DK158475B - Fremgangsmaade til fremstilling af interferon eller en interferonoploesning fra interferonproducerende bakterier. - Google Patents

Description

DK 158475B

Den foreliggende opfindelse angår udvindingen af interferon af interferon-producerende bakterier.

Selv om det i vide kredse menes, at interferon er af stor betydning som potentielt antiviralt middel og/ 5 eller middel mod cancer, har manglen på og den høje pris på interferon opnået ud fra naturlige kilder i væsentlig grad forsinket klinisk prøvning og en udbredt anvendelse af interferon. Rekombinant-DNA teknik er blevet benyttet til at frembringe bakterier, der er i stand til at produ-10 cere interferon (som udviser interferon-ekspressivitet); se f.eks. Nagata et al., "Nature1, bd. 284, 316-320 (1980). Gæring af sådanne bakterier ventes at give store mængder interferon ved væsentlig lavere omkostninger end det ville være muligt ved anvendelse af naturlige 15 kilder for interferon. Interferon til klinisk anvendelse må imidlertid være af høj renhed, og må ikke være forurenet med cellebestanddele eller cellerester fra de interferon-producerende bakterier. Forurening med sådanne urenheder ville kunne resultere i uheldige 20 reaktioner eller i ikke-reproducerbare prøvningsresultater. Udvinding af interferon af celler af interferonproducerende bakterier, med tilstrækkelig høj renhed til klinisk brug,har således frembudt et stort problem.

Der er nu overraskende fundet en forbedret 25 fremgangsmåde til udvinding af interferon af interferonproducerende bakterier.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til opnåelse af en opløsning af interferon ud fra interferon-producerende baktericeller bestående 30 i, at man syrner en første suspension af de interferon-holdige bakterieceller, fjerner i det væsentlige al suspenderingsvæsken fra cellerne, fremstiller en anden suspension af de syrnede celler, neutraliserer denne anden suspension eller gør den svagt basisk og skiller 35 den interferonholdige væske fra de suspenderede celler.

Om ønsket kan den resulterende væske videreforarbejdes, især ved udvinding af interferonet fra væsken, f.eks.

DK 158475B

2 ved kendte metoder.

For nemheds skyld vil alene ordet "neutraliserer" blive benyttet i den følgende del af beskrivelsen i stedet for "neutraliserer eller gør svagt basisk".

5 Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende op findelse frigives interferon overraskende fra cellerne ved neutralisation af suspensionen af syrnede celler, uden at der kræves mekanisk eller enzymatisk sprængning af celleoverfladen. Denne fremgangsmåde tillader 10 effektiv udvinding af interferon på en måde, der på afgørende måde formindsker forurening med celle-bestanddele og gør efterfølgende rensningstrin lettere og mindre kostbare.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen syrnes su-15 spensionen af interferon-producerende celler, der kan være i en gæringstank, fortrinsvis til en pH-værdi på ca. 1,3- 4,0, mere fordelagtigt til en pH-værdi på ca. 2,0-2,5.

Eksempler på egnede syrer, der kan benyttes ved syrningstrinet, er stærke syrer, specielt uorganiske syrer, såsom 20 saltsyre, salpetersyre, svovlsyre og phosphorsyre. Det foretrækkes imidlertid i almindelighed ikke at benytte syrer (såsom saltsyre), der kan korrodere gæringsudstyret, der benyttes ved dyrkningen af cellerne. Svovlsyre og phos-phorsyre foretrækkes derfor især. De ovennævnte suspende-25 ringsmedier er fortrinsvis vandige.

Det temperaturområde indenfor hvilket bakteriecellerne behandles med syre bør ligge fra ca. stuetemperatur (dvs. ikke lavere endl5°C) til ca. 40°C. Hvis temperaturen er for lav, vil bakterierne ikke dræbes 30 hurtigt nok under syrebehandlingen. Maksimumstemperaturen er ca. 40°C, idet interferonet vil kunne nedbrydes ved højere temperaturer.

Efter at cellesuspensionen er blevet syrnet, fjernes cellerne fra væsken, fortrinsvis ved centri-35 fugering. Hvis cellerne centrifugeres til dannelse af en pellet, må de resuspenderes før neutralisations-trinet. Hvis centrifugen er beregnet til anvendelse af en del af suspenderingsvæsken til dannelse af en 3

DK 158475B

slam af de centrifugerede celler, kan der eventuelt være en tilstrækkelig væskemængde i slammen til,at man kan gå videre til neutralisationstrinet uden re-suspendering af cellerne. Ordet "suspension",som her 5 benyttet, omfatter en sådan slam.

Cellesuspensionen neutraliseres fortrinsvis til en pH-værdi på ca. 7,0 til 8,0, især 7,2 til 7,6.

Eksempler på egnede baser, der kan benyttes ved neutralisationstrinet, er kaliumhydroxid og natriumhydroxid.

10 Eksempler på bakterier, der kan ændres ved re- kombinant-DNA teknik, så de producerer interferon, og hvoraf interferon derefter kan udvindes ved anvendelse af den foreliggende fremgangsmåde, er E. coli,

Bacillus subtilus, actinomyceter og lignende. De fore-15 trukne bakterier er E. coli og Bacillus subtilis.

E. coli foretrækkes i særlig grad.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan især benyttes i forbindelse med bakterier, der producerer leucocytinterferon. Sådanne bakterier kan 20 f.eks. fremstilles ved den af Nagata et al. beskrevne metode,"Nature", bd. 284, 316-320 (1980). Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan også benyttes i forbindelse med bakterier, der producerer fibroblastinterfe-ron. Sådanne bakterier kan f.eks. fremstilles ved 25 Derynck et al.'s metode,"Nature", bd. 287, 193-197 (1980). Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er især værdifuld i forbindelse med bakterier, der producerer humant leucocytinterferon.

Man har også betegnet leucocyt- og fibroblast-30 interferoner med nomenklaturen henholdsvis IFN-α og IFN-β. Hver af de ovennævnte typer af interferoner kan også have forskellige former. Se f.eks. UK patentansøgning 2.037.296A, publiceret 9. juli 1980; Streuli et al., "Science", bd. 209, s. 1343-1347 (1980); Goedel et 35 al., "Nature, bd. 287, s. 411-416 (1981); og Streuli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., bd. 78, s. 2848-2852 (1981) (Biochemistry).

DK 158475 B

4

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal belyses nærmere gennem følgende eksempel.

Eksempel 5 100 ml af et inoculum af interferon-producerende HB-101 E. coli indeholdende plasmidet Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-SN-35 eller et derivat deraf, fremstillet ifølge Nagata et al.'s metode, "Nature", bd. 284, 316-320 (1980), sættes til 9,9 liter gæringsmedium 10 i en 14 liters gæringstank ved 37°C. Mediet er fremstillet ud fra 330 g cerelose, 310 g gærekstrakt, 50 g KH2P04, 10 g MgS04.7H20 og vand indtil 9,9 liter.

pH-Værdien holdes ved 7,0 og temperaturen ved 37°C, medens blandingen luftes og omrøres,indtil kultu-15 rens vækst når den sidste del af exponentialkurven (5 til 7 timer). Derpå tilsættes 10 N phosphorsyre til E. coli suspensionen i gæringstanken, indtil der er opnået en pH-værdi på 2,1, og man lader blandingen henstå i 1 time, idet temperaturen holdes ved 25 til 20 37°C. Blandingens pH-værdi kontrolleres periodevis og genindstilles om nødvendigt på 2,1. Derpå høstes gæringstankens indhold og centrifugeres ved ca. 5000 x g eller derover.

Efter centrifugeringen høstes bakterie-pelleten.

25 Den resuspenderes som en ca. 10% vægt/volumen suspension af bakterier i en vandig opløsning, der er 50 mM tris (2-amino-2-hydroxymethyl-l,3-propandiol) og 0,15 M natriumchlorid (pH 7,5), og der tilsættes 3 M natriumhydroxid, indtil der er opnået en pH-værdi på ca. 7,3.

30 (Hvis den tilgængelige centrifuge frembringer en slam snarere end en pellet, er det eventuelt ikke nødvendigt at gensuspendere produktet i ovennævnte vandige opløsning, men man kan umiddelbart gå videre med tilsætning af 3 N natriumhydroxid til slammen). Den resulterende 35 suspension blandes i 1 time ved 4°C og centrifugeres derpå ved 5000 x g eller derover. Pelleten bortkastes. Supernatanten indeholder ekstraheret interferon, specielt al interferon (INF-al) som defineret af / 5 DK 158475 Β

Streuli et al.f "Science", bd. 209, s. 1343-1347 (1980), der kan renses yderligere eller koncentreres. Tilstedeværelsen af interferon i supernatanten fastslås ved fremgangsmåder beskrevet i "The Interferon System" af 5 William E. Stewart II, Springer Verlag, New York, s.

134-156 (1979).

På lignende måde udvinder man, efter anvendelse af et plasmid, der producerer a2-interferon, som defineret af Streuli et al., "Science", bind 209, side 1343-10 1347 (1980), sådant interferon fra dyrkningsmediet.

Efter anvendelse af et plasmid, der producerer en anden type leucocytinterferon (for eksempel et interferon valgt blandt de i UK patentansøgning 2.037.269A, publiceret 9. juli 1980, definerede interferoner), 15 udvinder man på lignende måde sådant interferon fra dyrkningsmediet.

På lignende måde udvindes, efter anvendelse af et plasmid, der producerer fibroblastinderferon, dette interferon fra dyrkningsmediet.

20 Der kan fremstilles derivater af ovennævnte plas mid Z-pBR 322 (Pst)/HcIF-SN-35, der producerer IFN- 1 mere effektivt. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ligeledes anvendelig til udvinding af interferon fra bakterier indeholdende sådanne plasmider.

25 30 1

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til opnåelse af en opløsning af interferon ud fra interferon-producerende bakterieceller, kendetegnet ved, at man syrner en første su- 5 spension af interferonholdige bakterieceller, fjerner i det væsentlige al suspenderingsvæsken fra cellerne, fremstiller en anden suspension af de syrnede celler, neutraliserer denne anden suspension eller gør den svagt basisk og skiller den interferonholdige væske fra de su- 10 spenderede celler.

2. Fremgangsmåde til opnåelse af interferon ud fra interferon-producerende bakterieceller, kendetegnet ved, at man syrner en første suspension af interferonholdige bakterieceller, fjerner i det væsentli- 15 ge al suspenderingsvæsken fra cellerne, fremstiller en anden suspension af de syrnede celler, neutraliserer denne anden suspension eller gør den svagt basisk, skiller den interferonholdige væske fra de suspenderede celler og udvinder interferonet af nævnte væske.

3. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den første suspension syrnes med en stærk uorganisk syre.

4. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at den 25 første suspension syrnes med svovlsyre eller phosphor-syre.

5. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at den første suspension får en pH-værdi på ca. 1,3 til 4,0.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendeteg net ved, at den første suspension får en pH-værdi ca. 2,0 til 2,5.

7. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at den anden 35 suspension neutraliseres eller gøres svagt basisk med kaliumhydroxid eller natriumhydroxid.

8. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de fore- DK 158475 B gående krav, kendetegnet ved, at den anden suspension får en pH-værdi på 7,0 til 8,0.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at suspensionen får en pH-værdi på 7,2 til 5 7,6.

10. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at bakteriecellerne er E. coli celler.

11. Fremgangsmåde ifølge et vilkårligt af de 10 foregående krav, kendetegnet ved, at interferonet er leucocytinterferon.