JPS6258996A - 遺伝子組換え体からの生産物の回収方法 - Google Patents
遺伝子組換え体からの生産物の回収方法Info
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- JPS6258996A JPS6258996A JP19607985A JP19607985A JPS6258996A JP S6258996 A JPS6258996 A JP S6258996A JP 19607985 A JP19607985 A JP 19607985A JP 19607985 A JP19607985 A JP 19607985A JP S6258996 A JPS6258996 A JP S6258996A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、遺伝子組換え体により生産された有用タンパ
ク質を回収する方法に関する。
ク質を回収する方法に関する。
近年、遺伝子組換え体を用いた各種の蛋白質、ポリペプ
チドの生産が盛んになった。この方法において、しばし
ば遭遇する問題は、生産物が宿主内に蓄積し、それが凝
固・不溶化することである。そのため、生産された蛋白
質、ポリペプチドの効率的な回収方法が必要とされてい
る。
チドの生産が盛んになった。この方法において、しばし
ば遭遇する問題は、生産物が宿主内に蓄積し、それが凝
固・不溶化することである。そのため、生産された蛋白
質、ポリペプチドの効率的な回収方法が必要とされてい
る。
一方、大腸菌等の遺伝子組換え体を用い、蛋白質、ポリ
ペプチドの生産を工業的規模で製造する場合は、バイオ
ハザード対策として培養物の宿主生物を失活または死滅
させてから回収することが必要とされている。宿主生物
からの生産物の回収方法としては、従来３つの方法で行
われている。第１の方法は、培養した宿主生物を熱、酸
処理などの方法で物理的封じ込め条件下で失活させる。
ペプチドの生産を工業的規模で製造する場合は、バイオ
ハザード対策として培養物の宿主生物を失活または死滅
させてから回収することが必要とされている。宿主生物
からの生産物の回収方法としては、従来３つの方法で行
われている。第１の方法は、培養した宿主生物を熱、酸
処理などの方法で物理的封じ込め条件下で失活させる。
失活した宿主生物を集め、必要とする生産物を抽出・回
収する。第２の方法は、培養後期に洗剤、酵素、抗生物
質等を添加し、宿主生物を溶解失活させ、生産物を抽出
する。第３の方法は、失活処理なしで物理的封じ込め条
件下で培養した宿主生物を集め、生産物を抽出する。こ
れらの方法はいずれもいくつかの問題を含んでいる。第
１の方法は、熱または、酸処理を行うことにより、宿主
生物の失活と同時に目的とする生産物の失活、または回
収率の低下が生じる。第２の方法は、目的とする生産物
を医薬品または食品に利用する場合、洗剤、抗生物質の
完全除去が困難であり品質の保証ができない。また酵素
を用いる場合は、酵素自体高価であること、酵素タンパ
ク買の添加による目的生産物の精製が困難になること、
酵素中伸では、宿主生物の失活が不完全であり、洗剤等
の［１川が必要であることなどの問題が生じる。
収する。第２の方法は、培養後期に洗剤、酵素、抗生物
質等を添加し、宿主生物を溶解失活させ、生産物を抽出
する。第３の方法は、失活処理なしで物理的封じ込め条
件下で培養した宿主生物を集め、生産物を抽出する。こ
れらの方法はいずれもいくつかの問題を含んでいる。第
１の方法は、熱または、酸処理を行うことにより、宿主
生物の失活と同時に目的とする生産物の失活、または回
収率の低下が生じる。第２の方法は、目的とする生産物
を医薬品または食品に利用する場合、洗剤、抗生物質の
完全除去が困難であり品質の保証ができない。また酵素
を用いる場合は、酵素自体高価であること、酵素タンパ
ク買の添加による目的生産物の精製が困難になること、
酵素中伸では、宿主生物の失活が不完全であり、洗剤等
の［１川が必要であることなどの問題が生じる。
第３の方法は、政府の規制に基づく設備は高価となり、
天吊生産には適切でない。
天吊生産には適切でない。
〔発明が解決しようとする問題点）
本発明の目的は、これら従来の方法の問題点を解決し、
眉仏子ＩＩＩ換え体の生産物をダ１率良く回収すること
にある。さらに本発明（ま、宿主生物を失活または死滅
さけてから生産物を回収する必要がある場合は、該宿主
生物を失活または死滅させ、かつ目的生産物をそのち１
γＪ品の品７１に影響を与えずに効：＃良く回収づるこ
とら目的とする。
眉仏子ＩＩＩ換え体の生産物をダ１率良く回収すること
にある。さらに本発明（ま、宿主生物を失活または死滅
さけてから生産物を回収する必要がある場合は、該宿主
生物を失活または死滅させ、かつ目的生産物をそのち１
γＪ品の品７１に影響を与えずに効：＃良く回収づるこ
とら目的とする。
〔問題点を解決するための手段）
上記の目的は以下の本発明により達成される。
すなわち本発明は、遭伝子組換え体により生成される生
産物を回収するに際し、該遺伝子組換え体をカオトロピ
ックイオンを含む溶液で９８即することを特徴とする１
伝子組換え体からの生産１力の回収方法である。
産物を回収するに際し、該遺伝子組換え体をカオトロピ
ックイオンを含む溶液で９８即することを特徴とする１
伝子組換え体からの生産１力の回収方法である。
遺伝子組換え体とは、有用蛋白質をコードするＤＮＡ断
片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に組み
込まれた弁用ベクターにより、宿主生物を形質転換した
ものであり、公知の方法、たとえばＱｏｅｄｄｅｌ、
Ｄ、 ｖ、 ｅｔ ａｌ 。
片が翻訳開始信号とともに、プロモーター制御下に組み
込まれた弁用ベクターにより、宿主生物を形質転換した
ものであり、公知の方法、たとえばＱｏｅｄｄｅｌ、
Ｄ、 ｖ、 ｅｔ ａｌ 。
Ｎ ｕｃｌｅｉｃ Δａｉｄｓ Ｒｅｓ、、８．４
０５７ （１９８０） ： Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ 、
Ｐ、 ｅｔ ａｔ 、 Ｎａｔｕｒｅ 。
０５７ （１９８０） ： Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ 、
Ｐ、 ｅｔ ａｔ 、 Ｎａｔｕｒｅ 。
２９８．３４７−３５０ （１９８２）：Ｊｏｅｌ 。
Ｈ，ｅｔ ａｌ 、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、、１１ 。
Ｒｅｓ、、１１ 。
６８７−７０６ （１９８３）等に記載の方法により作
製することができる。
製することができる。
遺伝子組換え体の宿主生物としては、特に限定されない
が、具体的にはＥ、 ｃｏｌｉ、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｊｅｒｉｕｉ、 ３ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ等の胞子形成能のない細菌、５ａｃｃｈａ
ｒｏｌｌｌｙｃｅｓ、 Ｃａｎｄｉｄａ等の酵母、マウ
ス１−細胞、ＣＨＯＩ胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊膜由来
ＦＬｉｌｌｌ胞等の動物細胞が挙げられる。
が、具体的にはＥ、 ｃｏｌｉ、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｊｅｒｉｕｉ、 ３ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓ等の胞子形成能のない細菌、５ａｃｃｈａ
ｒｏｌｌｌｙｃｅｓ、 Ｃａｎｄｉｄａ等の酵母、マウ
ス１−細胞、ＣＨＯＩ胞、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊膜由来
ＦＬｉｌｌｌ胞等の動物細胞が挙げられる。
生産物とは遺伝子組換え体により生産できるものであれ
ば特に限定されないが、たとえば各種インターフェロン
（α、β、γ）、インターロイキン２等が挙げられる。
ば特に限定されないが、たとえば各種インターフェロン
（α、β、γ）、インターロイキン２等が挙げられる。
本発明は、遺伝子組換え体を培養して有用タンパク質を
産生させた後に、カオトロピックイオンを含む溶液で処
理し、必要の１９合は宿主生物を失活もしくは死滅させ
て、生産物を回収することを特徴とする。ここにカオト
ロピックイオンとは、水溶液中の水の構造を破壊し、疎
水性物質と水が接触した時に起こる水のエントロピーの
減少を抑制し、疎水性物質の溶解度を高める性質を示す
イオンである。（［蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武
−１山下仁平編、１９８１年 南江堂）。この中でも本
発明では上記性質の強いカオトロピックイオンが好まし
く、たとえばトリブロモ酢酸イオン、トリクロル酢酸イ
オン、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イ
オン、ジクロル酢酸イオン、グアニジウムイオン イオンまたはマグネシウムイオン等が好ましく用いられ
る。特に、トリブロモ酢酸イオン、トリクロル酢酸イオ
ン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロル酢
酸イオン、ヨウ素イオン、グアニジウムイオンが好まし
い。これらのカオトロピックイオンは塩として使用する
のが好ましく、らちろんカオトロピックイオン同志の塩
でも良い。これらの塩は一種でも二種以上を混合して使
用しても良い。
産生させた後に、カオトロピックイオンを含む溶液で処
理し、必要の１９合は宿主生物を失活もしくは死滅させ
て、生産物を回収することを特徴とする。ここにカオト
ロピックイオンとは、水溶液中の水の構造を破壊し、疎
水性物質と水が接触した時に起こる水のエントロピーの
減少を抑制し、疎水性物質の溶解度を高める性質を示す
イオンである。（［蛋白質・酵素の基礎実験法」堀尾武
−１山下仁平編、１９８１年 南江堂）。この中でも本
発明では上記性質の強いカオトロピックイオンが好まし
く、たとえばトリブロモ酢酸イオン、トリクロル酢酸イ
オン、チオシアン酸イオン、ヨウ素イオン、過塩素酸イ
オン、ジクロル酢酸イオン、グアニジウムイオン イオンまたはマグネシウムイオン等が好ましく用いられ
る。特に、トリブロモ酢酸イオン、トリクロル酢酸イオ
ン、チオシアン酸イオン、過塩素酸イオン、ジクロル酢
酸イオン、ヨウ素イオン、グアニジウムイオンが好まし
い。これらのカオトロピックイオンは塩として使用する
のが好ましく、らちろんカオトロピックイオン同志の塩
でも良い。これらの塩は一種でも二種以上を混合して使
用しても良い。
使用するカオトロピックイオンの濃度は０゜１Ｍ以上が
好ましく、特に２〜６Ｍが好ましい。
好ましく、特に２〜６Ｍが好ましい。
遺伝子組換え体をカオトロピックイオンを含む溶液で処
理する方法は、たとえば生産される有用タンパク質が宿
主生物内に蓄積するものの場合は、次の様にして行う。
理する方法は、たとえば生産される有用タンパク質が宿
主生物内に蓄積するものの場合は、次の様にして行う。
培養増殖させた遺伝子１１換え体を集め、カオトロピッ
クイオンを含む溶液１こ懸濁する。ホモジナイザー処理
、音波処理、加圧破壊処理、温情処理などの物理機械的
処理により破砕する。
クイオンを含む溶液１こ懸濁する。ホモジナイザー処理
、音波処理、加圧破壊処理、温情処理などの物理機械的
処理により破砕する。
破砕液を遠心分離により上清と沈澱に分ける。
カオトロピックイオンの効果により、上清に目的の生産
物を効率良く回収できる。遺伝子組換え体を破砕した後
カオトロピックイオンを添加することもできる。
物を効率良く回収できる。遺伝子組換え体を破砕した後
カオトロピックイオンを添加することもできる。
また、宿主生物を失活または死滅させる必要のある場合
は、カオトロピックイオンを用いて次の様に予め失活ま
たは死滅処理をしてから生産物を回収する。まず遺伝子
組換え体を集め、カオトロピックイオンを含む溶液に懸
濁する。
は、カオトロピックイオンを用いて次の様に予め失活ま
たは死滅処理をしてから生産物を回収する。まず遺伝子
組換え体を集め、カオトロピックイオンを含む溶液に懸
濁する。
Ｏ〜５０℃１０分間以上（通常１〜３時間）放置すると
失活または死滅する。使用するカオトロピックイオンの
種類、処理温度及び処理時間は、遺伝子組換え体の特性
、及び生産物の安定性により調節する。本発明方法は、
高温はもちろん、低温においても遺伝子組換え体を失活
・死滅させることができる点に特色がある。失活・死滅
後そのまま破砕抽出処理を行うことができる。失活・死
滅接地の抽出溶媒と交換することもできるが、失活・死
滅処理に用いたカオトロピックイオンを抽出回収のため
に使用できるため、失活・死滅処理後そのまま破砕抽出
処理する方法は本発明の好ましい方法である。
失活または死滅する。使用するカオトロピックイオンの
種類、処理温度及び処理時間は、遺伝子組換え体の特性
、及び生産物の安定性により調節する。本発明方法は、
高温はもちろん、低温においても遺伝子組換え体を失活
・死滅させることができる点に特色がある。失活・死滅
後そのまま破砕抽出処理を行うことができる。失活・死
滅接地の抽出溶媒と交換することもできるが、失活・死
滅処理に用いたカオトロピックイオンを抽出回収のため
に使用できるため、失活・死滅処理後そのまま破砕抽出
処理する方法は本発明の好ましい方法である。
〔発明の効果］
本発明は、遺伝子組換え体の生産物を簡便な方法で効率
良く回収することができ、また目的生産物を高力価で回
収できるという優れた方法である。また、宿主生物を失
活・死滅させて回収する場合は、同一溶液で処理できる
ため非常に簡便な方法である。
良く回収することができ、また目的生産物を高力価で回
収できるという優れた方法である。また、宿主生物を失
活・死滅させて回収する場合は、同一溶液で処理できる
ため非常に簡便な方法である。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、こ
れにより本発明の有用性が限定されるものではない。
れにより本発明の有用性が限定されるものではない。
実施例１
ヒ１へβ型インターフェロン発現プラスミドを保持する
大引１．Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｌ）ＫＭ６を、
２．５Ｌ容ミニジヤーを用いて培養を行った。ｐＫＭ６
は、プラスミドｐＫＴ１−９の５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配
列を修飾することにより得た。ｐＫＴｌ−９は、Ｔｕｆ
Ｂプロモーター支配下にヒトインターフェロン−βポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ断片が組み込まれた発現プ
ラスミドｐＴｕｓ Ｉ ＦＮβ−５（谷ロ、生化学５４
，３６３ （１９８２））を、ＥｃｏＲＩとＣ１ａｌで
処理しＴ ｕｆ’Ｂプロモーター断片を除７．５４９
（１９７６））由来のＴｒｐプロモーター、ＳＤ配列を
含むＥｃｏＲｌ−Ｔａｉｌ断片を挿入することにより得
た。ｐ Ｋ Ｔ １−９の５Ｄ−ＡＴＧ間塩基配列は、
ＡＧＧＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧであるが、本配列について
合成りＮＡオリゴマーを用いて修飾を加え、ＡＧＧＴＴ
ＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧとしたものがｐＫＭ６である。
大引１．Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｌ）ＫＭ６を、
２．５Ｌ容ミニジヤーを用いて培養を行った。ｐＫＭ６
は、プラスミドｐＫＴ１−９の５Ｄ−ＡＴＧ間の塩基配
列を修飾することにより得た。ｐＫＴｌ−９は、Ｔｕｆ
Ｂプロモーター支配下にヒトインターフェロン−βポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ断片が組み込まれた発現プ
ラスミドｐＴｕｓ Ｉ ＦＮβ−５（谷ロ、生化学５４
，３６３ （１９８２））を、ＥｃｏＲＩとＣ１ａｌで
処理しＴ ｕｆ’Ｂプロモーター断片を除７．５４９
（１９７６））由来のＴｒｐプロモーター、ＳＤ配列を
含むＥｃｏＲｌ−Ｔａｉｌ断片を挿入することにより得
た。ｐ Ｋ Ｔ １−９の５Ｄ−ＡＴＧ間塩基配列は、
ＡＧＧＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧであるが、本配列について
合成りＮＡオリゴマーを用いて修飾を加え、ＡＧＧＴＴ
ＴＧＡＡＡＴＣＧＡＴＧとしたものがｐＫＭ６である。
培養基は、リンＦｉ１カリウム０．３％、リン酸２ナト
リウム０．６％、塩化ナトリウム０゜５％、塩化アンモ
ニウム０．１％、グルコース０．５％、カザミノ酸０．
５％、硫酸マグネシウム１ ｍＭ、ビタミンＢ＋６μ
（１／ｒｌｄ！、アンピシリン５０μ（１／ｄを用いた
。１２の培地を仕込み、撹拌数６０Ｏｒｐｍ、通気ｆｉ
１ ｕｕＭ、２５℃の条件下で運転した。トリプトフ
ァンオペロンの誘導物質であるインドールアクリル酸を
加え、グルコースとカザミノＭ混液を添加しながら６０
時間培養した。培養菌体をｉｏ、ｏｏ。
リウム０．６％、塩化ナトリウム０゜５％、塩化アンモ
ニウム０．１％、グルコース０．５％、カザミノ酸０．
５％、硫酸マグネシウム１ ｍＭ、ビタミンＢ＋６μ
（１／ｒｌｄ！、アンピシリン５０μ（１／ｄを用いた
。１２の培地を仕込み、撹拌数６０Ｏｒｐｍ、通気ｆｉ
１ ｕｕＭ、２５℃の条件下で運転した。トリプトフ
ァンオペロンの誘導物質であるインドールアクリル酸を
加え、グルコースとカザミノＭ混液を添加しながら６０
時間培養した。培養菌体をｉｏ、ｏｏ。
Ｘ（１５分間の遠心分離操作により集めた。グリセロー
ル１０％、エチレングリコール２０％を含むトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に４℃に冷却し、菌体を０Ｄ５
５０ ｎｍ１００となるよう懸濁した。菌体を超音波処
理により破砕し、遠心分離を行い、菌体破砕物を回収し
た。この菌体破砕物懸濁液に各種カオトロピックイオン
を添加した。カオトロピックイオンとして、４Ｍトリク
ロル酢酸ナトリウム塩、４Ｍチオシアン酸ナトリウム塩
、４Ｍジクロル酢酸ナトリウム塩を用い、対照としてカ
オトロピックイオンを添加しないものを使用した。よく
撹拌した後遠心分離し、ヒトβ型インターフェロンを回
収したヒトβ型インターフェロンは、ヒト羊膜由来ＦＬ
細胞と■ＳＶを用いたＣＰ２５０法を用いて定量した。
ル１０％、エチレングリコール２０％を含むトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）に４℃に冷却し、菌体を０Ｄ５
５０ ｎｍ１００となるよう懸濁した。菌体を超音波処
理により破砕し、遠心分離を行い、菌体破砕物を回収し
た。この菌体破砕物懸濁液に各種カオトロピックイオン
を添加した。カオトロピックイオンとして、４Ｍトリク
ロル酢酸ナトリウム塩、４Ｍチオシアン酸ナトリウム塩
、４Ｍジクロル酢酸ナトリウム塩を用い、対照としてカ
オトロピックイオンを添加しないものを使用した。よく
撹拌した後遠心分離し、ヒトβ型インターフェロンを回
収したヒトβ型インターフェロンは、ヒト羊膜由来ＦＬ
細胞と■ＳＶを用いたＣＰ２５０法を用いて定量した。
結果を第１表に示す。
第１表
実施例２
ヒトインターロイキン２ （ＩＬ−２＞を発現するプラ
スミドを保持する大腸菌、Ｅ、ＧＯＩｉＨＢ１０１／ｐ
Ｔｈ ＩＬ２−ΔＳＢを培養し、ヒトインターロイキ
ン２の生産を行った。ｐＴｈ １１２−Δ８Ｂ（特願昭
６Ｏ−８８８９６）は、ＩＬ−２生産を誘導したヒト扁
桃由来リンパ球（Ｖ ｉ １ｃｈｅｋらｌ ｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ｌ ＩＩ１ｍｕｎｉｔｙ３−４ １３
１ （１９８１））より岡山らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
３−２８０ （１９８３））に従ってｍ−ＲＮＡを調
製し、ｃＤＮＡを作製した。この、ｃＤＮＡライフ ＝
／ ’）−より、３．Ａ、 ＲＯ３Ｏｎｂｅｒｇらが示
しテイル手法により（３ｃｉｅｎｃｅ、 ２２３ 、１
４１２（１９８４））、［Ｌ−２ｃＤＮＡを得た。
スミドを保持する大腸菌、Ｅ、ＧＯＩｉＨＢ１０１／ｐ
Ｔｈ ＩＬ２−ΔＳＢを培養し、ヒトインターロイキ
ン２の生産を行った。ｐＴｈ １１２−Δ８Ｂ（特願昭
６Ｏ−８８８９６）は、ＩＬ−２生産を誘導したヒト扁
桃由来リンパ球（Ｖ ｉ １ｃｈｅｋらｌ ｎｆｅｃｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ｌ ＩＩ１ｍｕｎｉｔｙ３−４ １３
１ （１９８１））より岡山らの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
３−２８０ （１９８３））に従ってｍ−ＲＮＡを調
製し、ｃＤＮＡを作製した。この、ｃＤＮＡライフ ＝
／ ’）−より、３．Ａ、 ＲＯ３Ｏｎｂｅｒｇらが示
しテイル手法により（３ｃｉｅｎｃｅ、 ２２３ 、１
４１２（１９８４））、［Ｌ−２ｃＤＮＡを得た。
このＩＬ−２ｃＤＮＡのＨｇ１Ａ Ｉ −ＢａｍＨＩ断
片とｐＫＭ６のＴｒｐプロモーターを含むＣ１ａ連結し
、ｐＴｈ ＩＬ２−ΔＳＢを作製した。
片とｐＫＭ６のＴｒｐプロモーターを含むＣ１ａ連結し
、ｐＴｈ ＩＬ２−ΔＳＢを作製した。
培養は、実施例１の培養基に酵母エキス０゜１％追加す
る以外は、全く同条件で行った。集菌菌懸濁用溶液には
、５０１Ｍトリス塩酸緩衡液ｐＨ８，０を用い、カオト
ロピックイオンとして、７Ｍ塩酸グアニジン、または４
Ｍトリクロル酢酸ナトリウム塩を用いた。懸濁時の菌濃
度はｏＤ５５０２０′とした。抽出方法は実施例１に従
った。抽出液は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８，０
で５０倍希釈した後保存しヒトインターロイキン２の定
量を行った。ＩＬ−２の定量は、ＣＴＬＬｉｉｌ胞を用
い、Ｔ、 １ｙｌＯ３ｌａｎｎの方法（Ｊ 、 （ｍ
ｍｕｎｏｌｏｏｉｃａｌ Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ６５
。
る以外は、全く同条件で行った。集菌菌懸濁用溶液には
、５０１Ｍトリス塩酸緩衡液ｐＨ８，０を用い、カオト
ロピックイオンとして、７Ｍ塩酸グアニジン、または４
Ｍトリクロル酢酸ナトリウム塩を用いた。懸濁時の菌濃
度はｏＤ５５０２０′とした。抽出方法は実施例１に従
った。抽出液は５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８，０
で５０倍希釈した後保存しヒトインターロイキン２の定
量を行った。ＩＬ−２の定量は、ＣＴＬＬｉｉｌ胞を用
い、Ｔ、 １ｙｌＯ３ｌａｎｎの方法（Ｊ 、 （ｍ
ｍｕｎｏｌｏｏｉｃａｌ Ｍ ｅｔｈｏｄｓ ６５
。
５５ （１９８３））に従った。対照としては、末梢血
リンパ球より得た１ｍ−２５０００Ｕ／戒を希釈して用
いた。結果は第２表に示す。
リンパ球より得た１ｍ−２５０００Ｕ／戒を希釈して用
いた。結果は第２表に示す。
第２表
実施例３
ＬＢ培地（バクトドリブトン１％、酵母エキス０．５％
、Ｎａ Ｃ１０，５％、グルコース１％ｐＨ７，０）５
０ｄを５００ｒｄ容バツフル付フラスコに入れ、１２０
℃、１５分間殺菌した。
、Ｎａ Ｃ１０，５％、グルコース１％ｐＨ７，０）５
０ｄを５００ｒｄ容バツフル付フラスコに入れ、１２０
℃、１５分間殺菌した。
これに大腸菌ＨＢ１０１／ｐＢＲ３２２を植菌し、３０
℃１８時間振盪培養した。ＯＤ ５５０は約１２に到達
した。この培養液より菌体を集め、以下の懸濁用溶液を
添加し１０ｄとした。懸濁用溶液はグリセロール１０％
、エチレングリコール２０％を基本とし、各種カオトロ
ピックイオンを添加した。ｐＨは５〜８の範囲で処理し
た。カオトロピックイオンは、４Ｍトリクロル酢酸ナト
リウム塩、４Ｍチオシアン酸ナトリウム塩、４Ｍ塩酸グ
アニジン、４Ｍジクロル酢酢酸ナナトリウム塩用いた。
℃１８時間振盪培養した。ＯＤ ５５０は約１２に到達
した。この培養液より菌体を集め、以下の懸濁用溶液を
添加し１０ｄとした。懸濁用溶液はグリセロール１０％
、エチレングリコール２０％を基本とし、各種カオトロ
ピックイオンを添加した。ｐＨは５〜８の範囲で処理し
た。カオトロピックイオンは、４Ｍトリクロル酢酸ナト
リウム塩、４Ｍチオシアン酸ナトリウム塩、４Ｍ塩酸グ
アニジン、４Ｍジクロル酢酢酸ナナトリウム塩用いた。
よく懸濁した後４℃、１５時間放置した。生菌数を確認
する際、カオトロピックイオンの生育阻害の可能性を除
くため、処理菌体を、生理食塩水で一回洗浄した後、１
０ａｅの生理食塩水に再懸濁した。この懸濁液１１ｎｌ
を滅菌したしＢ培地５０ｄ中に添加し、３０℃２日間培
養を行った。また懸濁液１００μ℃をしＢ寒天培地に塗
布し、３０℃２日間インキュベートした。上記のカオト
ロピックイオンで処理した場合いずれも、生菌は存在し
なかった。
する際、カオトロピックイオンの生育阻害の可能性を除
くため、処理菌体を、生理食塩水で一回洗浄した後、１
０ａｅの生理食塩水に再懸濁した。この懸濁液１１ｎｌ
を滅菌したしＢ培地５０ｄ中に添加し、３０℃２日間培
養を行った。また懸濁液１００μ℃をしＢ寒天培地に塗
布し、３０℃２日間インキュベートした。上記のカオト
ロピックイオンで処理した場合いずれも、生菌は存在し
なかった。
実施例４
実施例３に従い、各種宿主生物の失活・死滅を確認した
。細菌として、Ｅ、 ｃｏｌｉ、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ、 Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ酵母として、３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 、動物細胞として、ヒト羊膜由
来株化細胞であるＦＬ細胞を用いた。
。細菌として、Ｅ、 ｃｏｌｉ、 Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ、 Ｓ ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａ
ｕｒｅｕｓ酵母として、３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 、動物細胞として、ヒト羊膜由
来株化細胞であるＦＬ細胞を用いた。
細菌の培養は、実施例３と同じ＜ＬＢ培地を用いた。酵
母の培養は、グルコース２％、酵母エキス０．２％、ポ
リペプトン０．５ｇ、１Ｍマグネシウム０．０５％、リ
ン酸２水素カリウム０．１％、Ｉ）Ｈ５，６〜５．８の
培地を用い、５００ｄパンフル付三角フラスコに５０ｒ
ｎ１．仕込み、３０℃１８時間培養した。Ｑ （） ５
５０は約２７に到達する。細菌、酵母集菌後、４Ｍトリ
クロル酢酸ナトリウム塩溶液に懸濁（１０” ｃｅｌｌ
Ｓ／ｍ１）し、４℃、１５時間放置した。失活・死滅の
確認は実施例３に従った。いずれも生菌は存在しなかっ
た。
母の培養は、グルコース２％、酵母エキス０．２％、ポ
リペプトン０．５ｇ、１Ｍマグネシウム０．０５％、リ
ン酸２水素カリウム０．１％、Ｉ）Ｈ５，６〜５．８の
培地を用い、５００ｄパンフル付三角フラスコに５０ｒ
ｎ１．仕込み、３０℃１８時間培養した。Ｑ （） ５
５０は約２７に到達する。細菌、酵母集菌後、４Ｍトリ
クロル酢酸ナトリウム塩溶液に懸濁（１０” ｃｅｌｌ
Ｓ／ｍ１）し、４℃、１５時間放置した。失活・死滅の
確認は実施例３に従った。いずれも生菌は存在しなかっ
た。
ヒト羊膜由来株化細胞であるＦＬ細胞を浮遊培養細胞増
殖用培地（Ｅａｇｌｅ′ｓ ＭＥＭ Ｎｏ、４１００
０ｍｊ！、 Ｐｒｅｃｏｌｏｓｔｒｕｎ Ｃａ１ｆ Ｓ
ｅｒｕｍ ５０ｍ１，３％グルタミン溶液１０Ｉｎ１
，７．５％炭酸水素ナトリウム溶液２！Ｍ！、ｐＨ７，
３）で３７℃、スピナー・フラスコで培養した。培養細
胞を９６穴マイクロプレートに１穴当り１０４〜１０５
Ｃｅ１１Ｓとなるようシードし、３７℃、５％炭酸ガス
インキュベーター中で２０〜２４時間培養した。マイク
ロプレート中の培地を除き、４Ｍｔ−リクロル酢酸ナト
リウム塩を含む培地と交換した。３７℃、２時間放置し
た後、トリクロル酢酸を含まない培地と交換し、一度洗
浄した。新しい培地を加え、３７℃２０〜２４時間培養
した。クリスタルバイオレット染色により生細胞数を確
認した。染色されず、生細胞は存在しなかった。
殖用培地（Ｅａｇｌｅ′ｓ ＭＥＭ Ｎｏ、４１００
０ｍｊ！、 Ｐｒｅｃｏｌｏｓｔｒｕｎ Ｃａ１ｆ Ｓ
ｅｒｕｍ ５０ｍ１，３％グルタミン溶液１０Ｉｎ１
，７．５％炭酸水素ナトリウム溶液２！Ｍ！、ｐＨ７，
３）で３７℃、スピナー・フラスコで培養した。培養細
胞を９６穴マイクロプレートに１穴当り１０４〜１０５
Ｃｅ１１Ｓとなるようシードし、３７℃、５％炭酸ガス
インキュベーター中で２０〜２４時間培養した。マイク
ロプレート中の培地を除き、４Ｍｔ−リクロル酢酸ナト
リウム塩を含む培地と交換した。３７℃、２時間放置し
た後、トリクロル酢酸を含まない培地と交換し、一度洗
浄した。新しい培地を加え、３７℃２０〜２４時間培養
した。クリスタルバイオレット染色により生細胞数を確
認した。染色されず、生細胞は存在しなかった。
Claims (1)
- （１）遺伝子組換え体により生成される生産物を回収す
るに際し、該遺伝子組換え体をカオトロピツクイオンを
含む溶液で処理することを特徴とする遺伝子組換え体か
らの生産物の回収方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19607985A JPS6258996A (ja) | 1985-09-06 | 1985-09-06 | 遺伝子組換え体からの生産物の回収方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19607985A JPS6258996A (ja) | 1985-09-06 | 1985-09-06 | 遺伝子組換え体からの生産物の回収方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6258996A true JPS6258996A (ja) | 1987-03-14 |
Family
ID=16351849
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19607985A Pending JPS6258996A (ja) | 1985-09-06 | 1985-09-06 | 遺伝子組換え体からの生産物の回収方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6258996A (ja) |
-
1985
- 1985-09-06 JP JP19607985A patent/JPS6258996A/ja active Pending
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