FI70927B - Extration av interferon fraon bakterier - Google Patents

Description

70927

Extration av interferon frSn bakterier Interferonin uutto bakteereista Föreliggande uppfinning avser extraktion av interferon frSn interferonuttryckande bakterier.

Även om interferon allmänt antages vara av stor betydelse säsom ett potentiellt avntiviralt och/eller anticancermedel har den ringa tillgSngen och Stora kostnaden för interferon frSn naturliga källor fördröjt väsentlig klinisk testning och vittspridd användning av interferon. Rekombinant DNA-teknik har använts för att skapa bakterier, som kan uttrycka interferon: jämför exempelvis Nagata et al^., "Nature", volym 284, sidorna 316-320 (1980). Fermentation av sSdana bakterier förväntas ge Stora mängder interferon till väsentligt lägre kostnad än som skulle vara möjligt genom användning av naturliga källor för interferon. Emellertid mäste interferon för klinisk användning vara av hög renhetsgrad och fctr inte vara förorenat med cellbestSndsdelar eller cellavfall frSn den interferonuttryckande bakterien. Kontaminering med sädana föroreningar skulle resultera i ogynnsamma reaktioner eller testresultat som inte är reproducerbara. Extraktion av interferon frSn celler av interferonuttryckande bakterier med tillräckligt hög renhetsgrad för klinisk användning har följ-aktligen utgjort ett väsentligt problem. Enligt uppfinningen har helt överraskande en förbättrad metod upptäckts för extraktion av interferon frSn interferonuttryckande bakterier.

Enligt uppfinningen ästadkommes ett förfarande för framställ-ning av en lösning av interferon frSn interferonuttryckande bakterieceller, vilket kännetecknas av att man surgör en första suspension av interferonhaltiga bakterieceller, avlägsnar väsentligen ali suspenderingsvätska frSn cellerna, framställer en andra suspension av de surgjorda cellerna, neutraliserar eller gör svagt basisk denna andra suspension och separerar 2 70927 den interferonhaltiga vätskan frän de suspenderade cellerna.

Om sä önskas kan den erhällna vätskan behandlas vidare, särskilt genom extraktion av interferon frlin vätskan, t.ex. enligt kända metoder.

Vid förfarandet enligt uppfinningen frigöres interferon helt överraskande frSn cellerna vid neutralisation av suspensionen av surgjorda cellerna utan behov av mekanisk eller enzymatisk sönderbrytning av cellytan. Denna metod medger effektiv utvinning av interferon pä ett sätt, som signifikant minskar förorening av cellbeständsdelar och gftr efterföljande reningssteg lättare och mindre kostnadskrävande.

Vid förfarandet enligt uppfinningen surgöres suspensionen av de interferonuttryckande cellerna, som kan förfinnas i en fermentationstanke, företrädesvis till ett pH av ungefär 1,3 - 4,0, mer föredraget till ett pH av ungefär 2,0 - 2,5. Exempel pä lämpliga syror, som kan användas vid surgörnings-steget, är starka syror, särskilt mineralsyror s&som klorväte-syra, salpetersyra, svavelsyra och fösforsyra. Emellertid föredrages helt allmänt att inte använda syror (säsom klor-vätesyra) som kan korrodera den fermentationsutrustning som användes för odling av cellerna. Svavelsyra och fosforsyra är därför de mest föredragna. De ovannämnda suspensionsmedierna är företrädesvis vattenhaltiga.

Det temperaturintervall vid vilket bakteriecellerna behandlas med syra skall vara frän ungefär rumstemperatur (dvs. inte lägre än ungefär 15°C) tili ungefär 40°C. Om temperaturen är för läg avdödas bakterierna inte hastigt nog under syra-behandlingen. Den maximala temperaturen är ungefär 40°C emedan interferonet kan nedbrytas vid högre temperaturer.

Efter det att cellsuspensionen surgjorts avlägsnas cellerna ur vätskan, företrädesvis genom centrifugering. Om cellerna centrifugeras tili bildning av en pellet skall de ätersuspen- 3 70927 deras före neutralisationssteget. Om centrifugen är konstruerad för att använda en andel av suspenderingsvätskan till bildning av en uppslamning av de centrifugerade cellerna kan det före-finnas tillräckligt med vätska i uppslamningen för att man skall fortskrida tili neutralisationssteget utan Stersuspen-dering av cellerna. Uttrycket "suspension" innefattar i före-liggande sammanhang en s£dan uppslamning.

Cellsuspensionen neutraliseras företrädesvis tili ett pH av ungefär 7,0 - 8,0, företrädesvis 7,2 - 7,6. Exempel pS lämpliga baser, som kan användas vid neutralisationssteget, är kaiiumhydroxid och natriumhydroxid.

Exempel pS bakterier, som kan förändras genom rekombinant DNA-teknik för framställning av interferon och varifrän interferon därefter kan extraheras med användning av förfarandet enligt uppfinningen är IS. coli, Bacillus subtil is, Actino-mycetes och liknande. De föredragna bakterierna är JS. coli och Bacillus subtil is, E, coli är mest föredragen.

Förfarandet enligt uppfinningen kan särskilt användas med bakterier, som uttrycker leukocytinterferon; en sädan bakterie kan exempelvis framställas enligt den metod som angives av Nagata et ai., "Nature", volym 284, sidorna 316-320 (1980). Förfarandet enligt uppfinningen kan även användas med bakterier som uttrycker fibroblastinterferonj sädana bakterier kan exempelvis framställas enligt det förfarande som angives av Derynck et ai., "Nature", volym 287, sidorna 193-197 (1980). Förfarandet enligt uppfinningen är särskilt användbart med bakterier som uttrycker humant leukocytinterferon.

Leukocyt- och fibroblastinterferoner har även omnämnts med referens tili nomenklaturen IFN-alfa resp IFN-beta. Var och en av de ovannnännda typerna av interferon kan även ha oi ikä former. Jämför exempelvis den britiska patentskriften 4 70927 nr 2.037.296A, publiceras den 9 juli 1980; Streuli et^ al. , "Science", volym 209, sidorna 1343-1347 (1980); Goedel et al,, "Nature", volym 287, sidorna 411-416 (1981); och Streuli et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., volym 78, sidorna 2848-2852 (1981) (Biochemstry).

Uppfinningen belyses närmare medelst följande exempel.

Exempel

Tillsätt 100 ml av ett inoculum av interferonuttryckande HB-101 E. coli innehSllande plasmiden Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-SN-35 eller ett derivat därav, framställt enligt Nagata et. _al., "Nature", volym 284, sidorna 316-320 (1980 ), till 9,9 liter odlingsvätska i en 14 liters fermetor vid 37°C. Odlingsvätskan framställes av 330 gram cerelos, 310 gram jästextrakt, 50 gram KH2P04, 10 gram MgS04*7H20 och vatten till 9,9 liter.

Upprätthäll pH vid 7,0 och temperaturen vid 37°C under luftning och omrörning av blandningen tills odlingens tillväxt nSr sen exponentiell fas (5-7 timmar). Tillsätt därefter 10 N fosfor-syra till suspensionen av E. coli i fermentorn tili pH 2,1 och Iät blandningen stä i en timme under upprätthällande av temperaturen vid 25 - 37°C. Kontrollera periodiskt blandningens pH och om sä erfordras inställes detsamma pä 2,1. Skörda därefter fermentorns innehäll och centrifugera detta vid ungefär 5000 g eller däröver.

Skörda bakteriepelleten efter centrifugering. Ätersuspendera pelleten säsom en ungefär 10 procentig vikt/volym suspension av bakterier i en vattenlösning som är 50 mM Tris(2-amino-2-hydroximetyl-1,3-propanediol) och 0,15 M natriumklorid (pH 7,5) och tillsätt 3 N natriumhydroxid tili ett pH av ungefär 7,3.

5 70927 (Om den tillgängliga centrifugen ger en uppslamning snarare an en pellet är det kanske inte nödvändigt att ätersuspendera produkten i den ovannämnda vattenlösningen och man kan fort-sätta med att tillsätta 3 N natriumhydroxid till uppslamningen). Blanda den erhällna suspensionen i en timme vid 4°C och därefter centrifugera vid 5000 g eller däröver. Bortkasta pelleten.

Den överflytande vätskan innehSller extraherat interferon, speciellt alfa-1 interferon (IFN-alfa-1), sSsom definierats av Streuli et £l., "Science", volym 209, sidorna 1343-1347 (1980), som kan ytterligare renas eller koncentreras. Närvaron av interferon i den överflytande vätskan indikeras enligt metoder angivna i "The Interferon System" av William E. Stewart II, Springer Verlag, New York, sidorna 134-156 (1979).

Efter användning av en plasmid som uttrycker alfa-2 interferon, säsom definierats av Streuli et <al., "Science", volym 209, sidorna 1343-1347 (1980), extraherar man pS liknande sätt sädant interferon ur odlingsvätskan.

Efter användning av en plasmid som uttrycker nägon annan typ av leukocytinterferon (exempelvis ett interferon utvalt bland interferoner som definieras i den britiska patentansökningen nr 2 037 296A, publicerad den 9 juli 1980) extraherar man p£ liknande sätt detta interferon ur odlingsvätskan.

Efter användning av en plasmid uttryckande fibroblastinter-feron extraherar man pä liknande sätt detta interferon ur odlingsvätskan.

Derivat av den ovannämnda plasmiden Z-pBR 322 (Pst/HcIF-SN-35 som uttrycker IFN-alfa-1 mer effektivt kan framställas. Förfarandet enligt uppfinningen är likaledes tillämpligt pä extraktion av interferon ur bakterier innehällande sädana plasmider.

Claims (6)

1. Förfarande för framställning av en lösning av interferon ur interferonuttryckande bakterieceller, känneteck-n a t därav, att man surgör en första suspension av inter-feronhaltiga bakterieceller, avlägsnar väsentligen ali suspen-deringsvätska frän cellerna, framställer en andra suspension av de surgjorda cellerna, neutraliserar eller gör svagt basisk denna andra suspension och separerar den interferonhaltiga vätskan fr&n de suspenderade cellerna.

2. Förfarande för tillvaratagande av interferon frSn interferonuttryckande bakterieceller innehällande vätska, k ä n n -etecknat därav, att man surgör en första suspension av interferonhaltiga bakterieceller, avlägsnar väsentligen ali suspenderande vätska frSn cellerna, framställer en andra suspension av de surgjorda cellerna, neutraliserar eller gör svagt basisk denna andra suspension, separerar den interferonhaltiga vätskan frän de suspenderade cellerna, och extraherar interferonet pä känt sätt frän den angivna vätskan.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, känne-t e c k n a t därav, att den första suspensionen surgöres med en stark mineralsyra, t.ex. svavelsyra eller fosforsyra, företrädesvis tili ett pH-värde av 1,3 - 4, särskilt tili ett pH-värde av 2,0 - 2,5.

4. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-3, känne-t e c k n a t därav, att den andra suspensionen neutraliseras eller görs basisk med kaliumhydroxid eller natriumhydroxid, företrädesvis tili ett pH-värde av ungefär 7,0 - 8,0, särskilt ungefär 7,2 - 7,6.

5. Förfarande enligt nägot av patentkraven 1-4, känne- 7 70927 t e c k n a t därav, att bakteriecellerna utgöras av E. coli-celler.

6. Förfarande enligt n&got av patentkraven 1-5, k ä n n e -t e c k n a t därav, att interferonet utgöres av leukocytinter-feron.