HU187763B

HU187763B - Process for producing new polyether compounds

Info

Publication number: HU187763B
Application number: HU81180A
Authority: HU
Inventors: Chao-Min Liu; Barbara Prosser; John Westley
Original assignee: F.Hoffmann-La Roche Et Co Ag,Ch
Priority date: 1980-01-30
Filing date: 1981-01-28
Publication date: 1986-02-28
Also published as: PT72417B; PH16583A; MC1364A1; FI70247B; ES498922A0; AU6657281A; DK29881A; AR227660A1; NO810319L; IL61971A0; ATE4217T1; ZA81151B; JPH0250918B2; DK149639C; KR830005358A; EP0035119A3; IE50886B1; GR73021B; PT72417A; AU536300B2

Description

Találmányunk új poliétcr-vcgyülclck előállítására vonatkozik.

A 4.138.481 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban egy új Streptomyces hygroscopicus törzs új poliéter-típusú antibiotikum termeléséhez vezető fermentációját írták le. Az idézett szabadalmi leírásban foglalt eljárás azonban mind a felhasznált mikroorganizmus, mind az előállított antibiotikum tekintetében különbözik a jelen szabadalom szerinti eljárástól.

Találmányunk tárgya eljárás az (I) általános képletű X-14868Á és X-14868B antibiotikumok és gyógyászatilag alkalmas sóik előállítására (mely képletben R jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport).

Találmányunk tárgya továbbá eljárás az új X14868C antibiotikum és gyógyászatilag alkalmas sói előállítására.

A nátriumsó fizikai állandói az alábbiak:

I. Az infravörös spektrumot a 3. ábrán mutatjuk be.

2.. Az olvadáspont 172—175 °C (nátriumsó).

3. Fajlagos forgatóképcsség:

[a]_D=kloroform, metanol + 49,6- +30,5°

4. Mikroanalízis:

C % = 57,13; H % = 8,58; Na % = 2,36 %.

Találmányunk tárgya továbbá eljárás az új X14868D antibiotikum és gyógyászatilag alkalmas sói előállítására.

A nátriumsó fizikai állandói az alábbiak:

1. Az infravörös spektrumot a 4. ábrán mutatjuk be.

2. Olvadáspont: 194 - 195 °C (nátriumsó).

3. Fajlagos forgatóképesség:

[<z]_D = kloroform, + 41,1° metanol + 29,2°

Az új mikroorganizmust a Colloroy (Ausztrália) helyen gyűjtött tengerparti homokmintából izoláltuk, A Nocardia sp. X-14868 egy reprezentatív törzsének jellemző sajátosságait az alábbiakban foglaljuk össze;

Általános jellemzők

Λ Norcardia sp. X-14868 jellemzői ismérvei az alábbiak légspórakepződés hiánya; néhány napos inkubálás után Gram-pozitív szubsztrátum micélium fragmentációja; mezo-diamino-pimelinsav, galaktóz, arabinóz és ribóz sejtfal-beépítése.

Növekedési jellemzők

Az organizmust a Shirling és Gottlieb által leírt [„Methods fór Characterization of Streptomyces Species”, Intern. J. System. Bacteriol. 16,313 —340 oldal, 1066] standard ISP táptalajokon (Difco) és az alábbiakban ismertetett, tenyészetek jellemzésére használatos táptalajokon tenyésztjük.

Élesztő extrakt;

élesztő extrakt 1,0%; glükóz 1,0%, agarl,5%; pH 6,8.

Glükóz-élesztő extrakt-pepton: glükóz 0,3 %, élesztő extrakt 0,5 %, pepton0,5 %, kalcium-karbonát 0,75 %, agar 1,5 %, pH 7,0;

Glükóz-aszparagin :

glükóz 1,0 %, aszparagin 0,05 %, dikálium-hidrogén-foszfát 0,05 %, agar 1,5 %, pH 6,8.

Szacharóz-nitrát:

szacharóz 1,0 %, nátrium-nitrát 0,2 %, dikáliumhidrogén-foszfát 0,1 %, magnézium-szulfát-heptahidrát 0,05 %, kálium-klorid 0,05 %, agar 1,5 3.

Λ további tesztekben felhasznált táptalajok irodalmi adatait az alábbiakban adjuk meg;

4. Mikroanalízis:

C % = 60,32; h % = 8,8O;

Na % = 3,40.

*

A találmányunk tárgyát képező eljárás szerint a fenti négy antibiotikumot oly módon állítjuk elő, hogy a Nocardia X-I4868 ATCC 31585 törzs valamely altenyészetét nitrogénforrást tartalmazó vizes szénhidrát-oldatban szubmerz aerob körülmények között fermentáljuk, majd a kapott oldatból a végtermékeket szétválasztjuk és izoláljuk.

Az általános képletekben Me metilcsoportot jelent.

A találmányunk szerinti eljárással előállítható antibiotikumokat a Nocardia sp. X-14868 elnevezésű új species termeli. Az X-14868 laboratórium jelzésű élő organizmus tenyészetét az American Type Culturc Collection intézetnél (Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok) ATCC 31585 szám alatt deponáltuk. A tenyészetet Nocardia törzsként azonosítottuk.

Teszt Hivatkozás

A. Nátrium-klorid tűrés Gordon és Smith:

„Rapidly Growing Acid Fást Bacteria”, J. Bacteriol. 66: 41 -48 (1953).

B. Kazein hidrolízis

C. Nitrát redukció

D. Zselatin Skerman, „A Guide to lActinomyces the IDentification of táptalajjal (Difco) the Gcncra of plusz 2,0 % agarral Bacteria”, Williams hús infúziós agarban and Williams Co., módosított] Baltimore (1967)

-2187763

Teszi Hivatkozás

E. Keményítő [Actinomyces táptalaj (Difco) plusz 0,25 % oldható keményítő és 2,0 % agar],

F. Lakmusz-tejrc (Difco) kifejtett hatás.

G. Lizozimmal szemben Gordon, „Somé kifejtett ellenállás. Criteria fór the

Recognition of Nocardia”, J. Gén. Microbiol. 45: 355-365 (1966).

H. Penicillinnel szemben mutatott érzékenység (10 egység lemez).

A kísérleteket majdnem valamennyi táptalajjal °C-on és 37 'C-on végezzük el. Színmeghatározás 2 és 4 héttel inkubálás után.

A szén-hasznosítást Shirlin és Gottlieb fent hivatkozott módszerével ISP-9 (Difco) táptalaj felhasználásával végezzük el.

Az X-14868 törzs ISP-I táptalajon készített 48 órás tenyészetét centrifugáljuk és homogenizáljuk; ily módon inokulációra alkalmas mosott szuszpenziót kapunk.

A mikroorganizmus 10, 28, 36, 45 és 50 ’C-on való tcnycszőkcpcsscgct az ISP-I (Difco) táptalaj beoltásával végezzük el. A diamonipimelinsav izomerjének sejtfal-analízisét Becker és tsai módszerével végezzük el [Appl. Microbiol. 12, 421-423 (1964)]. A sejtfal cukortartalmát Lechevalier és Lechevalier módszerével határozzuk meg [Actinomycctalcs, kiadó: Prauscr IL, Gustav Fischer, Jena, 311-316. oldal (1970)]: A nokardomikolsav elemzést Lechevalier módszerének kismérvű módosításával hajtjuk végre [Lcehcvalier és Horan, Can. J. Microbiol. 19:965 - 972, (1973)].

Eredmények

Mikroszkópos vizsgálat. Az X-14868 törzs szubsztrátum micéliumot termel, mely néhány nap múlva fragmentálódik és extenzív micéliumot fejleszt. F törzs kötélszerű csomókból álló légmicéliumot képez, spórákat azonban nem találtunk.

i

Sejtfal-elemzés

A sejtfal a diamino-pimclinsav mczoizomcrjct, valiiininl galaklózl ésarbinózt lartahnaz [Lechevalier és tsai osztályozása szerint - Adv. Appl. Microbiol., 14, 47-72(1971) - a sejtfal IV. típusú]. Úgy tűnik, hogy a mikroorganizmus nokardomikolsavat termel. Ezek a morfológiai és kémiai sajátosságok az. X-14868 törzset a Nocardia genushoz sorolják.

Makroszkópos vizsgálatok

Az 1. táblázatban a különböző szilárd táptalajokon 4 hete át 28 ’C-on inkubált X-14868 törzs növekedési jellemzőit, spóraképződését, legmieeliumának színét, a szubsztrátum micélium hátoldalának színét és az oldható pigment képződését mutatjuk be.

I. táblázat

Nocardia X-14868 tenyésztési jellemzői

Agar táptalaj

Növekedés mértéke és légmicélium

Lcgmicclium színe

Szubsztrátum micélium hátoldalának színe

Élesztő maláta extraktum (1SP-2)	közepes-mérsékelt növekedés; némi légmicélium izolált élekben; bőrszerű növekedés	b (osztrigafehér)	2 ie (mustárcserszínű)
zabliszt (ISP-3)	mérsékelt növekedés; mérsékelt légmícélium	b (osztrigafehér)	3 de (természetes)
szervetlen sók-keményítő (ISP-4)	ritka növekedés; ritka légmicélium	b (osztrigafehér)	2 de (természetes rostszerű)
gliccrin-aszparagin (ISP5)	gyenge növekedés; csaknem semmi légmicélium; szubsztrátum micélium	b (osztrigal'ehcr)	2 ge (eserszinü) 3

187 763

I. táblázat folytatása Nocardia X-14868 tenyésztési jellemzői

Agar táptalaj

Növekedés mértéke és lcgmicélium

Légmicélium színe

Szubszlrátum micélium hátoldalának színe’ élesztő extrakt bőséges növekedés; ritka légmicé- b (osztrigaíeiiér) lium; bőrszerű növekedés ge (barnás drapp) glükóz-élesztő extrakt- mérsékelt növekedés; ritka légmicé- b (osztrigafehér) az éle- 3 ge (drapp) pepton . lium az éleken; bőrszerű növekedés; ken barna oldható pigment glükóz-aszparagin szacharóz-nitrát mérsékelt növekedés; némi légmicé- 2 de (természetes, rost- 3 ge (drapp) lium; bőséges növekedés szerű) ritka növekedés; mérsékelt légmicé- b (osztrigafehér) lium átlátszó c (It. szürke)

Megjegyzés: Az inkubálás titán négy nettéi egyetlen táptalaj esetében sem találtunk a iégmicéiiumban spórákat.

*=A színárnyalatokat a „Color Harmony Manual 4. kiadás 1958” (Container Corporation of America, Chicago) alapján adtuk meg.

ll. táblázat

X-14868 törzs szénfocrás hasznosítása

Szénforrás	Hasznosítás
Szénforrás nélkül	_
D-glükóz	+ +
D-xilóz	—
L-arabinóz
L-ramnóz	-
D-fruktóz	±
D-galaktóz	+
RafFmóz	-
D-mannit	-
i-inozit	-
Szalicin	±
Szacharóz	-
Cellulóz	A»—

a_ = negatív reagálás, nincs hasznosítás;

=fc = nem egyértelmű reagálás;

+ = nagyobb növekedés, mint a szénforrás-kontrollon, azonban kisebb növekedés, mint glükózon;

+ + — pozitív reagálás, a növekedés mértéke a glükózon mértnek felel meg.

A 111. táblázatban néhány azonosításra alkalmas fontos, főként metabolikus tulajdonságot sorolunk fel.

Fiziológiai jellemzők

Az X-14868 törzs a zselatint és a kazeint hidrolizál35 ja, a keményítőt azonban nem. A tenyészet 10 egység lemez penicillinnek cs a táptalajban oldott 0,005 % lizozimnak ellenáll; ezt a meghatározást Gordon és tsai módszerével [J. Gén. Microbiol. 45, 355 — 364 (1966)] végezzük el. A törzs a lakmusz-tejet teljesen peptonizálja. Az ISP 1., 6. és 7. táptalajon melanintermelést nem találunk.

All. táblázatban az X-14868 törzs ISP 9 (Difco) táptalajon 28 °C-on 1 hónapon át végzett inkubálás után meghatározott szénforrás-hasznosítását adjuk meg.

Ifi. táblázni

X-14868 törzs jellemző tulajdonságai

Eredmény Teszt

ISP l, sötétedés ISP 6, sötétedés ISO 7, melanin —

Kazein-hidrolízis + +

Zselatin-hidrolízis + +

Keményítő-hidrolízis —

Nátrium-klorid tűrés (%) 5 %

Hőmérséklet, melyen növekedést θ® észleltünk 28 és 36 °C

187 763

Hl. táblázat folytatása

Eredmény	Teszt
Hátoldal pigment	nincs
Oldható pigment	Glükóz-
Penicillin érzékenység (10 egység lemez)	élesztő extraktpepton táptalajon barna
Nitrát redukció	+ +
Gram-festés	+
Saválló képesség	-
Kataláz	+
Diamino-pimelinsav	mezo-izomer
Sejtfal-cukrok	galaktóz, arabi-
Nokardomikolsav termelés	nóz, ribóz +

Az X-14868 törzs a többi Nocardia speciestől a IV. táblázatban megadott biokémiai jellemzők alapján különböztethető meg. Az összehasonlításhoz azokat a specieseket használtuk fel, melyek a Nocardia genu5 són belül az X-14868 törzzsel bizonyos mértékű fenotipikus allinitást mutatnak.

A IV: táblázatból látható, hogy négy species — azaz N. transvalensis, N. formica, N. petroleophila és N. saturnea — esetében nagyon kevés biokémiai adat áll rendelkezésre. Ezek a speciesek azonban az X14868 törzstől nagyon nagy mértékben különböznek. A N. transvalensis az irodalom szerint a IV. táblázatban szereplő N. brasiliensis-hcz nagyon hasonló. Λ N. formica speciest feltehetően tévesen sorolták a Nocar15 dia genusba, mert több hasonlóságot mutat a Straptomyces genushoz. A N. petroleophila és N. saturnea két nagyon távoli species, melyek a többi Nocardia speciesekhez kevéssé hasonlítanak. Az utóbbi két specieshez tartozó törzsek a légkör szcnhidroxid-larlalmát felhasználva szénmentes táptalajon is képesek élni és a többi Nocardia species - beleértve az X14868 törzset - erre nem képes.

IV. táblázat

Az X-14868 és más Nocardia speciesek összehasonlítása c

u o

E o

o ő

a, •a '3 a IS r- . CS u rt o.

-cJ ex o

8,

X

	Z	z	z	z z	z	z	z	z z	z z	z
Szénforrás hasznosítás
Glükóz	+	+	+	4		+	+	+	4“	+
L-arabinóz										+
L-ramnóz										—
D-fruktóz	+	4-	+	+			+	+	+	±
Galaktóz			+						+
Mannit		+	+	4~			+		+	—
Inozit			+						—
Szacharóz									4	—
Maltóz	+	+	+	+		4*	+			—
Mannóz	+		+	4-		+	+	4	+	±
Glicerin		+		4-		+	+	+	4-	—
Laktöz									+
Paraffin	+		+	+	-	+	+	4·		+
Acetát	+	+	+	+		+	4*	+		—
Butirát	+	+	4	+		+	4·	+		—
Malát	+		+	4-		4-	+			+
Propionát	~r	+	+	4~		4-		+		—
Piruvát		+	4-	+		4-	4-	4·		4
Szukcinát	4“		+	+			+	+		+
Citrát			4							±
Nitrát redukció		+	+	+	4	-	+	+	— —	+
Xantin hidrolízis		+	-	-		+				+
Zselatin hidrolízis			+	-	+	+	—	— —	— —	4-

187 763

Szénforrás hasznosítás

A jelen leírásban használt „Nocardia X-14868 species” kifejezés a Nocardia genusba tartozó, az X14868A antibiotikum termelésére képes és a Nocardia X-14R68 tenyészettől és altenyészeleitől kifejezetten meg nem különböztethető valamennyi törzset — beleértve a mutánsokat és variánsokat is — magában foglalja. Minthogy az X-14868A vegyület szerkezetét megadtuk, az e vegyület termelésére képes törzsek könnyen megkülönböztethetők azoktól a törzsektől, melyek az X-14868A antibiotikum termelésére nem képesek.

Az X I4868A antibiotikum gyógyászatilag alkalmas sóit szokásos módszerekkel állíthatjuk eiő. Ezeket a sókat a szabad sav alakjában levő antibiotikumból a szakember által jól ismert módszerekkel képezhetjük, pl. oly módon, hogy a szabad savat megfelelő bázis vagy só oldatával mossuk. A sóképzésre felhasználható gyógyászatilag alkalmas bázisként pl. alkálifém-bázisokat (pl. nátrium-hidroxid, káüum-hidroxid. lítium-hidroxid, stb.), alkáliföldfém-bázisokat (pl. kalcium-hidroxid, bárium-hidroxid, stb.) és ammónium-hidroxidot stb. alkalmazhatunk. A sóképzésre felhasználható gyógyászatilag alkalmas aikáliés alkáliföldfém sók közül a karbonátokat, hidrogénkarbonátokat és szulfátokat említjük meg.

A Nocardia X-14868 specieshez tartozó törzsek megfelelő körülmények között tenyésztve X-14868A vegyületet termelnek. A Nocardia X-14868 törzset tartalmazó fermentlevet oly módon készítjük el, hogy az X-14868A vegyület termelésére képes mikroorganizmus spóráival vagy micéliumával megfelelő táptalajt beoltunk, majd a fermentációt aerob körülmények között végezzük el. Az X-14868A antibiotikum szilárd táptalajon is előállítható, azonban nagy anyagmennyiség gyártása esetén előnyösen folyékony táptalajon fermentálunk. A fermentáció hőmérsékletét tág határokon belül változtthatjuk, így 20 °C és

35 ’C közötti hőmérsékleten, azonban előnyösen ~ 30’C-on dolgozhatunk. Előnyösen semleges vagy ahhoz közeli pH értéken végezhetjük el a fermentációt. Az X-14868A antibiotikum szubmerz fermentációja során alkalmazott táptalaj szénforrásként jg valamely kereskedelmi forgalomban levő gliceridolajaí vagy szénhidrátot (pl. glicerin, glükóz, maltóz, laktóz, dextrin, keményítő stb.) tartalmazhat tiszta vagy nyers formában; a táptalaj nitrogenforráskent valamely szerves anyagot (pl. szójababliszt, oldható desztillációs maradékok, mogyoróliszt, gyapotmagliszt, húsextrakt, pepton, halliszt, élesztő extrakt, kukoricalekvár stb.) és kívánt esetben szervetlen vegyületeket (pl. nitrátok vagy ammónium-sók) tartalmazhat. A táptalaj ásványi sókat (pl. ammónium-szulfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, kálium-klorid, kálium-foszfát, kalcium-karbonát stb.), puffereket (pl. nátrium-citrát és foszfátok) és nyomnyi mennyiségben nehézfémsókat is tartalmazhat. Amennyiben a fermentációt levegőztetett szubmerz körülmények között végezzük el, a fermentléhez előnyösen habzásgátlót (pl. folyékony paraffin, zsírok, olajok, szilikonvcgyiiletck stb.) adhatunk. Az Χ-Ι4868Λ antibiotikum előállításánál felhasznált táptalaj többfajta szénforrást, nitorgén-forrást ill. habzásgátlót tartalmaz30 hat.

Az V. táblázatban az X-I4868A antibiotikum és a kis mennyiségben jelenlevő három további komponens - X-I4868B, X-I4868C, X-I4868D - mikrobaellenes aktivitását mutatjuk be.

táblázat

Minimális gátlást koncentráció . (mcg/ml)

Mikroorganizmus ___________________________

	X-14868A	X-14868B	X-14868C	X-14868D
G (+) törzsek coccusok
Streptococcus faecium ATCC 8043	0,313	1,57	0,79	0,79
Staphylococcus aurcus ATCC 6538p	6,25	6,25	62,5	12,5
Sarcina lutea ATCC 9341	12,5	12,5	250	62,5
G ( + ) törzsek
Bacillus megaterium ATCC 8011	12,5	7,5	125	61,5
Bacillus sp. E ATCC 27859	0,39	0,79	6,25	1,57
Bacillus subtilis NRRL 558	12,5	25	250	62,5
Bacillus sp. ATCC 27860	6,25	12,5	125	25
G ( + ) törzsek
Mycobacterium phlei ATCC 355	12,5	25	250	62,5
Streptomyces cellulosae ATCC 3313	25	25	500	125
Penészek
Paccilomyccs varíoti ATCC 26820	250	500	X	X
Pcnicillum digitaluin ATCC 26821	1000	1000	X	X
Élesztők
Candida albicans NRRL 477	250	100	X	X
Saccharomyces cerevisiae NRRL 4226	1000	X	X	X

^x = a felhasznált penészekkel és élesztőkkel szemben 1 mg/ml koncentrációban hatástalan

-611

187 763

Az V. táblázat adatai igazolják, hogy az Χ-Ι4868Λ antibiotikum cs a kisebb mennyiségben jelenlevő három komponense bizonyos Gram-pozitív baktériumok növekedését gátolják. Ezek az antibiotikumok egészségügyi célokra szolgáló oldatokban (pl. kézmosásra vagy szennyezett helyiségek vagy laboratóriumok berendezései, padlózata vagy bútorzata tisztítására alkalmas folyadékokban) alkalmazhatók.

A VI. táblázatban e vegyületek kokcidiosztatikus hatását mutatjuk be, éspedig fertőzött kezeletlen kontrollal (IUC) és fertőzetlen kezeletlen kontrollal (UUC) összehasonlítva..

zóanyag kifejezésen olyan anyagok értendők, melyek parazitáéi lenes (pl. kokcidiosztatikus) hatással nem rendelkeznek, a hatóanyagokkal szemben közömbösek és a kezelt állatok állal biztonságosan elfogyaszthatok.

A hatóanyagot a kokcidiozis veszélyének kitett háziállatoknak (különösen baromfi, pl. pulyka vagy csirke) a takarmányba bedolgozva orálisan adhatjuk he. Ily módon a találmányunk szerinti készítmények a betegség megelőzésére vagy gyógyítására egyaránt i.lkalmazhatók. Az ily módon kezelt baromfi a kontrolihoz viszonyítva súlyát tartja, sőt súlygyarapodást

VI. táblázat

Csoport	Konc. %	Súly- gyara- podás, %	Pusz- tulás, %	Felső	Fertőzés átlagos mértéke Bél sérülések aránya Közepes Ceca	Avg.
UUC		100	0	0,0	0,0	0,0	0,0
IUC		37	20	2,7	2,0	3,0	2,6
X-14868A,	0,002	39	0	0,0	0,0	0,0	0,0
nátrium-só
Lot-1	..... 0,001	81	0	0,2	0,0	0,0	0,07
	0,005	96	0	0,4	0,3	0,0	0,2
X-14868A,	0,002	60	0	0,0	0,0	0,0	0,0
nátrium-só
Lot-IA

A teszt módszer leírása a következő:

Minden meghatározáshoz 10— 10 csirkét alkalmazunk. Súly-kontrollként és fertőzött kontrollként szintén 10-10 csirke szolgál. A teszt-vegyületet a fertőzés előtt 48 órával adjuk be. A teszt-vegyület 1 45 g-nyi mennyiségét mechanikai keverő-berendezésben a megfelelő koncentrációt biztosító mennyiségű csirketáppal összekeverjük. A fertőzést kb. 300.000 Eimeria acervulina, E. mivati, E. maxima, E. necatrix és E. tenella oociszta hozzápipcttázásával orálisan idézzük 50 elő. A teszt időtartama 6 nap, majd ennek elteltével a túlélő madarakat felboncoljuk és a végbélben levő durva sérülésekre megvizsgáljuk. A madarakat a túlélők és a bélsérülések száma alapján osztályozzuk. Az eredményeket a fertőzés átlagos mértéke (F.Á.M.) 55 formájában lejezzük ki. A 2,5-nél kisebb átlagos fertőzési mértéket tekintjük szignifikánsnak.

Találmányunk tárgya továbbá kokciodiosztatikus készítmény, mely hatóanyagként X-14868A antibiotikumot vagy gyógyászatilag alkalmas sóját vagy szári- 60 tott nemszűrt fermentlevet tartalmaz. Ezeket a készítményeket oly módon állíthatjuk elő, hogy a hatóanyagot iners hordozóanyagokkal öszekeverjük.

Iners -hordozóanyagként valamely takarmány, táp vagy iners anyagok alkalmazhatók. Az „iners hordo- θ⁵ is észleltünk. A találmányunk szerinti készítmények tehát nem csupán kokcidiozis kezelésére alkalmazhatók, hanem a takarmányhasznosítást is javítják és a súlyhozamot fokozzák.

A takarmány ill. állati táp hatóanyag-koncentrációját az adott eset szükségleteinek megfelelően állítjuk be; a hatóanyag-tartalom tág határokon belül változtatható. A hatóanyag-koncentráció, alsó határát az szabja meg, hogy a hatóanyag kívánt kokciodiosztatikus hatását még kifejthesse. A hatóanyag-tartalom felső határát oly módon választjuk meg, hogy nemkívánatos mellékhatások még ne lépjenek fel.

így pl. a takarmány premix vagy teljes állati táp hatóanyag-tartalma általában mintegy 0,0003 % és mintegy 0,001 % közötti értek, előnyösen mintegy 0,0005 % és mintegy 0,001 % közötti érték lehet. A kokcidiozis elleni hatás kifejtéséhez általában kb. 0,0005 % hatóanyag már elégséges. A 0,001 % feletti hatóanyag-tartalom esetében külön előny már néni jelentkezik, sőt bizonyos esetekben az ennél nagyobb hatóanyag-koncentráció az állatok növekedését cs takarmány-hasznosítását kedvezőtlenül befolyásolhatja és a pusztulási arány is nőhet.

Bár a 0,001 %-nál nagyobb hatóanyag-tartalmú takarmányok ill. tápok is hatékonyan akalmazhatók

-713

187 763 kokcidiózis ellen, a táp hatóanyag-tartalmának felső határa gazdaságossági okokból előnyösen kb. 0,001 %, minthogy ezt esetben legalacsonyabb az a egységnyi hatáskifejtésre jutó költség. A 0,0003 %-nál kevesebb hatóanyagot tartalmazó tápok már nem alkalmazhatók hatékonyan kokcidiózis gyógyítására ill. megelőzésére. A hatóanyag-tartalom alsó határa előnyösen 0,0005 %. Előnyösen alkalmazhatunk a baromfi által naponta elfogyasztott táp kb. 0,0005 %ának megfelelő mennyiségű hatóanyagot, minlhogy ez biztosítja minimlis dózissal a legnagyobb hatékonyságot.

Az optimális dózis természetesen az állat nagyságától is függ.A találmányunk szerinti hatóanyagot előnyösen oly módon alkalmazhatjuk kokcidiózis kezelésére vagy megelőzésére, hogy előbb valamely takarmánnyal, állati táppal vagy hordozóval összekevervetakarmány-premixet, takarmány-koncenírátumot vagy takarmány-adalékot készítünk, melyet hígítással az állat által közvetlenül elfogyasztható teljes takarmánnyá ill. táppá alakíthatunk vagy más arányban hígíthatunk. A takarmány-adalékok, koncentrátumok és premixek viszonylag nagy mennyiségű kokcidiosztatikus hatóanyagot tartalmaznak. Hordozóanyagként a hatóanyaggal szemben iners és a kezelendő állat által biztonságosan elfogyasztható szilárd anyagok alkalmazhatók, így pl. kereskedelmi baromfi takarmányok és lápok, őröl! gabonamagvak, gabonaipari melléktermékek, növényi fehérje koncentrátumok (pl. szója, mogyoró stb.), fermentációs melléktermékek, sók, mészkő, szervetlen vegyületek vagy ezek keverékei stb. Folyékony diszperziók készítéséhez vizet vagy növényi olajokat alkalmazhatunk, előnyösen relületaktív anyagok, emulgeálószerek stb. (pl. etiléndiamin-tetraecetsav stb.) és oldást elősegítő anyagok felhasználásával. A találmányunk szerinti parazita-ellenes készítményekben hordozóanyagként bármely iners, a kezelendő állattal szemben nem-toxikus anyag felhasználható.

A hatóanyagot az iners hordozóanyaggal porkeverék, szemcse vagy bármilyen kívánt alakban szokásos módszerekkel keverhetjük össze. így pl. eljárhatunk oly módon, hogy a hatóanyagot és az iners hordozóanyagokat bármely megfelelő őrlő- vagy porító-berendezésben a takarmánnyal ill. táppal együtt vagy anélkül finoman elporítjuk vagy megőröljük. Amennyiben az őrlést vagy porílást a takarmány vagy táp nélkül végezzük el, a kapott anyagot utólag finoman eloszlatjuk a takarmányban ill. tápban. A találmányunk szerinti hatóanyagot tartalmazó tipikus baromfi tápok különböző komponenseket tartalmazhatnak, igy pl. nagy energiatartalmú szemes terményeket (pl. kukoricát, búzát, búzalisztet, milot, zablisztet stb.), közepes és alacsony energiatartalmú magokat (pl. zabot, árpát, búzalisztet, közeptöreteket stb,); stabilizált zsírokat; növényi fehérjéket (pl. szójabablisztet, gabona glutin lisztet, mogyoróüszteí stb.); állati fehérjéket (pl. húslisztet, hallisztet, húsmaradékokat stb.); UGF-t (nem-azonosított növekedési faktort), B-vitamin hordozókat és forrásokat (pl. szárított tejtermékeket, szárított élesztőt, desztillációs és fermentációs maradékokat stb.); víztelenített alfalfalisztet és különböző speciális adalékokat (pl. riboflavint, B_I2-vitamint, kalcium-pantotenátot, niacint, kolint, K-vitamínt, E-vitamint, stabilizált A-vitamint,

Dj-vitamint, D-vitaminnal aktivált állali szteroidokal, kalcium- és foszfor-forrásokat - pl. dikalciumfoszfátot, gőzzel kezelt csontlisztet, fluormentesített foszfátokat, mészkövet stb.; jódozott sót, mangánszulfátot, cink-karbonátot, antibiotikumokat, metionint vagy hidroxi-analógját és antioxidánsokat stb,

A fentiekből kitűnik, hogy a találmányunk szerinti kokcidiosztatikus készítmények orális fogyasztásra szolgálnak. E készítményekéi a kezelendő állat szokásos takarmányához vagy tápjához adhatjuk vagy más megfelelő módon juttathatjuk az állat szervezetébe (pl. tabletta, drazsé, szemcse, bólus stb, alakjában) A hatóanyag ill. azt tartalmazó készítmény alkalmazása az állattenyésztés önmagukban ismert módszereivel történik,

A kisebb mennyiségben jelenlevő X-14868B, C és D komponens in vitro tesztek alapján szintén kokcidiosztatíkus hatást fejt ki. Az X-14868B in vivő is hatásosnak bizonyult.

Az X-14868A antibiotikum kérődző állatok (pl. szarvasmarha) súlygyaraodását fokozza. E mechanizmus részleteit — melyek során a kérődző állat a takarmányt elfogyasztja, megemészti, lebontja és metabolizalja — a bizonyos antibiotikumoknak kérődzők takarmányhasznositás-javító hatását leíró 3.839.557 sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás tartalmazza. A találmányunk szerinti készítmények az említett szabadalmi leírásban foglaltak szerint is alkalmazhatók. A gazdasági szempontból fontos kérődzők közül a szarvasmarhát, birkát, juhot és kecskét említjük meg.

Az X-14868A antibiotikumnak a kérődző állatok bendőjében termelt illékony zsírsavak arányára kifejtett hatását és ezáltal a kérődzők takarmányhasznosítását javító aktivitását az alábbi in vitro teszttel igazoljuk :

Bika bendőjéből gyomornedvet veszünk. A bikát

alábbi összetételű takarmányon tartjuk:
Kukorica	89,92 %
Alfalfa liszt	5,000 %
Szójába bolajliszt	3.00 %
Mészkő	0,80 %
Nátrium-klorid	0,60 %
Dikalcium-foszfát	0,50 %
Nyomelemek	0,025 %
Vitamin premix adalék	0,1 %
A-vitamin	4.0003 NE
Dj-vitamin	0,801 NE
E-vitamin	3,002 NE

A gyomornedvet szitán azonnal átfolyatjuk. Minden fermentáció esetében 75 ml ily módon kapott folyadékot az alábbi anyagokat tartalmazó 250 ml-es lombikba adunk:

g 80 : 20 % arányú finoman őrölt gabona/széna keverék;

ml 18 %-os vizes glükóz-oldat (1 millimól/ lombik);

1,5 ml 3,1 %-os vizes karbamid-oldat (0,76 millimól/lombik);a 10 esszenciális aminosavból (arginin, hisztidin, leucin, metionin, treonin, valin, lizin, izoleucin, fenil-alanin, triptofán) 60—60 mikromól;

a teszt-vegyület vizes oldatából 1 ml; a teszt-vegyület dózisa 10 vagy 25 pg/ml (a fermentlé számított teljes térfogata 80 ml).

-815

187 763

Minden lombikot 38 °C-on gázfelfogó sapkával felszerelt vízfürdőben történő rázatással inkubálunk. A sapkán folyamatosan széndioxidot vezetünk keresztül. 4 órás inkubálás után 10 ml fermentlevet percenkénti 14.000 fordulatszám mellett (kb. 30.000 g) 20 percen át centrifugálunk. A felül elhelyezkedő folyadékból 3 ml-t 1 ml 25 %-os metafoszforsavoldathoz adunk, mely belső standardként 23 mikromól 2-metiI-valeriánsavat tartalmaz. A kapott folyadékot szobahőmérsékleten 30 percen át ülepedni hagyjuk. A folyadékot 0,22 millimikronos Millipore szűrőn átszűrjük és lehűtjük. Az illékony zsírsavtartalmat gáz-folyadék kromatográfiás analízissel határozzuk meg.

Négy in vitro kontroll fermentációnál és két fermentációnál (az X-14868A antibiotikum koncentrációja 10 és 25 ppm) kapott gáz-folyadékkromatográfiás analízis (GLC) eredményeit az alábbi táblázatban foglaljuk össze.

VII. táblázat

Propionát (C-J móljainak az acetát (C₂) és n-bulirát (nCJ móljai összegéhez viszonyított aránya in vitro kérődző bendő fermentációjánál

Teszt-vegyület

Koncentráció

Illékony zsírsavak mólaránya

C₃(C₂ + nC₄)

Pozitív kontroll %-a

Negatív kontroll	0	0,203	51,8
X-14868A	5 ppm	0,323	82,5
	50 ppm	0,358	91,2
Pozitív kontroll	50 ppm	0,392	100,0
(Monensin)

A VII. táblázatból látható, hogy a propionátnak (C₃) az acetát és n-butirát összegéhez viszonyított aránya javul. A propionát növekedésével a szénhidrát-hasznosítás és ezáltal a takarmány-értékesítés javul.

Az X-14868A antibiotikum (a továbbiakban „az antibiotikum”) a ketózis megelőzésére és kezelésére alkalmas és a takarmány-hasznosítást javítja. A ketózis óka a propionát-vegyületek termelésének hiánya ill. csökkenése. Ismeretes, hogy ez ellen oly módon védekeznek, hogy a takarmányba propionsavat kevernek, mely a propionát-termelésnek kedvez. Nyilvánvaló, hogy amennyiben a közönséges takarmány a propionát-termelést fokozza, ez a ketózis előfordulását csökkenti.

Azt találtuk, hogy az X-14868A antibiotikumot kérődző állatoknak orálisan beadva a takarmányhasznosítás javítható. Előnyösen oly módon járhatunk el, hogy az antibiotikumot az állat takarmányába bekeverjük.

Az antibiotikumot azonban más módszerekkel is az állat szervezetébe juttathatjuk. így pl. az antibiotikumot tartalmazó tablettákat, drazsékat, bóluszokat vagy kapszulákat adhatunk be az állatnak. Az anti5 biotikum formulázását az állatgyógyászatban szokásos és közismert módszerekkel végezhetjük el.

A kapszulákat oly módon készíthetjük el, hogy a kívánt antibiotikumot zselatinkapszulákba töltjük. Az antibiotikumot kívánt esetben porított iners hígí10 tóanyaggal (pl. cukor, keményítő vagy tisztítóit kristályos cellulóz) hígíthatjuk a kapszulába töltendő keverék térfogatának növelése céljából.

Az antibiotikumot tartalmazó tablettákat szokásos gyógyszeripari eljárásokkal állítjuk elő. A tabletta a hatóanyagon kívül rendszerint valamely tablettaalapanyagot, szétesést elősegítő anyagot, abszorbenst, kögőanyagot és síkosítóanyagot tartalmaz. Tabletta-alapanyagként általában laktózt, finom cukrot, nátrium-kloridot, keményítőt cs mannilot akal20 mázhatunk. Szétesést elősegítő anyagként előnyösen keményítőt, továbbá alginsavat alkalmazhatunk. Felületaktív anyagként előnyösen pl. nátrium-laurilszulfátot vagy dioktil-nátrium-szulfoszukcinátot alkalmazhatunk. Abszorbcnsként pl. keményítőt, lak25 tózl, míg olajos anyagok esetében magnézium-karbonátot alkalmazhatunk. Kötőanyagként pl. zselatint, gumikat, keményítőt, dextrin! és különböző cellulózszármazékokat alkalmazhatunk. Síkositóanyagként előnyösen pl. Magnézium-sztearátot, talkumot, pa30 rafün viaszt, különböző fém-szappanokat és polietilénglikolt alkalmazhatunk.

Az antibiotikumot ’ovábbá a hatóanyagot lassan leadó bóluszok alakjában is kikészíthetjük. A bóluszok előállítása a tablettákéhoz hasonlóan történik azzal a különbséggel, hogy az antibiotikum kioldásának késleltetéséről gondoskodunk. A bóluszok a hatóanyagot hosszabb idő alatt adják le. A lassú kioldódást oly módon segítjük elő, hogy az antibiotikumot vízben nagyon oldhatatlan formában alkalmaz40 zuk. A bóluszhoz megfelelő anyagot (pl. vasat) adva a sűrűséget növeljük és ezáltal a bólusz a bendőben egy helyben marad.

Az antibiotikum kioldódását oly módon is lassíthatjuk, hogy oldhatatlan anyagokból álló mátrixot készítünk és a hatóanyagot oldhatatlan anyagokból álló mátrixba ágyazzuk be. E célra pl. növényi viaszokat, tisztított ásványi viaszokat és vízoldhatatlan polimer anyagokat alkalmazhatunk.

Folyadékok készítéséhez az antibiotikumot előnyö50 sen vízoldható formában alkalmazzuk. Amennyiben valamilyen okból az antibiotikum oldhatatlan formájára van szükség, fiziológiailag alkalmas oldószert (pl. polietilénglikolt) tartalmazó oldatot készítünk.

Az antibiotikum oldhatatlan formáját tartalmazó szuszpenziót oly módon készítjük, hogy az antibiotikumot annak oldására nem alkalmas oldószerben felvesszük. E célra az antibiotikum adott formájától függően növényi olajokat (pl. mogyoró-, kukoricaVísgy szezámolajat), glikolokat (pl. propilénglikolt vagy polietilénglikolt) vagy vizet alkalmazhatunk.

Az antibiotikum szuszpendálását fiziológiai szempontból alkalmas adjuvánsokkal biztosítjuk. E célra sűrítőanyagokat (pl. karboxi-melil-cellulózl, polivinil-pirrolidonl, zselatint és algiiiátokat stb.) alkalmaz65 ha tünk. Az antibiotikum szuszpendálását felületaktív

-917

187 763 anyagok is elősegíthetik, ezek közül pl. a lecitint, alkilfenol-polietilénoxid addíciós termékeket, naftalin-szulfonátokat, alkil-benzol-szulfonátokat és polioxietilén-szorbitán-észtereket említhetjük meg, melyek segítségével az antibiotikumot nem-oldó oldószerekben szuszpenziók készíthetők.

Egyes eseteken a szuszpenziókhoz a folyadék hidrofilitását, sűrűségét és felületi feszültségét befolyásoló anyagokat adhatunk. Ilyen szuszpendálószerként pl. szilikon habzásgátlókat, glikolokat, szorbilot és cukrokat alkalmazhatunk.

A szuszpendálható antibiotikumot a felhasználónak szuszpenzió, vagy az antibiotikum és az adjuvíánsok felhasználás előtt felhígítandó száraz keveréke alakjában ajánlhatjuk.

Az antibiotikumot kérődző állatok itatóvizéhez is hozzáadhatjuk. Ez esetben az antibiotikum valamely vízoldható vagy vízben szuszpendálható formáját megfelelő mennyiségben az itatóvízbe keverjük. A fenti itatóvizek készítését a folyadékoknál a korábbiakban ismertetett módszerekkel végezhetjük el.

Az állatokat legcélszerűbben oly módon kezelhetjük az antibiotikummal, hogy az antibiotikumot a takarmányba keverjük be. Az antibiotikumot bármilyen típusú takarmányba (beleértve szokásos száraz takarmányokat, folyékony tápokat és szemcsézett takarmányt) keverhetjük be.

Az antibiotikumnak a takarmányba történő bekeverését önmagukban ismert módszerekkel végezhetjük el. Általában nagy hatóanyag-tartalmú premixet készíthetünk a gyógyszerezett takarmány előállítása céljából. A premixek hatóanyagtartalma pl. mintegy 1 - 400 g/0,45 kg lehet. A premixek és a felhasználására és takarmány hatóanyagtartalma egyaránt tág határokon belül változhat. Szilárd vagy folyékony premixeket készíthetünk.

A megfelelő mennnyiségű antibiotikumot tartalmazó kérődző-lakai Hiányokat szokásos módszerekkel állíthatjuk elő. Kiszámíthatjuk az egyes állatoknak beadagolandó antibiotikum mennyiségét, az állat napi takarmány igényét és figyelembe vesszük a premix és a takarmány antibiotikum-koncentrációját.

Az antibiotikum tartalmú takarmányok készítése a kérődző-takarmányok előállítására ismert bármely megfelelő formulázási, keverési és pelletírozási módszerrel történhet.

Az antibiotikum orális beadása - mint már említettük - kedvezően változtatja meg a propionátoknak az acetátokhoz viszonyított termelését a bendőbcn. Feltételezhető, hogy a rostos ehető növényi anyagokat a bélben emésztő egygyomrú állatok esetében hasonlóképpen kedvező hatás lép fel, minthogy várható, hogy az antibiotikum orális beadásakor a propionát-acetát arány kedvezően megváltozik. A háziállatok közül pl. a ló, a sertés és a nyúl tápláléka egy részét a belekben emészti meg..

Az X-I4868A antibiotikum sertés-dizentéria kezelése és megelőzése során is hatásosnak bizonyult. E vegyület aktivitását Treponcma hyodysenteriae — a sertésdizentéria etiológiai szere — ellen vizsgáltuk meg. Az eredményeket a Vili. táblázatban foglaljuk össze, melyben az X-14868A antibiotikum sertésdizentéria kezelése és megelőzése terén mutatott hatását egy jól ismert gyógyszer aktivitásával hasonlítjuk össze.

10		Vili. táblázat
		Minimális gátlási
15	T. hyodysenteriae	koncentráció
törzs	(mcg/ml)
		X-14868A	Ipronidazola
	I	0,05	0,63
20	2	0,05	0,63
3	0,05	0,63
	4	0,05	2,5
	Átlag	0,05	1,1

Találmányunk továbbá a kisebb mennyiségben jelenlevő X-14868B, C és D komponensekre és ezek előállítására is kiterjed. E három komponens E. tenella ellen kifejtett in vitro kokcidiosztatikus aktivitását az alábbiakban igazoljuk:

Teszt-vegyület

E. tenella ellen kifejtett in vitro aktivitás (ppm)

X-14868B 0,1

X-14868C 10,0

X-I4868D 10,0

Az X-14868B vegyület szerkezete a (II) képletnek 4₅ felel meg.

Az X-14868A - D vegyületek infravörös abszorpciós spektruma a következő:

Χ-14868Λ - I ábra ₅₀ X-14868B - 2. ábra

X-14868C - 3. ábra

X-14868D - 4. ábra

A IX. táblázatban a Nocardia X-14868 fermentáci55 ója során termelt különböző komponensek fizikai ál’andóít tüntetjük fel.

-1019

187 763

IX. táblázat

X-14868 komponensek fizikai állandói

Vegyület száma	Op. °C	Fajlagos	„Mikroanalízis talált
forgatóképcsség L^alo	C %
kloroform	metanol	H %	Na %	OMe %
X-14868A	193-195	+ 40,6°	+ 23,8°	60,11	8,54	2,38	12,10
X-14868B	172,5-174	+ 46,1°	+ 34,8°	60,97	8,60	1,23	14,87
X-14868C	172-175	+ 49,6°	+ 30,5°	57,13	8,58	2,36	10,25
X-I4868D	194-195	+ 41,1°	+ 29,2°	60,32	8,80	3,40
*A és B vegyület számított mikroanalízise	Mólsúly	C %	H %	Na %	OMe %
X-14868A: C,₇H₇₉O_I7Na	939,25	60,10	8,50	2,45	13,22
X-I4868B:	C₉₆H₁₆₃O_MNa	•h₂o	1902,36	60,61	8,75	1,21	16,54

Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

I. példa

Nocardia X-14868 törzzsel végrehajtott rázatott lombikos fermentáció

Az X-14868A antibiotikumot termelő tenyészetet alábbi összetételű, ferde keményítő-kazein agar táptalajon tenyésztjük és tartjuk fenn:

Komponens	g/1 desztillált víz
Oldható keményítő	10,0
Kazein	1,0
Dikálium-hidrogén-foszfát	0,5
Vízmentes	0,5
magnézium-szulfát
Agar	20,0

A pH-t 7,4-re állítjuk be nátrium-hidroxiddal, majd autoklávban 20 percen át 15 font nyomáson kezeljük.

A ferde tenyészetet a Nocardia X-14868 tenyészettel inokuláljuk és 28 ”C-on 7-14 napon át inkubáljuk. A jól kifejlődött ferde agar tenyészettel 500 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 100 ml, alábbi összetételű steril'ezett inokulum táptalajt oltunk be

Komponens	g/1 desztillált víz
Paradicsomvelő	5,0
Oldható desztillációs
maradék	5,0
Peplon	5.0
Keserűanyagok tói mentesített
szárított élesztő	5,0
Kukorieakeményítő	20,0
Kalcium-karbonát	1,0
Dikálium-hidrogén-foszfát	1,0

A pH-t slerilezés előtt nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk be.

A beoltott inokulum táptalajt 28 °C-on 72 órán át sterilezzük percenkénti 250 fordulatszámú forgó rázatóberendezésen.

A kapott tenyészet 3 ml-es részletével (3 tf/tf %) 500 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 100 ml, alábbi öszetctclű sterilezőit termelő táptalajt inokulálunk:

Komponens	g/1 desztillált víz
Glicerin	40,0
Pepton	5,0
Cerelóz	2,0
Burgonyakeményítő	2,0
Zsírmentesített szójadara	5,0
Keserűanyagoktól
mentesített szárított élesztő	5,0
Nátrium-klorid	5,0
Kalcium-karbonát	0,2

-1121

187 763

2?

A pH-t autoklávozás előtt 6,4-re állítjuk be.

A beoltott táptalajt 28 ’C-on 5 napon ál inkubáljuk percenkénti 250 fordulatszámú forgó rázatóberendezésen. A fermentlében lévő X-14868A antibiotikum aktivitását Staphylococcus aureus ATCC 6538P törzzsel szemben az agar-dilftiziós lemezes módszerrel határozzuk meg.

2. példa

Az X-14868A antibiotikum nátrium-sójának és az X-I4868B antibiotikum nátrium-sójának izolálása a rázatott iombikos fermentációnál nyert fermcntléből.

A. lépés db fcl-litcrcs Erlcnmeyer lombikban végrehajtott fermentációnál nyert teljes fermentlevet (kiindulási táptalaj 100- 100 ml) 5 napos fermentáció után összegyűjtjük (5 liter) és fele térfogatú etilacetáttal kétszer extraháljuk. Az oldószeres réteget másfélórás keverés után elválasztjuk és vákuumban bepároljuk. A visszamaradó olajat (4 g) dietiléterben oldjuk és 200 g, dietiléterben szuszpendált szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot növekvő acetontartalmú dietiléter-aceton elegyekkel (az elualást 2 liter dietiléterrel kezdjük és 2 liter 9 : 1 arányú dietiléter-aceton eleggyei fejezzük be), majd 2 liter 1 : 1 arányú dietiléter-aceton eleggyei és utána 2 liter 7 : 3 arányú metilénklorid-etanol eleggyei eluáljuk. 40 mles frakciókat gyűjtünk össze, a 18-75. sz. frakciót egyesítjük, az oldószert vákuumban ledesztilláljuk és a maradékot (1,66 g) etilacetátban oldjuk és előbb azonos térfogatú 1 n sósavval kétszer, majd azonos térfogatú, szobahőmérsékleten telített nátriumkarbonát oldatta! kétszer mossuk. Az oldószeres fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk és az X-14868A antibiotikum nátrium-sóját kristályos n-hexán hozzáadásával kicsapjuk Etilacetát és n-hexán elegyéből történő átkristályosítás után az X-14868A antibiotikum nátrium-sójának analitikai tisztaságú mintáját kapjuk. Op.: 193- 194’C.

B. lépés

A 161 -215 sz. frakcióból az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a maradékot etilacetátban oldjuk és előbb I n sósavval, majd szobahőmérséleten telített nátrium-karbonát-oldattal mossuk és nátrium-szulfát felett szárítjuk. Az X-I4868B antibiotikum kristályos nátrium sóját n-hexán hozzáadásával csapjuk ki. Op.: 172,5-174’C.

3. példa

Nocardia X-14868 törzzsel végrehajtott tank fermentáció

Az X-14868A antibiotikumot tartalmazó, Nocardia X-14868 törzs tenyészetét alábbi összetételű, ferde keményítő-kazein agaron tenyésztjük és tartjuk fenn.

Komponens g/1 desztillált víz

Oldható keményítő 10,0

Kazein 1,0

Dikálium-hidrogcn-foszfát 0,5

Vízmentes magnézium-szulfát 0,5

Agár 20,0

A pH-t autoklávozás előtt nátrium-hidroxiddal 7,4 értékre állátjuk be.

A ferde táptalajt Nocardia X-14868 tenyészettel inokuláljuk és 28 ’C-on 7-14 napon át inkubáljuk. A jólfejlett ferde agar tenyészet egy részével 500 ml-es Erlenmeyer-Iombikban levő 100 ml, alábbi összetételű táptalajt beoltva vegetatív inokulumol készítünk:

Komponens g/1 desztillált víz

Paradicsomvelő	5,0
Oldható desztillációs	5,0
maradék
Pepton	5,0
Keserüanyagoktól	5,0
mentesített szárított élesztő
Kukoricakeményítő	20,0
Kalcium-karbonát	1,0
Dikálium-hidrogén-foszfót	1,0

A pH-t autoklávozás előtt 7,0 értékre állítjuk be.

Az inokulált táptalajt percenkénti 250 fordulatszámú forgó rázatógépen 28 ’C-on 72 órán át inkubáljuk.

A kapott tenyészet 60 ml-es részletével (3 tf/tf %) 6 literes Erlenmeyer-lombikbanlevő 2 liter, alábbi öszszetélelű inokulum táptalajt oltunk be:

Komponens	g/1 desztillált víz
Paradicsomvelő	5,0
Oldható desztillációs	5,0
maradékok
Keserűanyagoktól	5,0
mentesített szárított élesztő
Pepton	5,0
Kukoricakeményítő	20,0
Kalcium-karbonát	1,0
Dikálium-hidrogén-foszfót	1,0

ApH-t az autoklávozás előtt 7,0 értékre állítjuk be. A beoltott táptalajt 72 órán át 28 ’C-on percenkénti

250 fordulatszámú forgó rázatógépen inkubáljuk.

A kapott tenyészet 4 literes részletével 380 literes fermentorban levő 230 liter, alábbi összetételű termelő táptalajt oltunk be:

-1223

187 763 zist nátrium-szulfát felett szárítjuk, majd bepároljuk.

A visszamaradó olajat metilcn-kloridban okijuk és n-hexán hozzáadásával az X-14868A antibiotikum kristályos nátrium-sóját kicsapjuk. Op.: 193 - 195 ’C.

Komponens	g/l csapvíz
Glicerin	40,0
Pepton	5,0
Cerelóz	2,0
Burgonyakeményítő	2,0
Zsírtalanított szójadara	5,0
Kcscrűanyagoktól	5,0
mentesített szárított élesztő
Nátrium-klorid	5,0
Kalcium-karbonát	0,2
Habásgátló	0,l

A táptalaj pH-ját 6,4 értékre állítjuk be, mad 4,2 kg/cm¹ nyomású gőzzel 75 percen át sterilezzük.

Az inokulált táptalajt 90 liter/perc sebességű levegőztetés és percenkénti 280 fordulatszámú keverés mellett keverjük. A fermentációt 28 ’C-on 5 napon át végezzük,

A fermentlében levő X-14868A antibiotikum aktivitását Staphylococcus aureus ATCC 653P törzzsel szemben az agar-diffúziós lemezes módszerrel határozzuk meg.

4. példa

Az X-14868A, X-14868C és X-14868D antibiotikumok nátrium-sóinak izolálása Nocardia X-14868 törzzsel végrehajtott tank-fermentáció során kapott termentléből.

A. lépés

A 3. példában végrehajtott 230 literes fermentációnál nyert teljes fermentlevet 115 órás fermentáció után azonos térfogatú etilaceáthoz adjuk. Az elegyet egy órán át keverjük, az oldószeres réteget elválasztjuk cs vákuumban 4,2 literre pároljuk be. A betöményített oldószeres fázist azonos térfogatú 1 n sósavval kétszer, majd szobahőmérsékleten telített azonos térfogatú nátrium-karbonát-oldattal kétszer mossuk. Az oldószeres fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk és vákuumban bepároljuk. A visszamaradó olajat nhexánban oldjuk és acetonitrollel egyszer, majd 8 : 2 arányú acetonitril-metanol eleggyel kétszer extraháljuk. Az acetonitrillel és 8 : 2 arányú acetonitrol-metanoí eleggyel nyert extraktumot összegyűjtjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó olajat dietiléterben oldjuk, aktívszénnel kezeljük, szűrjük és n-hexán hozzáadásával az Χ-Ι4868Λ antibiotikum nyers nátrium-sójának kristályait lecsapjuk. A kapott nyers antibiotikum-kristályokat metilénkloridban oldjuk és 600 g, metilénkloridban szuszpendáit szilikagéllel töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 4 liter 8:2:0,02 arányú dietiléter-acelon-ammóniumhidroxid eleggyel eluáljuk. 45 ml-es frakciókat gyűjtünk össze és a 13—15. sz. frakciót egyesítjük. Az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a maradékot etilacetátban oldjuk és egymásután 1 n sósavval kétszer és szobahőmérsékleten telített nátrium-karbonát-oldattal kétszer mossuk. A szerves fáB. lépés

Az Χ-Ι4868Λ antibiotikum nyers nátrium-sójának előállításánál kapott anyalúgot (A. lépés) I kg szilikagél metilén-kloridos szuszpenzióját tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 1 liter n-hexánnal, majd 4 liter 7 : 3 arányú dietiléter-n-hexán elegytől 4 liter 8 : 2 arányú dietilclcr-acclon clcgyig növekvő gradiens szerint eluáljuk. 40 ml-cs frakciókat gyűjtünk össze és a 43 — 80. sz. frakciót egyesítjük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a maradékot etilacetátban oldjuk, majd előbb 1 n sósavval és utána szobahőmérsékleten telített vizes nátrium-karbonát oldattal mossuk, és aktív szénnel kezeljük. Szűrés után az etilacetátos fázist bepároljuk. A visszamaradó olajat dietiléterben oldjuk és n-hexán hozzáadásával további X-14868A antibiotikum nátriumsót csapunk ki. Op.: 193- 195’C.

C. lépés

Az A. lépes szerint szilikagélen végrehajtott kromatografálásnál nyert 22 — 40. frakciók feldolgozása után az X-14868C antibiotikum kristályos nátriumsóját kapjuk. Op.: 172- 175 ’C.

D lépés

Az X-14868A antibiotikum kristályos nátriumsójának előállításánál kapott anyalúgot (B. lépés) és a szilikagéles kromatografálásnál nyert 16-21. frakciót (A. lépés) egyesítjük, bepároljuk és 600 g szilikagél metilén-kloridos szuszpcnziójával töltött oszlopon kromatografáljuk. Az oszlopot 4 liter 1 : 1 arányú dietiléter-hexán eleggyel, 4 liter 6:2:2: 0,002 arányú dietiléter(aceton/n-hexán) ammónium-hidroxid eleggyel és 2 liter 8 : 2 arányú dietiléter-aceton elegygyel eluáljuk. 40 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A 71-98. frakciót összegyűjtjük és kristályosítjuk. További mennyiségű kristályos X-14868A antibiotikum nátriumsót kapunk. A 141 — 172. frakciót is egyesítjük, az oldószert vákuumban ledesztilláljuk és a maradékot dietiléter és η-hexán eíegyéből kristályosítjuk. Az X-14868D antibiotikum nátrium-sóját kapjuk. Op.: 194-195’C.

5. példa

Al X-14868A antibiotikum tallium sójának előállítása mgX-14868A antibiotikum-nátrium-só metilénkloridos oldatát I n sósavval, vízzel, majd vizes tallium-karbonál oldattal négyszer mossuk. Az oldószert ledesztilláljuk. Az oldatot kis térfogatra bepároljuk és n-hexán hozzáadásával az X-14868A antibiotikum

-1325

187 763 kristályos lallium-sóját kicsapjuk. Dietilcter és nhexán elegyéből történő átkristályosítás után röntgen-analízisre alkalmas kristályokat kapunk.

A kapott tenyészet ,7 ml-es részletével (3 tf/tf %) 500 ml-es Erlcnmeycr lombikban levő 100 ml, alábbi öszszetételű sterilezett termelő táptalajt oltunk be:

6. példa

Az X-14868A antibiotikum kalcium-sójának előállítása

200 mg X-14868A antibiotikum nátrium-só etilacetátos oldatát 1 n sósavval, majd szobahőmérsékleten telített vizes kalcium-hidroxid-oldattal háromszor mossuk. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk. Fehér szilárd hab alakjában az X-I4868A antibiotikum kalcium-sóját kapjuk.

7. példa

Nocardia X-14868 törzzsel végrehajtott rázatott lombik fermentáció

Az X-14868A antibiotikumot termelő törzset alábbi összetételű ferde keményítő-kazein-agar táptalajon tenyésztjük és tartjuk fenn.

Komponens	g/1 desztillált viz
Oldható keményítő	10,0
Kazein	1,0
Dikálium-h idrogén-foszfá t	0,5
Vízmentes magnézium-szulfát	0,5
Agar	20,0
A pH-t nátrium-hidroxiddal 7,4 értékre állítjuk be, majd I5 font nyomáson 20 percen át autoklávozzuk. A ferde agar táptalajt Nocardia X-14868 tenyészet-
tel ínokuláljitk és 28 °C-on 7	— 14 napon át inkubál-
juk. A jólfejlelt ferde agar	tenyészet micéiiumokat
tartalmazó részletével 500 ml-es Erlenmeyer lombikban levő 100 ml,alábbi összetételű sterilezett inoku-

lum táptalajt oltunk be:

Komponens	g/1 desztillált víz
Paradicsomvelő	5,0
Oldható desztillációs	5,0
maradék
Pepton	5,0
Kescrüanyagoklól	5,0
mentesített szárított élesztő
Kukoricakeményítő	20,0
Kalcium-karbonát	1,0
Dikálium-hirogén-foszfát	1,0

A pH-t sterilezés előtt nátrium-hidroxiddal 7,0 értékre állítjuk be,

A beoltott inokulum táptalajt percenkénti 250 fordulatszámú forgó rázatógépen 28 °C-on 72 órán át inkubáljuk.

Komponens g/1 desztillált víz

Ccrclóz45,0

Keményítő 20,0

Szójababliszt 15,0

Hidrolizált kazein (savas) 1,0

Fekete melasz 3,0

Kalcium-karbonát 2,5

Csapvízzel 1 liléire kiegészítve pH 7,1.

Az inokulált táptalajt 28 °C-on percenkénti 250 fordulatszámú forgó rázatógépen 7 napon át inkubáljuk. A fermentlében levő X-14868A antibiotikum aktivitását Staphylococcus aereus ATCC 6538P mikroorganizmussal szemben az agar-diíTúziós lemezes módszerrel határozzuk meg.

Claims

1. Eljárás (1) általános kcpletű polictcr-vcgyületck (mely képletben R jelentése hidrogénatom vagy metilcsoport) mely gyógyászatilag alkalmas sóik előállítására, azzal jellemezve, hogy a Nocardia X-14868 ATCC 31585 törzs valamely al-tenyészctét valamely nitrogén-forrást tartalmazó vizes szénhidrát-oldatban szubmerz aerob körülmények között tenyésztjük, majd a kapott oldatból a végtermékeket szétválasztjuk és izoláljuk, előnyösen oszlopkromatográfiával.

2. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) általános képletű X-14868A antibiotikumot (ahol R jelentése hidrogénatom) vagy gyógyászatilag alkalmas sóját izoláljuk.

3. Az I. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (1) általános képletű X-14868B antibiotikumot (mely képletben R jelentése metilcsoport) vagy gyógyászatilag alkalmas sóját izoláljuk.

4. Eljárás az X-14868AC antibiotikum — mely antibiotikum nátrium-sójának jellemző fizikai állandói az alábbiak:

1. az infravörös spektrumot a 3. ábrán mutatjuk be;

2. az olvadáspont 172 — 175 °C (nátirumsó);

3. fajlagos forgatóképesség:

[a]_D kloroform metanol + 49,6° +30,5°

- és gyógyászatilag alkalmas sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a Nocardia X-14868 ATCC 31585 törzs valamely al-tenyészetét valamely nitrogénforrást tartalmazó vizes szénhidrát oldatban szubmerz aerob körülmények között tenyésztjük, majd a kapott oldatból a fenti végtermékeket szétválasztjuk és a fenti végterméket izoláljuk, előnyösen oszlopkromatográfiával.

5. Eljárás az X-14868D antibiotikum — mely antibiotikum nátrium-sójának jellemző fizikai állandói az alábbiak:

-1427

187 763

I. az infravörös spektrumot a 4. ábrán mutatjuk be;

2. olvadáspont: 194-195 ’C (nátriumsó);

3. fajlagos forgatóképesség:

(a]„ kloroform metanol + 41,4” +29,2”

- és gyógyászatilag alkalmas sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a Nocardia X-14868 ATCC 31585 törzs valamely al-tcnyészciét valamely nitrogénforrást tartalmazó vizes szénhidrát-oldatban szubmerz aerob körülmények között tenyésztjük, majd a kapott oldatból a végtermékeket szétválasztjuk, és a fenti végterméket izoláljuk, előnyösen oszlopkromatográfiával.

6. Eljárás baktériumok által előidézett betegségek és/vagy kokcidiózis kezelésére és megelőzésére alkalmazható gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az I -5. igénypontok bármelyike szerint előállított vegyület gyógyászatilag alkalmas iners hordozóanyagokkal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé alakítunk.

7. Eljárás scrtcs-dizentcria kezelésére cs megelőzésére felhasználható gyógyászati készítmények előállítására, azzaljellemezve, hogy valamely, a 2. igénypont szerinti előállított vegyületet gyógyászatiig alkalmas iners hordozóanyagokkal összekeverünk és gyógyászati készítménnyé alakítunk.

8. Eljárás kérődzők állal elfogyasztható súlyhozamfokozó készítmények vagy azok készítésére alkalmas premixek előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, a 2. igénypont szerint előállitott vegyületet az állat számára ártalmatlan anyagba - előnyösen valamely állati takarmányba vagy tápba — bedolgozunk.