis en évidence une ~ixation réelle d'azote atmosphérique. 137 espèces - d'Angiospermes appartenant a 12 genres différents, classés dans 7 familles (BétuIacéesr Casuarinacées, Coriariacees, Eleagna-cees, Myricacees, Rhamnacees, Rosacees) ont ete reconnues (Bond 1974). L'endophyte responsable de la formation de ces nodosites fixatrices d'azote est un Actinomycete (Frankia) qui n'a ete isole en culture pure que depuis 1978 par LALONDE et al. (Uni-: versite de LAVAL, QUEBEC).
L'interet de l'utilisation de ces essences forestiares :
fixatrices d'azote en sylviculture, en particulier dans les sols marginaux, pauvres en azote, sans structure ou a structure modiEiee ne fait aucun doute; on peut citer pour mémoire, les exemples suivants:
- reforestation de tourbi~re en FRA (Aulne, Myrcia), -de moraines glacieres dans les Alpes (Aulne), de rejets de mines ou de carrieres de schistes bitumi-neux aux U.S.A.; ~ : -- fixation de dunes maritimes et continentales au Sénegal (Casuarina);
- amenagement de la Baie-James au Canada;
- associations Alnus r~bra - D~uglas dans les systemes forestiers N.O. Americains;
- utilisation d'~lnus glutinosa, A. c~rdata, _ incana, ,.
~'7~8 A crispa comme plantes d'appoint (nurse-tree) pour favoriser le developpement d'especes non fixatrices;
- utilisation de _anothus, Myrica, Hipophaea, Elea- ~_ gnus en association avec des espèces non fixatri-ces ou comme productrices d'engrais vert ou de biomasse.
L'inoculation est pratiquee traditionnellement au stade pép1niare par apport de nodules broyés avec l'inconvé- ~;
nient majeur de possibilite d'introduction de germes patho-gènes, et de l'impossibilité de les conserver même à basse temperature par suite d'une oxydation rapide des tanins et des substances phenoli~ues tcomposes toxiques pour le micro-orga-nisme). Il n'a pas ete possible jusqu'alors de demontrer de fa~on ~ormelle la possibilite d'augmenter la prod~ctivite de ces espèces par inoculation de l'endophyte developpe en cultu-re pure. De même dans le cas des ectomycorhizes l'inoculation ; se pratique traditionnellement par un sol provenant d'une autre ;~ pepinière et plus couramment actuellement par des cultures ~ pures de champignons mycorhiziens sur vermiculite; l'inocula-tion pratiquée de cette façon présente trois inconvenients:
. difficulte de developper le champignon (Pisolithus ou Hebeloma):
au moins 6 semaines (GRAHAN-LINDERMAN 1980 Can. J. Microb. 26, II) avec obtention d'une culture hétérogène et peu dense en milieu~
::
~liquide;
- au moins 8 ~ lO semaines sur vermiculite. ~ -~
Dans le cas d'une culture liquide, il est necessaire i~
de recuperer le mycelium et de le~broyer avant utilisation,~
avec les risques que comporte un cisaillement trop poussé
~aucune repousse en particulier pour Tub r) puisque le micro- -: ' , ':'~
~'7~
organisme ne présente q~e des hyphes et aucune ~orme de resistance.
. quantlte irnportante cl'inoculum à mettre en oeuvre, l/m dans le cas de micro-organisme developpe sur vermiculite, cl'o~ dificulte de stockage;
. necessite d'inoculer avec des inoculums fralchement prepares ou stockes a 4C.
Ces problemes ont amene la demanderesse a poursuivre ses recherches. Un objet de l'invention est de proposer un inoculum pouvant etre stocké à temperature ambiante et facile a utiliser.
Un autre objet est d'ameliorer la culture des mycorhi~
zes et des actinorhizes en particulier au niveau de l'homogenei- ~-té et de la réduction de la durée de culture (ectomycorhizes).
La présente invention a trait a un procede de prépara-tion d'un produit sec contenant des microorganismes inclus dans une matrice d'un gel de polym8re comprenant l~s étapes suivan- -tes: - la formation d'un gel de polymere en combinant au moins ~, un polymere du groupe des polysaccharides avec une composition contenant un microorganisme du groupe des mycorhizes et des actinorhizes et - la réticulation au moins partielle dudit polymère, ladite réticulation renfermant lesdits microorganis- ~`
mes dans la matrice dudit gel de polymère; - et le sechage -. ~ ,.
dudit gel de polymère. ~
~.
Selon la presente invention on entend par traitement ~ ;
de reticulation au moins partiel un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que traitement thermique, traitement par un sel metallique ou de synergie -~
au moyen d'un autre pol~mère et de preference avec un autre polysaccharide.
Avantageusement le polymere est a base d'un hetero-polysaccharide à haut poids moleculaire obtenu par '.,i ' ~, ` ~,; ' ~ ' ' ~ i ~796:~8 fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou des champignons appartenant au genre Sclerotium.
~ ~ ~ . - , , - . .... . .. ... ...... . .
On peut égalemen-t faire appel à des polymeres issus de go~nmes naturelles ou biosynthetiques, de provenances diver-ses: algues (alginates~ carraghenanes, agar), exsudats de plantes (gommes karaya, adragante, arabique), de graines (guar, caroube).
La farine de graines de caroube (locust bean gum) est un extrait du fruit du caroubier (Cera-tonia siliqua L.) arbre de la famille des Caesalpiniaceae (aire géographique:
bassin méditerranéen). La farine de graines de caroube est contenue dans l'endosperme de la c~raine. L'endosperme est sé-paré de l'embryon par abrasion mécanique ou par procede chimi-que.
La farine de graines de caroube est un polysaccharide (galactomannane) constitué d'unités ~.D. mannopyranosyl (liai-sons 1-4), une sur ~ ou 5 étant substituée en C6 par ~ D.
galactopyranosyl.
. La combinaison de la gomme Xanthane et de la farine de graines de caroube par effet synergique accrolt la viscosité
du gel. On pense que la gomme Xanthane est formee de chalnes ~ helicoidales et que l'lnteraction avec le galactomannane en-traine la formation de liaisons entre les chaînes et permet d'obtenir un gel à reseau tridimensionnelO
Les alginates sont des extraits raffines d'algues brunes de la classe des Phaeophycées.
L'acide alginique est un polymere lineaire de haut poids moleculaire formé d'une succession de molécules d'acide ~.D. mannopyranosyluronique et d'acide ~.L. gulopyranosyluro-nique. L'addition d'ions calcium permet la liaison de deux groupements carboxyl formant un pont entre les chalnes paral-leles, surtout dans les regions constituees d'acide guluroni-que. On obtient ainsi instantanement a 25 C un gel d'une plus grande viscosite. A l'oppose, l'addition d'ions phosphate . ~
':
:: : .~ ' ,, 1~ 8 permet un retard de la prise en masse, qui peut ~tre intéres-sant pour une manipulation de la preparation avant la gelifi-cation complete.
Comme indique dans le brevet ~rançais N 2.~53.215 publie le 30 octobre 1980, la concentration en micro-organismes dans la pre~aration peut etre augmentee par filtration ou centrifuyation prealable du milieu de culture, remise en suspension du il-trat ou du culot sous faible volume et introduction dans la solution de polysacchari.de.
Le (ou les) micro-organisme(s) peut être apporté se-lon des modes operatoires difEerents qui se caracterisent par le fait que l'on prepare tout d'abord un milieu de culture ¦~
que l'on ensemence avec le mi.cro-organisme et que l'on apporte :.
ensuite ce milieu de culture ou la suspension du micro-organis-me obtenue par filtration centrifugation dans la solution de polysaccharide et que l'on forme le gel par refroidissement. j~
Pratiquement, selon un premier mode de mise en oeu-vre, on forme tout d'abord une solution de polysaccharide a chaud que l'on ramène a une temp~rature de l'ordre de 40 a :~ ~
45C, et a laquelle on ajoute le milieu de culture renfermant :
le micro-organisme, ou la suspension du micro-organisme, on refroidit ensuite de manière a former le gel.
Selon une autre forme de mise en oeuvre, on apporte separement le milieu de culture ou la suspension microbienne a chaque solution de polysaccharide dans les mêmes conditlons de temperature, on melange et on refroidit pour former le gel.
On peut aussi, comme dit precedemment, faire appel à
un sel metallique, tel que de fer ou d'aluminium, complexe ou .
non par un polyol. :~
De plus on peut aussi dissoudre le polysaccharide dans le milieu de culture, notamment ~ temperature ambiante et former la reticulation in situ. - `
- 8 - ~
:
7~
Comme dit precédemment le micro-organisme selon l'invention peut etre constiute par une actinorhize telle que l'actinomycète endophyte de non légumineuse ou une mycorhize, ectomycorhize ou endom~corhize.
Les inoculums peuvent se presenter sous diverses formes: gel, poudre, billes, ou même fibres.
Dans le cas de l'actimomycète celui-ci peut être ap-porte sous forme de culture liquide ou sous ~orme de nodules broyés.
De manière avantageuse on procède a un sechaye du gel. Comme dit précedemment, il y a lieu de ne pas detruire le micro~organisme, et l'on sait que celui-ci est generalement très thermosensible.
Un séchage tel quel est long et conduit à un film sec facilement friable, et qui peut etre broye sans difficulte~
De manière preferentielle on additionne le gel d'une substance absorbante a grande capacite d'absorption d'eau, de manière à obtenir une teneur en eau residuelle dans la melange gel ~ absorbant comprise entre 70 et 250 g/100 g d'absorbant et avantageusement entre 100 et 150 g pour 100 g.
L'adsorbant est constitue par une matière poreuse ~ ~
telle que silice naturelle ou synthetique, silico-aluminates, ~ -:
cellulose. Le pH est voisin d~ 7 et les temperatures de se-~cha~e suffisamment basses pour ne pas detruire le micro-orga-nisme, de l'ordre de 20 a 30C.
La mise en forme peut être realisee de diverses façon.
Selon le premier mode de mise en oeuvre le gel est seché, puis broye finement, additionné d'une substance telle que la silice pUiS homogeneise. La poudre ainsi obtenue peut alors être mise sous forme de pastilles.
Selon une autre forme de mise en oeuvre, on introduit le gel humide et la substance telle que la silice dans un g _ . .
t~
melanyeur ou malaxeur, puis après malaxage, soit on e-tale e-t sèche directement le melange, jusqu'à ce que la perte en eau 50it comprise entre 0 et 50% de son poids, mais de préférence entre 30 et 40~, on obtien-t une poudre dont la teneur en eau residuelle est comprise entre 100 et 150 CJ pour 100g d'absor-bant, soit on introduit le melanye dans une extrudeuse et on sèche les granules obtenus à temperature ambiante jusqu'à ega-lement une perte en eau comprise entre 30 et 40%.
Dans le cas où le micro-organisme est constitué par une mycorhize, avantageusement celle-ci est apportee sous forme d'une culture mycelienne homogène. L'inoculum peut se presenter sous forme de billes, fils ou fibres humides.
On peut selon une première forme de realisation transformer le volume de culture liqui.de en un volume sensible- ;
ment identique du volume liquide, de manière à obtenir avanta-- geusement des billes humides. Selon une deuxième forme de realisation le gel obtenu après inclusion de la culture ou de la suspension du micro-organisme est additionné d'une substance absorbante, de façon a obtenir une poudre facilement manipula-ble. Avantageusement l'absorbant est constitue par une silice dont le pourcentàge en poids par rapport au gel est de 10 à
120~ et de preference 30 à 50%.
Dans les deux cas de mise en oeuvre, ce procede pre-sente l'avantage considerahle de ne faire subir au mycelium aucun traitement mecanique tel que cisaillement ou broyage.
De plus ce procede permet le stockage, en conditions non ste-riles sans contamination, des inoculums à temperature ambiante.
~ais la presente invention sera plus aisement compri-se à l'aide des exemples suivants donnes a titre indicatif, mais nullement limitatifs.
.
EXEMPLE 1: Actinomycète endophyte de non legumineuse :
, ,,. ,'1, 9't~
1. Souche - Isolement - Culture conservation _ . .
. Symbiose etudiee: Alnus ylutinosa - Frankia . Souches: Frankla ARbNN4b e-t AgNlay (Collection LALONDE Faculte de Foresterie et de Geodésie, Université de LAVAL-QUEBEC) . Isolement de E'rankia à partir du nodule ~technique LALONDE et al. Proc. Woxkshop 2.5/4-1979- ;
Corvallis-Oregon).
- On sterilise superficiellement une ex-tremite de nodule coralloIde (~l22 30~ durant 5 mn; puls NaC10 5% durant 30 mn);
- On rince à l'eau sterile - On place le nodule dans une salière contenant une solution à 1~, stérilisee par filtration de polyvinylpyrrili-done PVP + tampon phosphate (PBS tg/l) = NaC1 0,8 Na2HPO4, 7H2O 1,14 - KH2PO4 0,2));
- On sectionne la partie inferieure du nodule et transfère l'extremlte dans une autre salière contenant du PBS
~20 ~ (quelques gouttes);
- On écrase le nodulel prelève l'interieur et ense-mence un tube a essai contenant du milieu Q mod* ~QUISPE~ 1960 .
modifie LALONDE 1979);
*Q mod (g/l): K2HPO4 0,3 - NaH2PO4 0,2 - MgSO4 7H20 0,2 - KCl 0,2 Yeast Extract ¦BBL) 0,5 - Bacto-peptone (DIFCO) 5 - glucose 10 - citrate ~errique ~ac.
Citrique ~ citra*e ferrique solution 1%) 1 ml oligo-elements 1 ml - H2O qsp 1000 ml pH 6,8 -7,0 - CaCO3 0,1 - lecithine 5 mg - sterilisation 20 mn a 120C.
- On incube deux semaines à 27C.
, .
~1~7~
. Culture Après incubation, on fragmente le mycelium avec une seringue et on rein~cule 6 tubes; on procède de la meme façon toutes les 2 semaines afin de multiplier act.ivement l'Actino~
mycete (avant chaque repiquage, on lave la culture au PBS), on prelève la colonie dans le fond du tube avec une pipette et on transfère dans un milieu Q Mod.
. Conservation - Germination des spores On favorise la germination des spores d'une culture stockee plusieurs mois en plongeant la colonie dans une solu-tion: alanine 45 mg ~ leucine 60 mg + PBS 50 ml durant 30 mn et en la replasant dans le milieu Q mod après l'avoir fragmen~
tee.
La présente invention a trait à un procéde dl:inclu-sion de micro-organismes du groupe des mycorhizes e-t des acti-norhizes dans une matrice consti~uee par un gel de polymere, notamment ~ des fins ag~onomiques.
On a dejà propose depuis longtemps de fixer des micro-organismes sur un support comme par exemple dans l'US
1 909 622 depose en 1923 selon lequel on apporte des bacteries fixant l'azote, du genre Rhizobium.
Mais en general la culture de micro-organismes est adsorbee sur un support comme dans le brevet belge 521 850 qui preconise l'utilisation de terre de diakomees et de silice colloidale pour des Rhizobium. On a aussi fait appel à de la r bentonite comme dans le GB l 777 077, à des granules de plâtre (dans le FR 1 490 0~6), voire à de la lignite.
Mais ce mode par adsorbtion presente des inconve-nients notamment en ce qui concerne la survie du micro-organisme et sa protection lors du transport, du stockage et de la mani-pulation.
On comprend que cette voie n'a abouti qu'à des resul-tats très limites, et que l'on ait cherche à ameliorer les techniques de fixation. C'est ainsi que dans le brevet fran~ais 1 180 000 dans le cas de la fabricaiton des preparations riches en b~cteries du groupe des Azotobacter on a fait appel a un moût auquel on ajoute des substances a action adsorbante comme la cellulose, la farine d'os, le kaolin, du gel de silice.
Mais là encore la solution n'est pas satisfaisante. On a donc cherche à ameliorer à la fois la survie des micro-organismes, par exemple par inclusion, et la manière de les amener dans le milieu aux plantes.
C'est ainsi que dans le FR 77 102S4 du 5 Avril 1977 F
(correspondant à l'US 4 155 737) on a propose un procede qui fait appel à un inocuIum constitue par un gel de polymère dans " 1 ~
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lequel est inclus le micro-organisme, cet inoculum étant apporte dans la rhizosphère des plantes.
Selon ce brevet, le gel de polymere peut être consti-tue par un gel de polyacrylamide ou un gel de silice.
Mais l'on sait que le support doit retenir suffi-sa~nent le micro-organisme pour le conserver, le protéger, le présenter sous une forme manipuIable, tout en permettant son essaimage dans le milieu, et eventuellement en autorisant une aptitude au greffage d'additifs.
Par ailleurs ce support doit assurer la viabilite du micro-organisme mëme après des periodes de temps égales à plu sieurs semaines et ce dans des conditions d'hygrometrie varia-ble. Ceci veut dire que ce support doit etre a meme soit de contenir une reserve d'eau suffisante et la libérer à bon escient, soit de se procurer l'eau necessaire a partir du mi-lieu. Enfin le support ne doit pas etre gênant pour le milieu, c'est-à-dire qu'il doit etre soit biodegradable, soit non~ ~;
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connu le developpement que l'on etait en droit d'esperer. -`
Or, dans le brevet français N 2.453.215 publie le 30 octobre 19~0, la Demanderesse a revendique une solution particuliare-ment attrayante qui consiste a inclure le micro-organisme dans un polymere du groupe des polysaccharides et a provoquer une reticulation au moins partielle du polymère par exemple par voie thermique, ou par un sel metallique ou par synergie grâce à un autre polymère.
Cette solution donne des resultats etonnants, et pre~
sente en outre l'avantage de montrer une synergie remarquable lorsque l'on fait appel en plus a un compose absorbant et adsorbant tel qu'une silice. -~
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La Demanderesse a e~Eectué ses premiers travaux en - particulier sur Rhizo~ium japonicum, bactérie non sporulée fixatrice d'azote, tres sensible notamment ~ la dessiccation, la temperature et aux facteurs physico-chimiques.
Mais certains micro-organismes presentent des diffi-cultes supplementaires en raison de leur nature filamenteuse comme par exemple les champignons ectomycorhiziens (exemple:
_solithus, Hebeloma, Tuber, Boletus ...) qui entre autres ne presentent aucune ~orme de résistance lorsqu'ils sont cultivée en culture pure.
Les associations mycorhiziennes sont le résultat de l'association d'un champignon et d'une racine qui realise une symbiose vraie. Selon la nature de l'association, on distin-gue:
- les mycorhizes ectotrophes, se rencontrant surtout chez les arbres forestiers (Pinacees, Fagacees), et dont la plupart sont des champignons superieurs (Ascomycètes et sasidiomycètes);
- les mycorhizes endotrophes, qui sont le plus souvent I des champignons inférieurs (Phycomycètes), beaucoup plus répandues que les precedentes aussi bien chez les arbres et les arbustes que les plantes herbacees, dans le cas des mycorhizes à arbuscules e-t à vesi-cules, et limitees aux Ericacées, dans le cas de mycorhizes à pe1otons.
L'action bénéfique de ces champignons mycorhiziens sur la croissance des plantes peut être attribuée à une protec- `
tion phytosanitaire contre les pathogènes du sol, à la produc- ~ ~
tion de substances de croissance ou de vitamines, à l'améliora- `
tion de la nutrition minérale de la plante, en particulier du phosphore par augmentation de la possibilite d'exploration du sol, amélioration de l'absorption en eau en condition de ~1'7~
deficit hydrique.
Par ailleurs, dans le cas des non légumineuses fixa-trices d'azote, des associations s~mbiotiques de m~me type que celles existant entre Rhizobium et :Légumineuses se caractérisant par la formation de nodosites sur le système racinaire, se rencontrent aussi bien chez des arbres que chez des arbustes ou des plantes herbacees. Le role de ces nodules n'est connu que pour certaines plantes ligneuses, colonisant en general les sols pauvres ou degrades ~sables, moraines), où il a été mis en évidence une ~ixation réelle d'azote atmosphérique. 137 espèces - d'Angiospermes appartenant a 12 genres différents, classés dans 7 familles (BétuIacéesr Casuarinacées, Coriariacees, Eleagna-cees, Myricacees, Rhamnacees, Rosacees) ont ete reconnues (Bond 1974). L'endophyte responsable de la formation de ces nodosites fixatrices d'azote est un Actinomycete (Frankia) qui n'a ete isole en culture pure que depuis 1978 par LALONDE et al. (Uni-: versite de LAVAL, QUEBEC).
L'interet de l'utilisation de ces essences forestiares :
fixatrices d'azote en sylviculture, en particulier dans les sols marginaux, pauvres en azote, sans structure ou a structure modiEiee ne fait aucun doute; on peut citer pour mémoire, les exemples suivants:
- reforestation de tourbi~re en FRA (Aulne, Myrcia), -de moraines glacieres dans les Alpes (Aulne), de rejets de mines ou de carrieres de schistes bitumi-neux aux U.S.A.; ~ : -- fixation de dunes maritimes et continentales au Sénegal (Casuarina);
- amenagement de la Baie-James au Canada;
- associations Alnus r~bra - D~uglas dans les systemes forestiers N.O. Americains;
- utilisation d'~lnus glutinosa, A. c~rdata, _ incana, ,.
~'7~8 A crispa comme plantes d'appoint (nurse-tree) pour favoriser le developpement d'especes non fixatrices;
- utilisation de _anothus, Myrica, Hipophaea, Elea- ~_ gnus en association avec des espèces non fixatri-ces ou comme productrices d'engrais vert ou de biomasse.
L'inoculation est pratiquee traditionnellement au stade pép1niare par apport de nodules broyés avec l'inconvé- ~;
nient majeur de possibilite d'introduction de germes patho-gènes, et de l'impossibilité de les conserver même à basse temperature par suite d'une oxydation rapide des tanins et des substances phenoli~ues tcomposes toxiques pour le micro-orga-nisme). Il n'a pas ete possible jusqu'alors de demontrer de fa~on ~ormelle la possibilite d'augmenter la prod~ctivite de ces espèces par inoculation de l'endophyte developpe en cultu-re pure. De même dans le cas des ectomycorhizes l'inoculation ; se pratique traditionnellement par un sol provenant d'une autre ;~ pepinière et plus couramment actuellement par des cultures ~ pures de champignons mycorhiziens sur vermiculite; l'inocula-tion pratiquée de cette façon présente trois inconvenients:
. difficulte de developper le champignon (Pisolithus ou Hebeloma):
au moins 6 semaines (GRAHAN-LINDERMAN 1980 Can. J. Microb. 26, II) avec obtention d'une culture hétérogène et peu dense en milieu~
::
~liquide;
- au moins 8 ~ lO semaines sur vermiculite. ~ -~
Dans le cas d'une culture liquide, il est necessaire i~
de recuperer le mycelium et de le~broyer avant utilisation,~
avec les risques que comporte un cisaillement trop poussé
~aucune repousse en particulier pour Tub r) puisque le micro- -: ' , ':'~
~'7~
organisme ne présente q~e des hyphes et aucune ~orme de resistance.
. quantlte irnportante cl'inoculum à mettre en oeuvre, l/m dans le cas de micro-organisme developpe sur vermiculite, cl'o~ dificulte de stockage;
. necessite d'inoculer avec des inoculums fralchement prepares ou stockes a 4C.
Ces problemes ont amene la demanderesse a poursuivre ses recherches. Un objet de l'invention est de proposer un inoculum pouvant etre stocké à temperature ambiante et facile a utiliser.
Un autre objet est d'ameliorer la culture des mycorhi~
zes et des actinorhizes en particulier au niveau de l'homogenei- ~-té et de la réduction de la durée de culture (ectomycorhizes).
La présente invention a trait a un procede de prépara-tion d'un produit sec contenant des microorganismes inclus dans une matrice d'un gel de polym8re comprenant l~s étapes suivan- -tes: - la formation d'un gel de polymere en combinant au moins ~, un polymere du groupe des polysaccharides avec une composition contenant un microorganisme du groupe des mycorhizes et des actinorhizes et - la réticulation au moins partielle dudit polymère, ladite réticulation renfermant lesdits microorganis- ~`
mes dans la matrice dudit gel de polymère; - et le sechage -. ~ ,.
dudit gel de polymère. ~
~.
Selon la presente invention on entend par traitement ~ ;
de reticulation au moins partiel un traitement susceptible de modifier la structure du polysaccharide tel que traitement thermique, traitement par un sel metallique ou de synergie -~
au moyen d'un autre pol~mère et de preference avec un autre polysaccharide.
Avantageusement le polymere est a base d'un hetero-polysaccharide à haut poids moleculaire obtenu par '.,i ' ~, ` ~,; ' ~ ' ' ~ i ~796:~8 fermentation d'un hydrate de carbone par un micro-organisme du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou des champignons appartenant au genre Sclerotium.
~ ~ ~ . - , , - . .... . .. ... ...... . .
On peut égalemen-t faire appel à des polymeres issus de go~nmes naturelles ou biosynthetiques, de provenances diver-ses: algues (alginates~ carraghenanes, agar), exsudats de plantes (gommes karaya, adragante, arabique), de graines (guar, caroube).
La farine de graines de caroube (locust bean gum) est un extrait du fruit du caroubier (Cera-tonia siliqua L.) arbre de la famille des Caesalpiniaceae (aire géographique:
bassin méditerranéen). La farine de graines de caroube est contenue dans l'endosperme de la c~raine. L'endosperme est sé-paré de l'embryon par abrasion mécanique ou par procede chimi-que.
La farine de graines de caroube est un polysaccharide (galactomannane) constitué d'unités ~.D. mannopyranosyl (liai-sons 1-4), une sur ~ ou 5 étant substituée en C6 par ~ D.
galactopyranosyl.
. La combinaison de la gomme Xanthane et de la farine de graines de caroube par effet synergique accrolt la viscosité
du gel. On pense que la gomme Xanthane est formee de chalnes ~ helicoidales et que l'lnteraction avec le galactomannane en-traine la formation de liaisons entre les chaînes et permet d'obtenir un gel à reseau tridimensionnelO
Les alginates sont des extraits raffines d'algues brunes de la classe des Phaeophycées.
L'acide alginique est un polymere lineaire de haut poids moleculaire formé d'une succession de molécules d'acide ~.D. mannopyranosyluronique et d'acide ~.L. gulopyranosyluro-nique. L'addition d'ions calcium permet la liaison de deux groupements carboxyl formant un pont entre les chalnes paral-leles, surtout dans les regions constituees d'acide guluroni-que. On obtient ainsi instantanement a 25 C un gel d'une plus grande viscosite. A l'oppose, l'addition d'ions phosphate . ~
':
:: : .~ ' ,, 1~ 8 permet un retard de la prise en masse, qui peut ~tre intéres-sant pour une manipulation de la preparation avant la gelifi-cation complete.
Comme indique dans le brevet ~rançais N 2.~53.215 publie le 30 octobre 1980, la concentration en micro-organismes dans la pre~aration peut etre augmentee par filtration ou centrifuyation prealable du milieu de culture, remise en suspension du il-trat ou du culot sous faible volume et introduction dans la solution de polysacchari.de.
Le (ou les) micro-organisme(s) peut être apporté se-lon des modes operatoires difEerents qui se caracterisent par le fait que l'on prepare tout d'abord un milieu de culture ¦~
que l'on ensemence avec le mi.cro-organisme et que l'on apporte :.
ensuite ce milieu de culture ou la suspension du micro-organis-me obtenue par filtration centrifugation dans la solution de polysaccharide et que l'on forme le gel par refroidissement. j~
Pratiquement, selon un premier mode de mise en oeu-vre, on forme tout d'abord une solution de polysaccharide a chaud que l'on ramène a une temp~rature de l'ordre de 40 a :~ ~
45C, et a laquelle on ajoute le milieu de culture renfermant :
le micro-organisme, ou la suspension du micro-organisme, on refroidit ensuite de manière a former le gel.
Selon une autre forme de mise en oeuvre, on apporte separement le milieu de culture ou la suspension microbienne a chaque solution de polysaccharide dans les mêmes conditlons de temperature, on melange et on refroidit pour former le gel.
On peut aussi, comme dit precedemment, faire appel à
un sel metallique, tel que de fer ou d'aluminium, complexe ou .
non par un polyol. :~
De plus on peut aussi dissoudre le polysaccharide dans le milieu de culture, notamment ~ temperature ambiante et former la reticulation in situ. - `
- 8 - ~
:
7~
Comme dit precédemment le micro-organisme selon l'invention peut etre constiute par une actinorhize telle que l'actinomycète endophyte de non légumineuse ou une mycorhize, ectomycorhize ou endom~corhize.
Les inoculums peuvent se presenter sous diverses formes: gel, poudre, billes, ou même fibres.
Dans le cas de l'actimomycète celui-ci peut être ap-porte sous forme de culture liquide ou sous ~orme de nodules broyés.
De manière avantageuse on procède a un sechaye du gel. Comme dit précedemment, il y a lieu de ne pas detruire le micro~organisme, et l'on sait que celui-ci est generalement très thermosensible.
Un séchage tel quel est long et conduit à un film sec facilement friable, et qui peut etre broye sans difficulte~
De manière preferentielle on additionne le gel d'une substance absorbante a grande capacite d'absorption d'eau, de manière à obtenir une teneur en eau residuelle dans la melange gel ~ absorbant comprise entre 70 et 250 g/100 g d'absorbant et avantageusement entre 100 et 150 g pour 100 g.
L'adsorbant est constitue par une matière poreuse ~ ~
telle que silice naturelle ou synthetique, silico-aluminates, ~ -:
cellulose. Le pH est voisin d~ 7 et les temperatures de se-~cha~e suffisamment basses pour ne pas detruire le micro-orga-nisme, de l'ordre de 20 a 30C.
La mise en forme peut être realisee de diverses façon.
Selon le premier mode de mise en oeuvre le gel est seché, puis broye finement, additionné d'une substance telle que la silice pUiS homogeneise. La poudre ainsi obtenue peut alors être mise sous forme de pastilles.
Selon une autre forme de mise en oeuvre, on introduit le gel humide et la substance telle que la silice dans un g _ . .
t~
melanyeur ou malaxeur, puis après malaxage, soit on e-tale e-t sèche directement le melange, jusqu'à ce que la perte en eau 50it comprise entre 0 et 50% de son poids, mais de préférence entre 30 et 40~, on obtien-t une poudre dont la teneur en eau residuelle est comprise entre 100 et 150 CJ pour 100g d'absor-bant, soit on introduit le melanye dans une extrudeuse et on sèche les granules obtenus à temperature ambiante jusqu'à ega-lement une perte en eau comprise entre 30 et 40%.
Dans le cas où le micro-organisme est constitué par une mycorhize, avantageusement celle-ci est apportee sous forme d'une culture mycelienne homogène. L'inoculum peut se presenter sous forme de billes, fils ou fibres humides.
On peut selon une première forme de realisation transformer le volume de culture liqui.de en un volume sensible- ;
ment identique du volume liquide, de manière à obtenir avanta-- geusement des billes humides. Selon une deuxième forme de realisation le gel obtenu après inclusion de la culture ou de la suspension du micro-organisme est additionné d'une substance absorbante, de façon a obtenir une poudre facilement manipula-ble. Avantageusement l'absorbant est constitue par une silice dont le pourcentàge en poids par rapport au gel est de 10 à
120~ et de preference 30 à 50%.
Dans les deux cas de mise en oeuvre, ce procede pre-sente l'avantage considerahle de ne faire subir au mycelium aucun traitement mecanique tel que cisaillement ou broyage.
De plus ce procede permet le stockage, en conditions non ste-riles sans contamination, des inoculums à temperature ambiante.
~ais la presente invention sera plus aisement compri-se à l'aide des exemples suivants donnes a titre indicatif, mais nullement limitatifs.
.
EXEMPLE 1: Actinomycète endophyte de non legumineuse :
, ,,. ,'1, 9't~
1. Souche - Isolement - Culture conservation _ . .
. Symbiose etudiee: Alnus ylutinosa - Frankia . Souches: Frankla ARbNN4b e-t AgNlay (Collection LALONDE Faculte de Foresterie et de Geodésie, Université de LAVAL-QUEBEC) . Isolement de E'rankia à partir du nodule ~technique LALONDE et al. Proc. Woxkshop 2.5/4-1979- ;
Corvallis-Oregon).
- On sterilise superficiellement une ex-tremite de nodule coralloIde (~l22 30~ durant 5 mn; puls NaC10 5% durant 30 mn);
- On rince à l'eau sterile - On place le nodule dans une salière contenant une solution à 1~, stérilisee par filtration de polyvinylpyrrili-done PVP + tampon phosphate (PBS tg/l) = NaC1 0,8 Na2HPO4, 7H2O 1,14 - KH2PO4 0,2));
- On sectionne la partie inferieure du nodule et transfère l'extremlte dans une autre salière contenant du PBS
~20 ~ (quelques gouttes);
- On écrase le nodulel prelève l'interieur et ense-mence un tube a essai contenant du milieu Q mod* ~QUISPE~ 1960 .
modifie LALONDE 1979);
*Q mod (g/l): K2HPO4 0,3 - NaH2PO4 0,2 - MgSO4 7H20 0,2 - KCl 0,2 Yeast Extract ¦BBL) 0,5 - Bacto-peptone (DIFCO) 5 - glucose 10 - citrate ~errique ~ac.
Citrique ~ citra*e ferrique solution 1%) 1 ml oligo-elements 1 ml - H2O qsp 1000 ml pH 6,8 -7,0 - CaCO3 0,1 - lecithine 5 mg - sterilisation 20 mn a 120C.
- On incube deux semaines à 27C.
, .
~1~7~
. Culture Après incubation, on fragmente le mycelium avec une seringue et on rein~cule 6 tubes; on procède de la meme façon toutes les 2 semaines afin de multiplier act.ivement l'Actino~
mycete (avant chaque repiquage, on lave la culture au PBS), on prelève la colonie dans le fond du tube avec une pipette et on transfère dans un milieu Q Mod.
. Conservation - Germination des spores On favorise la germination des spores d'une culture stockee plusieurs mois en plongeant la colonie dans une solu-tion: alanine 45 mg ~ leucine 60 mg + PBS 50 ml durant 30 mn et en la replasant dans le milieu Q mod après l'avoir fragmen~
tee.
2. CULTURE DES PLANTES (ALNUS GLUTINOSA~
. Pre~ermination des graines Cette operation comporte quatre phases:
~`
: - selection des graines ; ~ Les`gralnes sont placees dans un becher contenant de l'hexane (d = 0,66). On recupère et on seche sur papier ~
tre celles qui tombent au fond, les graines surnageant sont eliminees;
~ ' `.
- levee de dormance Les graines sont mises dans de l'eau et placées du-rant 4 jours à +4C;
. Pre~ermination des graines Cette operation comporte quatre phases:
~`
: - selection des graines ; ~ Les`gralnes sont placees dans un becher contenant de l'hexane (d = 0,66). On recupère et on seche sur papier ~
tre celles qui tombent au fond, les graines surnageant sont eliminees;
~ ' `.
- levee de dormance Les graines sont mises dans de l'eau et placées du-rant 4 jours à +4C;
3~ .
- Stérilisation ;
Dans NaCl~ à 5% durant 5 mn, suivie d'un lavage a .~:
l'eau distillée sterilisee;
~ .
- Pregermination r Les graines sont placées sur un milieu gélosé, sur bolte de Pétri, renfermant 1% de gélose, et 1,5~ de saccharose;
les boites de Pétri sont disposées ~ l'envers dans une enceinte saturee en eau et sont maintenues à une température de 28C à
l'obscurité durant 6 jours.
. Repi~uaye des plantules Les plantules non contaminées sont repiquées dans des POUC~ES>~ ou en tubes à essai de ~ 22.
. Repiquage en ~<POUCHES
On dispose dans un sac en polyéthylène (10 x 20 cm) du papier filtre présentant une gouttière à sa partie supé-- rieure; on introduit 8 ml de solution de CRONE (modifié
LALONDE - 1972 - J. Can. Botanic 5, 25-97), sans azote, diluée au l/2 dans le sachet, de fa~on à humecter le filtre en tota-2:0 lite; on perce des trous dans la gouttière et on dispose les plantules, radicelles en ace de l'ori~ice et de façon à ce que les cotyledons dépassent de la gouttière; les sachets sont mis en pièce régulée (éclairement 15000 lux, photo-période 14 j heures, température comprise entre 19 et 23C). I
:
- RepIqua~e sur vermiculite ~ -Des tubes de 0 22 mm sont remplis de 40 ml de vermi-culite lavée ~ l'eau; on additionne 20 ml de solution de CRONE
diluée au 1/2 puis on stérilise l'ensemble 20 mn à 120C; les plantules sont repiquées et incubees comme precedemment;
' 3. PREPARATION DES. INOCULUMS
3.1 Inoclllurns avec culture de Frankia incluse Les colonies de Frankia provenant de 10 cultures en tubes a essai.s développees durant 15 jours sont prelevees, remises en suspension dans 55 ml de PBS et fraymentées; les inoculums sont prepares avec cette suspension concentree, ren-fermant hyphes, spores et sporanges, de la façon suivante:
. Inoculum à base d'al~i ate AlG) Les concentrations sont donnees pour la preparation de 45 g de gel.
- on dissout 0,45 g d'alginate dans 36 ml de suspen-sion;
- on ajou-te 9 ml de solution de CaSO4, 2H2O à 6 g/l sous agitation. Le gel obtenu est alors soit seché a l'air ~usqu'a deshydratation soit additionne de 40% de son poids en silice et melange. jusqu'a obtention d'une poudre humide homo-gène;
cette poudre est ensuite sechee à temperature ambiante jusqu'à
ce que l'inoculum ne contienne plus que 125 g d'eau par 100 g de silice.
. Inoculum à base de gomme xanthane + farlne de graines de caroube (XG) I :
Les concentrations sont donnees pour la preparation de 45 g de gel.
- on dissout 225 mg de gomme xanthane dans 15 ml d'eau distillee a environ 70C;
- on procède de la meme façon en remplacant la gomme xanthane par 225 mg de farine de graines de caroube;
- lorsque les deux solutions sont a environ ~5C, on ajoute a chacune, sous agitaiton, 7~5 ml de suspension;
- on verse alors le melange suspension ~ graines de ; ~ :
~1'7~
caroube dans le mélanye suspension + yomme xanthane;
- on refroidit et on obtient un yel.
Ce gel est soit séche à l'air jusqu'à déshydratation soit additionné comme pour le gel AlG de 40% de son poids en silice; le melange est seche à température ambiante jusqu'à ce que la teneur en eau residuelle soit de 125 g par 100 g de silice.
3.2 Inoculums avec ~ s inclus 100 ml de nodules d'Alnus glutinosa fraichement pre-leves sont lavés puis broyés à l'aide d'un mixer de ~acon ~
obtenir environ 300 ml d'une suspension homogène qui servira à
préparer les gels à base d'alginate ou de gomme xan-thane avec nodules broyés inclus.
, Les gels sont seches à l'air puis reduits sous forme de poudre.
- Inoculums à base d'alginate (AlG) Pour la preparation de 200 g de gel:
. on dissout 2 g d'alginate dans 160 ml de suspension . on ajoute 40 ml de CaSO4, 2H2O à 6 g/l, on obtient un gel.
Une partie de ce g21 est sechee jusqu'~ deshydrata-tlon totaIe, à temperature ambiante t une autre partie est additionnée de 40~ de son poids de la même silice puis sechée jusqu'à ce que la teneur en eau résiduelle soit de 125 g par 100 g de silice.
' - Inoculum à base de gomme xanthane + farine de ~raines de caroube Pour la preparation de 360 g de gel:
.:
~L'7~
. on dissout l,8 g de gomrne xanthane dans 120 ml d'eau à 70C, durant 20 minu-tes, sous agitation, puis on rame ne la température à environ 45C;
. on procède de la même fa~on en rempla~ant la yomme xanthane par 1,8 g de farine de graines de caroube2 . lorsque les deux solutions sont à environ 45C, on ajoute à chacune 60 ml de suspens:Lon de nodules broyés;
. on reroidit et on ob1:ien-t un gel dont une partie est désh~dratee et l'autre partie additlonnec de sil;ice comm~
pour le gel d'alginate.
- Stérilisation ;
Dans NaCl~ à 5% durant 5 mn, suivie d'un lavage a .~:
l'eau distillée sterilisee;
~ .
- Pregermination r Les graines sont placées sur un milieu gélosé, sur bolte de Pétri, renfermant 1% de gélose, et 1,5~ de saccharose;
les boites de Pétri sont disposées ~ l'envers dans une enceinte saturee en eau et sont maintenues à une température de 28C à
l'obscurité durant 6 jours.
. Repi~uaye des plantules Les plantules non contaminées sont repiquées dans des POUC~ES>~ ou en tubes à essai de ~ 22.
. Repiquage en ~<POUCHES
On dispose dans un sac en polyéthylène (10 x 20 cm) du papier filtre présentant une gouttière à sa partie supé-- rieure; on introduit 8 ml de solution de CRONE (modifié
LALONDE - 1972 - J. Can. Botanic 5, 25-97), sans azote, diluée au l/2 dans le sachet, de fa~on à humecter le filtre en tota-2:0 lite; on perce des trous dans la gouttière et on dispose les plantules, radicelles en ace de l'ori~ice et de façon à ce que les cotyledons dépassent de la gouttière; les sachets sont mis en pièce régulée (éclairement 15000 lux, photo-période 14 j heures, température comprise entre 19 et 23C). I
:
- RepIqua~e sur vermiculite ~ -Des tubes de 0 22 mm sont remplis de 40 ml de vermi-culite lavée ~ l'eau; on additionne 20 ml de solution de CRONE
diluée au 1/2 puis on stérilise l'ensemble 20 mn à 120C; les plantules sont repiquées et incubees comme precedemment;
' 3. PREPARATION DES. INOCULUMS
3.1 Inoclllurns avec culture de Frankia incluse Les colonies de Frankia provenant de 10 cultures en tubes a essai.s développees durant 15 jours sont prelevees, remises en suspension dans 55 ml de PBS et fraymentées; les inoculums sont prepares avec cette suspension concentree, ren-fermant hyphes, spores et sporanges, de la façon suivante:
. Inoculum à base d'al~i ate AlG) Les concentrations sont donnees pour la preparation de 45 g de gel.
- on dissout 0,45 g d'alginate dans 36 ml de suspen-sion;
- on ajou-te 9 ml de solution de CaSO4, 2H2O à 6 g/l sous agitation. Le gel obtenu est alors soit seché a l'air ~usqu'a deshydratation soit additionne de 40% de son poids en silice et melange. jusqu'a obtention d'une poudre humide homo-gène;
cette poudre est ensuite sechee à temperature ambiante jusqu'à
ce que l'inoculum ne contienne plus que 125 g d'eau par 100 g de silice.
. Inoculum à base de gomme xanthane + farlne de graines de caroube (XG) I :
Les concentrations sont donnees pour la preparation de 45 g de gel.
- on dissout 225 mg de gomme xanthane dans 15 ml d'eau distillee a environ 70C;
- on procède de la meme façon en remplacant la gomme xanthane par 225 mg de farine de graines de caroube;
- lorsque les deux solutions sont a environ ~5C, on ajoute a chacune, sous agitaiton, 7~5 ml de suspension;
- on verse alors le melange suspension ~ graines de ; ~ :
~1'7~
caroube dans le mélanye suspension + yomme xanthane;
- on refroidit et on obtient un yel.
Ce gel est soit séche à l'air jusqu'à déshydratation soit additionné comme pour le gel AlG de 40% de son poids en silice; le melange est seche à température ambiante jusqu'à ce que la teneur en eau residuelle soit de 125 g par 100 g de silice.
3.2 Inoculums avec ~ s inclus 100 ml de nodules d'Alnus glutinosa fraichement pre-leves sont lavés puis broyés à l'aide d'un mixer de ~acon ~
obtenir environ 300 ml d'une suspension homogène qui servira à
préparer les gels à base d'alginate ou de gomme xan-thane avec nodules broyés inclus.
, Les gels sont seches à l'air puis reduits sous forme de poudre.
- Inoculums à base d'alginate (AlG) Pour la preparation de 200 g de gel:
. on dissout 2 g d'alginate dans 160 ml de suspension . on ajoute 40 ml de CaSO4, 2H2O à 6 g/l, on obtient un gel.
Une partie de ce g21 est sechee jusqu'~ deshydrata-tlon totaIe, à temperature ambiante t une autre partie est additionnée de 40~ de son poids de la même silice puis sechée jusqu'à ce que la teneur en eau résiduelle soit de 125 g par 100 g de silice.
' - Inoculum à base de gomme xanthane + farine de ~raines de caroube Pour la preparation de 360 g de gel:
.:
~L'7~
. on dissout l,8 g de gomrne xanthane dans 120 ml d'eau à 70C, durant 20 minu-tes, sous agitation, puis on rame ne la température à environ 45C;
. on procède de la même fa~on en rempla~ant la yomme xanthane par 1,8 g de farine de graines de caroube2 . lorsque les deux solutions sont à environ 45C, on ajoute à chacune 60 ml de suspens:Lon de nodules broyés;
. on reroidit et on ob1:ien-t un gel dont une partie est désh~dratee et l'autre partie additlonnec de sil;ice comm~
pour le gel d'alginate.
4. RESULTATS
..... _ , I
4a. _Essai_en_~POUCHES
La survie du microorganisme après inclusion, séchage et stockage à température ambiante (20 - 25C), a été contro-lée sur des plantules dlAl~us glutinosa selon la technique des POUCHES decrite précedemment; les plantules disposées dans les sachets sont développées durant l0 jours en conditions contrôlées puis elles sont inoculées par depose, sous llextré-; 20 mité de la racine principale, de l'inoculum à étudier; si l'inoculation est eficace et si le microorganisme est vivant, on voit apparaltre l0 a 20 jours apr~s l'inoculation des ren-flements puis de petits nodules sur la racine à l'emplacement de la dépose. Les résultats obtenus avec des inoculums à base de gel AlG ou XG + silice stockes l0 à 20 jours à température ambiante figurent dans le tableau ci-après.
`~
.:
..
, .-: ;
Influence_du type d'inoculum sur la nodulation d'Alnus glutinosa . . _ . _ ~ . . . _ : Inoculum :Conservation: Quantité :nb. plantes : :(~ours) (4) :inoculum/plante:nodulées/nb. :
: : : :total plantes:
:Non inoculé : - : 0 : 0/18 t~
:Suspension : :
:nodules broyes : 0 : 0,25 ml : 5/6 : (1) : : : : r :nodules broyés :
:inclus dans XG :
:sec (2) . :20 : environ 5 my : 4/4 :ARbNN4b :culture liquide: 0 : 0,25 ml : 1/5 :(3) :inclus dans XG :
:~ silice (5) : 70 : 5 mg : 6/9 :
:inclus dans AlG: : : :
:~ silice : 70 :5 mg : 6/9 ,, _ . _~
:AgNlag : : : : ;
:culture liquide: 0 : 0,25 ml : 6/6 :(3) : : : :
:inclus dans XG :
:+ silice (5) : 20 : 5 mg : 5/6 :
(l) 150 mg nodules frais/5 mlH2O
- (2) sechage à l'air H = 12%
20 (3) culture ayant servi a l'inclusion.
(4) Conservation de l'inoculum a temperature ambiante (20 a 25C).
..... _ , I
4a. _Essai_en_~POUCHES
La survie du microorganisme après inclusion, séchage et stockage à température ambiante (20 - 25C), a été contro-lée sur des plantules dlAl~us glutinosa selon la technique des POUCHES decrite précedemment; les plantules disposées dans les sachets sont développées durant l0 jours en conditions contrôlées puis elles sont inoculées par depose, sous llextré-; 20 mité de la racine principale, de l'inoculum à étudier; si l'inoculation est eficace et si le microorganisme est vivant, on voit apparaltre l0 a 20 jours apr~s l'inoculation des ren-flements puis de petits nodules sur la racine à l'emplacement de la dépose. Les résultats obtenus avec des inoculums à base de gel AlG ou XG + silice stockes l0 à 20 jours à température ambiante figurent dans le tableau ci-après.
`~
.:
..
, .-: ;
Influence_du type d'inoculum sur la nodulation d'Alnus glutinosa . . _ . _ ~ . . . _ : Inoculum :Conservation: Quantité :nb. plantes : :(~ours) (4) :inoculum/plante:nodulées/nb. :
: : : :total plantes:
:Non inoculé : - : 0 : 0/18 t~
:Suspension : :
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:inclus dans XG :
:sec (2) . :20 : environ 5 my : 4/4 :ARbNN4b :culture liquide: 0 : 0,25 ml : 1/5 :(3) :inclus dans XG :
:~ silice (5) : 70 : 5 mg : 6/9 :
:inclus dans AlG: : : :
:~ silice : 70 :5 mg : 6/9 ,, _ . _~
:AgNlag : : : : ;
:culture liquide: 0 : 0,25 ml : 6/6 :(3) : : : :
:inclus dans XG :
:+ silice (5) : 20 : 5 mg : 5/6 :
(l) 150 mg nodules frais/5 mlH2O
- (2) sechage à l'air H = 12%
20 (3) culture ayant servi a l'inclusion.
(4) Conservation de l'inoculum a temperature ambiante (20 a 25C).
(5) Silice precitée - surface BET = 200 m2/g - CTAB = 80 m2/g.
On constate que la nodulation est d'environ 100%
dans le cas des inoculums préparés à partir de microorganismes inclus + silice bien que la quantité de culture apportee dans 5 mg soit 50 ~ 100 fois inferieure a celle apportée dans 0,25 ml d'inoculum liquide.
4.b. Essais sur vermiculite L'injectivité et l'efficience du microorganisme r (souche ARbNN4b) après inclusion et stockage à température am-biante (20 ~ 25 C) ont été contrôlées sur Alnus glutinosa - 17 ~
. . .~ .. ~ , developpë en tubes A essais renfermant ve:rmiculite -~ milieu nutritif sans azote (solution de CRONE); les resul-tats obtenus figurent dans le tableau suivant: r Influence du ty~e d'inoculum sur la nodulation et la .... ~
croissance d'Alnus ~lutinosa (âge des plantules 50 jours) - . _ ; ,:
:
:Inoculum :Conservation:Nb.nodules:Poids en :Hauteur:Aspect : (1) : (jours) (2):/6 plantes:mg partie:moyenne: des :
: : : :aerienne : des :plantes :
: : : :ver-te/6 :plantes:
: : : :plantes : non : : 0 : 182 : 3i~~ chlorose:
: inocule : - : 0 : 195 : 42 :chlorose:
.
~ liquUide ' g ~ 331 50 vert : Inclus : : : ~- -:dans XG -~
: silice : 15 . 30 . 468 . 56 vert : Inclus : : : ~ : :
silice 30 36 , 515 . 59 . vert : _ : : _ ~ I
: Inclus .+ silice 30 . 32 , 444 . 62 ' vert ,: : : : : : :
__ (1) Culture ayant servi à l'inclusion.
(2) Conservation de l'inoculum a temperature ambiante (20 25C).
Ces resultats presentent une originalite certaine dans ce domaine, puisque, pour la premlere fois, on a reussi A ~.
preparer des inoculums avec inclusion de l'endophyte (cul-ture pure de Frankia ou suspension de nodules broyes) ayant les I -avantages suivants: -- inoculums sous forme de poudre facile à manipuler - mise en oeuvre possible sous de très faibles volumes - conservation de l'infectivite des microorganismes inclus au cours du s-tockage a temperature ambiante , - 18 ~
- aucun probleme de contamination par agents exté-rieurs.
Le procédé d'inclusion de nodules broyés de Casuari-na, dans un gel d'alginate séché ~ l'air, a notamment été
utilise pour l'inoculation de 600 000 pieds de Casuarina au Sénégal dans le cadre d'un projet de fixation de dunes mariti-mes et continentales.
EXEMPLE 2: Mycorhizes .
1.1: Souche utilisée - Pisolithus tinctor us (Marx) , 1.2: Culture du microorganisme en milieu li~uide .
L'entretien et la culture du champignon sont prati-qués en regle générale sur milieu MARX modifié MELIN-NORKRANS
(~N)(l) ~
la duree de fermentation dans ces conditions est de 6 à 8 : -semaines.
(1) MMN (g/l): CaC12 0,05 - NaCl 0,025 - K2HPO4 0,5 - (NH4)2 HPO4 0,25 - MgSO~,7H2O 0,15 - Citrate Ferrique 1 ml (1% citrate Fe) - thiamine 100 ~m - I
extrait de malt 3,0 saccharose 10,0 - H2O qsp .:
1000 ml pH = 5,5 -:
Une des sequences de culture qu'on a adoptee pour Pisolithus est donnee ci-après:
~'7~3ti1~
SOUCHE D ' ORIGINE
~1, Repiquage sur milieu gélosé MARX
Culture inoculum I Stockage à + 4C
en erlen 300 (milieu PEG ) !
.~
. Culture inoculum II
en erlen 300 (milieu PEG) ~ /
Culture productrice en fermenteur de 2 litres (m.ilieu PEG) - Entretien de la souche: Sur milieu gélosé MARX
. (boite de Pétri ou tubes inclinés).
' ~
- Culture inoculum I
: . . " ':
. recipient: erlen de 300 ml bouché au coton polyu-réthane rempli avec 70 ml de milieu de culture;
. milieu de culture PEG (g/l): peptone 10 - yeast ~.
extract 5 - glucose 10 - gélose 1, pH = environ 7, sterilisa- :
tion 25 mn a 120C, pH après stérilisation d'environ 6,6;
. ensemencement a partir d'une culture sur gelose (fragments de gelose ~ mycélium);
. conditions: incubation 10 ~ 15 jours sur table d'agitation tournant a 100-140 t/mnj excentration du plateau : 25 mm, temperature 28C.
~ ..
~ ! .
,' ~ ''' " ' ' " ' ` .
~.~t~
, - Culture inoculum II
.
Les conditions de cu~ture sont les mêmes,que prece- ~
demment mais,l'ensemencemen-t se fait à partir d'une cul-ture I
à raison de 5 à 10% la durée d'incubation est réduite a une semaine. .
- Culture productrice en fermenteur de 21 (Bi.ola-itte) . rempIissage: 1000 ml.
. milleu: PEG décrit ci-dessus . ensemencement: 1 à 10%
. conditions: agitation par une turbine tournant a 250-300 t/mn aération 20 l/heure, température 25 à 30C. I
' ' ., .
RESULTATS
' ~:
Après 8 à 13 jours de culture en fermenteur de 2 litres, on obtient une culture homogène et dense, ce qui évite ~: un broyage ulterieur du mycélium avant preparation de l'ino- , , culum; la quantite de,biomasse Ipoids sec a 105C) obtenue par litre de milieu est voisine de 2,5 g/l.
1.3 Préparation d'inoculums avec microorganismes inclus ;, ' ; ' Les champignons ectomycorhiziens ne présentant au-cune forme de resistance lorsqu'ils sont cultives en culture pure, il est necessaire de conserver lors de la preparation de l'inoculum une certaine teneur en eau residuelle de façon à
,~
.
assurer la survie du mycelium; ce type d'inoculum a ete reali-se soit par adjonction de silices au gel, apres inclusion du champignon dans un gel à base de polysaccharides, soit en melangeant la suspension mycelienne avec de l'alginate et en laissant tomber goutte à goutte ce melange dans une solution concentree de CaCl2 selon le principe decrit par HACKEL 1977 applique à l'immobilisation de Rhizobiu_ (brevet FR 79.28956 -1979). r - Inoculums sous for_e de poudre La culture developpée en fermenteur de 2 litres est r filtree ou centrifugee, lavee puis mise en suspension dans l'eau physi.ologi~ue; cette suspension est utilisee pour prepa-rer des gels a base d'alginate ou de gomme xanthane selon les procedes decrits anterieurement pour Frankia. ~
Ces gels sont ensuite additionnes de silice synthe- , ;
tique ou naturelle mala~es puis seches jus~u'a ce que la teneur en eau residuelle soit comprise entre 70 et 250%, de façon à 5~.
obtenir des poudres humides ou partiell'ement deshydratees qui sont conservees en flacons bouches. , :
- Inoculums sous forme de billes d'alginate On dissout dans la suspension mycelienne l à 2 g/l d'alginate puis on laisse tomber goutte a goutte le melange dans une solution concentree de CaCl2 a 170 g/l; on recupere , ,~
rapidement les billes formees qui sont ensuite lavees a l'eau du robinet et conservees en flacons bouches.
~ ' La survie du champignon ~Pisolithus tinctorius), en .
`' - 22 -.
particulier dans le cas des billes d'alginate, est supérieure à 6 mois, a température ambiante; le test utilisé pour appre cier la survie repose sur le principe de la datermination r colorimetrique de l'activite respirometrique par reduction du Nitro Blue Tetrazolium en formazan, compose colore en bleu.
Le contrôle de l'inEectivite et de l'efficience de ces inocu-lums est effectue sur Pinus caribaea ou Pinus pinaster après remise en solution des billes à l'aide d'un decomplexant tel r ~ue phosphates, citrate, 1actate.
Ces essais illustren-t les progrès spectaculaires realisés dans la préparation d'inoculums avec ectomycorhizes:
- par amélioration des conditions de culture en mi-lieu liquide d'un champiynon mycorhizien utilise couramment: production de biomasse homogene e-t re-duction de 4 à 6 semaines de la duree de fermenta-tion;
- par la preparation d'inoculums faciles à mettre en oeuvre et permettant la survie du microorganisme durant plusieurs mois.
~es exemples precedents ne sont pas limitatifs de la presente invention, en particulier, on na sortirait pas du cadre de ladite invention en appliquant le procede de prepara-tion d'inoculums avec E'rankia et ectomycorhizes à l'inclusion d'endomycorhizes à pelotons developpées en culture pure et à
l'inclusion de broyats de racines mycorhizees par des andomy- -corhizes à vesicules et à arbuscules, des inoculums prepares par inclusion de racines infectees puis broyees (m~celium -~
spores) dans des gels XG ou AlG additionnes de silice conser-30 vent leur infectivite: presence du champignon endomycorhizien à vésicules et arbuscules sur les racines de la plante test inoculae par ce procede.
.;
. : : , . .
On constate que la nodulation est d'environ 100%
dans le cas des inoculums préparés à partir de microorganismes inclus + silice bien que la quantité de culture apportee dans 5 mg soit 50 ~ 100 fois inferieure a celle apportée dans 0,25 ml d'inoculum liquide.
4.b. Essais sur vermiculite L'injectivité et l'efficience du microorganisme r (souche ARbNN4b) après inclusion et stockage à température am-biante (20 ~ 25 C) ont été contrôlées sur Alnus glutinosa - 17 ~
. . .~ .. ~ , developpë en tubes A essais renfermant ve:rmiculite -~ milieu nutritif sans azote (solution de CRONE); les resul-tats obtenus figurent dans le tableau suivant: r Influence du ty~e d'inoculum sur la nodulation et la .... ~
croissance d'Alnus ~lutinosa (âge des plantules 50 jours) - . _ ; ,:
:
:Inoculum :Conservation:Nb.nodules:Poids en :Hauteur:Aspect : (1) : (jours) (2):/6 plantes:mg partie:moyenne: des :
: : : :aerienne : des :plantes :
: : : :ver-te/6 :plantes:
: : : :plantes : non : : 0 : 182 : 3i~~ chlorose:
: inocule : - : 0 : 195 : 42 :chlorose:
.
~ liquUide ' g ~ 331 50 vert : Inclus : : : ~- -:dans XG -~
: silice : 15 . 30 . 468 . 56 vert : Inclus : : : ~ : :
silice 30 36 , 515 . 59 . vert : _ : : _ ~ I
: Inclus .+ silice 30 . 32 , 444 . 62 ' vert ,: : : : : : :
__ (1) Culture ayant servi à l'inclusion.
(2) Conservation de l'inoculum a temperature ambiante (20 25C).
Ces resultats presentent une originalite certaine dans ce domaine, puisque, pour la premlere fois, on a reussi A ~.
preparer des inoculums avec inclusion de l'endophyte (cul-ture pure de Frankia ou suspension de nodules broyes) ayant les I -avantages suivants: -- inoculums sous forme de poudre facile à manipuler - mise en oeuvre possible sous de très faibles volumes - conservation de l'infectivite des microorganismes inclus au cours du s-tockage a temperature ambiante , - 18 ~
- aucun probleme de contamination par agents exté-rieurs.
Le procédé d'inclusion de nodules broyés de Casuari-na, dans un gel d'alginate séché ~ l'air, a notamment été
utilise pour l'inoculation de 600 000 pieds de Casuarina au Sénégal dans le cadre d'un projet de fixation de dunes mariti-mes et continentales.
EXEMPLE 2: Mycorhizes .
1.1: Souche utilisée - Pisolithus tinctor us (Marx) , 1.2: Culture du microorganisme en milieu li~uide .
L'entretien et la culture du champignon sont prati-qués en regle générale sur milieu MARX modifié MELIN-NORKRANS
(~N)(l) ~
la duree de fermentation dans ces conditions est de 6 à 8 : -semaines.
(1) MMN (g/l): CaC12 0,05 - NaCl 0,025 - K2HPO4 0,5 - (NH4)2 HPO4 0,25 - MgSO~,7H2O 0,15 - Citrate Ferrique 1 ml (1% citrate Fe) - thiamine 100 ~m - I
extrait de malt 3,0 saccharose 10,0 - H2O qsp .:
1000 ml pH = 5,5 -:
Une des sequences de culture qu'on a adoptee pour Pisolithus est donnee ci-après:
~'7~3ti1~
SOUCHE D ' ORIGINE
~1, Repiquage sur milieu gélosé MARX
Culture inoculum I Stockage à + 4C
en erlen 300 (milieu PEG ) !
.~
. Culture inoculum II
en erlen 300 (milieu PEG) ~ /
Culture productrice en fermenteur de 2 litres (m.ilieu PEG) - Entretien de la souche: Sur milieu gélosé MARX
. (boite de Pétri ou tubes inclinés).
' ~
- Culture inoculum I
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. recipient: erlen de 300 ml bouché au coton polyu-réthane rempli avec 70 ml de milieu de culture;
. milieu de culture PEG (g/l): peptone 10 - yeast ~.
extract 5 - glucose 10 - gélose 1, pH = environ 7, sterilisa- :
tion 25 mn a 120C, pH après stérilisation d'environ 6,6;
. ensemencement a partir d'une culture sur gelose (fragments de gelose ~ mycélium);
. conditions: incubation 10 ~ 15 jours sur table d'agitation tournant a 100-140 t/mnj excentration du plateau : 25 mm, temperature 28C.
~ ..
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, - Culture inoculum II
.
Les conditions de cu~ture sont les mêmes,que prece- ~
demment mais,l'ensemencemen-t se fait à partir d'une cul-ture I
à raison de 5 à 10% la durée d'incubation est réduite a une semaine. .
- Culture productrice en fermenteur de 21 (Bi.ola-itte) . rempIissage: 1000 ml.
. milleu: PEG décrit ci-dessus . ensemencement: 1 à 10%
. conditions: agitation par une turbine tournant a 250-300 t/mn aération 20 l/heure, température 25 à 30C. I
' ' ., .
RESULTATS
' ~:
Après 8 à 13 jours de culture en fermenteur de 2 litres, on obtient une culture homogène et dense, ce qui évite ~: un broyage ulterieur du mycélium avant preparation de l'ino- , , culum; la quantite de,biomasse Ipoids sec a 105C) obtenue par litre de milieu est voisine de 2,5 g/l.
1.3 Préparation d'inoculums avec microorganismes inclus ;, ' ; ' Les champignons ectomycorhiziens ne présentant au-cune forme de resistance lorsqu'ils sont cultives en culture pure, il est necessaire de conserver lors de la preparation de l'inoculum une certaine teneur en eau residuelle de façon à
,~
.
assurer la survie du mycelium; ce type d'inoculum a ete reali-se soit par adjonction de silices au gel, apres inclusion du champignon dans un gel à base de polysaccharides, soit en melangeant la suspension mycelienne avec de l'alginate et en laissant tomber goutte à goutte ce melange dans une solution concentree de CaCl2 selon le principe decrit par HACKEL 1977 applique à l'immobilisation de Rhizobiu_ (brevet FR 79.28956 -1979). r - Inoculums sous for_e de poudre La culture developpée en fermenteur de 2 litres est r filtree ou centrifugee, lavee puis mise en suspension dans l'eau physi.ologi~ue; cette suspension est utilisee pour prepa-rer des gels a base d'alginate ou de gomme xanthane selon les procedes decrits anterieurement pour Frankia. ~
Ces gels sont ensuite additionnes de silice synthe- , ;
tique ou naturelle mala~es puis seches jus~u'a ce que la teneur en eau residuelle soit comprise entre 70 et 250%, de façon à 5~.
obtenir des poudres humides ou partiell'ement deshydratees qui sont conservees en flacons bouches. , :
- Inoculums sous forme de billes d'alginate On dissout dans la suspension mycelienne l à 2 g/l d'alginate puis on laisse tomber goutte a goutte le melange dans une solution concentree de CaCl2 a 170 g/l; on recupere , ,~
rapidement les billes formees qui sont ensuite lavees a l'eau du robinet et conservees en flacons bouches.
~ ' La survie du champignon ~Pisolithus tinctorius), en .
`' - 22 -.
particulier dans le cas des billes d'alginate, est supérieure à 6 mois, a température ambiante; le test utilisé pour appre cier la survie repose sur le principe de la datermination r colorimetrique de l'activite respirometrique par reduction du Nitro Blue Tetrazolium en formazan, compose colore en bleu.
Le contrôle de l'inEectivite et de l'efficience de ces inocu-lums est effectue sur Pinus caribaea ou Pinus pinaster après remise en solution des billes à l'aide d'un decomplexant tel r ~ue phosphates, citrate, 1actate.
Ces essais illustren-t les progrès spectaculaires realisés dans la préparation d'inoculums avec ectomycorhizes:
- par amélioration des conditions de culture en mi-lieu liquide d'un champiynon mycorhizien utilise couramment: production de biomasse homogene e-t re-duction de 4 à 6 semaines de la duree de fermenta-tion;
- par la preparation d'inoculums faciles à mettre en oeuvre et permettant la survie du microorganisme durant plusieurs mois.
~es exemples precedents ne sont pas limitatifs de la presente invention, en particulier, on na sortirait pas du cadre de ladite invention en appliquant le procede de prepara-tion d'inoculums avec E'rankia et ectomycorhizes à l'inclusion d'endomycorhizes à pelotons developpées en culture pure et à
l'inclusion de broyats de racines mycorhizees par des andomy- -corhizes à vesicules et à arbuscules, des inoculums prepares par inclusion de racines infectees puis broyees (m~celium -~
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Claims (26)
1. Procédé de préparation d'un produit sec contenant des microorganismes inclus dans une matrice d'un gel de polymère comprenant les étapes suivantes: - la formation d'un gel de polymère en combinant au moins un polymère du groupe des poly-saccharides avec une composition contenant un microorganisme du groupe des mycorhizes et des actinorhizes et - la réticulation au moins partielle dudit polymère, ladite réticulation renfer-mant lesdits microorganismes dans la matrice dudit gel de polymère; - et le séchage dudit gel de polymère.
2. Procédé de préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la réticulation du polymère est obtenue par traitement thermique.
3. Procédé de préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la réticulation est effectuée par action d'un sel métallique.
4. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 1, caractérisé par le fait que la réticulation est obtenue par traitement de synergie par un autre polymère, avantageusement un autre polysaccharide.
5. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 1, caractérisé par le fait que le polymère est à base d'un hétéropolysaccharide à haut poids moléculaire obtenu par fermentation d'un hydrate de carbone par un microorganisme du genre Xanthomonas ou Arthrobacter ou des champignons appartenant au genre Sclerotium.
6. Procédé de préparation du produit selon la revendication 5, caractérisé par le fait que le gel de poly-saccharide comprend également au moins un autre polysaccharide du groupe de la farine de graine de caroube et des gommes d'origine naturelle.
7. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 5 ou 6, caractérisé par le fait que l'on prépare tout d'abord un milieu de culture que l'on ensemence avec le micro-organisme et que l'on apporte ensuite ce milieu de culture ou la suspension de micro-organismes obtenue par centrifugation ou filtration du milieu de culture dans la solution de polysaccha-ride et que l'on forme le gel par refroidissement.
8. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 5 ou 6, caractérisé par le fait que l'on prépare tout d'abord une solution de polysaccharides à chaud, que l'on ramène à une température de 40-45°C et que l'on ajoute le milieu de culture renfermant le micro-organisme ou la suspension de micro-organismes et que l'on refroidit ensuite de manière à former un gel.
9. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 1, 2 ou 3, caractérisé par le fait que l'on apporte séparément le milieu de culture ou la supension de micro-organismes à chaque solution de polysaccharide.
10. Procédé de préparation du produit selon la revendication 3, caractérisé par le fait que l'on dissout, à
température ambiante, le polysaccharide dans le milieu de culture ou la suspension de micro-organisme et que l'on forme la réticulation in situ.
température ambiante, le polysaccharide dans le milieu de culture ou la suspension de micro-organisme et que l'on forme la réticulation in situ.
11. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est constitue par un actinomycète endophyte de non légumineuse.
12. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 4, caractérisé par le fait que l'actinomycète est apporté sous forme de culture liquide.
13. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 11, caractérisé par le fait que l'actinomycète est apporté sous forme de nodules broyés.
14. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 11, caractérisé par le fait que l'on additionne le gel d'une substance à grande capacité d'absorption d'eau de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel +
absorbant comprise entre 70 et 250 g/100 g d'absorbant.
absorbant comprise entre 70 et 250 g/100 g d'absorbant.
15. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 14, caractérisé par le fait que l'on additionne le gel d'une substance à grande capacité d'absorption d'eau de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel absorbant comprise entre 100 et 150 g/100 g d'absorbant.
16. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 14, caractérisé par le fait que l'absorbant est consti-tué par une silice dont le pourcentage en poids est de 10 à
120% par rapport au gel.
120% par rapport au gel.
17. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 16, caractérisé par le fait que l'absorbant est consti-tué par une silice dont le pourcentage en poids est de 30 à 50%
par rapport au gel.
par rapport au gel.
18. Procédé de préparation du produit selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le micro-organisme est constitué par une mycorhize apportée sous forme d'une cultu-re mycélienne homogène.
19. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 18, caractérisé par le fait que l'on transforme le volume de culture liquide sensiblement dans le même volume soli-de.
20. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 18, caractérisé par le fait que l'on forme un inoculum se présentant sous forme de billes, fils ou fibres humides.
21. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 18, caractérisé par le fait que l'on additionne le gel d'une substance à grande capacité d'absorption d'eau de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel +
absorbant comprise entre 70 et 250 g pour 100 g d'absorbant.
absorbant comprise entre 70 et 250 g pour 100 g d'absorbant.
22. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 21, caractérisé par le fait que l'on additionne le gel d'une substance à grande capacité d'absorption d'eau de manière à obtenir une teneur en eau résiduelle dans le mélange gel +
absorbant comprise entre 100 et 150 g.
absorbant comprise entre 100 et 150 g.
23. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 21, caractérisé par le fait que l'absorbant est cons-titué par une silice dont le pourcentage en poids par rapport au gel est de 10 à 120%.
24. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 23, caractérisé par le fait que l'absorbant est cons-titué par une silice dont le pourcentage en poids par rapport au gel est de 30 à 50%.
25. Procédé de préparation du produit selon la reven-dication 21 ou 23, caractérisé par le fait que l'on forme un inoculum présentant l'aspect d'une poudre.
26. Procédé d'inclusion de micro-organismes selon la revendication 22 ou 24, caractérisé par le fait que l'on trans-forme un inoculum présentant l'aspect d'une poudre.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8104474A FR2501229A1 (fr) | 1981-03-06 | 1981-03-06 | Procede d'inclusion de micro-organismes du groupe des mycorhizes et des actinorhizes |
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