FI70247B

FI70247B - Foerfarande foer framstaellning av polyeterantibiotika

Info

Publication number: FI70247B
Application number: FI810252A
Authority: FI
Inventors: Chao-Min Liu; Barbara Prosser; John Westley
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1980-01-30
Filing date: 1981-01-29
Publication date: 1986-02-28
Also published as: PT72417B; PH16583A; MC1364A1; ES498922A0; AU6657281A; DK29881A; AR227660A1; NO810319L; IL61971A0; ATE4217T1; ZA81151B; JPH0250918B2; DK149639C; KR830005358A; EP0035119A3; IE50886B1; GR73021B; PT72417A; AU536300B2; IL61971A

Description

70247

Menetelmä polyeetteriantibioottien valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä polyeetteriyhdisteiden valmistamiseksi, jolla menetelmällä saadaan uusia polyeetteri-5 yhdisteitä, nim. antibiootteja X-14868A ja X-14868B, joilla on yleinen kaava (I) OMe OMe ry 1C OH “ ^

νγϊ,Λ^ _ V

OH H J H υ u - 0 "·

I Me Me H Me H u H H OR

C02H

15 jossa R on vastaavasti vety tai metyyli (ja Me on metyyli), sekä niiden farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja. Lisäksi saadaan uutta antibioottia X-14868C ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, jonka antibiootin X-14868C Na-suolalla 20 on seuraavat fysikaaliset ominaisuudet: 1) kuviossa 3 esitetty infrapunaspektri; 2) sulamispiste 172-175°C (Na-suola) ;

3) ominaiskiertokyky C^-JD

kloroformissa +49,6° ja metanolissa + 30,5°, ja 25 4) mikroanalyysi 57,13 % C 8,58 % H 2,36 % Na sekä uutta antibioottia X-14868D ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, jonka antibiootin X-14868D Na-suolalla on seuraavat fysikaaliset ominaisuudet: 30 1) kuviossa 4 esitetty infrapunaspektri; 2) sulamispiste 194-195°C (Na-suola);

3) ominaiskiertokyky L X7D

kloroformissa +41,1° ja metanolissa +29,2°, ja 4) mikroanalyysi 35 60,32 % C 8,80 % H 3,40 % Na.

70247 Nämä neljä antibioottista yhdistettä saadaan keksinnön mukaisella menetelmällä, jossa kannan Nocardia X-14868 ATCC 31585 alaviljelmää viljellään vesiliuoksessa, joka sisältää hiilihydraattia ja typpipitoisia ravinteita aerobisissa 5 submerssiolosuhteissa ja sen jälkeen erotetaan ja eristetään lopputuotteet mainitusta liuoksesta.

Läheistä rakennetta olevia polyeetteriantibiootteja tunnetaan esim. FI-patenttihakemuksesta 752 180, FI-patentti-julkaisusta 55 051, DK-patenttijulkaisusta 133 254 sekä jul-10 kaisusta J. Antibiotics no. 10, 1979, s. 79 - 96.

Organismi, joka tuottaa keksinnön mukaisella menetelmällä edellä mainitut antibiootit, on uusi laji nimeltään Nocardia sp. X-14868. Viljelmä elävästä organismista varustettu laboratoriomerkinnällä X-14868 on talletettu laitok-15 seen American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA ja lisätty sen pysyvään mikro-organismikokoelmaan merkinnällä ATCC 31585. Viljelmä on tunnistettu Nocardia-kan-naksi.

Uusi mikro-organismi eristettiin näytteestä, joka 20 otettiin talteen rantahiekasta Colloroys'ssä Australiassa. Nocardia sp. X-14868 kannan edustajalla on seuraavat ominaisuudet :

Yleiset ominaisuudet:

Nocardia sp. X-14868:lie on luonteenomaista ilmaitiöi-25 den muodostuksen puuttuminen, Gram-positiivisen substraatti-huovaston fragmentoituminen usean päivän inkuboinnin jälkeen ja solun seinän rakentuminen meso-diaminopimeliinihaposta, galaktoosista, arabinoosista ja riboosista.

li 3 70247

Kasvuominaisuudet:

Organismi viljeltiin vakio ISP elatusaineis-sa (Difco), jotka Shirling ja Gottlieb ovat kuvanneet julkaisussa "Methods for Chracterization of 5 Streptomyces Species", Intern. J. System. Bacteriol., 16, s. 313-340, 1066 samoin kuin useissa muissa ela-tusaineissa, joita käytettiin viljelmän tunnistamiseksi kuten alla on luetteloitu:

Hiivauute: 10 hiivauute, 1,0%; glukoosi, 1,0%; agar, 1,5%; pH 6,8

Glukoosi-hiivauute-peptoni: glukoosi, 0,3%; hiivauute, 0,5%; peptoni, 0,5%; CaCO^, 0,75%; agar 1,5%, pH 7,0 15 Glukoosi-asparagiini: glukoosi 1,05; asparagiini, 0,05%; K^HPO^, 0,005%; agar, 1,5%; pH 6,8 Sakkaroosi-nitraatti: sakkaroosi, 1,0%; NaNO^, 0,2%; K^HPO^, 0,1%; 20 MgS04.7H20, 0,05%; KC1, 0,05%; agar, 1,5%.

Muissa kokeissa käytetyt elatusaineet olivat seuraavista viitteistä peräisin:

Koe Viitteet A. Natriumkloriditoleranssi Gordon ja Smith, "Rapidly 25 Growing Acid Fast Bacteria", B. Kaseiinin hydrolyysi I. Bacteriol., 66:41-48, 1953 C. Nitraatin pelkistys D. Gelatiini (mukailtu Skerman, "A Guide to the 30 Actinomyces elatusaineella Genera of Bacteria", (Difco) plus 2,0% agar Williams and Williams Co., lihainfuusioagarissa Baltimore, 1967 E. Tärkkelys (Actinomyces elatusaine (Difco) plus 35 0,25% liukoista tärkkelystä ja 2,0% agaria.) 7 0 2 4 7 F. Vaikutus lakmusmaitoon (Difco) S. Lysotsyymikestävyys Gordon, "Some Criteria for the Recognition of Nocardia", J. Gen.

5 Microbiol., 45:355-364, 1966 H. penisilliiniherkkyys (10 yksikön kiekot)

Kokeet suoritettiin 28°C:ssa ja il C: ssa lähes 10 kaikissa elatusaineissa. Värimääritykset tehtiin 2 ja 4 viikon inkuboinnin jälkeen.

Hiilen kulutus määriteltiin julkaisun Shirling ja Gottlieb (yllä) menetelmällä käyttäen ISF-9 (Difco) elätusainetta.

15 48 tunnin ikäinen ISP-1 elätusaineviljelmä X-14868:sta sentrifugoitiin ja homogenoitiin pestyn suspension saamiseksi ymppäämistä varten.

Organismien kykyä kasvaa 10, 28, 36, 45 ja 50°C:ssa tutkittiin ymppäämällä ISP-1 (Difco) elatus-20 aine. Diaminopimeliinihappoisomeerin solunseinäana- lyysi suoritettiin ulkaisun Becker et ai., Appi. Mikcrobiol., 12, ^21-423, 1964 menetelmällä. Solun seinän sokeripitoisuuden määrittämiseksi seurattiin julkaisun Lechevalier ja Lechevalier, Actinomycetales, 25 Ed. H. Prauser, Gustav Fischer, Jena, s. 311-316, 1970 menetelmää. Nocardomykolihappoanalyysi suoritettiin hiukan mukaillen julkaisun Lechevalier, Lechevalier ja Horan, Can. J. Microbiol. 19:965-972, 1973 menetelmää .

3 0 Tulokset:

Mikroskooppinen tutkimus. Kanta X-14868 tuottaa substraattihuovaston, joka jakautuu useiden päivien kuluttua sallien laajan huovaston kehittymisen. Se tuottaa ilmahuovaston, joka muodostuu köysimäisistä 35 tupsuista, mutta itiöitä ei löydetty lainkaan.

5 70247

Solunseinäanalyysi. Solun seinä sisältää diami-nopimeliinihapon meso-isomeeriä samoin kuin galaktoo-sia ja arabinoosia (solunseinätyyppi IV julkaisun Lechevalier et ai., Adv. Appi. Microbiol., 14, 47-72, 5 1971 luokittelussa). Organismi näyttää tuottavan nocardiomycolihappoja. Nämä morfologiset ja kemialliset kriteerit sijoittavat X-14868 Nocardia-sukuun.

Makroskooppinen tutkimus. Taulukko 1 esittää yhteenvetona kasvun määrän, itiöiden muodostumisasteen, 10 ilmamassavärin, substraattihuovaston alapuolen värin ja kaiken läsnäolevan liukoisen pigmentin, jotka kanta X-14868 tuottaa erilaisissa kiinteissä elatusaineis-sa 4 viikon inkuboinnin jälkeen 28°C:ssa.

70247

N

cc c

O) 03 -H

p c c O -H c

C -r O P

a -h c x o x 5 A -H « f ° “ ; -3 ^ -s §

c c C · im H

O ·Η — «> O 4-J

ρ X CC CO CC

c/ι e c ω p QC

e c c c e ^ m n

> ·Η Ή ·Η 44 C ·μ CU

4-* O 03 (—I i—I · H C P C

CU C Ci rH i—I i—I F > Q

0 X P C O O tm -—' tm O m OJ

C P C 03 cc D ai a' 0) C P

C ρ :C P Cc P bO ω M :C X C

03 p > C O O P -H -H -H > :C 0)

P C C CC a) 03 CU 03 S C P C

Cc > |—li—I CU X 4-3 X X C Ρ ρ C mt W W W 03 :0 c

Ρ p Ci—I Ρ P

E 03 03 UO 03 O) 03 03 P C P C

OOP X X bfl bO ω to Ph C P o

> 3 X > O

i—) Γ/' Csl P CM cm n ro CO i—! s—' >) h h

0'· P

-1—> p co

1 1 H" - TM H—N TM TM TM 03 t-O

P c h-hCCCC C X en

> 0) COJOJOJO) - $ >, P

C gCCCC CC:0 CO «H C ·Ρ Ρ ρ ·Η 0) Ή ι—I ·

CD Ο -ΗΟΟΟΟ C O _ X

οο χ q x x x x ρ x c o P X X ι—li—li—I r—j i—li—I 00

ι—ι C C ι—! C C C C ι—l C 03 X

IO> C > > > > O > 03 4J

X 4- > C 03 P

03 c ^ C c c C ^ S cc C C P C Ή *H ·Η ·Η C O Ρ ‘Η Ρ > C PC C C C ιΗ C tm C C Ρ

X O C 03 C 03 03 0) 03 Ρ r—I C 03 CO C

CC -Hp 0)4-1 4-1 4-J PC v-/ 4-> 4-< CC

C X C oo PO) 03 ω 03 C P 0) P C

O C =C O 030 O O O 3 O C O C C

o e > ^ o·^ ^ ^ ai x x ^ p jr X rH mt c 03 MX 430X343 cm 43 >,

M 43 CC

oi n O ω g XII - Cm

X C _ X C PC

C CCC > P C C Ρ X

ι ' C O c 03 ρ C 03 X

c CP I C Ρ X I C P C

mc 3 co - λ ·- x c 3 -h -n c o ρ o ι c e c o o -pc o) p m p p p

-P ) _H > 1—1 x -H CO C 6 M g P O

c C O ι—I W m Cp Cl 0) Ö m C Co

C pC·!— · - C χ C oo O X 03 "h O Cp ‘^X C :C

> 03 X O C > X ·π Cp XX C Ρ Ρ Cu C X X :C Ή

O O' CC > O C > 03 C X > tfl ffl > rtf X 00 P

C oo F C PC -H p O C P C oi oi E C C3 C O 43 o X p h δ ib X d o) c > cc m>mo3c p; p x ppccxm xo xoxcx·- e o p ι—I > E; »ή ^ p ,r% .#h C X P rt! hv Ή o CCXcoCi-iCO CEXCOCCXXOCO CO -h >-^

p:m cmpm OP >P >Xp >p5 0)rdcx 03 P > P 0) CO

_H0 -d^^HlPC^OlW 03PP 030303 CE deal 03 p CX)

CX X C Ή pCrdC nj pröCÖJPX •«'P PCC CC C XC

•ro :C QPa)CPQ3X> XCCX>XPPCPP>>X> 03 PC

EXXCgupc o cc o pp pow ow cp

C p C Cp CC QCC03CCCCPCCCCCCO :CX

M C-PPCPXX XXPCX03CXCQ3CXXXXP > o > >CrJ3C-yPXC XCcn k m C PXCX pX XX 03 03 00 0) P g X C C F P P X C F P x x c 03 X F C 3 F C >, " C C03CC O C p P C13 C C CPC 0'd 11 3 OXCUPP > · p e

X X03Q3XXP d-H Xi—I 03 C-HSXdCCXPC CP OCpO

e oj ω p X (U P e . g* S| P 03 P :C X <

-o -o (U X M *i ι C

01 CN I CO 01 X -o p p I

a) e ι e ι p e f- d ι e p e p x p x d :fö ι p p a) ι cu ι ρ οι ρ ω

•H PO0 COOCPXPP P pp PP Ö-HC

C CP Ρ I—I C CO Q W3-o C U3 CP 03bO ÖPP

03 Emt Xmt Mp h CClO e Q C C QC CCC

r C C C CCmtOSCiC oco Oh CCC

CP > CU Cp OP 03 C Ph > x>p X C XCF

CC Ρ P e CU :C O 03 Uo Ph 00 Ρ X Ρ (X CX Xpo OOP PC C G3 X C >, P 03 3-I Ρ Ρ Ρ a> P 03 X p e

<1' X C X P [li 03 P CO C μη X CO X Oh 00 03 d X

II

7 70247

Fysiologiset ominaisuudet: Kanta X-14868 hydrolysoi gelatiinia ja kaseiinia, mutta ei tärkkelystä. Viljelmä oli vastustuskykyinen 10 yksikön penisillii-nikiekolle samoin kuin 0,005% lysotsyymille liuotet-5 tuna elatusaineeseen kokeiltuna julkaisun Gordon, J. Gen. Microbiol., 45, 355-364, 1966 menetelmällä. Kanta peptonoi täydellisesti lakmusmaidon. ISP l:llä, 6:11a eikä 7:llä ei todettu melaniinimuodostusta.

Taulukko 2 esittää kannan X-14868 hiilenkulu-10 tuksen tulokset ISP 9:llä (Difco) 28°C:ssa yhden kuukauden inkuboinnin jälkeen.

Taulukko 2. Kannan X-14868 hiilen hyväksi käyttö Hillilähde Reaktioa

Ei hiili vertailua 15 D-glukoosi ++ D-ksyloosi L-arabinoosi L-ramnoosi D-fruktoosi + 20 D-galaktoosi +

Raff inoosi D-mannitoli i-inositoli

Salisiini + 25 Sakkaroosi

Selluloosa__ -_ a: -negatiivinen reaktio;- epävarma reaktio; + kasvua enemmän kuin hiilivertailulla, mutta vähemmän kuin glukoosilla; + + positiivinen reaktio, yhtä 30 suuri kuin kasvumäärä glukoosilla.

3 70247

Taulukossa 3 on luettelo diagnostisesta tärkeistä, enimmäkseen aineenvaihdunnallisista ominaisuuksista.

Taulukko 3. X-14868:n ominaisuudet 5 Koe Tulos ISP 1, tummuminen ISP 6, tummuminen ISP 7, melaniini

Kaseiinihydrolyysi ++ 10 Gelatiinihydrolyysi ++ Tärkkelyshydrolyysi

NaCl (%) toleranssi 5% Lämpötila, jossa kasvusta tehtiin

huomioita 29 ja 36°C

15 Käänteispuolen pigmentti puuttuu

Liukoinen pigmentti ruskea glukoosi/ hiivauute-peptonissa

Penisilliini (10 yksikön kiekko) herkkyys 2Q nitraatin pelkistys ++

Gram väri +

Hapon kestävä väri

Katalaasi +

Diaminopimeliinihappo meso-isomeeri „γ Solun seinäsokerit galaktoosi, arabi- noosi, riboosi

Nokardomykolihapon tuottaminen +

Kanta X-14868 voidaan erottaa muista Nocardia -lajeista taulukossa 4 esitettyjen biokemiallisten ominaisuuksien perusteella. Nämä lajit on valittu 30 vertailuun, koska ne muodostavat ainoan joukon

Nocardia-suvussa, jonka kanssa X-14868:11a on jonkun-asteista fenotyyppistä affiniteettia.

Taulukosta 4 voidaan nähdä, että hyvin vähän biokemiallisia tietoja on saatavissa neljälle lajeis-35 ta, nimittäin N. transvalensis, N. formica, N.

Il 9 70247 petroleophila ja N. saturnea. Kuitenkin nämä lajit ovat hyvin erilaisia kuin X-14868. N. transvalensiksen on ilmoitettu olevan hyvin samankaltainen kuin K. brasiliensis, joka sisältyy taulukkoon H. N. formica 5 on ehkä väärin sijoitettu sukuun Nocardia ja muistuttaa enemmän sukua Streptomyces. N. petroleophila ja N. saturnea ovat kaksi hyvin erotettavaa lajia, joilla on vähän affiniteettia muihin Nocardia-lajeihin. Näiden kahden lajin jäsenet voivat elää hiilettömässä 10 elatusaineessa ilmakehän hiilidioksidin avulla, eikä tämä käy päinsä muiden lajien kohdalla, mukaan lukien X-14868.

10 70247

Taulukko k. Kannan X-m868 vertailu muiden Nocardia-lajien kanssa.

> « -H §j « <c -h tn Sd 0 tn tn c S m n 1 c ai <D 8 $ Ή .

I % I 3 s |S | I 8 S 2 -H *H -H B fi) .2 3 -2 }M rs β U) mjj rn ffir* ä, P OH Ή

5 sS !§ aa la! I

„..Ί . „ —2-2—ύ—EL_E5__? z z z z z z z

Hiilen käyttö 1

Glukoosi + + + + + + + + + L-Arabir.oosi L-Ramnoosi D-Fruktoosi + + + + ++ +

Galaktoosi .

+ +

Mannitoli + + + + +

Inositoli +

Sakkaroosi + _

Maltoosi + + + + + +

Mannoosi + + + + + + 4 ♦

Glyseroli + + + + + +

Laktoosi

Parafiini + + + + _ + + + +

Asetaatti ++++ +++

Butyraatti + + + + + + +

Malaatti + + + 4 + +

Propionaatti + + + + + +

Pyruvaatti ++++ +4+ +

Sukkinaatti + + + + 4 4

Sitraatti + +

Nitraatin pelkistys +++-+-+♦---♦

Ksantiini hydrolyysi + + +

Gelatiini hydrolyysi + - + +

---J_L_ I i . i 1 1 , I

70247

Antibiootin X-14868 farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat voidaan valmistaa tavanomaisilla tavoilla. Nämä suolat valmistetaan antibiootin vapaasta happomuodosta alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi pesemällä vapaata hap-5 poa liuoksessa sopivan emäksen tai suolan kanssa. Esimerkkejä tällaisista farmaseuttisesti hyväksyttävistä emäksisistä yhdisteistä, jotka pystyvät muodostamaan suoloja esillä olevan keksinnön tarkoituksiin, ovat alkalimetalliemäkset kuten natriumhydroksidi, kaliumhydroksidi, litiumhydroksidi ja vas-10 taavat; maa-alkalimetalliemäkset kuten kalsiumhydroksidi, bariumhydroksidi ja vastaavat; ja ammoniumhydroksidi. Alkali-metalli- tai maa-alkalimetallisuolat, jotka sopivat farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen muodostukseen, voivat sisältää anioneja kuten karbonaatteja, bikarbonaatteja ja sulfaat-15 teja.

Nocardia X-14868, kasvatettuna sopivissa olosuhteissa, tuottaa yhdistettä X-14868A. Nocardia X-14868 sisältävä käy-misliuos valmistetaan ymppäämällä yhdistettä X-14868A tuottavan organismin itiöitä tai huovastoa sopivaan elatusaineeseen 20 ja sitten viljelemällä aerobisissa olosuhteissa. X-14868:n tuottamiseksi viljely kiinteällä elatusaineella on mahdollinen, mutta tuottamiseksi suurissa määrissä viljely nestemäisessä elatusaineessa on edullinen. Viljelylämpötilaa voidaan vaihdella laajalla alueella, 20 - 35 °C, jossa organismi voi 25 kasvaa, mutta edullisia ovat lämpötilat välillä 26 - 30 °C

ja oleellisesti neutraali pH. Antibiootin X-14868A tuottavan organismin aerobisessa submerssiviljelyssä elatusaine voi sisältää hiililähteenä kaupallisesti saatavissa olevaa glyseridi-öljyä tai hiilihydraattia, kuten glyseroli, glukoosi, maltoosi, 30 laktoosi, dekstriini, tärkkelys, jne. puhtaissa tai raakati-loissa ja typen lähteenä orgaanista ainetta kuten soijapapu-jauhoja, tislausjätettä, maapähkinäjauhoja, puuvillansiemen-jauhoja, lihauutetta, peptonia, kalajauhoja, hiivauutetta, viljan liotusnestettä, jne. ja haluttaessa epäorgaanisia typ-35 pilähteitä kuten nitraatteja ja ammoniumsuoloja. Se voi myös sisältää mineraalisuoloja kuten ammoniumsulfaattia, magnesium-sulfaattia, natriumkloridia, kaliumkloridia, kaliumfosfaattia, 12 70247 kalsiumkarbonaattia ja vastaavia ja puskurointiaineita kuten natriumsitraattia ja fosfaattia ja jälkiä raskaista metalli-suoloista. Ilmastetuissa submerssiviljelymenetelmissä käytetään edullisesti vaahdonestoainetta, kuten nestemäistä 5 parafiinia, rasvaöljyjä tai silikoniyhdisteitä. Useampaa kuin yhtä lajia hiililähdettä, typpilähdettä tai vaahdonestolähdet-tä voidaan käyttää antibiootin X-14868A tuottamiseen.

Seuraava taulukko 5 kuvaa antibiootin X-14868A ja kolmen vähäisemmän komponentin X-14868B; X-14868C; ja X-14868D 10 antimikrobista aktiivisuutta.

li 13 70247 □ f? on ^ oo *r\ — ° S S —<—'(ΝΙΚΛ CN ir\ « * ** en i ~ Ό 'Xivocvj KO o-ι * * £ x δ $ oo

H ^ ^ (N

+->2 - - +-* _ o rsi o „νοοΌ <-><-, * .

8 1 ™ ° § * * * * ,9 >< ^ _<N—< N 1Λ

rQ

'rl CO

SS ^ ^ G\ ^ ^ w “Ί'ΤΊ ^ 5 p - — S'cn" rSo” ^ o7 ^ ~ _. _ ^ •H -^ ' - N - S3 o e g * S ? x ^2 "A 3 Ή < •H S 2 ^ es ^ H O0 H ΓΛ (N Ir\ .S f: o"^ N N o” <N vo” (SV o o o 0 Λ ~· ~11 CN o o

j- X N O (NO

e

• <—I

o > LO ^ 8 ·% o e o ’£ ro . Jj

’S

E

. o Γ+-.

e

CD «H

(¾ i—I ro i—f cx jd oo i—I i—I O CXJ ex: . — co o co oj oo zr -* 1-0 CO CO CO CD Γ.

CD LO CD CM r- oo O lo O cnj αζ τ-i •=r O O oo O CJ o- 2 ΓΛ

O p H E- O O

00¾ <C O <C CJ> * ~ ^ <1-1 o CJ H < -2

CJ J- oo ω E-· < J

•H CJ CO CDlOCO < S e G E—cn LDuor^ h <1> n

ω < ooesi 0) ζ; (0 M

•H ^ CJ> h J 3 -H n

e g en cj cNice;o (n p en X

& 3 3 h ^ « o o -h g -h q3 W) ·η o < 6 O 25 H ·Η H +J4J > £ L o 5 3 cj < 0)3 o ro 0) ^

0 (U D »H E-I (Λ rH r-1 ·Η 4J P

1 Γθπ3 k<C’<-t rC 1—I £-< ·Η c/3®p Ö Mh 0) rH (X (D CO * Π ^ . «P W »H . O >*H fl] CJ3 M v) 3 id rö-p e ti uttp •h 3οα>-μω)·Γα·4->3ω m .h<d 1=1 ^ t-J O O +-1 3 0/ ft 3 ft 3 ·Η0) (DP -QP _j •iyÖD^ScninmgS-iO o g h & • X O O i-H 3 H CD >-, >i-H [fl E frt Q OO o) m en w tn -h -h G £?,h O ^ X OH J en 3333 S4 00 5 >H 3H Se

-b>>>C r—i H r-1 H ¢+-1 +-> i—I -H OS O

^ C+irC *H ^ Hi—I H H ^ 2 Oi CL> ·ΗΟ 03 H h }λ + 0) Oh o + H H H *r-i + O 0! CU O ·Η > Ό ^ m

^ u υ u υ v- 0 3 G o) e h fG

„ +-'H3 ¢333 >,+-> o 3 O -H ¢3 ^ rj oo ο-οο- oo öcamm o9 S oo κ ex cu χ o co 14 70247

Kuten taulukossa 5 osoitetaan, antibiootilla X-14868 ja sen kolmella vähäisemmällä komponentilla on ominaisuus vaikuttaa estävästi tiettyjen gram-positiivisten bakteerien kasvuun. Ne ovat sen vuoksi käyttökelpoisia pesuliuoksissa, 5 joita käytetään hygieniatarkoituksiin, samoin kuin käsien pesussa ja saastuneitten huoneitten ja laboratorioiden laitteiden, lattioiden tai kalusteiden puhdistuksessa.

Seuraava taulukko 6 esittää kokkeja vastustavan aktiivisuuden verrattuna tartutetun käsittelemättömän vertailun 10 (IUC) ja tartuttamattoman käsittelemättömän vertailun (UUC) vastaavaan aktiivisuuteen seuraten alla esitettyä koemenetelmää .

Il 15 1 0 - 70247 CD CO °_ ^ °_ ™ M^OCN ooo o~ rtf

O PPJ

•Ή _i V g o „ CD 5 ,3 ° ° ooo o 11 I pH CO ** r— w

c H 'ri ° ^ OOO O

•Η -H & -P Ä C 0 ^

(D ·Η C SD

• rH ^

:r0 rO :¾ O

* rH · (H

ly/ !_I

ωθω°0 Ο ο γλ o CD CD 0) *- ·- -

^ O ^ O N OOO O

(¾ ε Ο Γχ O (M ii- o u · - .-

i”1 o (N OOO O

<£> o

^ I

rH tH

Φ I—) — Λ

H H IfloP ° O OOO O

2 3 'S, ω C CO O >> C :¾

*HC0o\° O (X ON —« VO O

ιτβ-Η ΟΓΛ rv 00 ON \0 ί-U i—1 4 ’ <r\ <n -. o on , ooo o y o^ ο Ο

15 O O o" O

Γ0 (Tj

I—I rH

“ q - g < I < i M g 00 rf vo 3 vo 3 <· :<3 M *2 ·Η rH ®° ·Η r-t S-SU X^l ^ 1

% 5 3 vl Itf't ' id :S

Pi 1 -1 — XCUJ x CH

ί 6 70247

Koerrenot elmä. Tässä kokeessa käytetään 10 kananpoi-kaa lääkeryhmää kohti. Kymmentä kananpoikaa käytetään painoverta il uria ia kymmenen kananpoikaa tartutettuna vertailuna. Lääkettä annetaan 48 tuntia ennen infektion anta-5 mistä. Yksi p kokeiltavaa lääkettä sekoitetaan mekaanisessa sekoi 11 imosca riit tävään määrään kananpojanrehua aikaansaamaan haluttu annos. Infektion muodostaa suunnilleen 300 000 Eimeria aeervulina, E. mivati, E, maxima, E. necatrix ja E. tenolla munarakkulaa annettuna pipetillä suuhun. Koe kestää 1G kuuden päivän ajan ja sitten henkiin jääneille linnuille tehdään ruumiinavaus ja kokonaisvauriot umpisuolessa tutkitaan. Koelinnut arvotellaan henkiinjääneiden lukumäärän ja suclistovaurioiden mukaan. Tulokset ilmaistaan keskimääräisenä infekt j.oac teenä (A.D.J). Pienempi kuin 2,5 keskimäärä i -15 nen infektioaste katsotaan merkitseväksi.

Polyeetteriantibiootti X-14868A on 12-25 kertaa aktiivisempi kokkidiostaattina kuin tunnetut polyeetteriantibiotit, kun käytetään tavanomaista 5 ppm:a annosta.

Kokkidiostaattiset seokset, jotka sisältävät aktiiviko sena aineosana keksinnön mukaisesti saatavaa antibioottia X-148Ö8A tai sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja tai kuivaa suodattamatonta etatusainetta, valmistetaan sekoittamalla aktiivinen aineosa inerttiin aineosaan. Inertti aineosa voi muodostua rehusta, täyteaineista ja vastaavista. Termillä 2 5 "inertti aineosa" -.arkoitetaan ainetta, joka ei toimi loisia torjuvana aineena, esim. kokkidiostaatti, on tehoton aktiiviseen aineosaan, nähden ja jota käsiteltävät eläimet voivat turvallisesti nauttia, ja siten tällainen inertti aine on esillä olevan keksinnön tarkoitukseen nähden inertti.

30 Aktiivinen aineosa hallitsee annettuna suuhun kokki- dioosi-alttiilie kotieläimille, erikoisesti siipikarjalle kuten kalkkunat ja kananpojat, rehun aineosana tehokkaasti taudin joko ehkäisemällä sen tai parantamalla sen ilmennyttyä. Edelleen käsitelty siipikarja joko säilyttää painonsa tai 35 itse asiassa lisää painoaan vertailuihin verrattuna.

li 17 70247

Siten keksinnön mukaisesti saatavaa yhdistettä sisältävät seokset eivät vain hallitse kokkidiosia, vaan auttavat myös parantamaan rehun muuttumistehoa nainen lisäykseksi.

5 Aktiivisen aineosan varsinainen väkevyys eläi men rehussa voidaan tietenkin säätää yksilöllisten tarpeiden mukaan ja se voi vaihdella laajalla alueella. Väkevyyttä rajoittavana tekijänä on se, että minimiväkevyys on sellainen, että aktiivista aineosaa 10 annetaan käytettäväksi riittävä määrä aikaansaamaan halutun kokkidioosihallinnan ja maksimiväkevyys on sellainen, että nautitun seoksen määrä ei johda mihinkään kiusallisiin eikä haitallisiin sivuvaikutuksiin.

15 Siten esimerkiksi rehuesiseos tai täydellinen rehu sisältää riittävästi aktiivista aineosaa kattamaan noin 0,003 % - noin 0,001 % painosta päivittäisestä rehun kulutuksesta. Edullisesti käytetään noin 0,0005 % - 0,001 % painosta. Yleensä noin 0,0005 % 20 aktiivista aineosaa on riittävästi kokkidioosin torjuntaan ja hallitsemiseen. Suuremmat määrät kuin 0,001%, vaikka ovatkin tehokkaita kokkidioosia vastaan, eivät yleensä osoita parantuneita tuloksia yli 0,001% ja joissakin tapauksissa vaikuttavat vastakkaisesti kas-25 vuun, ruokintatehoon ja kuolleisuuteen.

Vaikkakin määrät yli 0,001% ovat tehokkaita kokkidioosin torjuntaan, tämä määrä on edullinen yläraja taloudellisista syistä, s.o. kulu tehokkuusyk-sikköä kohti on matalin tällä alueella. Pienemmät mää-30 rät kuin 0,0003 % eivät ole tehokkaita kokkidioosin torjuntaan. Alarajana on edullinen 0,0005 %, koska se varmistaa tehokkuuden. Edullisin määrä, so. noin 0,0005 % painosta siipikarjan päivittäisestä rehun kulutuksesta on erikoisen tehokas, koska se saa aikaan 35 maksimivaikutuksen minimiannoksella.

18 70247

Optimi annostaso vaihtelee tietenkin eläimen koon mukaan. Käytettäessä keksinnön mukaisesti saatavia antibiootteja kokkidioosin käsittelyyn tai ehkäisyyn ne voidaan ensin yhdistää tai sekoittaa johonkin rehuaine-5 osaan tai kantaja-aineeseen, jolloin saadaan rehun lisäaine esiseos, rehuväkevöite tai rehun lisäaine-täydennys. Rehun lisäaine, väkevöite tai esiseos on valmiste, joka on tarkoitettu eläimelle käytettäväksi suoraan tai jota voidaan edelleen laimentaa täydelli-10 sen rehun tuottamiseksi tai se voidaan nauttia ja käyttää muiden annosten täydennyksenä. Rehun lisäaine-täydennykset, väkevöite ja esiseokset sisältävät suhteellisen suuret prosenttimäärät kokkidiostaat-teja, s.o., aktiivinen aineosa on sekoitettu sopi-15 vaan kantaja-aineeseen tavalla, joka aikaansaa kokki-diostaatin oleellisesti tasaisen dispergoitumisen kantaja-aineeseen. Sopivia kantaja-aineita ovat kiinteät aineet, jotka ovat inerttejä aktiiviseen aineosaan nähden ja jotka käsiteltävä eläin voi turvallisesti 20 nauttia. Tyypillisiä tällaisia kantaja-aineita ovat kaupalliset siipikarjan rehut, jauhetut viljanjyvät, jyvien sivutuotteet, kasviproteiiniväkevöitteet (soija, maapähkinät, jne), käymissivutuotteet, suolat, kalkki-kivi, epäorgaaniset yhdisteet ja vastaavat tai niiden 25 seokset. Nestemäiset dispersiot voidaan valmistaa käyttämällä vettä tai kasvisöljyä edullisesti sisältäen pinta-aktiivisen aineen, emulgoivan aineen ja vastaavan, nestemäisessä dispersiossa kuten etyleenidiamiir.it etra-etikkahappo, jne. ja liukoisuutta parantavia aineita.

30 Mikä tahansa sopiva kantaja-aine tai täyteaine voi toimia inerttinä aineosana loisia torjuvan aineen kiinteässä muodossa, edellyttäen että se on aktiiviseen aineeseen nähden inertti ja myrkytön sikäli kuin kysymyksessä on eläin, jolle se on annettava.

35 Aktiivinen aineosa voidaan sekoittaa puuroksi, palloiksi tai mihin tahansa haluttuun muotoon inertin

II

19 70247 kiinteän kantaja-aineen tai täyteaineen kanssa millä tahansa tavanomaisella menetelmällä. Esimerkiksi seokset voidaan muodostaa jauhamalla hienoksi tai hienontamalla aktiivinen aineosa ja inertti aineosa käyttämällä mitä tahansa kaupallisesti 5 käytettävissä olevaa survinta tai hienonninta rehun ollessa mukana tai puuttuessa. Ellei rehuaine ole mukana, kun jauhaminen tai hienontaminen suoritetaan, saatu aine voidaan jakaa mihin tahansa mukavasti käytettävissä olevaan rehuainee-seen.

10 Tyypilliset siipikarjarehut, joita voidaan täydentää keksinnön mukaisesti saatavalla aktiivisella aineosalla, voivat sisältää useita aineosia, esimerkiksi ne voivat sisältää runsasenergisiä viljatuotteita kuten maissia, vehnää, red dog -vehnäjauhoja, durraa, kaurahiutaleita tai vastaavaa; 15 keski- tai pienienergisiä viljatuotteita, kuten kauroja, ohraa, vehnäjauhoja, keskinkertaisia jauhoja, normijauhoja tai vastaavia; stabiloituja rasvoja; kasvisproteiinia kuten soijajauhoja, maissigluteenijauhoja, maapähkinäjauhoja tai vastaavia, eläinproteiinia kuten kalajauhoja, kalan liukenevia 20 aineita, lihatähteitä tai vastaavia; UGF (unidentified growth factor tunnistamaton kasvutekijä)-lähteitä ja muita B-vita-miinikantaja-aineita, kuten kuivamaitotuotteita, kuivahiivaa, kuivia tislausjätteitä, käymisjätteitä tai vastaavia; de-hydratoituja sinimailasjauhoja; ja erilaisia erikoislisäai-25 neita kuten riboflaviinia, B12-vitamiinia, kalsiumpantotenaat-tia, niasiinia, koliinia, K-vitamiinia ja E-vitamiinia tai vastaavaa samoin kuin stabiloitua A-vitamiinia, D^-vitamiinia (D-aktivoituja eläinsteroleja); kalsium- ja fosforitäydennyk-siä samoin kuin dikalsiumfosfaattia, höyrytettyjä luujauhoja, 30 defluorattua fosfaattia, kalkkikiveä tai vastaavia; jodioitua suolaa, mangaanisulfaattia, sinkkikarbonaattia, antibioottista rehutäydennystä; metioniinia tai sen hydroksianalogia ja hapetuksen estoainetta.

Kuten yllä esitetystä ilmenee, kokkidiostaatit on tar-35 koitettu suun kautta nautittaviksi. Ne voidaan lisätä käsiteltävän eläimen tavalliseen rehuannokseen tai ne voidaan antaa muilla menetelmillä, kuten sisällyttämällä samaan tablet- 20 70247 tiin, pilleriin tai isoon pilleriin ja syöttämällä se eläimelle pakolla. Aktiivisen aineosan antamista on harkittava tietyn eläimen kannalta maatalouskäytännön puitteissa.

Vähäisemmillä aineosilla X-14868B, C ja D on myös 5 kokkeja vastustavaa aktiivisuutta in vitro tutkimuksissa. X-14868 on osoitettu aktiiviseksi myös in vivo.

Antibiootin X-14868A on myös todettu olevan aktiivinen kasvun edistäjä märehtijöillä, so. sellaisilla eläimillä, joilla on pötsin toiminta, esim. nautakarjalla. Sen mekanis-10 min pohdinta, jolla ravinto sulatetaan, hajotetaan ja aineenvaihdunta tapahtuu märehtivällä eläimellä, voidaan löytää US-patentista no. 3 839 557, joka koskee tiettyjen antibioottien käyttöä märehtijoitten ravinnon hyväksikäytön parantamisessa. Kaupallisesti tärkeisiin märehtiviin eläimiin kuuluvat nauta-15 karja, lampaat ja vuohet.

Antibioottien X-14868A tehokkuutta pötsissä muodostuvien haihtuvien rasvahappojen suhteen muuntelussa (ja siten ravinnon hyväksikäytön parantamisessa) esitetään seuraavan in vitro tutkimuksen avulla.

20 Pötsinestettä saadaan härältä, jolla on avanne pötsiin.

Härkää pidetään seuraavalla ruokavaliolla: maissia: 89,93 % sinimailasjauhoa: 5,000 % soijapapuöljyjauhoa: 3,00 % 25 kalkkikiveä: 0,80 %

NaCl: 0,60 % dikalsiumfosfaattia: 0,50 % hivenainemineraaleja: 0,025 % vitamiiniesiseoslisäykset: 0,1 % 30 A-vitamiini, TIU: 4,0003 D^-vitamiini, IU: 0,801 E-vitamiini, TIU: 3,002 Pötsineste suodatetaan välittömästi seulan läpi. Jokaiseen käyttämiseen lisätään 75 ml saatua nestettä 250 ml:n kol-35 viin, joka sisältää seuraavaa: 1 g 80 %:20 % hienoksi jauhettua jyvä:heinä muonaa; 21 7024 7 1 ml 18 % glukoosin vesiliuosta (1 millimooli kolvia kohti); 1,5 ml 3,1 % urean vesiliuosta (0,76 millimoolia kolvia kohti); 5 60 mikromoolia kutakin 10 välttämätöntä aminohappoa (arginiini, histidiini, leusiini, metioniini, treoniini, väliini, lysiini, isoleusiini, fenyylialaniini, tryptofaani); 1 ml kokeiltavan lääkkeen vesiliuosta antamaan joko 10 tai 25 ^ug/ml (laskettuna 80 ml:n käymisseoksen kokonais-10 tilavuus).

Jokaista kolvia inkuboidaan 38 °C:ssa ravistellussa vesihauteessa, joka on varustettu kaasunjohtokuvulla. Hiilidioksidia johdetaan jatkuvasti kuvun läpi. Neljän tunnin inkuboinnin jälkeen 10 ml käymisnestettä sentrifugoidaan pyö-15 rimisnopeudella 233 1/s (noin 30 000 g) 20 minuutin ajan. Päältä otetaan 3 ml nestettä, joka lisätään 1 ml:aan 25 % metafosforihappoliuosta, joka sisältää 23 mikromoolia 2-metyylivaleriaanahappoa sisäisenä vertailuna. Saadun nesteen annetaan seistä huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Neste 20 suodatetaan 0,22 millimikronin Millipore-suodattimella ja sitä säilytetään jääkaapissa odottamassa haihtuvien rasvahappojen kaasu-nestekromatografisiä analyysejä.

Kaasu-nestekromatografiset (GLC) analyysit neljälle in vitro vertailukäymiselle ja kahdelle käymiselle, jotka 25 sisältävät 10 ja 25 ppm antibioottia X-14868A, esitetään seu-raavassa taulukossa.

70247 22 re

P

CO

(1) tti cn p

Ο Ή CO

CP >3 CP Ή t—I

id ·Η -H CO LO CN O

:rÖ .-CT P id r· r* r* r·

CO n) (1) ·γΙ +j I-ICsIrHO

ω >T3 tn p lo co cr> o

P -H CO x O 0) i—I

0) CO rö 3 CO >

CU ·Η p CO

p g ·Ρ P>

,Ρ =3 rd 1—I

3 P > O

co P 3 0 •P >, p g :rd £

O PC -H X

O ·Η <d pc g i» 33

P

— .-O

co Cu

Γ- CJ

o O P ^

^ P p P

Λί ·Η -H CJ

3 p > p r—I fd + 3 cd P CN m oo co cn 3 P ·Η O ocNLncn H CU - cn co co oo CO /"“N r> r· <* <> nj -- co o o o o eu o m p •I—1

' ·> · H

ro 4-> O Ή ^ Hj 3 to g g g

P P CP CP CP

H >-> >i CP CP CP

P P > 3 3 CU o lo o o 3 P PC LO lo P I :rd O P >

•H

CP CO

O 3 P p 3 3

Cu CP i—I (—I

j · H · H

cd cd

P P

CU CU

> >

3 P

CU CU

p p ^ p ή ·η p

CU > < > -H

0) Ή CO Ή (/)

P ·Η CO -HP

CO P OD p CU

•H 3 P -HP

Ό M H ω o rP CU I ΟΣ >H S X CU ^ 70247 23

Kuten taulukossa 7 on osoitettu, propionaatin (C3) suhde asetaattiin ja n-butyraattiin on merkittävästi parantunut. Hiilihydraateista, propionaattien mieluummin kuin asetaattien lisäyksen ohella hiili-5 hydraatin teho ja sen vuoksi ravinnon hyväksi käyttö on kasvanut.

Antibiootin X-14868A (tämän jälkeen "antibiootti" tai "antibioottinen yhdiste") antaminen estää ja käsittelee ketoosia samoin kuin parantaa ravinnon 10 hyväksi käyttöä. Ketoosin aiheutumismekanismi on pro-pionaattiyhdisteiden viallinen muodostuminen. Nykyään suositeltu käsittely on propionihapon tai ravintojen, jotka ensisijaisesti tuottavat propionaatteja, antaminen. On ilmeistä, että propionaattituotannon edistäminen 15 tavallisista ravinnoista vähentää ketoosin ilmenemistä .

On keksitty, että antibiootti X-14868A lisää ravinnon hyväksikäytön tehoa märehtivissä eläimissä kun se annetaan suuhun eläimille. Helpoin tapa antaa 20 antibiootti on sekoittaa se eläimen ravintoon.

Kuitenkin antibiootti voidaan käyttökelpoisesti antaa muilla tavoilla. Esimerkiksi se voidaan sisällyttää tabletteihin, lääkejuomiin, isoihin pillereihin tai kapseleihin ja antaa eläimille. Antibioottiyhdis-25 tevalmisteet tällaisissa annosmuodoissa voidaan saada aikaan eläinlääketieteen farmaseuttisella alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä.

Kapselit valmistetaan helposti täyttämällä ge-latiinikapselit millä tahansa halutulla halutun anti-30 biootin muodolla. Haluttaessa antibiootti voidaan laimentaa inertillä hienonnetulla laimentimella, kuten sokeri, tärkkelys tai puhdistettu kiteinen selluloosa, sen tilavuuden lisäämiseksi helpottamaan kapseleit-ten täyttämisessä.

35 Antibioottitabletit valmistetaan tavanomaisil la farmaseuttisilla menetelmillä. Aktiivisen aineosan 70247 24 lisäksi tabletti yleensä sisältää perusainetta, hajottavaa ainetta, adsorbenttia, sideainetta ja voiteluainetta. Tyypillisiä perusaineita ovat laktoosi, pölysokeri, natriumkloridi, tärkkelys ja mannitoli.

5 Tärkkelys on myös hyvä hajottava aine samoin kuin algiinihappo. Pinta-aktiivisia aineita kuten natrium-lauryylisulfaattia ja dioktyylinatriumsulfosukkinaat-tia käytetään myös toisinaan. Yleisesti käytettyihin absorbentteihin taas kuuluvat tärkkelys ja laktoosi, 10 kun taas magnesiumkarbonaatti on myös käyttökelpoinen öljymäisille aineille. Usein käytettyjä sideaineita ovat gelatiini, kumit, tärkkelys, dekstriini ja useat selluloosajohdannaiset. Yleisesti käytettyjen voite-luaineitten joukossa ovat magnesiumstearaatti, talk-15 ki, paratiinivaha, useat metallisaippuat ja polyety-leeniglykoli.

Antibioottiyhdisteen antaminen voi tapahtua hitaasti liukenevana pillerinä. Tällaiset isot pillerit valmistetaan kuten tabletit, paitsi, että ne va-20 rustetaan antibiootin liukenemisen viivyttämiskeinol-la. Isoja pillereitä valmistetaan liukenemaan pitkällisinä ajanjaksoina. Hidasta liukenemista auttaa erittäin veteen liukenemattoman antibioottimuodon valitseminen. Rautajauheen kaltaista ainetta lisätään nos-25 tamaan pillerin tiheyttä ja pitämään se paikallaan pötsin pohjalla.

Antibiootin liukenemista viivytetään käyttämällä liukenemattomien aineiden matriisia, johon lääke suljetaan. Esimerkiksi kasvisvahojen, puhdistettujen 30 mineraalivahojen ja veteen liukenemattomien polymeeris ten aineitten kaltaiset aineet ovat käyttökelpoisia.

Antibioottilääkejuomat valmistetaan helpoimmin valitsemalla vesiliukoinen antibioottimuoto. Jos jostain syystä halutaan liukenematonta muotoa, voidaan 35 tehdä suspensio. Vaihtoehtoisesti lääkejuoma voidaan 70247 25 valmistaa liuoksena fysiologisesti hyväksyttävässä liuottimessa kuten polyetyleeniglykolissa.

Antibiootin liukenemattomien muotojen suspensiot voidaan valmistaa myös liuottimiksi sopimatto-5 miin aineisiin kuten kasvisöljyihin kuten maapähkinä-, maissi- tai seesamiöljy, glykoliin kuten propyleeni-glykoli tai polyetyleeniglykoliin; tai veteen riippuen valitun antibiootin muodosta.

Sopivat fysiologisesti hyväksyttävät apuaineet 10 ovat välttämättömiä antibiootin pitämiseksi suspen-doituna. Apuaineet voidaan valita paksuntimien joukosta, kuten karboksimetyyliselluloosa, polyvinyyli-pyrrolidoni, gelatiini ja alginaatit. Monet pinta-aktiiviset aineiden luokat toimivat antibiootin sus-15 pendoijina. Esimerkiksi lesitiini, alkyylifenoli/po-lyetyleenioksidiadduktit, naftaleenisulfonaatit, alkyylibentseenisulfonaatit ja polyoksietyleenisorbi-taaniesterit ovat käyttökelpoisia tehtäessä suspensioita nestemäisiin liuottimina toimimattomiin aineisiin. 20 Lisäksi monet aineet, jotka voivat vaikuttaa nesteen hydrofiilisyyteen, tiheyteen ja pintajännitykseen, voivat auttaa suspensioitten tekemisessä yksityisissä tapauksissa. Esimerkiksi silikonivaahdonesto-aineet, glykolit, sorbitoli ja sokerit voivat olla 25 käyttökelpoisia suspendoivia aineita.

Suspendoituva antibiootti voidaan tarjota kasvattajalle suspensiona tai antibiootin ja apuaineiden kuivana seoksena laimennettavaksi ennen käyttöä.

Antibiootti voidaan myös antaa märehtijöitten 30 juomavedessä. Lisääminen juomaveteen suoritetaan li säämällä antibiootin veteen liukoista tai veteen sus-pendoituvaa muotoa sopivassa määrin. Juomaveteen lisättävä antibioottivalmiste seuraa samoja periaatteita kuin lääkejuomavalmiste.

35 Käytännöllisin tapa käsitellä eläimiä antibi- 70247 26 oottiyhdisteellä on ravintoannokseen lisättävä yhdis-tevalmiste. Minkä tahansa tyyppinen ravinto voidaan lääkitä antibioottiyhdisteillä, mukaan lukien tavalliset kuivarehut, nestemäiset ravinnot ja rakeiste-5 tut ravinnot.

Lääkkeitten eläinrehuihin lisäysmenetelmät ovat hyvin tunnettuja. On tavallista tehdä väkevöity lääke-esiseos lääkittyjen rehujen raaka-aineeksi. Esimerkiksi tyypilliset lääke-esiseokset voivat sisäl-10 tää noin 1 - noin 400 g lääkettä 454 g esiseosta.

Laaja alue on tuloksena laajasta lääkkeen väkevyys-alueesta, joka voidaan haluta lopullisessa ravinnossa. Esiseokset voivat olla joko nestemäisiä tai kiinteitä.

15 Sopivat määrät antibioottia hyödylliseen kä sittelyyn sisältävien märehtijän rehujen kaava on hyvin ymmärretty. On välttämätöntä vain laskea yhdistemäärä, joka halutaan kullekin eläimelle annettavaksi, otettava huomioon eläimen päivittäin syömän ravinnon määrä 20 ja käytettävän esiseoksen antibioottiyhdisteen väkevyys ja laskettava antibioottiyhdisteen tai esiseoksen sopiva väkevyys ravinnossa.

Kaikki valmiste-, sekoitus- ja rakeistusmene-telmät, joita tavallisesti käytetään märehtijöiden 25 rehujen alalla ovat täysin sopivia antibioottista yhdistettä sisältävien rehujen valmistamiseksi.

Kuten on osoitettu, antibiootin antaminen suuhun muuttaa suotuisasti propionaattien tuotantoa suhteessa asetaattien tuotantoon pötsissä. Sen vuoksi voi-30 daan päätellä, että sama käsittely hyödyttäisi myös yksimahaisia eläimiä, jotka käyttävät kuituista kasvis-ainetta umpisuolessa, koska olisi odotettavissa, että suotuisa käänne propionaatti/asetaattisuhteessa tapahtuisi annettaessa suuhun välitöntä antibioottia. Hevo-35 set, siat ja kanit ovat esimerkkieläimiä, jotka sulattavat osan ruoastaan umpisuolikäymisellä.

70247 27

Antibiootti X-14868A on osoittautunut aktiiviseksi myös aineena sikojen punataudin käsittelyssä ja ehkäisyssä. Yhdisteen aktiivisuutta Treponema hyödysenteriae'ta, sikojen punataudin aiheuttajaa 5 vastaan tutkittiin. Tulokset, jotka esittävät vertailevan kokeen, joka seuraa hyvin tunnettuja koemenetelmiä, tunnettua ainetta vastaan sikojen punatautia käsiteltäessä ja ehkäistäessä, on esitetty alla olevassa taulukossa.

10 Taulukko 8

Minimi inhiboiva väkevyys (mcg/ml) T. hyodysenteriae kanta X-14868A Ipronidatscll 1 0,05 0,63 15 2 0,05 0,63 3 0,05 0,63 4 0,05 2,5 keskiarvo 0,05 1,1

Myöskin esillä olevaan keksintöön osaa muodos-20 tamassa ovat uudet vähäisemmät aineosat, jotka on nimitetty X-14868B, C ja D. Näillä aineosilla on in vitro kokkeja vastustavaa aktiivisuutta E. tenellaa vastaan alla esitetysti.

Yhdiste In vitro aktiivisuus E. tenellaa 25 vastaan ppM tehokas E. tenellaa vastaan X-14868B 0,1 X-14868C 10,0 X-14868D 10,0 30 Yhdisteen X-14868B rakennekaava on seuraava: 70247 28 OMe

AoMe

OMe JmiMe II

r OH = U

5 " θν/ΝγΜθιιΓ^Ν ?_ Mev^\>Me Γοί'3'hYh 1s^oTT-oTl· erf—fr-O-T1 Me I Me Me H Me H H H OMe co2h .

10

Vastaavien yhdisteiden infrapuna-absorptio-spektrit ovat seuraavat: X-14868A - kuvio 1 X-14868B - kuvio 2 15 X-14868C - kuvio 3 X-14868D - kuvio 4

Taulukko 9 esittää Nocardia X-14868 käymisessä saatujen eri aineosien fysikaaliset vakiot.

Il 70247 29 OJ o tJ o f'» u~\ -ς: γμ Ö ~ ™ ™ O ^ ^ £222 IR 2 2 o

-H

w -5 <x> m jo O 12 m _

Z (Λ (N ^ 2 cj- CN

_j -o * v. v w *r ^ H CN —< CN n O- (N -Ϊ £

rH

rC

§

I x S S ~ s I SS

* 00 CO 00 oo £ oo oo _ 1^ f°i ΓΜ -μ _ CV -1 m _

° 0¾ o o K 0“ υ 2 VO

V νο^Άο^οο

rt VO VW

> +-> Φ o 10 -P -H 0 β o 0 >Λνθ H So 1 =° « Ά ro 2. ^

CD rtf _rf S O CT\ * ^ ' O

u ω £ 2 7 2 2 Λ Gv Cv O A -πω + + + +S —

Ai -H £ S

Ai cn ,Η. ,

3 >. g S

ή <w 0 μ 3 ,0 £ no o0oo H 0) Qg vo _ ^ _ »H v/ r\ *· *· *> «*;

C0 . 6 H 2 2 2^ CQ

0 3--3--3--3- φ + + + +(0 C -π H < (ΰ

OJ

OO rH

VO -=+ -Ch O

00 u~v »r> tr> 0) <N

Z Ο σν , (X σχ -μ X

rH 0 —* l/S -h CO

1 1^11 *H _J

x · rv CN ΓΝ 3· -U fl-5 (¾ ΟΝΓ^Γ^σν,μ; 2 en >, ^ 3 +- m '£ cT 9η ζν c\ \a -V Γν- —<

rt ^ X

§ ^ -

P P CJ <J

I ^ ta u 9 'a < cö S CO OO °2 ^ CO 00

3 i2 O VO Ή O VO

c *2 oo 00 00 H CO 00 <d 2 Ξ £; 2 £ f; * ω i i i i 0) , , 8 χχχχ.* x ><

I I

70247 30

Seuraavat esimerkit on tarkoitettu kuvaamaan keksintöä.

Esimerkki 1

Nocardia X-14868 ravistelukolvikäyminen 5 Antibiootin X-14868A tuottava viljelmä kasva tetaan ja ylläpidetään tärkkelys-kaseiini agar-alustalla, jonka kokoomus on seuraava (g/1 tislattua vettä): liukoinen tärkkelys 10,0 10 kaseiini 1,0 K2HP04 0,5

MgSO^ (vedetön) 0,5

Agar 20,0 pH säädetään 7,4:ksi Na0H:lla ennen autokla-15 vointia 6,8 kg paineella 20 minuutin ajan.

Alusta ympätään Nocardia X-14868 viljelmällä ja sitä inkuboidaan 28°C:ssa 7-14 päivän ajan. Hyvin kasvaneesta agar-alustasta otettu huovastoa sisältävä agar-pala käytetään sitten 500 ml Erlenmeyer-kolvin 20 ymppäämiseen, joka sisältää 100 ml steriloitua ymp- päysväliainetta, jonka kokoomus on seuraava (g/1 tislattua vettä): tomaatin puristusjätettä 5,0 tislausjätettä 5,0 25 peptonia 5,0 makeutettua kuivahiivaa 5,0 maissitärkkelystä 20,0

CaC03 1,0 k2h?oh 1,0 30 pH säädetään 7,0:ksi Na0H:lla ennen steriloin tia .

Ympättyä ymppäysväliainetta inkuboidaan 28°C:ssa 72 tunnin ajan kiertoravistimessa, toimien pyörimisnopeudella 4,2 1/s.

35 3 ml annos (3 %, til/til) saatua viljelmää käytetään sitten 500 ml Erlenmeyer-kolvin ymppäämi- 70247 31 seen, joka sisältää 100 ml steriloitua tuotanto-elatusainetta, jonka kokoomus on seuraava (g/1 tislattua vettä): glyseroli 40,0 5 peptoni 5,0 sereloosi 2,0 perunatärkkelys 2,0 rasvattomat soijasuurimot 5,0 makeutettu kuivahiiva 5,0 10 NaCl 5,0

CaC03 0,2 pH säädetään 6,4:ksi ennen autoklavointia. Ympättyä elatusainetta inkuboidaan 28°C:ssa 5 päivän ajan kiertoravistimessa pyörimisnopeudella 15 4,2 1/s. Antibiootin X-14868 tehoa käymisliemessä arvioidaan kokeilla Staphylococcus aureusta ATCC 6538P vastaan käyttäen agar diffuusio kuppi-lautanen-koetta.

Esimerkki 2 20 Antibiootti X-14868A-Na-suolan ja antibiootti X-14868B-Na-suolan eristäminen ravistuskolvikäymi-sestä:

Vaihe A: Kaikki liemi 50:stä puolen litran Erlenmeyer-kolvista, joista kukin sisälsi 100 ml, yh-25 distettiin 5 päivän käymisen jälkeen (5 1) ja uutettiin kahdesti puolella tilavuudella etyyliasetaattia. Kun oli sekoitettu puolen tunnin ajan, liuotinkerros erotettiin ja väkevöitiin öljyksi (4 g) alennetussa paineessa. Öljy liuotettiin dietyylieetteriin ja kro-30 matografoitiin dietyylieetterilietteellä täytetys sä 200 g silikageelipylväässä. Pylväs eluoitiin nou-sevasti 2 litrasta dietyylieetteriä 2 litraan dietyyli-eetteri/asetonia (9:1) ja sitten 2 litralla dietyyli-eetteri/asetonia (1:1) ja sitten 2 litralla metylee-35 nikloridi/etyylialkoholia (7:3). Kerättiin fraktiot 70247 32 HO ml kukin ja fraktiot 18-75 yhdistettiin, liuotin poistettiin niistä alennetussa paineessa ja näin saatu jäännös (1,66 g) liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin samalla tilavuudella IN HC1 kaksi kertaa, 5 jota seurasi pesu samalla tilavuudella Na2C02 (kyllästetty huoneen lämpötilassa) kaksi kertaa. Liuotin-faasi kuivattiin Na2S01+:llä ja lisäämällä n-heksaania saatiin antibiootti X-14868A-Na-suolakiteet. Uudelleen kiteytys etyyliasetaatti/n-heksaanista tuotti 1G analyyttisen näytteen antibiootti X-14868A-Na-suolaa. Sp. 19 3-19 H°C.

Vaihe B: Fraktioista numerot 161-215 saatiin liuottimen poistamisen alennetussa paineessa ja jäännöksen etyyliasetaattiin liuottamisen ja IN HClrllä 15 pesemisen jälkeen, jota seurasi Na2C02 (kyllästetty huoneen lämpötilassa) pesu ja kuivaus Na^O^rllä, kun oli lisätty n-heksaania, antibiootti X-14868B-Na-suolakiteet. Sp. 172,5-17H°C.

Esimerkki 3 2 0 Nocardia X-14868:n tankkikäyminen

Antibiootin X-14868 tuottava Nocardia X-14868 viljelmä kasvatetaan ja ylläpidetään tärkkelys-kaseiini -agar-alustalla, jonka kokoomus on seuraava: (g/1 tislattua vettä): 25 liukoinen tärkkelys 10,0 kaseiini 1,0 K2HP04 0,5

MgS0u (vedetön) 0,5

Agar 20,0 30 pH säädetään 7,U:ksi Na0H:llä ennen autoklavoin- t ia.

Alusta ympätään Nocardia X-14868 viljelmällä ja sitä inkuboidaan 28°C:ssa 7-14 päivän ajan. Hyvin kasvaneesta agaralustasta otettu huovastoa sisältävä 35 agar-pala käytetään sitten vegetatiivisen rokotteen valmistamiseksi ymppäämällä 500 ml Erlenmeyer-kolvi, 70247 33 joka sisältää 100 ml ymppäysväliainetta, jonka kokoomus on seuraava (g/1 tislattua vettä): tomaatin puristusjäte 5,0 tislausjäte 5,0 5 peptoni 5,0 makeutettu kuivahiiva 5,0 maissitärkkelys 20,0

CaCOg 1,0 k2hpo4 1,0 10 pH säädetään 7,0:ksi ennen autoklavointia.

Ympättyä elatusainetta inkuboidaan 72 tunnin ajan 28°C:ssa kiertoravistimessa pyörimisnopeudella 4,2 1/s.

60 ml (3 % til/til) tätä viljelmälientä käy-15 tetään 6 litran Erlenmeyerkolvin ymppäämiseksi, joka sisältää 2 litraa ymppäysväliainetta, jonka kokoomus on seuraava (g/1 tislattua vettä).

tomaatin puristusjäte 5,0 tislausjäte 5,0 20 peptoni 5,0 makeutettu kuivahiiva 5,0 maissitärkkelys 20,0

CaC 0 3 1,0 k2hpo4 1,0 25 pH säädetään 7,0:ksi ennen autoklavointia.

Neljä litraa tätä viljelmää käytetään 230 l:n 30 ymppäämiseksi seuraavaa tuotantoväliainetta 380 l:n käymistankissa (g/1 vesijohtovettä): glyseroli 40,0 peptoni 5,0 sereloosi 2 ,0 35 perunatärkkelys 2,0 rasvattomat soijasuurimot 5,0 70247 34 makeutettu kuivahiiva 5,0

NaCl 5,0

CaC03 0,2

Vaahdonesto 0,1 5 Väliaineen pH säädetään 6,4:ksi ennen steriloin- 2 tia 1 1/4 tunnin a]an 4,2 kg/cm höyryllä.

Ympättyä väliainetta ilmastetaan paineilmalla nopeudella 90 1/min ja sitä sekoitetaan sekoittimil-la pyörimisnopeudella 4,7 1/s. Käyttäminen suori-10 tetaan 28°C:ssa. 5 päivän ajan.

Antibiootin X-14868A tehoa käymisliemessä arvioidaan Staphylococcus aureus ATCC 6538P:tä vastaan käyttäen agar diffuusio kuppi-lautanen koetta.

Esimerkki 4 15 Antibiootin X-14868A-;C-; ja D natriumsuolojen eristäminen Nocardia X-14868:n tankkikäymisestä.

Vaihe A: Kaikkeen liemeen 230 1 käymisestä kuten on esitetty esimerkissä 3, lisättiin 115 tunnin kasvun jälkeen sama tilavuus etyyliasetaattia. Kun oli 20 sekoitettu tunnin ajan, liuotinkerros erotettiin ja väkevöitiin 4,2 ltksi alennetussa paineessa. Väkevöi-ty liuotinuute pestiin samalla tilavuudella IN HC1 kaksi kertaa, jota seurasi pesu kaksi kertaa samalla tilavuudella Na2CC3 (kyllästetty huoneen lämpötilas-25 sa) . Liuotinfaasi kuivattiin ^220^:1^ ja väkevöitiin öljyksi alennetussa paineessa. Öljy liuotettiin n-hek-saaniin ja uutettiin kerran asetonitriilillä, ]ota seurasi kaksi uuttamista asetonitriili/metanolil-la (8:2). Asetonitriili ja asetonitriili/metanoli 30 (8:2) uutteet yhdistettiin ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Saatu öljy liuotettiin dietyy-lieetteriin, käsiteltiin hiilellä, suodatettiin ja lisäämällä n-heksaania saatiin raa'at antibiootti X-14868A-Na-suolakiteet. Raa'at antibioottikiteet 35 liuotettiin metyleenikloridiin ja niille suoritettiin 70247 35 kromatografia metyleenikloridilietteellä täytetyllä 600 g silikageelipylväällä. Pylväs eluoitiin 4 litralla dietyylieetteri/asetoni/ammoniumhydroksi-dia (8/2/0,02). Fraktiot 45 ml kukin kerättiin ja 5 fraktiot numerot 13-15 yhdistettiin. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa, jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin seuraavaksi kahdesti IN HCl:llä ja kahdesti Na^CO^illa (kyllästetty huoneen lämpötilassa), kuivattiin Na^SO^rllä. Etyyliasetaat-10 tifaasi väkevöitiin öljyksi ja liuotettiin metylee-nikloridiin ja lisäämällä n-heksaania saatiin kiteinen antibiootti X-14868A-Na-suola. Sp. 193-195°C.

Vaihe B: Raakojen antibiootti X-14868A-Na-suolakiteiden emäliuos (kuvattu edellä esitetyssä 15 askeleessa A) kromatografoitiin metyleenikloridi lietteellä täytetyllä 1 kg silikageelipylväällä. Pylväs eluoitiin 1 1:11a n-heksaania ja sitten nousevasta 4:stä litrasta dietyylieetteri/n-heksaania (7:3) 4 litraan dietyylieetteri/asetonia (8:2). 40 ml 20 fraktiot kerättiin ja fraktiot numerot 43-80 yhdistettiin. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin ja pestiin IN HClrllä, jota seurasi Na^CO^ vesiliuos (kyllästetty huoneen lämpötilassa) pesu ja hiilikäsittely. Suoda-25 tuksen jälkeen etyyliasetaattifaasi väkevöitiin öljyk si. öljy liuotettiin dietyylieetteriin ja n-heksaa-nin lisäys tuotti lisää antibiootti X-14868A-Na-suolaa. Sp. 193-195°C.

Vaihe C: Yllä esitetyssä vaiheessa A kuvatus- 30 ta silikageelipylväästä saadut fraktiot numerot 22-40 tuottivat kiteistä antibiootin X-14868C-Na-suolaa.

Sp. 17 2-17 5°C.

Vaihe D: Vaiheessa B kuvatun kiteisen antibiootti X-14868A-Na-suolan emäliuos ja fraktiot 16-21 35 silikageelipylväästä, kuvattu vaiheessa A, yhdistettiin, 70247 36 väkevöitiin ja ne kromatografoitiin metyleeni-kloridilietteellä täytetyssä 600 g silika- geeli.pylväässä. Pylväs eluoitiin 4 litralla dietyyli-eetteri/heksaania (1:1); 4 litralla dietyylieet-5 teri/asetoni/n-heksaani/ammoniumhydroksidia (6:2:2:0,002); 2 litralla dietyylieetteri/aseto-nia (8:2). Kerättiin 40 ml fraktiot kukin. Fraktiot numerot 71-98 yhdistettiin ja kiteytys tuotti lisää kiteistä antibiootti X-14868A-Na-suolaa. Fraktiot 10 numerot 141-172 yhdistettiin myös, liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja kiteytys dietyylieetteri/n-heksaanista tuotti antibiootti X-14868D-Na-suolaa.

Sp. 194-195°C.

Esimerkki 5 15 Antibiootin X-14868A talliumsuolan valmistus

Liuos, joka sisälsi 51 mg antibiootti X-14868A-Na-suolaa metyleenikloridissa, pestiin IN HClrllä, jota seurasi vesipesu ja sitten neljä kertaa talliumkarbonaatin vesiliuoksella. Liuotin ero-20 tettiin ja väkevöitiin pieneen tilavuuteen alennetussa paineessa ja n-heksaanin lisäyksen jälkeen otettiin talteen kiteinen antibiootin X-14868A talliumsuola. Uudelleen kiteytys dietyylieetteri/n-heksaanista tuotti sopivia kiteitä röntgenanalyysiin.

25 Esimerkki 6

Antibiootin X-14868A kalsiumsuolan valmistaminen Liuos, joka sisälsi 200 mg antibiootin X-14868A-Na-suolaa etyyliasetaatissa, pestiin ensin IN HCl:llä, sitten kolme kertaa kalsiumhydroksidin 30 vesiliuoksella (kyllästetty huoneen lämpötilassa). Liuotin erotettiin ja poistettiin alennetussa paineessa. Antibiootin X-14868A kalsiumsuola otettiin talteen valkeana kiinteänä vaahtona.

70247 37

Esimerkki 7

Nocardia X-14868 ravistelukolvikäyttäminen Antibiootin X-14868A tuottava viljelmä kasvatettiin ja ylläpidettiin tärkkelys-kaseiini-agar-alus-5 talla, jonka kokoomus oli seuraava (g/1 tislattua vettä): liukoinen tärkkelys 10,0 kaseiini 1,0 K2HP04 0,5 10 MgSO^ (vedetön) 0,5 agar 20,0 pH säädetään 7,4:ksi Na0H:lla ennen autokla-vointia 6,8 kg paineessa 20 minuutin ajan.

Alusta ympättiin Nocardia X-14868 viljelmällä 15 ja sitä inkuboitiin 28°C:ssa 7-14 päivän ajan. Hyvin kasvaneesta agar-alustasta otettu huovastoa sisältävä agar-pala käytettiin sitten 500 ml Erlenmeyer-kolvin ymppäämiseen, joka sisälsi 100 ml steriloitua ymppäysväliainetta, jonka kokoomus oli seuraava 20 (g/1 tislattua vettä): tomaatin puristusjäte 5,0 tislausjäte 5,0 peptoni 5,0 makeutettu kuivahiiva 5,0 25 maissitärkkelys 20,0

CaC03 1,0 k2hpo4 1,0 pH säädetään 7,0:ksi Na0H:lla ennen sterilointia. Ympättyä ymppäysväliainetta inkubointiin 28°C:ssa 30 72 tunnin ajan kiertoravistimessa pyörimisnopeuden ol lessa 4,2 1/s.

3 ml annos (3 %, til/til) saatua viljelmää käytetään sitten 500 ml Erlenmeyer-kolvin ymppää-miseksi, joka sisältää 100 ml steriloitua tuotanto-35 väliainetta, jonka kokoomus on seuraava (g/1 tislattua vettä): 70247 38

Sereloosi 45,0 tärkkelys 20,0 soijapapujauho 15,0 kaseiinihydrolysaatti (- (hapan) 1,0

Sokeriruokomelassi 3,0

CaCO 3 2,5

Vesijohtovettä 1 litraksi pH 7,1 10 Ympättyä väliainetta inkuboidaan 28°C:ssa 7 päi vän ajan kiertoravistimessa pyörimisnopeudella 4,2 1/s. Antibiootin Χ-14868Δ tehoa käymisliemessä arvioitiin kokeilemalla Staphylococcus aureus ATCC 6538P:tä vastaan käyttäen agar diffuusio kuppi-15 lautanen koetta.

Claims

15 I'texN^PMe I* ^ M (I) Me Me h He H h H 0R C02H 20 jossa R on vety, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, antibiootti X-14868B, jolla on kaava (I), jossa R on metyyli, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola, antibiootti X-14868C, jolla Na-suolana on seuraavat 25 fysikaaliset ominaisuudet: 1. kuvion 3 mukainen infrapunaspektri; 2. sulamispiste 172 - 175 °C; 3. ominaiskiertokyky Z~os7D kloroformissa +49,6° ja metanolissa +30,5°, ja 30 4) mikroanalyysi 57,13 % C 8,58 % H 2,36 % Na, tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola tai antibiootti X-14868D, jolla Na-suolana on seuraavat fysikaaliset ominaisuudet: 35 1) kuvion 4 mukainen infrapunaspektri; 2. sulamispiste 194 - 195 °C; 70247 3. orainaiskiertokyky (P<JO kloroformissa +41,1° ja metanolissa +29,2°, ja 4. mikroanalyysi 60,32 % C 8,80 % H 3,40 % Na, 5 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävä suola. Il Patentkrav 7 0 2 4 7 Förfarande för framställning av polyeterantibiotika, kännetecknat därav, att man odlar en subkultur 5 av stammen Nocardia X-14868 ATCC 31585 i en vattenlösning som innehäller kolhydrat och kvävehaltiga näringsmedel, under aeroba submersa förhällanden och därefter separerar och isolerar ur lösningen antibiotikuin X-14868A med formeln (I) 10 OMe OMe OH -Is O' ‘"Me

15 Me ^-^riMe 0 Me ^ ! Me Me H Me H H H OR co2h 20 väri R är väte, eller ett farmaceutiskt godtagbart sait därav, antibiotikum X-14868B med formeln (I), väri R är metyl, eller ett farmaceutiskt godtagbart sait därav, antibiotikum X-14868C, vilket som Na-salt har följande 25 fysikaliska egenskaper: 1. ett infrarött spektrum enligt figur 3; 2. en smältpunkt av 172 - 175 °C ; 3. en specifik vridning av L0*·]D i kloroform +49,6° och i metanol +30,5°, och 30 4) en mikroanalys av 57,13 % C 8,58 % H 2,36 % Na, eller ett farmaceutiskt godtagbart sait därav eller antibiotikum X-14868D, vilket som Na-salt har följande fysikaliska egenskaper: 35 1) ett infrarött spektrum enligt figur 4; 2. en smältpunkt av 194 - 195 °C ;