CN104277992B - 一株根瘤菌及其在柠条育苗中的应用 - Google Patents

一株根瘤菌及其在柠条育苗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株根瘤菌及其在柠条育苗中的应用。本发明提供的杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU01603，其保藏编号为CGMCC No.7895。本发明还保护所述菌株在促进柠条生长中的应用、在柠条育苗中的应用。本发明还保护一种菌剂，为培养所述菌株得到的整个培养体系。本发明的优点：（1）为生产上提供了生长速度快速的柠条根瘤菌，添补了国内外缺乏快生型柠条根瘤菌的空白；（2）革新了传统的柠条种植方式，增加了育苗并接种根瘤菌的工作，保证了柠条的结瘤率，促进了柠条在荒漠环境中的健康成长；（3）有利于在荒山、荒漠区以及道路绿化等过程中通过种植结瘤的柠条植株达到促进生态恢复和保护生态环境的目的。

Description

一株根瘤菌及其在柠条育苗中的应用
技术领域
本发明涉及一株根瘤菌及其在柠条育苗中的应用。
背景技术
根瘤菌是一类能与豆科植物结瘤共生的固氮细菌。当与合适的豆科植物共生时，根瘤菌固定空气中的氮气为氨，从而为豆科植物提供氮素营养，而豆科植物则通过光合作用为根瘤菌提供碳水化合物和能量，两者形成了很好的共生关系。
由于根瘤菌与豆科植物之间存在着相互识别作用，且这种作用又受到地理环境和土壤理化因子的影响，因此需要选育适合豆科植物且适应环境的根瘤菌，才能达到两者之间互惠互利的共生效果。在从未种植过豆科植物的土壤内种植豆科植物，需要接种合适的根瘤菌才能保障豆科植物良好地生长。
柠条是一种很好的防风固沙豆科植物，它在荒漠改良、生态保护、荒山改造中起着重要的作用。柠条根系发达，入地深达数米以上，抗击风沙和沙埋的能力强。多年生的柠条还可作为牛羊的饲料，柠条茎可编筐、造纸、制作复合板材或作为碳薪材料。
由于柠条多在贫瘠的荒漠地区生长，而通过人工施肥又存在着缺少肥源，施肥困难等诸多问题，因此解决柠条在荒漠地区良好生长的重要措施就是在种植初期使其与根瘤菌结瘤，形成共生固氮体系，再移植到合适的种植区，通过合理的养护管理，就能达到提高柠条的存活率、促进柠条健康生长，在荒漠绿化，改善生态环境中发挥重要的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一株根瘤菌及其在柠条育苗中的应用。
本发明提供的杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU01603，已于2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC No.7895。杨凌根瘤菌(Rhizobiumyanglingense)CCBAU01603简称菌株CCBAU01603。
本发明还保护菌株CCBAU01603在促进柠条生长中的应用。
本发明还保护菌株CCBAU01603在柠条育苗中的应用。
本发明还保护一种用于培养所述菌株CCBAU01603的培养基（YIA培养基），为采用如下方法制备得到的培养基：取肌醇8-12g、酵母粉2-4g、MgSO40.1-0.3g、NaCl0.05-0.15g、K2HPO40.15-0.35g和KH2PO40.15-0.35g，溶于水并用定容到1000ml。所述YIA培养基具体可为采用如下方法制备得到的培养基：取肌醇10g、酵母粉3g、MgSO40.2g、NaCl0.1g、K2HPO40.25g和KH2PO40.25g，溶于水并用定容到1000ml。所述培养基的pH具体可为7.0。
本发明还保护一种菌剂，为培养菌株CCBAU01603得到的整个培养体系。
所述菌剂具体可为采用如下方法制备得到的菌剂：（1）将菌株CCBAU01603接种至所述YIA培养基，28℃、160转/分钟振荡培养48小时；（2）取步骤（1）的整个培养体系，每1000毫升加入1毫升微量元素溶液，得到菌剂。所述微量元素溶液的制备方法具体如下：取H3BO42.86g、MnSO41.81g、CuSO4·5H2O0.8g、ZnSO40.22g、H2MoO40.02g，溶于水并用定容至1000ml。
本发明还保护所述菌剂在促进柠条生长中的应用。
本发明还保护所述菌剂在柠条育苗中的应用。应用所述菌剂进行柠条育苗的方法具体如下：（1）用所述菌剂喷洒柠条种子，使根瘤菌吸附于种子表面；（2）育苗，使根瘤菌在柠条根系上结瘤，形成结瘤幼苗；（3）幼苗的田间移栽；（4）田间管理，确保植株成活。室内及田间试验的结果均表明，应用本发明提供的菌剂后，可显著提高柠条的成活率和结瘤率，并促进柠条的生长。
本发明的发明人通过根瘤菌的分离、培养、遗传、表型等研究，找到一株高效结瘤固氮、且适应盐碱环境的柠条快生型根瘤菌。本发明的优点：（1）为生产上提供了生长速度快速的柠条根瘤菌，添补了国内外缺乏快生型柠条根瘤菌的空白；（2）革新了传统的柠条种植方式，增加了育苗并接种根瘤菌的工作，保证了柠条的结瘤率，促进了柠条在荒漠环境中的健康成长，获得更多的氮素营养；（3）通过本发明的实施，有利于在荒山、荒漠区及道路绿化中等过程中通过种植结瘤的柠条植株达到促进生态恢复和保护生态环境的目的。
附图说明
图1为播种45天后，每株植株的结瘤数目统计结果。
图2为播种45天后，每株植株的根瘤鲜重统计结果。
图3为播种45天后，每株植株的地上部分干重统计结果。
图4为播种45天后，每株植株的地上部分株高统计结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置15次重复实验，结果做统计学分析。柠条（学名：Caragana microphylla；俗称小叶锦鸡儿）：内蒙古鄂尔多斯市碧森种业有限公司。沙土：采集自内蒙古鄂尔多斯市中科院沙地生态试验站。
实施例1、根瘤菌的获得和鉴定
一、根瘤菌的获得
2011年7月从内蒙古鄂尔多斯中科院野外生态试验站的沙地中采集沙土样品，带回中国农业大学根瘤菌研究中心。将表面消毒的柠条种子种植到采集的沙土中，一个月后植株结瘤固氮。将根瘤取下，经表面消毒后，用YIA培养基分离其中的根瘤菌。经纯化并经后续的鉴定、回接结瘤验证后，将一株在YIA固体培养基上生长快速的菌株命名为CCBAU01603，该菌株为对于柠条具有高效结瘤固氮的作用。
二、根瘤菌的鉴定
革兰氏染色法染色结果为阴性；不产生芽孢。生长速度快于慢生型根瘤菌，在YIA液体培养基及28℃条件下培养时，代时为6.08小时。
菌株CCBAU01603的部分测序结果见序列表的序列1，与杨凌根瘤菌(Rhizobiumyanglingense)同源性最高。
综合以上鉴定结果，菌株CCBAU01603为杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)。
三、根瘤菌的保藏
杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU01603，已于2013年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No.7895。杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU01603简称菌株CCBAU01603。
实施例2、菌株CCBAU01603的应用
一、培养基的制备
YIA培养基，全称为“Yeast-Inositol-Agar”培养基，中文全称为“酵母粉-肌醇-琼脂”培养基。
YIA液体培养基的制备方法：取肌醇10g、酵母粉3g、MgSO40.2g、NaCl0.1g、K2HPO40.25g和KH2PO40.25g溶于蒸馏水，并用蒸馏水定容到1000ml；pH7.0。
YIA固体培养基的制备方法：在液体培养基的基础上，每升加入15-20g琼脂粉。
常规的用于根瘤菌的培养的培养基为YMA培养基(全称为“Yeast-Mannitol-Agar”培养基；中文全称为“酵母粉-甘露醇-琼脂”培养基)。YIA与YMA之间的差别仅在于碳源种类的不同，YIA培养基中碳源为肌醇，YMA培养基中，碳源为甘露醇。
本发明的实施例中使用YIA培养基，因为在YIA培养基中，肌醇充当根瘤菌生长的碳源，而豆科植物根系又可分泌此物质，同时肌醇还可做为根瘤菌与植物之间的分子对话的信号分子以及根瘤菌生长的生长因子。YMA培养基中，甘露醇仅做为根瘤菌生长的碳源，未见报到有其它功能。如果未能得到肌醇，可以使用YMA培养基培养菌株CCBAU01603，菌株也能生长良好。
二、根瘤菌菌剂的制备
1、菌株活化
将4℃冰箱保存于YIA固体斜面上的菌株CCBAU01603转接到新鲜配制的YIA固体培养基平板上，划线出单菌落。4℃冰箱保存时，保存时间不应长于3个月。
2、扩大培养
用灭菌后的接种环挑取上述平板上的单菌落一到两环，接种至200ml灭菌后的YIA液体培养基，28℃、160转/分钟振荡培养48小时。
3、根瘤菌菌剂的获得
取步骤2的整个培养体系，每1000毫升的上述培养体系加入1毫升灭菌后的微量元素溶液，得到根瘤菌菌剂。
微量元素溶液的制备方法：取H3BO42.86g、MnSO41.81g、CuSO4·5H2O0.8g、ZnSO40.22g、H2MoO40.02g，溶于蒸馏水，并用蒸馏水定容到1000ml。
培养体系与微量元素与微量元素溶液混合均匀可直接使用（本发明中直接使用），如短期存放，最好4-8℃保存，也可存在放于通风阴凉的地方，勿在阳光下曝晒，建议在1-2周内使用完毕。
三、根瘤菌菌剂的应用
1、苗床整理
第一组：将干湿度合适的沙土（水份控制在10%以下）过10目的筛子，然后均匀铺到苗床上，苗床的深度以30-50厘米为宜。
第二组：将直径为0.75-1.0mm的蛭石均匀铺到苗床上，苗床的深度以30-50厘米为宜。
2、用根瘤菌菌剂喷洒柠条种子
实验时间为4月初至4月中旬，实验地点为北京中国农业大学根瘤菌研究中心。
挑选健康、饱满、粒度大小一致的柠条种子，置于干净塑料盆中，在阴凉处用喷雾器将步骤二制备得到的根瘤菌菌剂喷洒于柠条种子表面，确保每粒种子都粘上菌剂。
实际应用中，也可将根瘤菌菌剂摇匀后，取适量倒到种子表面，然后搅拌均匀。
粘有根瘤菌菌剂的种子不宜在阳光下暴晒。
3、播种
第一组实验组（Sandy_01603组）：将步骤2中喷洒了根瘤菌菌剂的种子均匀播洒到步骤1制备的第一组苗床上，每粒种子占据5cm×5cm的面积，种子表面均匀覆盖一层1-2cm厚的湿度为20%左右的过10目筛后的沙子，将窗纱盖到苗床上，并与苗床保持20cm的距离，防止鸟儿刨食，再在苗床上喷洒适量的水份。
第一组对照组（Sandy_CK组）：将柠条种子（未进行步骤2的处理）均匀播洒到步骤1制备的第一组苗床上，每粒种子占据5cm×5cm的面积，种子表面均匀覆盖一层1-2cm厚的湿度为20%左右的过10目筛后的沙子，将窗纱盖到苗床上，并与苗床保持20cm的距离，防止鸟儿刨食，再在苗床上喷洒适量的水份。
第二组实验组（Vml_01603组）：用第二组苗床代替第一组苗床，且用“种子表面均匀覆盖一层1-2cm厚的粒径为0.75-1.00mm的蛭石”代替“种子表面均匀覆盖一层1-2cm厚的湿度为20%左右的过10目筛后的沙子”，其它共第一组实验组。
第二组对照组（Vml_CK组）：用第二组苗床代替第一组苗床，且用“种子表面均匀覆盖一层1-2cm厚的粒径为0.75-1.00mm的蛭石”代替“种子表面均匀覆盖一层1-2cm厚的湿度为20%左右的过10目筛后的沙子”，其它共第一组对照组。
4、育苗
播种后3-5天即可出苗，根据天气情况适时浇水，育苗时间为1.5-2个月，以45天为宜，以形成结瘤苗。结瘤苗形成后，可以统计结瘤数目、根瘤鲜重、地上部分干重、地上部分株高、叶片叶绿素含量等指标。
播种45天后，每株植株的结瘤数目统计结果见图1（每组统计15株植株），每株植株的根瘤鲜重(g)统计结果见图2（每组统计15株植株），每株植株的地上部分干重(g)统计结果见图3（每组统计15株植株），每株植株的地上部分株高(cm)统计结果见图4（每组统计15株植株）。图1至图4中，每个柱子上的横线为标准差。横线上面的字母（即a,b,c,d及不同组合）代表不同处理的差异是否显著(p=0.05水平)，如果为不同的字母则表示处理间有显著差异,如果有相同的字母则表示处理间的差异不显著。
结果表明，以蛭石为基质时，施加根瘤菌菌剂后，植株的各项生物学指标（包括结瘤数目、根瘤鲜重、地上部分株高、地上部分干重）均明显高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理，且差异显著。结果表明，以沙土为基质时，施加根瘤菌菌剂后，植株的各项生物学指标（包括结瘤数目、根瘤鲜重、地上部分干重）均高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理,且差异显著。结果表明，以沙土为基质时，施加根瘤菌菌剂后，植株的地上部分株高高于不施加根瘤菌菌剂的对照处理。
5、田间移植与管理
将完成育苗的幼苗用铁锹小心挖出，勿伤及根系，将幼苗放入合适的容器（如塑料袋）中，保持一定的湿度，尽快移植到田间。田间种植时，可以行播，每穴3-5株，穴间距为1米。移植后要根据情况及时浇水，以保证植株成活。植株成活后，第一年要防止牲畜啃食，如果植株得病要及时进行防治，禁止采伐3年后方可解除围封禁牧。

Claims (6)

1.杨凌根瘤菌(Rhizobium yanglingense)CCBAU 01603，其保藏编号为CGMCCNo.7895。
2.权利要求1所述菌株在促进柠条生长中的应用。
3.权利要求1所述菌株在柠条育苗中的应用。
4.一种菌剂，为培养权利要求1所述菌株得到的整个培养体系。
5.权利要求4所述菌剂在促进柠条生长中的应用。
6.权利要求4所述菌剂在柠条育苗中的应用。
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