JPH0229316B2

JPH0229316B2 -

Info

Publication number: JPH0229316B2
Application number: JP56189859A
Authority: JP
Inventors: Reiboitsutsu Hooru; Jei Wainsutain Maabin
Original assignee: Schering Plough Corp
Current assignee: Schering Plough Corp
Priority date: 1980-11-26
Filing date: 1981-11-26
Publication date: 1990-06-28
Also published as: JPS57118798A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はインターフエロン発現細菌からインタ
ーフエロン（γ―インターフエロンを除く）を抽
出することに関する。

インターフエロンは有効な抗菌剤および／また
は制癌剤として極めて重要であると広く信じられ
ている。しかし、天然物から得られるインターフ
エロンは希少かつ極めて高価なのでインターフエ
ロンの実際的な臨床試験および広範な使用はおく
れている。インターフエロンを発現できる細菌を
つくりだすためにDNAの遺伝子組み替え技術が
使用されてきた。例えば、ナガタらによつて
“Nature”284巻、316〜320（1980）に報告されて
いる。このような細菌の培養はインターフエロン
の天然物を使用した場合にくらべてかなり安い値
段で極めて多量のインターフエロンが得られると
思われる。しかし、医療用インターフエロンは高
純度でなければならず、インターフエロン発現細
菌の細胞成分または細胞残屑などで汚染されてい
てはならない。このような不純物で汚染されてい
る場合、副作用をおこしたり、あるいは再現性の
ない試験結果をあたえることがある。従つて、医
療用に使用できるような高純度のインターフエロ
ンをインターフエロン発現細菌の細胞から抽出す
ることは目下の主要な課題である。

ところで、米国には、組換えDNA技術によつ
て蛋白質の製造に使用される形質転換体は、培養
液の精製前に完全に不活性化されるか、好ましく
は死滅させられるべきであるという、政府規則が
ある。これは、培養と精製が通常別の場所で行わ
れ、バルクの生存細胞を輸送することが許されて
いないからである。これらの状況は日本において
も同様である。例えば、「組換えDNA実験指針」
には、「大量培養実験に係る物理的封じ込め」の
項に、LS−１，２レベルともに、組換え体を含
む培養液の取り扱いについて、「組換え体を含む
培養液は、滅菌操作を施さないで培養装置等から
取り出さないこと。」と規定されている。

従来、形質転換体を不活性化、あるいは死滅さ
せるためには、凍結融解法と機械的破壊法が用い
られていた。しかし、機械的破壊法は、非常に多
くの生存細胞が残るので、満足の行く方法ではな
かつた。また、凍結融解法は、完全には死滅させ
ることができない。この方法は実験室レベルでは
かろうじて採用できるものの、パイロツトプラン
ト規模（10）でさえも実際には採用することが
できないものであつた。

本発明者らは全く予期することなくインターフ
エロン発現細菌からインターフエロン（γ―イン
ターフエロンを除く）を抽出する改良された方法
を発見した。

本発明によつてインターフエロン発現細菌から
γ―インターフエロン以外のインターフエロンの
溶液を得る方法が提供される。該方法は、インタ
ーフエロン含有細菌細胞の第１懸濁液を酸性化さ
せ；該細胞からほとんど全ての懸濁用液体を除去
し；酸性化された細胞の第２懸濁液を調製し；前
記第２懸濁液を少なくとも中和し；そして、懸濁
された細胞からインターフエロン含有液体を分離
することからなる。所望ならば、得られた液体を
更に処理することもできる。特に、例えば、公知
の方法で前記液体からインターフエロン自体を抽
出できる。

本書で使用する“少なくとも中和する”という
表現は、前記の第２懸濁液を中性または弱アルカ
リ性にすることを意味する。便宜上、“中和する”
という省略された表現を本書で使用することがあ
る。

本発明の方法によれば、酸性化された細胞の懸
濁液を中和すると該細胞からγ―インターフエロ
ン以外のインターフエロンがおどろくほど放出さ
れてくる。しかも、本発明の方法によれば、酸性
化工程でインターフエロン含有細菌細胞を十分不
活性に、あるいは死滅させることができるので、
細胞表面を機械的に、あるいは、酵素的に破壊さ
せる必要性は全くない。本発明の方法によれば、
細胞成分による汚染をほとんどともなうことな
く、しかも良好な活性を有するインターフエロン
を効率的に回収できる。従つて、その後の精製工
程なども容易に、しかも安い費用で行なうことが
できる。

本発明の方法は、実施例２に示すように、凍結
融解法と異なり、商業的規模においても、形質転
換体の十分な不活性化あるいは死滅が可能であ
る。

本発明の方法において、発酵タンク中のインタ
ーフエロン発現細胞の懸濁液を好ましくはPH約
1.3〜4.0、一層好ましくはPH約2.0〜2.5にまで酸
性化させる。この酸性化工程に使用できる適当な
酸を例示すれば、強酸、特に塩酸、硝酸、硫酸お
よびリン酸のような鉱酸である。しかし、細胞の
培養に使用される発酵装置を腐食させるような酸
（例えば、塩酸）などは一般的に使用しない方が
よい。従つて、硫酸とリン酸が最も好ましい。前
記の懸濁用溶媒は水性であることが好ましい。

細菌細胞を酸で処理するときの温度範囲は約室
温（即ち、約15℃よりも高い温度）〜約40℃でな
ければならない。温度が低すぎる場合、酸処理中
に細菌を十分な速度で殺すことができない。上限
温度は約40℃である。なぜなら、インターフエロ
ンは高温では分解されてしまうからである。

細胞懸濁液を酸性化させた後、細胞を液体から
分離する。この分離は遠心分離によつて行なうこ
とが好ましい。細胞を遠心分離したときにペレツ
トが形成される場合、中和工程に入る前に該細胞
を再懸濁させなければならない。懸濁液の一部を
使用し、遠心された細胞のスラリーを調製するよ
うに前記遠心分離操作を行なう場合、細胞を再懸
濁させなくとも中和工程が行なえるようにするた
めスラリー中には十分な量の水を存在させること
ができる。本書で使用される“懸濁液”という用
語はスラリーのようなものも含む。

細胞懸濁液はPH約7.0〜8.0、好ましくはPH7.2〜
7.6にまで中和する。中和工程に使用できる適当
な塩基を例示すれば水酸化カリウムおよび水酸化
ナトリウムである。

DNA遺伝子組み替え技術によつてインターフ
エロンを生成するように改造することができ、し
かも、その後、本発明の方法を使用しγ―インタ
ーフエロン以外のインターフエロンを抽出するこ
とのできる細菌を例示すれば大腸菌（E.coli）、
枯草菌（Bacillus subtilis）およびアクチノマイ
セス属などである。好ましい細菌は大腸菌および
枯草菌である。大腸菌が最も好ましい。

本発明の方法は特に白血球インターフエロンを
発現する細菌について使用できる。このような細
菌は例えばナガタらが“Nature”、284巻、316〜
320（1980）に開示した方法によつて製造できる。
また、本発明の方法は線維芽細胞インターフエロ
ンを発現する細菌についても使用できる。このよ
うな細菌は例えば、Derynckらが“Nature”、
287巻、193〜197（1980）に開示した方法によつて
製造できる。本発明の方法はヒト白血球インター
フエロンを発現する細菌について特に有用であ
る。

白血球インターフエロンおよび線維芽細胞イン
ターフエロンはそれぞれIFN−αおよびIFN−β
という名称でも呼ばれている。また、前記のタイ
プのインターフエロンは各々異なつた形を有す
る。これらについては、1980年７月９日に発行さ
れた英国特許出願第2037296A明細書；Streuliら
の“Science”、209巻、1343〜1347頁（1980）に
開示された論文；Goedelらの“Nature”、287
巻、411〜416頁（1981）に開示された論文および
Streuliらの“Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.”、78
巻、2848〜2852頁（1981）（生化学）に開示され
た論文などを参照できる。

下記の実施例は本発明を例証するものであり限
定するものではない。

実施例１ナガタらが“Nature”、284巻、316〜320
（1980）に開示した方法によつて精製したプラス
ミドＺ−_pBR322（Pst）／HcIF−SN−35または
その誘導体を含有するインターフエロン発現HB
−101大腸菌の接種物100mlを容量14の発酵タン
ク中の37℃の液体培地9.9に添加した。この液
体培地はセルロース330ｇ、酵母エキス310ｇ、
KH₂PO₄50ｇ、MgSO₄・7H₂O10ｇおよび全量9.9
とするのに必要な適量の水から成つていた。培
養菌の生長が後期指数関数段階に達するまで（５
〜７時間）、混合物を通気、撹拌中、PHを7.0に、
そして、温度を37℃に維持した。次いで、PHが
2.1になるまで発酵タンク中の大腸菌懸濁液に
10Nリン酸を添加した。そして、温度を25〜37℃
に維持しながら、この混合物を１時間静置した。
混合物のPHを定期的に再チエツクし、必要ならば
PHを2.1に再調整した。その後、発酵タンク中の
内容物を回収し、回収物を5000G以上で遠心分離
した。

遠心分離後、細菌ペレツトを回収した。このペ
レツトをトリス（２―アミノ―２―ヒドロキシメ
チル―１，３―プロパンジオール）50mlおよび
0.15M塩化ナトリウムから成る水溶液（PH7.5）
に再懸濁させ、細菌の約10w／ｖ％懸濁液を得
た。PHが約7.3になるまで3N NaOHを添加した。
遠心分離したときペレツトではなくスラリーが得
られた場合、生成物を前記の水溶液に再懸濁させ
る必要はなく、スラリーに直接3N NaOHを添加
できる。得られた懸濁液を４℃で１時間混合し、
次いで、5000G以上で遠心分離した。ペレツトを
廃棄した。上澄液は抽出インターフエロン、特に
α1インターフエロン（INF−α1）を含有してい
る。INF−α1はStreuliらによつて“Science”、
209巻、1343〜1347頁（1980）に開示されている。
このINF−α1は更に精製または濃縮できる。上
澄液中にインターフエロンが存在することは
William E.Stewartによつて“The Interferon
System”（ニユーヨーク州、Springer Verlag
社）の134〜156頁（1979）に開示された方法で確
認される。

同様に、Streuliらが“Science”、209巻、1343
〜1347頁（1980）に開示したプラスミド発現α2
インターフエロンを使用した後、培養液から該イ
ンターフエロンを抽出した。

同様に、白血球インターフエロンの別の種類の
プラスミド発現細菌（例えば、1980年７月９日に
発行された英国特許出願第2037296A明細書に開
示されたインターフエロンの中から選択されるイ
ンターフエロン）を使用した後、培養液から該イ
ンターフエロンを抽出した。

同様に、プラスミド発現線維芽細胞インターフ
エロンを使用した後、培養液から該インターフエ
ロンを抽出した。

IFN−α1を発現する前記のプラスミドＺ―_p
BR322（Pst）／HcIF−SN−35の誘導体は一層効
率的に調製できる。本発明の方法は前記プラスミ
ドを含有する細菌からインターフエロンを抽出す
るのにも使用できる。

実施例２実施例１と同様にして、800の容量で培養
（37℃、7.83時間）した。培養終了後の生存細胞
数は、4.4×10⁹細胞／mlであつた。

培養終了後、酸処理による細胞不活性化または
死滅効果を測定するために、試料10mlを分離し
た。この試料に85％リン酸を加えてPH２〜2.1に
し、25℃で培養した。0.5、0.75および1.0時間後
に培養液をサンプリングし、細胞の生存を測定し
た。細胞の生存は、コロニー形成数（CFU）を
測定することによつて行つた。CFU／mlは全て
０であつた。

先に酸処理の死滅効果を調べるために試料10ml
を分離した残りの培養液に85％リン酸溶液を添加
し、PHを2.15にした。その後、発酵タンク中の内
容物を回収し、回収物を遠心分離した。酸性懸濁
液（PH2.1）とした後、50％NaOH16.5を添加
し、懸濁液を中和した（PH7.35）。中和懸濁液の
CFUも、０であつた。この中和懸濁液を遠心分
離し、α−インターフエロン溶液40IU／を得
た。なお、インターフエロンの活性はStewartの
方法によつて測定した。

Claims

【特許請求の範囲】１インターフエロン含有細菌細胞の第１懸濁液
を酸性化させ；該細胞からほとんど全ての懸濁用
液体を除去し；該酸性化細胞の第２懸濁液を調製
し；第２懸濁液を少なくとも中和し；そして、該
懸濁細胞からインターフエロン含有液体を分離す
ることからなる、インターフエロン発現細菌細胞
からインターフエロン（γ―インターフエロンを
除く）溶液を得る方法。２前記第１懸濁液を強鉱酸で酸性化させること
からなる特許請求の範囲第１項に記載の方法。３前記第１懸濁液を硫酸またはリン酸で酸性化
させることからなる特許請求の範囲第１項または
第２項に記載の方法。４前記第１懸濁液をPH約1.3〜4.0にまで酸性化
させることからなる特許請求の範囲第１項〜第３
項のいずれか１項に記載の方法。５前記第１懸濁液をPH約2.0〜2.5にまで酸性化
させることからなる特許請求の範囲第４項に記載
の方法。６前記第２懸濁液を水酸化カリウムまたは水酸
化ナトリウムで中和することからなる特許請求の
範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方
法。７前記第２懸濁液をPH約7.0〜8.0にまで中和す
ることからなる特許請求の範囲第１項〜第６項の
いずれか１項に記載の方法。８前記第２懸濁液をPH約7.2〜7.6にまで中和す
ることからなる特許請求の範囲第７項に記載の方
法。９前記細菌細胞が大腸菌（E.coli）細胞である
ことからなる特許請求の範囲第１項〜第８項のい
ずれか１項に記載の方法。１０前記インターフエロンが白血球インターフ
エロンであることからなる特許請求の範囲第１項
〜第９項のいずれか１項に記載の方法。