DK149639B - Fremgangsmaade til fremstilling ag antibiotisk aktive polyetherforbindelser - Google Patents

Description

149639

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af én eller flere hidtil ukendte polyetherforbindelser, nemlig én eller flere af de antibiotisk aktive polyetherforbindelser betegnet X-14868A,

X-14868B, X-14868C og X14868D, hvor antibiotikum X-14868A og 5 X-148G8B har formlen I

OMe OMe ' Kn/"">Ie = OH - υ

Me. Λ PMe 1 0 r\ h\ YY 1 [qh°hYh 10 oi= ο'ξ i^<yT,lMe

I Me Me H Me Η Η H 0R

co2h hvor R i antibiotikum X-14868A betegner hydrogen og i antibiotikum X14868B betegner methyl medens antibiotikum X-148G8C i form af natriumsalt har følgende 10 fysiske karakteristika: 1) et IR-spektrum som angivet i fig. 3; 2) et smeltepunkt på 172 - 175°C (Na-salt); 3) en specifik drejning [aj^ i chloroform på +49,6° og i methanol på +30,5° og 15 4) en mikroanalyse på C 57,13, H 8,58, Na 2,36 og antibiotikum X-14868D i form af natriumsalt har følgende fysiske karakteristika: 1) et IR-spektrum som angivet i fig. 4; 2) et smeltepunkt på 194 - 195°C (Na-salt); 20 3) en specifik drejning [a]^ i chloroform på +41,1° og i methanol på +29,1° og 4) en mikroanalyse på C 60,32, H 8,80, Na 3,40

eller farmaceutisk tolerable salte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en stamme af arten Nocardia sp. X-14868 ATCC

149639 2 31585 dyrkes i en vandig carbonhydratopløsning, som indeholder et nitrogenholdigt næringsmiddel, under submerse aerobe betingelser, hvorefter én eller flere af de nævnte antibiotisk aktive forbindelser fraskilles og isoleres fra denne opløsning i fri form eller i form af 5 farmaceutisk tolerable salte.

I de strukturformler, der forekommer i nærværende beskrivelse, betyder Me methyl.

Den organisme, der producerer de omhandlede antibiotika, er en hidtil ukendt art, der kaldes Nocardia sp. X-14868. En kultur af den le-10 vende organisme, som har fået laboratoriebetegnelsen X-14868, er deponeret i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA i den permanente samling af mikroorganismer under nr.

ATCC 31585. Kulturen er blevet identificeret som en stamme af Nocardia.

15 Den hidtil ukendte mikroorganisme er blevet isoleret fra en prøve, der er opsamlet fra strandsandet i Colloroy, Australien. En repræsentativ stamme af Nocardia sp. X-14868 har følgende karakteristika:

Generelle træk:

Nocardia sp. X-14868 er karakteristisk ved sin mangel på luftspore-20 dannelse, ved fragmentering af det grampositive substratmycelium efter flere dages inkubering og ved sin cellevægssammensætning af meso-diaminopimelinsyre, galactose, arabinose og ribose.

Vækstka ra kte ri stika:

Organismen blev dyrket på standard ISP-medier "Difco" , der er 25 beskrevet af Shirling og Gottlieb "Methods for Characterization of Streptomyces Species”, intern. J. System. Bacteriol., 16, side 313 -340, 1066, og forskellige andre medier er anvendt til at karakterisere strukturen: 3 149639 Gærekstrakt: 1,0% gærekstrakt, 1,0% glucose, 1,5% agar, pH-værdi 6,8. Glucose-gærekstrakt-pepton: 0,3% glucose, 0,5% gærekstrakt, 0,5% pepton, 0,75% CaCO^, 1,5% 5 agar, pH-værdi 7,0.

Glucose-asparagin: 1,0% glucose, 0,05% asparagin, 0,05% KjHPO^, 1,5% agar, pH-værdi 6,8.

Saccharose-nitrat: 10 1,0% saccharose, 0,2% NaNOg, 0,1% I^HPO^, 0,05% MgSO^^HjO, 0,05% KCI, 1,5% agar.

De medier, der blev anvendt i andre tests, var fra følgende referencer:

Test Reference 15 A. Natriumchloridtolerance Gordon and Smith, "Rapidly

Growing Acid Fast Bacteria", B. Caseinhydrolyse J. Bacteriol., 66:41 - 48, 1953 C. Reduktion af nitrat D. Gelatine (modificeret med Actino- Skerman, "A Guide to the 20 myces-væske "Difco” plus 2,0% Identification of the Genera of agar i kød infusionsagar) Bacteria", Williams and Williams

Co., Baltimore, 1967 E. Stivelse (Actinomyces-væske "Difco"® plus 0,25% opløselig 25 stivelse og 2,0% agar) F. Virkning på lakmus-mælk "Difco"® G. Modstandsdygtighed over for Gordon, "Some Criteria for the lysozym Recognition of Nocardia", J. Gen.

30 Microbiol., 45:355 - 364, 1966 H. Følsomhed over for penicillin (10 enhedsplader).

149639 4

Der blev foretaget tests ved 28°C og 37°C for næsten alle medier. Farvestemmelser blev udført 2 og 4 uger efter inkubering.

Carbonudnyttelsen blev bestemt ved Shirling og Gottliebs metode (jfr. ovenfor) under anvendelse af ISP-9 "Difco" -medium.

5 En 48 timer gammel ISP-1 væskekultur af X-14868 blev centrifugeret og homogeniseret til opnåelse af en vasket suspension til podning.

Organismernes evne til at vokse ved 10, 28, 36, 45 og 50°C blev undersøgt ved at pode væske af ISP-1 "Difco" -medium. Cellevægsanalyse af isomeren af diaminopimelinsyre blev udført ved Becker et 10 al.'s metode, Appl. Microbiol., 12, 421 - 423, 1964. Til bestemmelse af sukkerindholdet i cellevæggen blev Lechevalier og Lechevalier's metode, Actinomycetales, Ed. H. Prauser, Gustav Fischer, Jena, side 311 - 316, 1970, benyttet. Nocardomycolsyreanalyse blev udført ved en let modificering af Lechevalier, Lechevalier og Horan's metode, 15 Can. J. Microbiol. 19:965 - 972, 1973.

Resultater:

Mikroskopisk undersøgelse. Stammen X-14868 producerer et substratmycelium, som fragmenterer efter flere dage og tillader ekstensiv mycelial udvikling. Den producerer et luftmycelium, der består af 20 snorelignende duske, men der er ikke fundet sporer.

Cellevægsanalyse. Cellevæggen indeholder mesoisomeren af diaminopimelinsyre samt galactose og arabinose (cellevægtype IV ifølge Le-. chevalier et al.'s klassificering, Adv. Appl. Microbiol., 14, 47 - 72, 1971). Organismen synes at producere nocardomycolinsyrer. Disse 25 morfologiske og kemiske kriterier henfører X-14868 til arten Nocardia.

Makroskopisk undersøgelse. I tabel I er sammenfattet størrelsen af vækst, graden af sporedannelse, luftmassefarve, farve på bagsiden af substratmyceliet og eventuel forekomst af opløseligt pigment, der er dannet af stammen X-14868, på forskellige faste medier efter 4 uger 30 med inkubering ved 28°C.

Tabel I.

5 149639

Kulturkarakteristikum for Nocardia X-14868.

Agar- Størrelse af vækst og Luftmyceliets Farven på bagmedium luftmycelium farve3 siden af sub- 5 stratmycelium3 Gær-maltek- moderat til rigelig b (oyster 2 le (It. musstrakt vækst; noget luftmyce- white) tard tan) (ISP-2) lium i isolerede kanter, 10 læderagtig vækst

Havremel moderat vækst; mode- b (oyster 3 de (natural) (ISP-3) rat luftmycelium white)

Uorganiske sparsom vækst; spar- b (oyster 2 dc (natural, salte-sti- somt luftmycelium white) string) 15 velse (ISP-4)

Glycerol- ringe vækst; næsten b (oyster 2 ge (covert asparagin intet luftmycelium; white) tan) (ISP-5) substratmycelium 20 Gærek- rigelig vækst; spar- b (oyster 3 ge (beige) strakt somt luftmycelium; white) læderagtig vækst

Glucose- moderat vækst; spar- b (oyster 3 ge (beige) gærek- somt luftmycelium i white) i 25 strakt- kanten; læderagtig kanten pepton vækst, brunt opløseligt pigment

Tabel I fortsat 6 149639

Glucose-as- moderat vækst; noget 2 dc (natural, string) 3 ge (beige) paragin luftmycelium; læderagtrg vækst 5 Saccharose- sparsom vækst; mode-b (oyster white) gennemsigtig nitrat rat luftmycelium c (It. gray) NB: Der blev ikke fundet sporer i luftmyceliet i nogen af medierne, da de blev undersøgt efter 4 ugers in kubering.

10 3 Det anvendte farveskema var Color Harmony Manual, 4. udgave, 1958 (Container Corporation of America, Chicago).

Fysiologiske egenskaber. Stammen X-14868 hydrolyserede gelatine og casein, men ikke stivelse. Kulturen var modstandsdygtig over for en 10 enheders penicillinplade samt 0,005% lysozym opløst i 15 dyrkningsvæske, når den blev testet ved Gordon's metode, J.

Gen. Microbiol., 45, 355 - 364, 1966. Stammen peptoniserede lakmus-mælk fuldstændigt. Der kunne ikke påvises melanindannelse på ISP 1, 6 eller 7.

1 tabel II er angivet resultaterne af carbon udnyttelse på ISP 9 20 "Difco"® af stammen X-14868 ved 28°C efter 1 måneds inkubering.

Tabel II.

Carbon udnyttelse af stammen X-14868.

Carbonkilde Reaktion 3

Intet carbon/kontrol 25 D-Glucose ** D-Xylose L-Arabinose L-Rhamnose

Tabel II fortsat 7 149639 D-Fructose ± D-Galactose *

Raff i nose 5 D-Mannitol i-Inositol

Salicin i

Saccharose

Cellulose 10 _ a - = negativt respons; ± = tvivlsomt respons; + = mere vækst end på carbonkontrolprøven, men mindre end på glucose; ++ = positivt respons, der svarer til størrelsen af væksten på glucose.

I tabel III gives en liste over diagnostisk vigtige, hovedsagelig meta-15 boliske, egenskaber.

Tabel III.

Egenskaber ved X-14868.

Test Resultat ISP 1, mørkning 20 ISP 6, mørkning ISP 7, melanin

Caseinhydrolyse ++

Gelatinehydrolyse ++

Stivelseshydrolyse 25 NaCI (%) tolerance 5%

Temperatur, ved hvilken der

observeres vækst 28 og 36°C

Bagsidepigment intet

Opløseligt pigment brunt på glucose/gærek- 30 strakt-pepton

Tabel III fortsat 8 149639

Penicillinfølsomhed (10 enheders plade)

Nitratreduktion ++

Gramfarve + 5 Syrefast farve

Catalase *

Diaminopimelinsyre meso-isomer

Cellevæg-sukkerarter galactose, arabinose, ribose 10 Dannelse af nocardomycolinsyre +

Stammen X-14868 kan skelnes fra andre Nocardiaarter på basis af de i tabel IV anførte biokemiske karakteristika. Disse arter er blevet valgt af sammenligningsgrunde, idet de udgør den eneste gruppe inden for slægten Nocardia, med hvilken X-14868 har nogen grad af pheno-15 typisk affinitet.

Det fremgår af tabel IV, at meget få biokemiske data er tilgængelige for fire af arterne, nemlig N. transvalensis, N. formica, N. petrole-ophila og N. saturnea. Disse arter er imidlertid meget forskellige fra X-14868. N. transvalensis er blevet angivet at være meget lig N.

20 brasiliensis, som er medtaget i tabel IV. N. formica er muligvis forkert anbragt i slægten Nocardia og minder mere om slægten Strepto-myces. N. petroleophila og N. saturnea er meget forskellige arter med lille affinitet til andre Nocardia spp. Medlemmer af disse to arter kan leve i et carbonfrit medium ved udnyttelse af atmosfærisk carbondi-25 oxid, og dette er ikke tilfældet ved de andre arter, herunder X-14868.

Tabel IV.

9 149639

Sammenligning af stammen X-14868 med andre Nocardia arter.

E

3 U 14

tO QJ

·»· (A C (Q

>14 Ql f— W *·* 14 ·ρ- U(4«4C O ti i _ 49ICCJQI E & Ci,

U«4Ci*Or-CI»T>OCO«C"Z

tO «9 U U ·*· Cl Cl - C"0*— O > U q £ <* C Λ T- ·*- ·*- L u> — u <*. O · O-U(AOCHr- >,ral.3P03

(.•**<94-1 o U Cl r· U *-> W *“ O

O't-’i.voi'-ooO'aCJoScs V- O «O «3 *4-» <«- u Q.· C. O. V\

• ••«•••«••••I

g g Z g g g g g Z g g Z x

Carbonudnyttelse

Glucose + + + + + + + + + L-Arabinose • L-Rhamnose D-Fructose +'4 + +· 44 4 +

Galactose + +

Mannitol 444 4 4 -

Inositol +

Saccharose +

Maltose 4444 44

Mannose + ++ 444 4*

Glycerol + + 444 4 -

Lactose +

Paraffin + + + + - + + + +

Acetat 4444 444.

Butyrat 4 444 444

Mal at 444 44 +

Propionat 4444 4 +

Pyruvat 4444 444 +

Succinat 444 4 + + • Citrat + +

Nitratreduktion ++4-4-44---4 xanthinhydrolyse + - - 4 *

Gelatinehydrolyse 4- 44----·* 10 149639

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan anvendes alle sådanne stammer af slægten Nocardia, herunder mutanter og varianter af den ovennævnte stamme, som i det væsentlige har de ovenfor beskrevne egenskaber, og som producerer antibiotiket X-14868A, og som således 5 kan henføres til arten Nocardia sp. X-14868. Forbindelsen X-14868A er strukturelt identificeret i beskrivelsen, og efter at denne identifikation er kendt, er det let at skelne de stammer, der producerer den antibiotisk virksomme forbindelse X-14868A fra andre stammer.

De farmaceutisk tolerable salte af antibiotika X-14868 kan fremstilles 10 på sædvanlig måde. Disse salte fremstilles ud fra den frie syreform af antibiotikaene ved metoder, som er velkendte på området, f.eks. ved vask af den frie syre i opløsning med en egnet base eller et egnet salt. Eksempler på sådanne farmaceutisk tolerable basiske stoffer, som kan danne salte med de omhandlede antibiotika, omfatter alkalimetal-15 baser såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid og lithiumhydroxid; jordalkalimetalbaser såsom calciumhydroxid og bariumhydroxid; samt ammoniumhydroxid. Alkalimetal- eller jordalkalimetalsalte, der kan anvendes til dannelse af farmaceutisk tolerable salte, kan omfatte anioner såsom carbonater, hydrogencarbonater og sulfater.

20 En fermentations væske, som indeholder Nocardia X-14868, fremstilles ved at pode sporer eller mycelium af den organisme, der producerer forbindelserne X-14868, i et egnet medium og derefter dyrke dette under aerobe betingelser. Til produktion af X-14868 er det muligt at dyrke på et fast medium, men til produktion af store mængder fore-25 trækkes flydende medium. Dyrkningstemperaturen kan varieres inden for et vidt område, 20 - 35°C, inden for hvilket organismen kan vokse, men en temperatur på 26 - 30°C og en i det væsentlige neutral pH-værdi foretrækkes. Ved den submerse aerobe fermentering af organismen til produktion af antibiotikaene X-14868 kan mediet som 30 carbonkilde indeholde en kommercielt tilgængelig glyceridolie eller et carbonhydrat såsom glycerol, glucose, maltose, lactose, dextrin eller stivelse, i ren eller rå tilstand, og som nitrogenkilde kan der anvendes et organisk materiale såsom sojabønnemel, destillationsremanenser, jordnøddemel, bomuldsfrømel, kødekstrakt, pepton, fiskemel, gærek-35 strakt eller majsstøbevand og, om ønsket, uorganiske nitrogen kilder 11 149639 såsom nitrater og ammoniumsalte. Mediet kan også indeholde mineralsalte såsom ammoniumsulfat, magnesiumsulfat, natriumchlorid, kali-umchlorid, kaliumphosphat eller calciumcarbonat, pufferstoffer såsom natriumcitrat eller -phosphat og spormængder af tungmetalsalte. I 5 beluftede submerse kulturteknikker anvendes der fortrinsvis et an-tiskummiddel såsom flydende paraffin, fede olier eller siliconeforbin-delser. Til produktion af antibiotika X-14868 kan der anvendes mere end én type carbonkilde, nitrogenkilde eller antiskummiddel.

I nedenstående tabel V er anført den antimikrobielle virkning af anti-10 biotiket X-14868A og de tre mindre komponenter X-14868B, X-14868C og X-14868D.

12 149639

Tabel V.

Minimal inhiberende koncentration (mcg/ml) antibiotikum

5 Mikroorganisme X-14868A X-14868B X-14868C X-14868D

C (+) cocci Streptococcus faecium ATCC 8043 0,313 1,57 0,79 0,19 10 Staphylococcus aureus ATCC 6538p 6,25 6,25 62,6 12,5

Sarcina lutea ATCC 9341 12,5 12,5 250 62,5 G (+] stavbakterier

Bacillus megaterium ATCC 8011 12,5 7,5 125 61,5 15 Bacillus sp. E ATCC 27859 0,39 0,79 6,25 1,57

Bacillus subtilis NRRL 558 12,5 25 250 62,5

Bacillus sp. ATCC 27860 6,25 12,5 125 25 G (+) filamenter 20 Mycobacterium phlei ATCC 355 12,5 25 250 62,5

Streptomyces cell u losae ATCC 3313 25 25 500 125

Svampe

Paecllomyces varioti 25 ATCC 26820 250 500 1 1

Penicrllum digitatum ATCC 26821 1000 1000 1 1 Gærarter Candida albicans 30 NRRL 477 250 100 1 1

Saccharomyces cerevrsiae NRRL 4226 1000 1 1 1

Inaktiv ved 1 mg/ml over for de testede svampe og gærarter.

13 149639

Som anført i tabel V har antibiotiket X-14868A og dets tre mindre komponenter evne til at virke hæmmende på væksten af visse grampositive bakterier. De kan derfor være nyttige i vaskeopløsninger til sanitære formål såsom vask af hænder og rensning af udstyr, gulve 5 eller møbler i forurenede rum eller laboratorier.

I nedenstående tabel VI er anført den anti-coccidale virkning i forhold til en inficeret ubehandlet kontrol (IUC) og en ikke-inficeret, ubehandlet kontrol (UUC) ved den nedenfor anførte testmetode.

Tabel VI.

10 Gennemsnitlig infektionsgrad intestinal læsion, point

Gruppe Kone., Vægtfor- Døde- Øvre Middel Ceca Gennem-% øgelse,% lighed snit 15 UUC 100 0 0,0 0,0 0,0 0,0 IUC 37 20 2,7 2,0 3,0 2,6 X-14868A, 0,002 39 0 0,0 0,0 0,0 0,0 natriumsalt 20 Lot-1 0,001 81 0 0,2 0,0 0,0 0,07 0,0005 96 0 0,4 0,3 0,0 0,2 X-14868A, 0,002 60 0 0,0 0,0 0,0 0,0 natriumsalt

25 Lot-1 A

14 149639

Testmetode. Ved denne test anvendes 10 kyllinger for hver medikamentgruppe. 10 kyllinger anvendes som vægtkontrol, og 10 kyllinger anvendes som inficeret kontrol. Medikamentet indgives 48 timer før infektionen. 1 g af testmedikamentet blandes i et mekanisk blande-5 apparat med en tilstrækkelig mængde kyllingefoder til at give den ønskede dosis. Infektionen udføres ved oral administration med pipette af ca. 300.000 oocyter af Eimeria acervulina, E. mivati, E. maxima, E. necatrix og E. tenella. Testen varer i 6 dage, hvorefter de overlevende dyr obduceres og undersøges for store læsioner i ceca. For-10 søgsdyrene bedømmes efter antallet af overlevende og antallet af intestinale læsioner. Resultatet udtrykkes som den gennemsnitlige infektionsgrad (A.D.I.). En gennemsnitlig infektionsgrad på mindre end 2,5 anses for signifikant.

Coccidiostatiske præparater, der som aktiv bestanddel indeholder 15 antibiotiket X-14868A eller farmaceutisk tolerable salte deraf eller den . tørrede ikke-filtrerede dyrkningsvæske, fremstilles ved at blande den aktive bestanddel med et inert stof. Den inerte bestanddel kan f.eks. være et foder eller et fortyndingsmiddel. Med udtrykket "inert bestanddel" menes et materiale, som ikke virker som antiparasitisk 20 middel, f.eks. en coccidiostat, som er inaktivt over for den aktive bestanddel, og som let indtages af de dyr, der skal behandles.

Den aktive bestanddel bevirker, når den administreres oralt til husdyr, som er under mistanke for at have coccidiosis, især fjerkræ såsom kalkuner og kyllinger, som en komponent i foderet, en effektiv 25 bekæmpelse af sygdommen, idet den enten forhindrer den eller helbreder den efter dens indtræden. Endvidere holder det behandlede fjerkræ vægten eller forøger vægten i sammenligning med kontroldyr.

Således virker de omhandlede præparater ikke kun ved bekæmpelse af coccidiosis, men også ved at forbedre effektiviteten af omdannelsen af 30 foder til vægtforøgelse.

Den aktuelle koncentration af den aktive bestanddel i dyrefoderet kan naturligvis reguleres efter det individuelle behov og kan variere inden for et bredt område. De begrænsende kriterier for koncentrationen er, at den minimale koncentration er sådan, at der fås en 15 149639 tilstrækkelig mængde aktiv bestanddel til at bevirke den ønskede bekæmpelse af coccidiosis, og at den maksimale koncentration er sådan, at mængden af det indtagne præparat ikke resulterer i uheldige eller uønskede bivirkninger.

5 Således indeholder f.eks. en færdig foderforblanding eller et helfoder en tilstrækkelig mængde aktiv bestanddel til at udgøre mellem ca.

0,0003 og ca. 0,001 vægtprocent af det daglige foderforbrug. Der anvendes fortrinsvis ca. 0,0005 - 0,001 vægtprocent. Generelt er ca.

0,0005% aktiv bestanddel tilstrækkeligt til forebyggelse og bekæmpelse 10 af coccidiosis. Mængder på over 0,001% giver, selv om de er effektive over for coccidiosis, generelt ikke forbedrede resultater i forhold til 0,001% og kan i nogle tilfælde påvirke væksten, foderudnyttelsen og mortaliteten i ugunstig retning.

Selv om mængder på over 0,001% er effektive til bekæmpelse af cocci-15 diosis, er denne mængde den foretrukne øvre grænse på grund af økonomien, dvs. at omkostningen pr. effektivitetsenhed er lavest inden for dette område. Mængder på under 0,0003% er ikke effektive til bekæmpelse af coccidiosis. En nedre grænse på 0,0005% foretrækkes, da denne sikrer effektivitet. Den mest foretrukne mængde, dvs.

20 ca. 0,0005 vægtprocent af den daglige mængde foder til fjerkræ, er særlig effektiv, da den fører til maksimal effekt med minimal dosis.

Det optimale dosisniveau vil naturligvis variere med dyrets størrelse.

Ved anvendelse af antibiotiket, der fås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, til behandling eller forebyggelse af coccidiosis, kan det 25 først tilsættes eller blandes med en foderbestanddel eller et bærestof til dannelse af en foderadditivpræmix, et foderkoncentrat eller et foderadditivsupplement. Et foderadditiv, et koncentrat eller en forblanding er et stof, som skal fortyndes til dannelse af et helfoder, dvs. et stof, der er beregnet på direkte indtagelse af dyret, eller 30 som kan fortyndes yderligere til dannelse af et helfoder eller kan indtages og anvendes som supplement til andre rationer. Foderad-ditivsupplementer, koncentrater og forblandinger indeholder en relativt stor procentisk andel af coccidiostater, dvs. den aktive bestanddel sættes til egnet bærestof og blandes på en sådan måde, at 16 149639 der opnås en i det væsentlige ensartet fordeling af coccidiostaten i bærestoffet. Egnede bærestoffer er faste stoffer, som er inerte over for den aktive bestanddel, og som med sikkerhed fordøjes af det dyr, som skal behandles. Typiske bærestoffer er kommercielt tilgængelige 5 fjerkræfoderstoffer, formalede kornarter, kornbiprodukter, plante proteinkoncentrater (soja eller jordnødder), biprodukter fra fermentering, salte, kalk, uorganiske forbindelser eller blandinger deraf.

Flydende dispergeringsmidler kan fremstilles under anvendelse af vand eller vegetabilsk olie, fortrinsvis under anvendelse af et over-10 fladeaktivt middel eller en emulgator i flydende dispersion såsom ethylendiamintetraeddikesyre og solubiliseringsmidler. Alle egnede bærestoffer eller fortyndingsmidler kan virke som inert bestanddel i den faste form af det antiparasitiske middel under forudsætning af, at de er inerte over for det aktive materiale og er ikke-toxiske for det 15 dyr, hvortil de skal administreres.

Den aktive bestanddel kan blendes til et blandfoder, en pille eller en hvilken som helst ønsket form med det inerte bærestof eller faste fortyndingsmiddel ved en hvilken som helst sædvanlig teknik. F.eks. kan der dannes præparater ved finformaling eller pulverisering af den 20 aktive bestanddel og den inerte ingrediens under anvendelse af et hvilket som helst tilgængeligt formalingsapparatur eller en pulverisator med eller uden foderstoffet. Hvis foderstoffet ikke er med, når formalingen eller pulveriseringen udføres, kan det resulterende stof fordeles i et hvilket som helst sædvanligt tilgængeligt foderstof.

25 Typiske fjerkræfoderstoffer, som kan medikeres med den aktive bestanddel, kan indeholde flere bestanddele; f.eks. kan de indeholde kornprodukter med højt energiindhold såsom majs, hvede, "wheat red dog"-meI, milokorn eller havremel; kornprodukter med middelhøjt eller lavt energiindhold, f.eks. havre, byg, hvedemel, "middlings" eller 30 "standard middlings"; stabiliserede fedtstoffer, vegetabilsk protein såsom sojabønnemel, majsglutenmel eller jordnødderne!; animalsk protein såsom fiskemel, "fish solubles, "meat scraps"; UGF (uidentificeret vækstfaktor)-kilder og andre B-vitaminbærestoffer såsom tørmælksprodukter, tørret bryggerigær, tørrede destillationsremanenser eller 35 fermenteringsremanenser; dehydratiseret alfalfamel; og forskellige specielle additiver såsom supplerende riboflavin, vitamin B^/ calci- 17 149639 umpantothenat, niacin, cholin, vitamin K eller vitamin E og stabiliseret vitamin A, vitamin Dg (D-aktiverede animalske steroler); calcium-og phosphorsupplementer såsom dicalciumphosphat, dampet benmel, defluoreret phosphat eller kalk; ioderet salt, mangansulfat, zinkcar-5 bonat eller et antibiotisk fodersupplement; methionin eller dets hy-droxyanaloge og antioxidant.

Som det fremgår af det ovenstående forudses coccidiostatpræparaterne anvendt til oral indgivelse. De kan sættes til det normale foder til det dyr, der skal behandles, eller de kan administreres ad anden vej, 10 f.eks. blive inkorporeret i en tablet, en pille eller en bolus, som kan tvangsgives til dyret. Administrationen af den aktive bestanddel må vælges alt afhængig af det enkelte dyr i overensstemmelse med den teknik, der anvendes i praksis.

De mindre komponenter X-14868B, C og D har også anticoccidal virk-15 ning, når de afprøves in vitro. X-14868B har også vist sig at være virksom in vivo.

Antibiotiket X-14868A har også vist sig at have vækstfremmende virkning på drøvtyggere, dvs. dyr med vomfunktion, f.eks. kvæg. En diskussion af den mekanisme, ved hvilken foder fordøjes, nedbrydes 20 og metaboliseres af drøvtyggere, kan ses i USA patentskrift nr.

3.839.557, som omhandler anvendelsen af visse antibiotika til forbedring af foderudnyttelsen hos drøvtyggere, og hvortil der henvises.

Økonomisk vigtige drøvtyggere omfatter kvæg, får og geder.

Effektiviteten af antibiotiket X-148G8A til modificering af forholdet 25 mellem flygtige fedtsyrer, som produceres i vommen (og således forbedrer drøvtyggerens foderudnyttelse), påvises ved hjælp af følgende test in vitro.

Vomvæske fås fra en stud, der er udstyret med en vom-fistula.

Studen holdes på følgende foder: 149639 18

Majs: 89,93%

Alfalfamel: 5,000%

Sojabønneoliemel: 3,00%

Kalk: 0,80% 5 NaCI: 0,60%

Dicalciumphosphat: 0,50%

Spormineraler: 0,025%

Vitamin-præmix-tilsætning: 0,1%

Vitamin A, TIU: 4,0003 10 Vitamin Dg, IU: 0,801

Vitamin E, TIU: 3,002.

Vomvæsken sies straks gennem en si. Til hver fermentering sættes 75 ml af den resulterende væske til en 250 ml kolbe, som har følgende bestanddele: 15 1 g af en blanding af fintformalet korn og hø i forholdet 80%:20%; 1 ml af en 18%'s vandig glucoseopløsning (1 millimol/kolbe); 1,5 ml af en 3,1%'s vandig urinstofopløsning (0,76 millimol/kolbe); 60 mikromol af hver af de 10 essentielle aminosyrer (arginin, histidin, leucin, methionin, threonin, valin, lysin, isoleucin, phenylalanin og 20 tryptophan); og 1 ml af en vandig opløsning af testmedikamentet, hvorved der fås enten 10 eller 25 yg/ml (beregnet på hele fermentationsblandingens rumfang på 80 ml).

Hver kolbe inkuberes ved 38°C under rystning i et vandbad, som er 25 forsynet med gashætte. Carbondioxid ledes kontinuerligt gennem hætten. Efter 4 timers inkubering centrifugeres 10 ml af fermentationsvæsken ved 14.000 rpm (ca. 30.000 g) i 20 minutter. 3 ml af den overstående væske sættes til 1 ml af en 25%'s metaphosphorsyreopløs-ning, som indeholder 23 mikromol 2-methylvalerianesyre som intern 30 standard. Den resulterende væske lades sætte sig ved stuetemperatur i 30 minutter. Væsken filtreres gennem et 0,22 millimikron "Millipo-re"-filter og afkøles, indtil der udføres gas-væskechromatografisk analyse for flygtige fedtsyrer.

19 149639

Resultaterne af gas-væskechromatografisk analyse (GLC) på fire in vitro-kontrolfermentationer og to fermentationer, hvortil der er sat henholdsvis 10 og 25 ppm antibiotikum X-14868A, fremgår af nedenstående tabel VII.

5 Tabel VII.

Forholdet mellem mol propionat (Cg) og acetat (Cg) plus n-butyrat (nCj) i in vitro-vom-fermentationer

Flygtig fedtsyre 10 VFA mol for hold

Forbindelser Koncentration C^ffC^+nC^) % positiv kontrol

Negativ kontrol 0 0,203 51,8 X-14868A 5 ppm 0,323 82,5 50 ppm 0,358 91,2 15 Positiv kontrol (Monensin) 50 ppm 0,392 100,0

Som vist i tabel VII forbedres forholdet mellem propionat (Cg) og acetat og n-butyrat signifikant. Ved forøgelse af propionater frem for 20 acetater ud fra carbonhydraterne forøges effektiviteten af carbonhy-drat og dermed foderudnyttelsen.

Administration af antibiotikum X-14868A (herefter kaldt "antibiotikum" eller "antibiotisk forbindelse") forebygger og behandler ketose samt forbedrer foderudnyttelsen. Ketoses tilgrundliggende mekanisme er en 25 mangelfuld produktion af propionatforbindelser. Den behandling, der for tiden anbefales, er administration af propionsyre eller foderstoffer, som fortrinsvis danner propionater. Det er klart, at en tilskyndelse til propionatdannelse ud fra almindelige foderstoffer reducerer hyppigheden af ketose.

20 149639

Det har vist sig, at antibiotiket X-14868A forøger effektiviteten af foderudnyttelsen hos drøvtyggere, når det administreres oralt til dyrene. Den letteste måde at administrere antibiotiket er at blande det i dyrets foder.

5 Antibiotiket kan imidlertid også med fordel administreres på andre måder. F.eks. kan det inkorporeres i tabletter, flydende former, boli eller kapsler og gives til dyrene. Formulering af antibiotikumforbindelsen til sådanne dosisformer kan udføres ved metoder, som er velkendte inden for veterinærmedicinen.

10 Kapsler fremstilles let ved at fylde gelatinekapsler med en hvilken som helst ønsket form af det ønskede antibiotikum. Om ønsket kan antibiotiket fortyndes med et inert pulverformet fortyndingsmiddel, f.eks. sukker, stivelse eller renset krystallinsk cellulose, for at forøge dets volumen for at gøre kapselfyldningen lettere.

15 Tabletter af antibiotiket fremstilles ved sædvanlige farmaceutiske processer. Foruden den aktive bestanddel indeholder en tablet normalt en base, en desintegrant, en absorbent, et bindemiddel og et smøremiddel. Typiske baser omfatter lactose, flormelis, natriumchlorid, stivelse og mannitol. Stivelse er også en god desintegrant, ligesom 20 algininsyre er det. Overfladeaktive midler såsom natriumlauryfsulfat og dioctylnatriumsulfosuccinat anvendes også undertiden. Almindeligt anvendte absorbenter omfatter også her stivelse og lactose, medens magnesiumcarbonat også kan anvendes til olieagtige stoffer. Hyppigt anvendte bindemidler er gelatine, gummiarter, stivelse, dextrin og 25 forskellige cellulosederivater. Blandt de almindeligt anvendte smøremidler er magnesiumstearat, talkum, paraffinvoks, forskellige metalliske sæber og polyethylenglycol.

Administrationen af antibiotikumforbindelsen kan foregå ved en langsomt opløselig bolus. Sådanne boli fremstilles ligesom tabletter, bort-30 set fra, at et middel, som forsinker opløsningen af antibiotiket, er inkorporeret. Boli fremstilles til frigørelse over længere perioder. Den langsomme opløsning fremmes ved anvendelse af en meget vanduoplø-selig form af antibiotiket. Et stof såsom jernfilspåner tilsættes for at 21 149639 forøge bolusens vægtfylde og for at holde den på plads i bunden af vommen.

Opløsning af antibiotiket forsinkes ved anvendelse af en matrix af uopløselige stoffer, i hvilken medikamentet er indlejret. F.eks. kan 5 der anvendes stoffer såsom vegetabilske voksarter, rensede mineral-voksarter og vanduopløselige polymerstoffer.

Flydende former af antibiotiket fremstilles lettest ved at vælge en vandopløselig form af antibiotiket. Hvis der af én eller anden grund ønskes en uopløselig form, kan der fremstilles en suspension. Alter-10 nativt kan en flydende form formuleres som en opløsning i et fysiologisk tolerabelt opløsningsmiddel såsom polyethylenglycol.

Suspensioner af uopløselige former af antibiotiket kan fremstilles i ikke-opløsningsmidler såsom vegetabilske olier, f.eks. jordnøddeolie, majsolie eller sesamolie, i en glycol såsom propylenglycol eller en 15 polyethy lenglycol; eller i vand, alt afhængig af det valgte antibio tikums form.

Egnede fysiologisk tolerable adjuvanser er nødvendige for at holde antibiotiket suspenderet. Adjuvanserne kan vælges blandt fortykkelsesmidler, f.eks. carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidon, gelatine 20 og alginater. Mange typer overfladeaktive midler kan anvendes til at suspendere antibiotikum. F.eks. kan lecithin, alkylphenol/polyethy-lenoxid-adduktionsprodukter, naphthalensulfonater, alkylbenzensulf-onater og polyoxyethylensorbitanestere anvendes til fremstilling af suspensioner i flydende ikke-opløsningsmidler.

25 Der kan desuden tilsættes mange stoffer, som indvirker på hydrofili-teten, vægtfylden og væskens overfladespænding ved fremstillingen af suspensioner i individuelle tilfælde. F.eks. kan silicone-antiskummid-ler, glycoler, sorbitol og sukkerarter være nyttige suspenderingsmidler.

30 Det suspenderbare antibiotikum kan tilbydes til brugeren som en suspension eller som en tør blanding af antibiotiket og adjuvanser til fortynding før brug.

22 149639

Antibiotiket kan også administreres i drøvtyggernes drikkevand. Inkorporering i drikkevandet udføres ved at sætte en vandopløselig eller vand-suspenderbar form af antibiotiket til vandet i en passende mængde. Formulering af antibiotiket til tilsætning til drikkevandet 5 følger de samme principper som formulering af flydende former.

Den mest praktiske måde at behandle dyr med antibiotikumforbindelsen på er at inkorporere forbindelsen i foderet. Alle typer foder kan medikeres med antibiotikumforbindelserne, herunder almindelige tørre foderstoffer, flydende foderstoffer og pelletterede foderstoffer.

10 Metoderne til formulering af medikament til dyrefoderstoffer er velkendte. Det er sædvanligt at fremstille en koncentreret medikament-præmix som råstof til medikerede foderstoffer. F.eks. kan typiske medikamentpræmixer indeholde mellem ca. 2 og ca. 800 g/kg præmix.

Det brede område skyldes det brede koncentrationsområde for medi-15 kamentet, som kan ønskes i det endelige foder. Præmixer kan være enten flydende eller faste.

Formuleringen af drøvtyggerfoderstoffer, som skal indeholde passende mængder antibiotikum til virksom behandling, er velkendt. Det er blot nødvendigt at beregne den mængde forbindelse, som ønskes admini-20 streret til hvert dyr, at indregne mængden af foder/dag, som dyret æder, og den koncentration af antibiotikumforbindelsen, der er i den anvendte præmix, og at beregne den rigtige koncentration af antibiotikumforbindelsen eller af præmixen i foderet.

Alle metoder til formulering, blanding og pellettering af foderstoffer, 25 · som normalt anvendes til drøvtyggerfoder, kan anvendes til fremstilling af foderstoffer, som indeholder antibiotikumforbindelsen.

Det er blevet vist, at oral administration af antibiotiket på fordelagtig måde ændrer dannelsen af propionater i forhold til dannelsen af acetater i vommen. Det kan derfor postuleres, at den samme behand-30 ling også vil være fordelagtig for en-mavede dyr, som fordøjer fibrøse vegetabilske materialer i cecum, da det må forventes, at en gunstig ændring i propionat/acetat-forholdet vil indtræde efter oral administration af det pågældende antibiotikum.

23 149639

Heste, svin og kaniner er eksempler på dyr, som fordøjer en del af deres foder ved cecal fermentering.

Antibiotikum X-14868A har også vist aktivitet som middel til behandling eller forebyggelse af svinedysenteri. Forbindelsen er blevet 5 undersøgt for virkning mod Treponema hyodysenteriae, som forårsager svinedysenteri. Resultaterne, som viser en sammenligningstest ved velkendte testmetoder i forhold til et kendt middel til behandling og forebyggelse af svinedysenteri, fremgår af nedenstående tabel VIII.

10 Tabel VIII.

Minimal inhiberende koncentration (mcg/ml) T. hyodysenteriae-stamme X-14868A Ipronidazol 1 0,05 0,63 15 2 0,05 0,63 3 0,05 0,63 4 0,05 2,5

Middeltal 0,05 1,1

De antibiotisk aktive forbindelser X-14868B, C og D udviser anti-20 coccidial aktivitet in vitro mod en Escherichia tenella, hvilket fremgår af nedenstående tabel:

Aktivitet in vitro mod Escherichia tenella

Forbindelse PPM effektiv mod E. tenef la X-14868B 0,1 25 X-14868C 10,0 X-14868D 10,0.

24 149639 IR-Absorptionsspektrene for de respektive forbindelser er følgende: X-14868A - fig. 1 X-14868B - fig. 2 X-14868C - fig. 3 5 X-14868D - fig. 4.

I tabel IX er angivet fysiske konstanter for de forskellige komponenter, der produceres ved dyrkning af Nocardia X-14868.

25 149639

Tabel IX.

Fysiske konstanter for komponenter af X-14868

Komponent Nr. Smp. C [aj^, specifik Mikroanalyse, fundet 5 drejning i %C %H %Na %OMe chloro- me-form tha-nol 10 X-14868A 193-195 +40,6° +23,8° 60,11 8,54 2,38 12,10 X-14868B 172,5-174 +46,1° +34,8° 60,97 8,60 1,23 14,87 X-14868C 172-175 +49,6° +30,5° 57,13 8,58 2,36 10,25 X-14868D 194-195 +41,1° +29,2° 60,32 8,80 3,40 $ 15 Mikroanalyse, beregnet for forbindelse A og B Molvægt %C %H %Na %OMe X-14868A: C47H79°17Na 939,25 60,10 8,50 2,45 13,22 20 X-14868B (i dimer form): C96H163°34Na‘H2° 1902,36 60,61 8,75 1,21 16,54

Opfindelsen belyses nærmere i nedenstående eksempler: 26 149639

Eksempel 1.

Fermentering af Nocardia X-14868 i rystekolbe.

Nocardia X-14868, ATCC 31585 dyrkes og holdes på en stivelse-case-in-agarskråkultur med følgende sammensætning (g/liter destilleret 5 vand):

Opløselig stivelse 10,0 Casein 1,0 K2HP04 0,5 Vandfrit MgSC>4 0,5

Agar 20,0.

pH-Værdien indstilles på 7,4 med natriumhydroxid før autoklavering 10 ved 1 atmosfæres tryk i 20 minutter.

Skråkulturen podes med Nocardia X-14868-kultur og inkuberes ved 28°C i 7 - 14 dage. Et stykke myceliumholdig agar fra den velvoksede agar-skråkultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 100 ml steriliseret podningsmedium med følgende 15 sammensætning (g/liter destilleret vand):

Tomatpresserester 5,0

Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0 20 Majsstivelse 20,0

Calciumcarbonat 1,0 k2hpo4 1,0.

pH-Værdien indstilles på 7,0 med natriumhydroxid før sterilisation.

Det podede podningsmedium inkuberes ved 28°C i 72 timer i et med 25 250 rpm roterende rysteapparat.

En 3 ml's portion (3 v/v%) af den resulterende kultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml steriliseret produktionsmedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand): 27 149639

Glycerol 40,0 Pepton 5,0

Cerelose 2,0 Kartoffelstivelse 2,0

Affedtet sojagrit 5,0

Af bitret tørret gær 5,0 5 Natri umchlorid 5,0

Calciumcarbonat 0,2.

pH-Værdien indstilles på 6,4 før autoklavering.

Det podede medium inkuberes ved 28°C i 5 dage i et rysteapparat med 250 rpm. Styrken af antibiotikum X-14868A i fermentation s væsken 10 bedømmes ved forsøg mod Staphylococcus aureus ATCC 6538P under anvendelse af en agardiffusions-hulpladeteknik.

Eksempel 2.

Isolering af antibiotikum X-14868A-natriumsalt og antibiotikum X-14868B-natriumsalt fra en rystekolbefermentation: 15 Trin A: Hele væsken fra 50 halv-liters Erlenmeyerkolber, opnået som beskrevet i eksempel 1, og som hver indeholder 100 ml, efter 5 dages fermentering sammenhældes (5 liter) og ekstraheres to gange med et halvt rumfang ethylacetat. Efter omrøring i 1/2 time fraskilles opløsningsmiddelfasen og inddampes til en olie (4 g) under reduceret tryk.

20 Olien opløses i diethylether og chromatograferes på en ved diethyl-etheropslæmning pakket kolonne med 200 g silicagel. Kolonnen elueres med en gradient mellem 2 liter diethylether og 2 liter diethylether/-acetone (9:1) og derefter 2 liter diethylether/acetone (1:1) og endelig 2 liter methylenchlorid/ethylalkohol (7:3). Fraktioner på hver 40 ml 25 opsamles, og fraktion nr. 18 - 75 sammenhældes, opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, og den således vundne remanens (1,66 g) opløses i ethylacetat og vaskes to gange med et lige så stort rumfang IN HCI, hvorefter der vaskes to gange med et lige så stort rumfang af en ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløsning.

30 Opløsningsmiddelfasen tørres over natriumsulfat og ved tilsætning af 28 149639 n-hexan fås antibiotikum X-14868A-natriumsalt-krystaller. Ved omkrystallisation af ethylacetat/n-hexan fås en analyseren prøve af antibiotikum X-14868A-natriumsalt, smeltepunkt 193 -194°C.

Trin B: Fra fraktion nr. 161 - 215 fås, efter at opløsningsmidlet er 5 fjernet under reduceret tryk, og remanensen er optaget i ethylacetat og vasket med 1N HCI efterfulgt af ved stuetemperatur mættet natri-umcarbonatopløsning og tørring over natriumsulfat og påfølgende tilsætning af n-hexan, antibiotikum X-14868B-natriumsalt-krystaller/ smeltepunkt 172,5 - 174°C.

10 Eksempel 3.

Tankfermentering af Nocardia X-14868.

En kultur af Nocardia X-14868, som producerer antibiotiket X-14868A, dyrkes og holdes på en stivelse-casein-agarskråkultur med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand): 15 Opløselig stivelse 10,0

Casein 1,0 K2HP04 0,5

Vandfrit magnesiumsulfat 0,5

Agar 20,0.

20 pH-Værdien indstilles til 7,4 med natriumhydroxid før autoklavering.

Skråkulturen podes med en kultur af Nocardia X-14868 og inkuberes ved 28°C i 7 - 14 dage. Et stykke agar med mycelium fra den vel-groede agar-skråkultur anvendes derefter til fremstilling af et vegetativt inokulum ved podning af en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som inde-25 holder 100 ml inokulummedium med følgende sammensætning (g/ liter destilleret vand): 29 149639

Tomatpresseremanens 5,0

Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0 5 Majsstivelse 20,0

Calciumcarbonat 1,0 k2hpo4 1,0.

pH-Værdien indstilles på 7,0 før autoklavering.

Det podede medium inkuberes i 72 timer ved 28°C i et med 250 rpm 10 roterende rysteapparatur.

60 ml (3 v/v%) af denne kulturvæske anvendes til podning af en 6 liters Erlenmeyerkolbe, som indeholder 2 liter inokulummedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Tomatpresseremanens 5,0 15 Destillationsremanens 5,0

Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Majsstivelse 20,0

Calciumcarbonat 1,0 20 K2HP04 1,0.

pH-Værdien indstilles på 7,0 før autoklavering.

Det podede medium inkuberes i 72 timer ved 28°C i et med 250 rpm roterende rysteapparatur. 1 liter af denne kultur anvendes til at pode 230 liter af nedenstående 25 produktionsmedium i en 380 liters fermenteringsbeholder (g/liter ledningsvand): 30 149639

Glycerol 40,0

Pepton 5,0

Cerelose 2,0

Kartoffelstivelse 2,0 5 Affedtet sojag rit 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Natriumchlorid 5,0

Calciumcarbonat 0,2

Antiskummiddel 0,1.

10 pH-Værdien i mediet indstilles på 6,4 før sterilisering i 1,25 time med 2 4,2 kg/cm damp.

Det podede medium beluftes med komprimeret luft i en mængde på 90 liter/minut og omrøres med omrørere med 280 rpm. Fermenteringen udføres ved 28°C i 5 dage.

15 Styrken af antibiotiket X-14868A i fermentationsvæsken bedømmes ved forsøg mod Staphylococcus aureus ATCC 6538P under anvendelse af agardiffusions-hulpladetest.

Eksempel 4.

Isolering af antibiotikum X-14868A-, -C- og -D-natriumsalt fra tank-20 fermentation af Nocardia X-14868.

Trin A: Til hele væsken fra en 230 liters fermentation som beskrevet i eksempel 3 sættes efter 115 timers vækst et lige så stort rumfang ethylacetat. Efter omrøring i 1 time fraskilles opløsningsmiddelfasen, og den inddampes til 4,2 liter under reduceret tryk. Den koncentre-25 rede opiøsningsmiddelekstrakt vaskes to gange med et lige så stort rumfang IN HCI og derefter to gange med et lige så stort rumfang af ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløsning. Opløsningsmiddelfasen tørres over natriumsulfat og inddampes under reduceret tryk til en olien. Olien opløses i n-hexan og ekstraheres én gang med 30 acetonitril og derefter to gange med acetonitril/methanol i forholdet U9639 31 8:2. Acetonitril- og acetonitril/methanol (8:2)-ekstrakterne sammenhældes, og opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk. Den resulterende olie opløses i diethylether, behandles med aktivkul og filtreres, og ved tilsætning af n-hexan fås rå antibiotikum X-14868A-natri-5 umsalt-krystaller. De rå antibiotikumkrystaller opløses i methylenchlo-rid og underkastes chromatografi på en ved methylenchloridopslæm-ning pakket kolonne med 600 g silicagel. Kolonnen elueres med 4 liter diethylether/acetone/ammoniakvand i forholdet 8:2:0,02. Fraktioner på hver 45 ml opsamles, og fraktion nr. 13 - 15 sammenhældes. Op-10 løsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, og remanensen opløses i ethylacetat og vaskes først to gange med IN HCI og derefter to gange med ved stuetemperatur mættet natriumcarbonatopløsning og tørres over natriumsulfat. Ethylacetatfasen inddampes til en olie, som opløses i methylenchlorid, og ved tilsætning af n-hexan fås krystallinsk anti-15 biotikum X-14868A-natriumsalt, smeltepunkt 193 - 195°C.

Trin B: Moderluden fra de rå antibiotikum X-14868A-natriumsalt-krystaller (beskrevet ovenfor i trin A) chromatograferes på en ved methylenchloridopslæmning pakket kolonne med 1 kg silicagel. Kolonnen elueres med 1 liter n-hexan og derefter med en graduent mellem 4 20 liter diethylether/n-hexan (7:3) og 4 liter diethylether/acetone (8:2).

Fraktioner på hver 40 ml opsamles, og fraktion nr. 43 - 80 sammenhældes. Opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, og remanensen opløses i ethylacetat og vaskes med 1N HCI efterfulgt af ved stuetemperatur mættet vandig natriumcarbonatopløsning, og der be-25 handles med aktivkul. Efter filtrering inddampes ethylacetatfasen til en olie. Olien opløses i diethylether, og ved tilsætning af n-hexan fås yderligere antibiotikum X-14868A-natriumsalt, smeltepunkt 193 -195°C.

Trin C: Fraktion nr. 22 - 40 fra den i trin A beskrevne silicagel-kolonne giver krystallinsk antibiotikum X-14868C-natriumsalt, smel-30 tepunkt 172 - 175°C.

Trin D: Moderluden fra det i trin B beskrevne krystallinske antibiotikum X-14868A-natriumsalt og fraktion nr. 16 - 21 fra den i trin A beskrevne silicagelkolonne sammenhældes, inddampes og underkastes chromatografi på en ved methylenchloridopslæmning pakket 600 g sili- 32 149639 cagelkolonne. Kolonnen elueres med 4 liter diethylether/hexan (1:1), 4 liter diethylether/acetone/n-hexan/ammoniakvand (6:2:2:0,002) og 2 liter diethylether/acetone (8:2). Fraktioner på hver 40 ml opsamles.

Fraktion nr. 71 - 98 sammenhældes, og ved krystallisation fås yder-5 ligere krystallinsk antibiotikum X-14868A-natriumsalt. Fraktion nr.

141 - 172 sammenhældes også, opløsningsmidlet fjernes under reduceret tryk, og ved krystallisation af diethyler/n-hexan fås antibiotikum X-14868D-natriumsalt, smeltepunkt 194 - 195°C.

Eksempel 5.

10 Fremstilling af thalliumsaltet af antibiotikum X-14868A.

En opløsning af 51 mg af antibiotikum X-14868A-natriumsalt opnået ifølge eksempel 2 i methylenchlorid vaskes med IN HCI og derefter med vand og derefter fire gange med en vandig opløsning af thal-liumcarbonat. Opløsningsmidlet fraskilles og inddampes til et lille 15 rumfang under reduceret tryk, og efter tilsætning af n-hexan fås krystallinsk thalliumsalt af antibiotikum X-14868A. Ved omkrystallisation af diethylether/n-hexan fås krystaller, der er egnede til røntgenanalyse.

Eksempel 6.

20 Fremstilling af calciumsaltet af antibiotikum X-14868A.

En opløsning af 200 mg af antibiotikum X-14868A-natriumsalt opnået ifølge eksempel 2 i ethylacetat vaskes først med IN HCI og derefter tre gange med ved stuetemperatur mættet vandig calciumhydroxidop-løsning. Opløsningsmidlet fraskilles og fjernes under reduceret tryk.

25 Calciumsaltet af antibiotikum X-14868A isoleres som et hvidt fast skum.

33 149639

Eksempel 7.

Rystekolbefermentering af Nocardia X14868.

Nocardia X-14868, ATCC 31585 dyrkes og holdes på en stivelse-case-in-agarskråkultur med følgende sammensætning (g/liter destilleret 5 vand):

Opløselig stivelse 10,0

Casein 1,0 K2HP04 0,5

Vandfrit magnesiumsulfat 0,5 10 Agar 20,0.

pH-Værdien indstilles på 7,4 med natriumhydroxid før autoklavering ved 1 atmosfæres tryk i 20 minutter.

Skråkulturen podes med Nocardia X-14868-kultur og inkuberes ved 28°C i 7 - 14 dage. Et stykke myceliumholdig agar fra den velvoksede 15 agar-skråkultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyer-kolbe, som indeholder 100 ml steriliseret podningsmedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

Tomatpresserester 5,0

Destillationsremanens 5,0 20 Pepton 5,0

Afbitret tørret gær 5,0

Majsstiveise 20,0

Calciumcarbonat 1,0 k2hpo4 1,0 25 pH-Værdien indstilles på 7,0 med natriumhydroxid før sterilisation.

Det podede podningsmedium inkuberes ved 28°C i 72 timer i et med 250 rpm roterende rysteapparat.

Claims (3)

149639 En 3 ml's portion (3 v/v%) portion af den resulterende kultur anvendes derefter til at pode en 500 ml Erlenmeyerkolbe, som indeholder 100 ml steriliseret produktionsmedium med følgende sammensætning (g/liter destilleret vand):

5 Cerelose 45,0 Stivelse 20,0 Sojabønnemel 15,0 Caseinhydrolysat (syre) 1,0 "Black strap"-me!asse 3,0

10 Calciumcarbonat 2,5 Ledningsvand ad 1 liter pH-værdi 7,1 Det podede medium inkuberes ved 28°C i 7 dage i et med 250 rpm roterende rysteapparat. Styrken af antibiotiket X-14868A i fermen-15 tationsvæsken bedømmes ved forsøg mod Staphylococcus aureus ATCC 6538P under anvendelse af agardiffusions-hulpladetest. Fremgangsmåde til fremstilling af én eller flere af de antibiotisk aktive polyetherforbindelser betegnet X-14868A, X-14868B, X-14868C og X-20 14868D, hvor antibiotikum X-14868A og X-14868B har formlen I OMe rV· fOH 0 UH ^ O-sfci ί (Tj—2s 0-4'Me h Me Me H Me Η Η H OR