FI69099C

FI69099C - Foerfarande foer framstaellning av farmaceutiskt aktiv kijanimicin

Info

Publication number: FI69099C
Application number: FI810078A
Authority: FI
Inventors: Jay Allan Waitz; Ann Camille Horan; Mahesh Gordhandas Patel
Original assignee: Essex Laeaekkeet Oy
Priority date: 1980-01-17
Filing date: 1981-01-13
Publication date: 1985-12-10
Also published as: IE810054L; DK149823B; US4375542A; EP0033840B1; NO155732C; AR226337A1; JPH0327559B2; DE3164568D1; HU181799B; ES498452A0; FI810078L; DK149823C; AU543520B2; CA1177426A; EP0033840A3; NO155732B; JPS56118078A; ZA81217B; AU6619181A; IL61902A0

Description

Förfarande för framställning av famaceutiskt aktiv kijanimicin

Menetelmä valmistaa farmaseuttisesti aktiivista kijanimisiinia 1 69099 Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för framstMllning av farmaceutiskt aktiv kijanimicin.

Kijanimicin och dess salter uppvisar antibiotisk verkan och är användbara säsom anti-aknemedel, säsom antitumörmedel, säsom anti-malariamedel, säsom antibakteriella medel och säsom antiinflammatoriska medel. Pä gund av dess antibakteriella aktivitet betecknas kijanimicin nedan säsom ett antibiotikum även om det uppvisar andra icke antibiotiska besläktade verkningar.

Förfarande enligt uppfinningen innefattar odling av en kijamicin producerande stam av Actinomadura kijaniata i ett vattenhaltigt näringsmedelsmedium tills väsentlig antibakteriell aktivitet förlänats därtill och isolation av kijanimicin säsom sädan eller i form av ett farmaceutiskt godtagbart sait. Närmare bestämt odlas Actinomadura kijaniata nov sp. SCC 1256, ATCC 31588.

Actinomadura kijaniata nov sp. SCC 1256 isolerades frän ett jordprov frän Kenya i Afrika. En kultur av denna mikroorganism har deponerats i American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, där den getts numret ATCC 21588 (depositionsdatum 28 november 1979). Ett prov därav utlämnas pä begäran.

Stammen, SCC 1256, har följande morfologiska egenskaper vid odling pä jästextrakt-dextrosagar vid 30°C under 14-21 dagar: 2 69099 rikligt, krulligt luftmycelium, som fragmenteras till länga kedjor av eliptiska sporer med en ungefärlig diameter av 1,ΟΙ, 5 mikron och längden 15-2,0 mikron. Det vegetativa myceliet bildar rikligt med grenar.

Organismen innehäller meso-diaminopimelinsyra (meso-DAP) säsom en karakteristisk aminosyra i cellväggen. Hela celler innehäller 3-O-metyl-D-galaktos (maduros).

I tabell 1 anges odlingsegenskaperna för SCC 1256, som odlats pä olika standardmedia, vilka föreslagits av Shirling och Gottlieb (Inter. J. Syst. Bact. 16.313-340, 1966) samt Waks-man (The Actinomycetes, voi. II, The Williams and Wilkins Co., 1961). Observationer gjordes efter 14 dagar vid 30°C. De färg-beteckningar som tillskrivits det vegetativa myceliepigmentet utgöres av ett färgnamn (Descriptive Color Names Dictionary, Container Corp. USA, 1950) och ett färg-chip-nummer (Color Harmony Manual, edition 4, Container Corp., USA, 1958). Den väsentliga färgen hos det vegetativa myceliet är mörkgrön, luftmyceliet säsom massa är vit och bildas rikligt pä ISP medium nr. 7, stärkelseagar och jästextrakt-dextrosagar.

De fysiologiska egenskaperna och kolhydratutnyttjandet för stam 1256 anges i tabell 2 resp. 3.

Morfologiska och cellväggsanalyser visar att stammen SCC 1256 är en art av släktet Actinomadura. Ingen av de beskrivna arter-na av Actinomadura (Cross & Goodfellow, Actinomycetales, Characteristics and Practical Importance, London, Academic Press, 1973; Nonomura, Jap. J. Ferment 52:71-77, 1974; Preobrazhenskaya och Sveshnikova, Microbiol 43:864-868, 1974) uppvisar kombinationen av mörkgröna vegetativa mycelier, vita luftmyce-lier och de fysiologiska egenskaperna för SCC 1256. Dessutom producerar ingen av dessa kijanimicin. Odlingen anses därför vara en ny art ay släktet Actinomadura som betecknats A. kijania-ta nov sp. SCC 1256, ATCC 31588.

II

3 69099

Tabell I

Tillväxtegenskaperna för A. kijaniata pä olika deskriptiva media___

Medium Tillvaxtegenskaper

Bennetts agar G: +++, god S: stegrad, vikt AM: förefinnes spartsamt, vit DFP: fränvarande C: g 22 li, tallgrön

Czapek sukrosagar G: +++, god S: bandliknande AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 22 n, mörkt tallgrön

Glukos-asparaginagar G: +++, god S: stegrad, vikt AM: närvarande, sparsam, vita fläckar DFP: fränvarande C: g 22 n, mörkt tallgrön

Glycerol-asparaginagar G: +++, god S: platt, vikt AM: fränvarande DFP: grä, rödbrun C: centrum, g 19 po, mörk lager periferi, g 6 ie, "redwood" Näringsagar G: +++, god S: stegrad, vikt AM: fränvarande DFP: svagt mattgrön C: g 23 n, "evergreen"

Vattenagar G: +, dälig S: granulär AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 24 ge, dammigt grön jästextrakt-maltextrakt- G: +++, god agar (ISP nr. 2) S: stegrad, härd, vikt AM: förefinnes, vita fläckar DFP: fränvarande C: centrum, g 21 nl, mörkt jade- grön, periferi, g 2 ec, biskvi 4 69099

Potatis-dextrosagar G: ++, moderat S: platt till nägot stegrad AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 2 ge, dolt gulbrun

Emersons agar G: + till ++, god till moderat S: platt, granulär AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 22 ig, lagerbär NZA-glukosagar G: +++, god S: mjuk, kompakt vikt AM: fränvarande DFP: fränvarande till mörk brun C: g 15 po, mörkt skif ferfärg<id Jästextraktglukosagar G: +++, god S: stegrad, djupt vikt, härd sprickbildning AM: närvarande, vit DFP: fränvarande C: centrum, g 22 ig, mandelgrön periferi, g 3 ge, kamelfärgad

Tomatpasta-havremjölsagar G: +++, god S: platt, granulär AM: närvarande, vita fläckar DFP: fränvarande C: g 1 1/2 li, ljust olivfärgad

Stärkelseagar (Waksman nr. G: +, tämligen god 21) S: platt, granulär AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 24 ig, salviagrön

Kalcium-maleatagar G: + tili ++, tämligen god tili (Waksman nr. 7) moderat S: plikat, mjuk AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 2 gc, bambu

Havremjölsagar(ISP nr. 3) G: + tili ++, tämligen god tili moderat S: platt, granulär AM: närvarande, vita fläckar DFP: fränvarande C: g 22 nl, mörkt tallgrön 11 5 69099

Oorganiska salter - stärkelse- G: +, tämligen god agar (ISP nr. 4) S: platt,·. granulär AM: fränvarande DFP: svagt grön C: centrum, g 23 li, skiffer-grön, periferi, g 4 ge, ljust gulbrun

Pepton-järnagar G: ++, moderat S: stegrad, granulär AM: närvarande, vita fläckar DFP: fränvarande C: g 2 ge, dolt gulbrun

Kaseinagar G: ++, moderat S: platt, granulär AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 22 ih, mossgrön

Tyrosinagar (ISP nr. 7) G: +++> 9od S: stegrad, vikt AM: närvarande, riklig, vit DFP: fränvarande C: g 5 ih, blygrä

Stärkelseagar (jäst) G: +++, god S: härd, vikt AM: närvarande, moderat, vit DFP: fränvarande C: g 23 li, skiffergrön

Kalciumcitratagar G: +, tämligen god S: platt, granulär AM: fränvarande DFP: fränvarande C: g 2 li, dolt brun

Gelatinagar (McDade) G: ++, moderat S: stegrad, kompakt vikt AM: fränvarande DFP: fränvarande C: centrum, g 1 po, ebenholts, periferi, g 1 fe, gräbeige G: tillväxt; S: ytkännetecken; AM: luftmycelium; DFP: diffuserbara pigment; och C: tillväxtfärg 6 69099

Tabell 2

Fysiologiska egenskaper för A. kljaniata

TEST A. KIJANIATA

Hydrolys av: Resultat: adenin + hypoxantin + tyrosin + xantin + kasein + stärkelse +, svagt positiv gelatin + nitrat till nitrit svagt positiv

Tillväxt i närvaro av:

NaCl .

ι,ο % +++, god 2.0 % ++, moderat 3.0 % +, tämligen god till dälig

Tillväxt vid 28°C +++, god 35°C +++, god 40°C ++, tämligen god till moderat 45°C +, tämligen god

Bildning av H2S negativ melanin negativ (

II

7 69099

Tabell 3

Utnyttlande av kolhydrater TEST A. KUAN I AT A

Kolhydrater ^

Kontroll - D-arabinos + L-arabinos +

Dextrin +

Dulcitol -

Erytritol D-fruktos + L-fukos + D-galaktos + D-glukos + it-m-d-glukosid m-d-D-glukopyranosid + (grön dfp)

Glycerol +

Inositol +

Inulin

Laktos

Maitos + D-mannitol - D-mannos +

Melibios

Melizitos -

Raffinos L-ramnos + fcibos +

Sackaros +

Trehalos + D-xylos + 1) Medium enligt Luedemann och Brodsky, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1963, sid. 116-124 (1964) .

8 69099

Fermentation När A. kijaniata fermenteras under reglerade betingelser i ett lämpligt medium bildas att antibiotikum som här nedan betecknas kijanimicin.

Den fermentation som bildar antibiotikumet päbörjas genom bildning av ett kraftigt vegetativt inokulum, som vanligen bildas i tvä eller tre stagier. Ett lämpligt medium för f ram-ställning av ett sädant inokulum anges nedan säsom medium A och medium B. Inokulet och fermentationen genomföres i ett medium, väri pH upprätthälles vid ett värde frän ungefär 6,5 tili ungefär 8,5, företrädesvis ungefär 7,5 för inokulet och 7,0 för fermentationen. De rätta pH-intervallen upprätthälles vanligen genom tillsats av lämpliga buffertmedel, t.ex. kal-ciumkarbonat.

Det vegetativa inokulet och fermentationen utföres vid frän ungefär 25°C tili ungefär 45°C, företrädesvis mellan 28°C och 35°C. Den mest föredragna temperaturen vid vilken det vegetativa inokulet framställes och vid vilken fermentationen genomföres är ungefär 30°C.

Näringsmedelsmedia framställes helt allmänt i ett lämpligt fermentationskärl eller en fermentationskolv, som sterili-seras och kyles före inokuleringen. Medierna kan emellertid lagras under aseptiska betingelser vid temperaturer under 0 före användning.

Framställning av inokulum För att framställa antibiotikumet enligt uppfinningen före-drages ett kraftigt växande vegetativt inokulum.

Inokulumframställningen utföres i allmänhet i tvä eller flera stadier. För fermentationer i stor skala (t.ex. ungefär 50 liter) föredrages det att -.inokulet framställes i tre stadier..

Ett lämpligt medium för framställning av vegetativa inokula anges i tabellen nedan: it 69099 9

Medium A: Köttextrakt 3 g

Tryptos 5 g

Dextros 1 g

Potatisstärkelse 24 g Jästextrakt 5 g

Kalciumkarbonat 2 g

Vattenledningsvatten tili 1,0 liter 2 ml nyligen tinad helbuljong av A. kijaniata användes för inokulering av 50 ml sterilt medium A.

Koiven inkuberas vid ungefär 30°C i ungefär 48 timmar tili ungefär 96 timmar, företrädesvis ungefär 72 timmar, pä en skakapparat vid ungefär 300 varv/minut och med en rörelse-vidd av 5 cm.

Det andra inokulerinqssteget 25 ml av det första inokulet användes för att inokulera en serie av 500 ml andelar sterilt medium A i tväliters erien-meyer-kolvar. Kolvarna inkuberades vid ungefär 30°C under frän ungefär 24 tili ungefär 72 timmar, företrädesvis 48 timmar.

Det tredje inokuleringssteget 25 ml av det andra inokulet användes för inokulering av var och en av en serie av 500 ml-portioner av sterilt medium B i 2-liters erlenmeyer-kolvar. Kolvarna inkuberades under om-röring vid ungefär 350 varv/minut och vid ungefär 30°C under frän ungefär 24 tili ungefär 72, företrädesvis 48 timmar. Luftning vid ungefär 0,35 volymer luft/volym fermentation/minut (vvm) utfördes.

Följande medium har visat sig ge bade tillfredsställande och reproducerbara utbyten av antibiotisk produktion.

Medium B: Jästextrakt 5 g/liter

Dextros 10 g/liter Löslig stärkelse 20 g/liter 10 69099 "NZ Amine (Difco) 5 g/liter

Kalciumkarbonat 4 g/liter

Koboltklorid 10

Eftersterilisering pH 7,0

Antibiotisk produktion 10 liter sterilt medium B inokulerades med 500 ml av det andra stegets inokulum som framställts sasom beskrivits ovan. Fermentationsblandningen inkuberades vid frän ungefär 27°C till ungefär 35°C, företrädesvis ungefär 30°C, under omröring och luftning vid ungefär 350 varv/minut och vid 0,35 vvm. Fermentationsvätskans pH upprätthölls vid frän ungefär 6,8 till ungefär 7,5 genom tillsats av utspädd syra eller alkali efter behov. Tillsats av utspädd syra eller utspätt alkali var vanligen onödig. Vid normal fermentation stiger emellertid pH till ungefär 7,5 och faller tillbaka till neutralitets-punkten vid fermentationens slut.

Isolation och rening

Kijanimicin kan isoleras genom extraktion med användning av ungefär 2 volymer av icke blandbart organiskt lösningsmedel (t.ex. etylacetat) per extrakt och genom extraktion av od-lingsvätskan tvä ganger. Extrakten kombineras, indunstas till en äterstod och loses i aceton. Produkten fälles genom tillsats av eter:hexan (6:4, volym/volym) . Den erhällna matt--gula fällningen filtrerades och torkades i vakuum under unge--fär 40°C för erhällning av kijanimicin.

Kijanimicin kan renas kromatografiskt pä kiselgel med använd-ning av ett lämpligt lösningsmedelssystem.

Kijanimicin har en unik kemisk struktur. Denna innehäller en ny tetrasackaridenhet bestäende av tre molekyler L-digitoxos och en molekyl 4-0-metyl-L-digitoxos. Tetrasackaridenheten är bunden till en andra hydroxylgrupp i aglykon. Substansen har även en ny grenkedjig nitrosockerart, D-kijanos, som även är bunden till en sekundär hydroxigrupp pä aglykonet.

II

11 69099

Kijanimicin är en färglös amorf fast substans, som sönder-delas vid 174,5°C och har följande fysikalisk-kemiska egen-skaper:

Tabell 4

Elementaranalys:

Funnet: C 60,78 H 7,94 N 1,96 % θ67ΗΐθΟίί2θ24 m°tsvarar: 'C 61,08 H 7,65 N 2,13 0 29,14 % pka 5,0 -116,4° (C 0,3 %, CH30H) UV-spektrum: λ max (CF3CH2OH) 199 nm (E^ 328,4), 242 nm (E^* 56,2), 1% 1% 264 nm (E^m 63,1), 274 nm (Εχ 60,7).

> max (CH OH/O, IN HC1) 260 nm (E*% 60,8) 3 icm λ max (CH-0H/0,1 NaOH) 236 nm (E*% 103,9), 265 nm (E** 86,1), 3 lcm icm 276 nm (E^m 83,4) .

Cirkulär dlkroism

Ie7194-ne,0i6, /δι7216-ΐ76,οΐ6, /&/300+n,479 (cf3ch2oh) IR-spektrum: 0max (CHC13) 3690, 3620, 3540, 3480, 3440, 2970, 2940, 1755, 1733, 1623, 1545, 1515, 1318, 1232, 1130, 1060 cm"1.

lIt NMR-spektrum: SH (CDC13) 0,65 (2H,m), 1,07 (3H,d,J=7Hz), 1,18 (3H,d,J=6Hz), 1,20-1,40 (grupp av signaler), 1,60 (3H,s), 1,64 (3H,s), 3,45 (3H,s), 3,76 ppm.(3H,s) 13C-NMR NMR~sPektrum:

Se (CDC13) 206,2, 201,5, 167,1, 157,4, 141,5, 137,1, 135,7, 126.7, 125,8, 123,6, 121,5, 119,3, 101,9, 99,8, 98,2, 97,1, 92.2, 91,0, 90,8, 84,5, 83,3, 82,6, 79,6, 78,4, 72,4, 71,8, 69,1, 68,1, 67,5, 67,1, 66,8, 65,1, 64,9, 64,4, 63,8, 62,6, 57.3, 53,8, 53,2, 52,7, 51,0, 43,1, 41,6, 40,2, 38,5, 36,8, 35.7, 35,5, 34,8, 34,4, 31,3, 31,1, 29,9, 29,7, 27,9, 25,3, 12 69099 22,2, 20,2, 18,4, 17,9, 17,9, 17,9, 17,0, 15,1, 15,1, 14,0, 13,7.

Molekylvikt och formel:

Bestämd genom plasmadesorption masspektrometriskt (Cf) pä ki-janimicinmetyleter (1331,5+0,2, cg8H102N2°24^ *

Stabilitet;

Kijanimicin är väsentligen stabilt vid pH 6-10 vid rumstem-peratur och upp till 100°C i minst 30 minuter. Substansen förlorar aktivitet hastigt vid rumstemperatur vid pH 2-3.

Struktur:

Pa basis av ovannämnda fysikaliska data och röntgenkristallo-grafiska studier pä diacetylderivatet av aglykonen har följande strukturformel bestämts för kijanimicin: n 13 69099

OH

0 O h I 'x^\y*c”3 ""Ή '>°T' "ρφφν . - ;Λ., λ* \ j J}\0^y Γ N02 H ^/

• ^ „|H

T^CH3

CH20H

Emedan kijanimicin är sur till sin karaktär bildar substansen fysiologiskt godtagbara (dvs. farmäceutiskt godtagbara) metall- eller aminkatjonsalter. Belysande exempel pä sädana metaller- är alkalimetallerna, dvs. litium, natrium och kalium, h 69099 samt jordalkalimetaller, dvs. magnesium och kalcium. Andra metaller, dvs. aluminium, zink och järn, faller även inom ramen för uppfinningen. Belysande exempel pä aminer är de som härrör fran primära, sekundära eller tertiära aminer. Exempel pä lämpliga aminer är metylamin, dimetylamin, trietylamin, etyl-amin, dibutylamin, triisopropylamin, N-metylhexylamin, decyl-amin, dodecylamin, allylamin, krotylamin, cyklopentylamin, dicyklohexylamin, bensylamin, dibensylamin, /3 -fenyletylamin, CL-fenyletylamin, etylendiamin, dietylentriamin och liknande alifatiska, cykloalifatiska och aralifatiska aminer innehällan-de upp tili och med ungefär 18 kolatomer, säväl som hetero-cykliska aminer, dvs. piperidin, morfolin, pyrrolidin, pipera-zin och lägre alkylderivat därav, dvs. 1-metylpiperidin, 4-etylmorfolin, 1-isopropylpyrrolidin, 2-metylpyrrolidin, 1,4-dimetylpiperazin, 2-metylpiperidin, 1,4-dimetylpiperazin, 2-metylpiperidin och liknande säväl som aminer innehällande vattensolubiliserande eller hydrofila grupper, dvs. mono-, di- och trietanolamin, etyldietanolamin, N-butyletanolamin, 2-amino-l-butanol, 2-amino-2-etyl-l,3-propandiol, 2-amino-2-metyl-l-propanol, tris(hydroximetyl)aminometan, N-fenyletanol-amin, N-(p-tetramylfenyl)dietanolamin, galaktamin, N-metyl-D-glukamin, N-metylglukosamin och liknande.

Följande exempel belyser uppfinningen ytterligare.

Exempel 1.

Isolation av kijanimicin

Kromatografera 30,1 g rä kijanimicin pä en 4 kg kiselgelkolonn med användning av 3,5 % metanol i metylenklorid säsom elue-ringsmedel. Tillvaratag 10 ml-fraktioner under styrning av kolonnen genom tunnskiktskromatografi pä kiselgelplattor med användning av 10 % metanol i kloroform säsom eluerings-medel. Kombinera fraktioner med saitana mobilitet pä TLC-plattorna och indunsta tili torrhet för erhällning av 9,3 g kijanimicin. Genom kombination av mer längsamt rörliga fraktioner och in-dunstning därav tili torrhet kan 5,5 g kijanimicin erhällas.

15 69099

Exempel 2.

Natriumsalt av kijanimicin Sätt 7,6 g kijanimicin till en omrörd lösning av 58,12 ml O,IN natriumhydroxid i 800 ml destillerat vatten och fortsätt omröringen vid 25°C i 5 timmar. Filtrera lösningen genom en fin sintrad glastratt och lyofilisera filtratet för erhällning av 6,3 g av natriumsaltet av kijanimicin säsom en färglös amorf fast substans.

Funnet: C 58,65; H 7,49; N 1,93; Na 2,24 %

Cg7HggN2024Na motsvarar: C 60,08; H 7,45; N 2,09; Na 1,72 % A7*6C = -165,5° (0,3 %, H20).

UV-absorption: ^.max (CF3CH2OH) 197 nm (E**m 304,5), 236 nm (Elcm 65'2)' 266 nm (Eicm 62'8)' 272 nm (Eicm 62'8)· IR-absorption: Omax (KBr) 3450, 2970, 2925, 1720, 1625, 1542, 1510, 1405, 1050 cm-1.

Pä liknande sätt och med användning av en ekvivalent kvantitet av andra saltbildande element säsom kalium- eller rubidium-hydroxid och liknande och pä väsentligen samma sätt säsom beskrivits i detta exempel kunde motsvarande kijanimicin-salter framställas.

Pä liknande sätt och med användning av en ekvivalent mängd av en organisk katjonbildande substans säsom N-metylglukamin eller dietylamin och liknande och enligt väsentligen samma förfarande som i detta exempel kunde motsvarande kijanimicin-salter framställas.

Kljanimicins biologiska aktivitet

Akne är ett tillständ vars patogenes inte Mr helt känd. Det är emellertid känt att tillförsel av vissa antibiotika (t.ex. tetracyklin) har en välgörande terapeutisk effekt. De antibiotika som uppvisar den största effekten är de som är aktiva gentemot Propionibacterium acnes. Detta antyder att P. acnes spelar en framträdande roll vid uppkomsten av sjukdomen. Bort-sett frän aktiviteten gentemot P. acnes skall ett effektivt anti-aknemedel ha ett snävt spektrum av antimikrobiell aktivi- ie 69099 tet för att minska möjligheten för uppkomst av resistenta mikroorganismer. Ett sädant medel skall uppvisa tillräcklig lipidsolubilitet för att kunna penetrera in i fettkörteln, skall ha en begränsad potential för irritation ooh sensiti-sering ooh skall uppvisa antilipasegenskaper, varigenom man förhindrar uppkomst av inflammerande fria fettsyror frän sebum.

Kijanimicin tillfredsställer de ovan ställda fordringarna.

Vid testning gentemot en mängfald stammar av P. acnes upp-visade kijanimicin MIC-värden varierande frän 0,37 tili 1,5 mcg per ml efter 48 timmar i flytande tioglykolatvätska.

Den använda metodologin in vivo vid anti-aknetestning var väsentligen densamma som anges i den amerikanska patentskrif-ten 4.044.140.

Vid användning för behandling av akne varierar dosintervallet vanligen mellan ungefär 5 tili ungefär 25 mg kijanimicin per kg kroppsvikt och dag. Topisk och parenteral tillförsel i enhetsdoseringsform föredrages helt allmänt.

Kijanimicin är även aktivt gentemot stammar av anaerobiska bakterier andra än P. acnes. Vid testning in vitro var sub-stansen aktiv exempelvis gentemot stammar av Peptococcus-arter och Peptostreptococcus.

Kijanimicin uppvisar anti-tumörverkan gentemot P-388-leukemi vid testning in vivo pä möss som tillförts en letal dos därav i förväg.

Anti-tumörverkan bestämdes enligt det standardtest som pub-licerats av National Cancer Institute i Cancer Chemothr. Rep. 3:1-103 1972.

Vid testet tillfördes lO^celler pä mus av P-388-leukemi (bleomycinsensitiv) intraperitonelt pä dag 1. Testföreningen utspäddes i serie (1/10, 1/100, etc.) och varje utspädning tillfördes en mus frän dag 1 till dag 9. Djur som dog pä eller före dag 5 ansägs ha dötf pä grund av toxisk verkan.

li 17 69099

Kontroller utfördes nted användning av bleomycin och olivomycin A. Resultaten beräknas enligt den formel, väri MST = mediumöverlevnadstid i dagar; T = behandlad, C = kontroll

MST /C = MST-T/MsT-kontroll x 100 T

Om /C > 125 uppvisar testföreningen signifikant anti-tumör-aktivitet.

Kijanimicin uppvisar även antiparasitisk aktivitet och är speciellt användbar gentemot stammar av malariaparasiten, Plasmodium berghei. Aktiviteten pävisades i försök med användning av CF^-möss, som tillfördes en letal dos av blod frän tidigare infekterade möss, varvid antibiotisk terapi päbörjades en dag efter infektionen.

Kijanimicin uppvisar en anti-inflammatorisk effekt vid under-sökning enligt inom vetenskapen örkända testförfaranden, varvid sädan aktivitet är speciellt fördelaktig vid behandling av akne.

Kijanimicin uppvisar ett oralt värde för PD^0 i mg/kg för möss gentemot representative gramnegativa och grampositiva bakterier varierande frän 50 tili över 100 säsom natriumsaltet och frän 10 tili över 100 i form av den fria antibiotiska sub-stansen. Den antibiotiska substansen uppvisar ett subkutant värde för PD,-0 i mg/kg gentemot saimia bakterie av frän 10 tili över 100 bäde säsom natriumsaltet och säsom den fria antibiotiska substansen.

Kijanimicin uppvisar ett värde för LD,-0 oralt och subkutant, som är större än 1000 mg/kg. Värdet för LD^0 vid oral och sub-kutan tillförsel är sälunda ungefär 10 gänger värdet för PD,-0 (dvs. det terapeutiska indexet är ungefär 10).

Claims

1. Förfarande för fraraställning av farmaceutiskt aktiv kijani-micin, som har formeln: OH * 0 OH J CH3/ir07 o Π h\ r ># .CH3 ch3oconh CH3YM>h#V ch3 JH^.CH3C^h ch!s^Vo jy. Jo, H^Nf3HOs/^>=o 2. t^O L ]^CH3 ch2oh och farmaceutiskt godtagbara salter därav, känneteck-n a t därav, att man odlar en kijanimicin producerande stam II 19 69099 av Actinomadura kijaniata, i ett vattenhaltigt näringsmedels-medium tills en väsentlig antibakteriell aktivitet uppkonunit däri och man isolerar kijanimicin säsom sädant eller i form av ett farmaceutiskt godtagbart sait.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, kännetecknat därav, att man odlar Actinomadura kijaniata nov. sp. SCC 1256 ATCC 31588.

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, kännetecknat därav, att kijanimicin isoleras i form av natrium-, kalium-, rubidium-, N-metylglukamin- eller dietylamin-saltet. 69099

1. Menetelmä valmistaa farmaseuttisesti aktiivista kijanimi-siinia, jonka kaava on OH 0 CH3yM^*0^ 0 H° cH^'—oy λ# .ch3 ch3oconh CH3SiIhi>h#v LCH3 J £Η,^:ώ5>„ ]^ch3 ch2oh ja sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja, tunnettu siitä, että kijanimisiinia tuottavaa Actinomadura li