FI66023B

FI66023B - Foerfarande foer framstaellning av nya anti-inflammatoriskt vekande 11beta-hydroxisteroider

Info

Publication number: FI66023B
Application number: FI790240A
Authority: FI
Inventors: Ernst Schoettle; Alfred Weber; Mario Kennecke; Helmut Dahl; Joachim-Friedrich Kapp; Hans Wendt; Klaus Annen; Henry Laurent; Rudolf Wiechert
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1978-01-25
Filing date: 1979-01-25
Publication date: 1984-04-30
Also published as: FI790240A; FR2422689A1; SU927123A3; SU880253A3; NO154583B; ES477162A1; BG33737A3; PT69126A; AU4365779A; IE790134L; DD150749A5; EP0003341A2; IL56494A; CS207753B2; IL56494A0; DD141523A5; DK28779A; AU529292B2; EP0003341A3; IE47729B1

Description

r: JT1 ,-, .... KUULUTUSJULKAISU ^ Λ Ä 4&Γφ W ( *) UTLÄGGNINGSSKRIFT 6 6023 gSEjlSsS C Pater, !; ti. r.yärrc t ty 10 CO 1904

Patc-rt r.eddclat ' (51) Kv.lMlnt.CI.3 e 12 P 33/00 , C 07 J 5/00, 7/00 SU O M I —F! N LAND (21) Pitenttlh.k.mui— P>t*ntan*Oknio| 790240 (22) H»k#ml*f4tvi — Ameknlnpdag 25.01.79 ^ ^ ^ (23) AlkupMvi — Glhlghcudaf 25.01 .79 (41) Tullut |ulklteksl — Bllvlt offuntllg 26.07.79

Patentti- ja rekUterlhallltut Nihtivtk.ip.non |. kuuLju.k.taun pvm. -

Patent- ech regittarstyraiaan Anukin utUjd och uti..krtft«n publkend 30.04.84 (32)(33)(31) ttuolkeu» —Begird prlorltet 25.01.78 19.12.78 Saksan Liittotasavalta-Förbunds-republiken Tyskland(DE) P 2803661.5, P 2855^65.6 (71) Sche r i ng Akt iengesel 1 schaf t, Ber 1 in/Bergkamen, DE; Miillerstr. 170-178, D—1000 Berlin 65, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Ernst SchÖttle, Berlin, Alfred Weber, Berlin, Mario Kennecke, Berlin,

Helmut Dahl, Berlin, Joachim-Friedrich Kapp, Berlin, Hans Wendt,

Berlin, Klaus Annen, Berlin, Henry Laurent, Berlin, Rudolf Wiechert,

Berlin, Saksan Liittotasava1ta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7*0 Oy Koi ster Ab (5^) Menetelmä uusien, tulehduksia ehkäisevästi vaikuttavien 11^-hydroksiste-roidienvaImi stamiseksi - Förfarande för framstä11 ning av nya anti-inflam-matoriskt verkande 1l£-hydroxisteroider

Keksintö koskee menetelmää uusien, tulehduksia ehkäisevästi vaikuttavien 11(3 -“"hydroksisteroidien valmistamiseksi, joilla on yleiskaava I

r**> p -- - 0CH0Ri 1

X

jossa sidos......merkitsee yksinkertaista sidosta tai kaksois- sidosta, X on vety, fluori, kloori tai metyyli, R on 1-8 hiiliatomia sisältävä, mahdollisesti happiatomin katkaisema ai kyy li tai bentsyyli ja > £ :.02 3 p ..... ....

"2 on vety tai 1-*Ι li π 1 ] atom a s lsaltävä alkyyl i tai R., j a R merkitsevät yhdessä 1,nraoty I eorei ä tai tet rametyleeniä, n . on vety tai hyd reksi, ja on vety tai mt-vyy li , valmi st ani is oksi .

Jo kauan on ollut tunnettua, että tulehduksia ehkäisevästi vaikuttavien 17 o<-hydroksikortikoidien vaikutuksen tehoa paikallisesti käytettäessä voidaan kohottaa osteröimälla niiden 17-hyd-roksiryhmä. iV’’t. yleisreferaatti in Thomas L. Popper ja Arthur S. IVatr.ick, "Anti Inflammatory Steroids in Antiinflammatory Agents", Volume 1, Ac adorni ·:· Press, New York, San Fransiseo, London (19 7 h) sivut .:68-171).

Nyt on keksitty, että tehokkuutta paikallisesti käytettäessä, j a / toi halutun paikallisen tulehdusta ehkäisevän vaikutuksen ja 0.1-toivotun sysi:'-emisen vaikutuksen jakautumaa, voidaan vieläkin kohottaa siten, etIS näiden kert1 koidien 17 (X-hydroksirvhmien vety-atomia ei korvata esterillä vaan asetaalitähteellä.

Yleiskaavan I mukaisten uusien kortikoidien substituentteina •P1 voi olla suorakot j ui non tai sivuketjuinen alkyylitähde, jossa on 1-8 tai edull ieest i 1-b h lii ia torni a. Tällaisia alkyyl itähteitä ovat esimerkiksi metyylit-ähde, etyylitähde, propyylitähde, iso-propyylitähde, but.yy litähde, i sobutyy l i tähde , tert.-butyy] i tähde, pentyyli tähde , i sopentyy li tähde , heksyy litähde , heptyy li tähde tai oktyyli tähde . Subst:: ΐ-uentin H a 1 k y y ] 11 aha o voi kuitenkin, olla my es happi at omin katkoi soma. Tällaisia tähteitä ovat esi merkiksi 7-netoksietoksi t ähd.-, 8-metcksinronyyJ ioksi1 ähde toi ?-etokoieloksi t ähde.

Ylei skoavan 1 mukaisten kort ikoidi · n substituentteina η.Ί voi :)lla 1-^ hiiliatornuen aikyy 11 ryhmä, kuten esim. metyy 1 i. ryhmä , etyy1iryhmä, propyy 7iryhrnä tai outyyli ryhmä. Huomionarvoisia ovat yleiskaavan I mukaiset: kort i koi di t, joissa R, vastaa vetyatomia, koska näinä eivät voi muodostaa diastoreomeeriseoksia.

Uusien kort i koidi en vaikutuksen alkumi non ja vaikutuksen kesto samein ku ι n η ί ΐ uen li uko i s uus f y s ί o lovi sest i hyväksyttävä in liuottimiin riippuvat samoin kuin tunnettujen kortikoidienkin erityisesti si ita, onko 21-asemassa oleva hydroksiryhmä esteröity ja ,;os se oti, millä hapoilla se on esteröity.

Esteröityinä 21-hydroks lryhminä R^ tulevat kysymykseen Lähinnä as yy11o k s i ry hmät, joiden asyylit ähteessä on 1-16 hiiliatomia, 3 6 502 3 sulfaattiryhmät tai fosfaatti ryhmät. Sopivia asyylioksiryhmiä ovat esimerkiksi ryhmät, jotka ovat suoraketjuisten tai sivuket-juisten, tyydytettyjen ja tyydytettymättömien alifaattisten mono-tai dikarboksyylihappojen johdannaisia, joissa tavalliseen tapaan voi olla substituentteina esimerkiksi hydroksiryhmiä, aminoryhmiä tai halogeeniatomeja.

Asyy 1 ioksiryhmiksi soveltuvat edelleen myös s.ykloalifaattisien, aromaattisten, aromaattis-alifaattisten sekahappojen tai heterosykiistan happojen tähteet, joissa voi olla myös tavanomaisia substituentteja. Sopivina asyylioksiryhminä mairiitlakoon erityisesti: formyy lioksi-, asetoksi-, propionyy lioks i , butyryy Iloksi-, pentanoyylioksi-, hcksanoyy1ioksi-, oktanoyylioksi-, undekanoyy1i-oksi-, dlmotyyliasetoksi -, trimetyyliaset oksi-, dietyy1iaseloksi-, tert.-butyyliasetcksi-, bentsoyylioksi-, fenasetyylioksi-, syklo-pentyylipropionyylioksi-, hydroksiasetoksi-, monoklooriasetcksi-, diklooriasetoksi-, triklooriasetoksi-, edelleen dimetyyliaminoase-toksi-, trimetyyliaminoasetoksi-, dietyyliaminoasetoksi-, piperi-diinoasetoksi-, nikotinoyylioksi-, CO-karboksipropionyylioksi- ja CO-karboksipentanoyylioksiryhmä.

Vesiliukoisten vaikutusaineiden valmistamiseksi kl-asyyli-oksiyhdisteet, joiden asyylitähteessä on emäksinen typpiryhmä, voidaan muuttaa vastaaviksi happoadditiosuoloiksi, kuten esim. hydroklorideiksi, hydrobromideiksi, sulfaateiksi, fosfaateiksi, oksalaateiksi, tartraateiksi tai maleaateiksi. Edelleen ?l-kar-boksyylihappomonoesterit, samoin kuin rikkihappo- ja fosforihappo-esterit voidaan muuttaa vesiliukoisuuden parantamiseksi aikaiisuo-loikseen, kuten esimerkiksi natrium- tai kaiiumsuoloiksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien kortikoidien valmistamiseksi, jotka ovat 11^3-hydroksiesteroideja on tunnusomaista, että 11-deoksisteroidia, joilla on yleiskaava II

Ρ'Λ f? c=o | OCHORj (II) x 6:502 3 jossa X, R,, , Rn ja Rj merkitsevät samaa kuin edellä ja Rr on vety, hydroksi tai alkanoyylioks1, jossa on 1-6 hiiliatomia, ferment o Idaan Curvularia-suvun s ionivi 1 j elmän avulla, ja haluttaessa saatujen kaavan I mukaisten yhdisteiden, joissa....... mer kitsee yksinkertaista sidosta, 1,2-asema dehydrataan, ja haluttaessa saadut kaavan I mukaiset 21-hydroksisteroidit esteröidään.

Kuten tunnettua tulehduksia ehkäiseviä vaikutuksia omaavia 11 ^-hydroksistoroideja (kuten esim. kortikoideja: hydrokortisoni, Prednisolon, Bexamelhason, Betamethason, Prednyliden, Triamuinolon, Fluori nolon tai Plurandrenolon) valmistetaan hyvin kalliin monivaiheisen osasyntees i.n avulla luonnossa esiintyvistä steroideista (kuten dioogeniinista), joita on yhä vaikeammin hankittavissa riittävin määrin. Näiden yhdisteiden monivaiheisessa synteesissä mikrobiologisesti tapahtuva 110-hydroksiryhmän sijoittaminen steroidi-runkoon on yleensä kallein ja suurimman hukkaprosentin aiheuttava synteesivaihe.

Vuonna 1966 kehitettiin menetelmä, jonka avulla pregnaani-sar j an 11-de s oksi-1 7 - hydroksi st ero idej a 11 0-hyd ro ksy loi taessa saantoa voidaan kohottaa oleellisesti esteröimällä 17 «λ-hydroksi-ryhmä, hydroksyioimalla sitten Curvularia-suvun sienien avulla ja saippuoimalla saadut 11 (7>-hydroksi-17 ^-asyylioksisteroi di t (DE-patenttijulkaisu 1 6l8 699)· 17-hvdroksiryhmän asylointi on kuitenkin hyvin kallis ja tällöin saatavat saannot ovat usein epätyydyttävät .

Myöskin 11 ^-hydroksi-17^-asyylioksisteroidien hydrolyysi on vaikea, koska useimmiten muodostuu sivutuotteita, mikä edellyttää kallista ja hukkaa aiheuttavaa saatujen tuotteiden puhdistusta, jotta nämä vastaisivat vaikuttavilta lääkeaineilta edellytä t t ävi ä puhtausvaa t i muksia.

Myös US-patent.1;ijulkaisussa 3 530 938 käsitellään l.l-deoksi-steroidien fernoritoint ia Curvularia Lanata sieni viljelmän .avulla läheistä rakennetta oleviksi 11 (3-hydrok.sistcroideiksi.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä sitä vastein käytetään steroidi-lähtöaineita, joita voidaan valmistaa hyvin saannoin vastaavista 17-hydroksisteroideista ja saadut tuotteet voidaan hydrolysoida nopeasti ja kvantitatiivisesti vastaaviksi 11/(3j Ι7<λ-dihydroks isteroIdeiksi.

Menetelmän mukaisesti käytettävät steroidit voivat olla tavanomaisesti substituoituja ja/tai niissä voi olla kakso.is-sideksia.

l· 6:302 3 5

Hydroksiryhmien tai asyylioksiryhmien sijainti esim. 21-ase-massa, halogeeniatomien, lähinnä fluoriatomien, metyyliryhmien tai metyyliryhmien läsnäolo, esim. 6- ja/tai 16-asemassa, ei häiritse keksinnön mukaisen menetelmän suoritettavuutta, Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään lähtöyhdisteinä lähinnä sellaisia steroideja, joiden 3-aaemassa on oksoryhmä ja 4,5-asemassa kaksoissidos.

Muiden lähtöyhdisteiden käyttöä huomioimatta keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan olosuhteissa, joita käytetään tavallisesti steroidien 11/^-hydroksylointiin Curvularia-suvun sienien avulla.

Hydroksylointiin soveltuvia Curvularia-suvun sieniä ovat esimerkiksi Curvularia falcuta QM-102 H, Curvularia gonticulata IPO (6284), Curvularia lunata NRRL 2380, NRRL 2434, ATCC 12017 tai IFO (6286) tai Curvularia maculans IFO (6292).

Mainittakoon, että muutkin kuin Curvularia-suvun 11 (¾-hydroksy loivat mikro-organismit soveltuvat käytettäviksi menetelmää sovellettaessa; tästä ei yleensä ole mitään etua keksinnön mukaiseen menetelmään verrattuna.

Viljely tapahtuu uppoviljelmänä näiden mikro-organismien yhteydessä tavallisesti käytettävissä viljelyolosuhteissa sopivassa elatusaineessa ilmastusta käyttäen. Viljelmiin lisätään sitten substraattia (sopivaan liuottimeen liuotettuna tai lähinnä emulgoidussa muodossa), ja fermentoidaan kunnes substraatin muuttuminen on tapahtunut mahdollisimman täydellisesti.

Sopivia substraattiliuottimia ovat esimerkiksi metanoli, etanoli, glykolimonometyylieetteri, dimetyyliformamidi tai dime-tyylisulfoksidi. Substraatti voidaan saada emulgoitumaan esimerkiksi suihkuttamalla tämä hienojakoisessa muodossa tai veden kanssa sekoittuvaan liuottimeen (kuten metanoliin, etanoliin, asetoniin, glykolimonometyylieetteriin, dimetyyliformamidiin tai dimetyyli-sulfoksidiin) liuotettuna voimakasta pyörrevirtausta käyttäen (lähinnä kalkittomaan) veteen, jossa on tavanomaisia emulgointi-apuaineita. Sopivia emulgointiapuaineita ovat ionittomat emul-gaattorit, kuten esim. etyleenioksidiadduktit tai polyglykolien rasvahappoesterit. Sopivina emulgaattoreina mainittakoon esim. kaupan olevat kostutusaineet Tegin Tagat^R\ Tween^R^ ja

Span^R^.

___ - τζ 6 66023

Substraattien emulgointi mahdollistaa usein suuremman subs-traattituoton ja siten substraattikonsentraation kasvun. Itsestään selvää on kuitenkin myös mahdollisuus käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä substraattituoton kohottamiseen muita menetelmiä, jotka ovat fermentointiasiantuntijain tiedossa.

Edullisin substraattikonsentraatio, substraatin lisäysaika ja fermentoinnin kesto riippuvat käytettävän substraatin rakenteesta ja käytettävän mikro-organismin laadusta. Suuret on, kuten mikrobiologisten steroidimuuntumisten yhteydessä yleensäkin edellytetään, yksityistapauksissa saatava selville ammattimiehen tiedossa olevin esi kokein.

Tämän jälkeen mahdollisena toimenpiteenä tapahtuva yleiskaavan I mukaisten tyydytettyjen A^-steroidien 1-aseman dehydraus voidaan suorittaa sekä mikrobiologisin työskentelymenetelmin että myös puhtaasti kemiallisin menetelmin. Siten /^-steroidien 1-ase-ma voidaan esimerkiksi dehydrata tavanomaisissa olosuhteissa Bacillus-suvun (esimerkiksi Bacillus lentus- tai Bacillus sphaeri-cus-lajin) tai nivelbakteerien (esimerkiksi Arthrobacter simplex-lajin) bakteeri viljelmillä. Toisaalta Δ -dehydraus voidaan kuitenkin suorittaa myös siten, että ^-steroideja kuumennetaan tässä reaktiossa tavallisesti käytettävien hapetusaineiden, kuten esim. seleenidioksidin tai 2,3-dikloori-5,6-disyaanibentsokinonin kanssa neutraaleissa 1luottimissa.

Saadut menetelmän mukaiset tuotteet voidaan yksinkertaisella tavalla lohkoa vastaaviksi 11 {$ , 17 ot, 21-trihydroksisteroideiksi.

Tämä lohkai.su suoritetaan olosuhteissa, joita tavallisesti käytetään asetaalien hydrolysoirmin tai alkoholyysin yhteydessä. Yhdisteitä voidaan lohkoa esim. siten, että niiden annetaan reagoida pienimolekyylisessä alkoholissa, kuten motanolissa tai etanolissa tai vesipitoisessa orgaanisessa 1iuottimessa, kuten glykolLinono-metyylieetterissä, tetrahydrofuraani saa, dioksaanissa, dimetyyli-formamidissa, dimetyylisulfoksi dissa, heksametyylifosforihappotri-amidissa, asetonissa epäorgaanisen hapon, kuten suolahapon, rikkihapon, fosforihapon, perkloorihapon, sulfonihapon, kuten p-tolu-eenisulfonihapon, vahvan happamen karboksyylihapon, kuten muurahaishapon, etikkahapon, trifluorietikkahapon, happamien ioninvaih-tajien tai Lewis-happojen, kuten booritrifluoridin, sinkkikloridin, sinkkibromidin tai titaanitetrakloridin kanssa.

7 6:502 3

Keksinnön mukaisella menetelmällä saadut yleiskaavan I mukaiset 21-hydroksisteroidit voidaan haluttaessa estercidä esimerkiksi, seuraavasti: 21-hydroksiryhmä esteröidään edullisesti sulfonihapolla, lähinnä metaanisulfonihapolla tai p-tolueenisulfonihapolla ja sulfonihapporyhmä vaihdetaan sen jälkeen halogeeniksi. 21-hydrok-siryhmän esteröinti tapahtuu esim. antamalla sulfonihappokloridin vaikuttaa orgaanisen emäksen, kuten pyridiinin läsnäollessa tai vesipitoisen alkalin läsnäollessa 21-hydroksisteroideihin. Sulfoni-happoryhmän vaihtaminen halogeeniatomiin tapahtuu lähinnä antamalla 2i-sulfon.happoesterien reagoida alkalihalogenidin, kuten esim. litiumkloridin tai kaliumvetyfluoridin kanssa polaarisen liuottimen, kuten esim. dimetyyliformamidin läsnäollessa reaktiolämpötilan ollessa välillä 50°C - l80°C.

Terapeuttiset kokeet

Yleiskaavan I mukaisilla uusilla kortikoideilla on erittäin hyvä tulehduksia ehkäisevä vaikutus ja niiden halutun paikallisen vaikutuksen tehokkuuden ja ei-toivotun systeemisen sivuvaikutuksen välinen jakauma on erittäin edullinen.

Paikallisen vaikutuksen tehokkuus voidaan määrittää verisuonien supistumiskokeen avulla seuraavalla tavalla.

Kokeen suorituksessa käytetään kahta kahdeksan, kumpaakin sukupuolta olevan, koe-eläimen muodostamaa ryhmää, joita ei ole kahden viimeisen viikon aikana käsitelty paikallisesti kortikoste-roideilla. Kun koe-eläinten selästä on poistettu väli Stratum corneum - Stratum lucidum (20-40 Tesakalvosuikaletta), näihin koh-

O

tiin levitetään 0,1 g:n valmiste-erä 4 cm':n alueille, joissa ei ole okkulsiosidosta. Jotta vältettäisiin saman valmisteen apli-kointi samoille ihon alueille, levitys suoritetaan kiertojärjes-tyksessä.

Kokeen suorittaja arvioi verisuonien supistumisen visuaalisesti 4:n ja 8:n tunnin kuluttua käyttämällä seuraavaa vaikutuksen arvointiasteikkoa: 1 = vaaleus täydellinen, 2 = vähäistä jäännös-punoitusta, 3 = keskikertaista punoitusta, punoitusintensiteetti _______ - τ~.

8 6:502 3 repäistyn, käsittelemättömän ja vaurioittamattoman ihon keskivälillä, 4 - punoitusta, joukossa vähäisiä vaaleita kohtia, 5 = ei vaaleita kohtia tai voimistunutta punoitusta.

Yksittäiset arviot ilmoitetaan.

Kussakin koesarjassa käytetään vertailuaineena Diflucortolon-21-valerianaatt ia ( = 6^, 9 <A-dif luori-ll/^ -hydroksi-16oi.-metyyli-21-vaieryylioksi-1,H-pregnadieeni-3,20-dionia = DFV).

Kussakin tapauksessa ilmoitetaan yksityisissä tutkimussarjoissa ilmoitettujen DFV:n ja kokeiluaineen keskimääräisten vai-kutusasteiden ero Positiiviset Δ-erot osoittavat, että kokei luaine on arvioitu edullisemmaksi kuin DFV, negatiiviset erot osoittavat, että kokeiluaine on arvioitu epäedullisemmaksi kuin DFV.

Seuraavissa taulukoissa on esitetty havaitut koetulokset, jotka on saatu käsittelemällä kokeilukohteita 0,1 ppm vaikutusai-netta sisältävällä valmisteella.

Yhdisteiden systeeminen tehokkuus voidaan määrittää apuaine-turvotuskokeen avulla seuraavasti: SPF-rottiln, joiden painot ovat 130-150 g, ruiskutetaan tu-lehduspesäkkeiden aiheuttamiseksi 0,1 ml 0,5 %:sta Mycobacterium butyricum-suspensiota (saatavana amerikkalaiselta Difko-yhtiöltä) oikeaan takakäpälään. Ennen ruiskuttamista mitataan rottien käpälien tilavuudet. Kun ruiskuttamisesta on kulunut 24 tuntia, käpälien tilavuudet mitataan uudelleen turvotuksen määrän määrittämiseksi. Tämän jälkeen rotille annetaan suun kautta tai ihonalaisesti erilaisin määrin kokeiltavaa ainetta - liuotettuna seokseen, jossa on 29 I bentsyylibentscaattia ja 71 % risiiniöljyä. Seuraavien 24 tunnin kuluttua mitataan uudelleen käpälien tilavuudet.

Kontrollieläimiä käsitellään samalla tavalla sillä erotuksella, että niihin ruiskutetaan kokeiltavaa ainetta sisältämätöntä bent syy 1 ibent soar; tt i-risii n iöljy-seosta.

Saaduista käpälien tilavuuksista määritetään tavalliseen tapaan kokeiltavan aineen määrä, joka tarvitaan koetta varten aiheutetun käpälien turpoaman tilavuuden pienentämiseksi 50 %.

Seuraavissa taulukoissa on esitetty saadut koetulokset, jolloin keksinnön mukaisia aineita verrataan rakenteellisesti analogisiin, kaupan olevien preparaattien sisältämiin kortikoideihin.

9 66023 s—\

G

CU

X) Λ ^ O · op x υ cm • zj- 0) rr) en lo w

O O k O

i—I o ro ro Zf H O O CM

co ·ιΗ lo i—i i—( i—) ro cm i—l 3 1 Θ .g ^ 5 § a h c 4, S· s lii M di :<d J- Γ"

0 < H o LO CD

rH CL) LO

3 ωθ 1 “ 3

CO

fd I-1 h ω •H o ω Λί

•h co G

ed H H

Jj -P ^3 -P CO r>> C'- zj- LO CD CD

Tj (/} 4-J -j-> »N rs rs rs rs rs r'

Ad H G o o o o o o o 0 Pr CO i—I | + + + + + +

•r- G G

1 ω Λ M

•rH » s s ω ·Η ς •H C Ή "K aas 0 CO G P cm ro J- en en en XL Ή -P P r CD 2 r rr r p P G co o » o o o o P<Dzl-H| + O + + + + 1 1 o s

H

O

G ·Η 1H

2

H X) G

2 i i i i o fG r—I G) [Π- H ·Η H CM CM H CM |X)

^ ' I I « I. I, I. ·Η I

H )n ^sl S( Si "a H O

\ i G h bO m^-h e-1 h i l h l>,cm i—IHO i—I P i—IG 1—I Ή i—I zX Ή zt H PO Λ HCCO lp HP I G IlG I I Ή I G ro | Q> 1H 1rH CX | Q) H | O H ·Η O Ή H G H cd I H cd -p co i -H b0 co zr ·η co en -H co en O en P ή n) en e p x xH eno) x: ι τ> x: xl ΐί a; ·η ä >> e g X (JO niG XL P OP I POI O P d p ft® Tn O JJ X PH O O G p CO O P -P O H P I PPO) -h HCLrS >, i2 ΐ! g i >, O ^ i >sS XG S 2 .§.Vh .-SgT 5-3? ·3£™ ££8 Ί

PiAdP xjpcsi enene Ό E ·η xd xl h xl xj i o r3 (X gj

>1-H M-P IE·' X! xL O I -H G I Q G Oi H iPl .H

0) -Penned H H 00 op -H HCOQ) H ft3 -P H G -< -P zf S

-p ex: jd cm m i -PPTO cm xl <u cm p <g gn 5 (m u i x

en Λ p -H P ~ XL ·Ρ «»"Ρ I " Q G, «&£Λ«<1>«·Ρ^ P

p J. P G S 1 O G J, >iO λ fx Η) Λ G® \. ws. bO O l -H g V Ί 'O o -p Q-p o Oi g; h " p j) o p -¾ \ p m <.

r-C r- £>>·Η 0 r1Hs1 ^ t''1- 1r3 2 i—1 m H H (0 h Γ'·'· i—I H H (N

>-< H S e H T) ro rH Oh Oh H -H Oh rH i—i Oh rH ^ O 1 10 66023 j

G

a; ä

Q

M O *

Φ rc CG LO

O O CM co X rH o to _

Ci) -r-) LO *> C

3^0 CM oo -rj o G ö A g ζ £

G * H

V & 0)

G C

•h <u O p ms.

<D 3 ·Η Ά ω (P :rn to cc <G '—i O c* rs O QJ 00 cn "zJ tip 0 ts 3.

0

X

p 3 Ό 3 co m H Q) •—I o •Η

CO CO G

•H *H *H nj ? ^

G P 3 P

m co p 3 co co <~m *Τ3 *H r—f r* r* ^ .G a oo p o o o <? S n*

•H G

G <D

O *H Η

rH G G

O O "G m CO 3 P 3 •H CO Cp

G 'H I. p CH CM t" CN

ZZ G P 3 e <\ ri ^ m <u h o o o cp ^ > 3 3

CM

O

H I

3 λ:

3 Q I

H | I G H

m n "3 e

I C (/] >iH

•H |. ob p; I ·Η -G I H

V · ··' ^ 0) G S G 1 'rf R

-¾ C> t< G G " O $ Q

P CM H (ZLt V i—I -H ^X ‘cj

,¾ •'i il >i i ij P V

T3 co G -h J- Λ -H I T1 P I

I 9 φ «ή I co σ l, 1 o tU

-G · H FrC I—(G ,-Λ X H * 3 S CM P

H r O OIOxOcio-H^ co

G <D G fr-dM Pcjco i WC) H

V a"3 3) co ό h m i o x i x3 I ·Ρ G Po x | I g -H -H O -H £

H Ti Ό Γ* o <—) ·Η ·Η C '—i -Μ C

£ g * h +J CM CO to 3 ξ; ^ J{ 3 P ^ 50 P- I S co O O -H H I -H -3 d t'' 0) 11 H H I p 4-1 X) T3 m

‘.d ή S'-' cMcn-Ha)(umt;„^ P

9 <- a· h '-^GwSG.2r'S, μ h λ i e * ° δ ω ^ >j· o \p i o su _1 1 P >

<—i λ·ρ r—i a) *p i—i e— G 1 ^ *3 G

HHTJ HS'PCMHPC'JWP -li li 6 602 3

/—N

S

Ό ! .

u Π3 0) O U5 O Ή

X ·Η O O CM

ω M lt> «. r

3 Ω CO CO rH

μ C M

o o t -S -5

3 (rt O

-P Ä C

i> c C 3J °

’td -H M

3 *d M i—I o <; 0) l-O CM 00

-H Q CM

a' bO M

& 3 3 c e ·μ

-H Q

a) C

o

Ai

-H

3 Ό td 3 a> ω o

AC

3 -S «e a § a) -P 3 μ tj σι μ 3 c- o ro Ή ‘H rH CO Λ f'

0 ft CO p r O i—I I—I

M p . M cd + + +

•h tn O

1 s

H C C

ft O -H 3 g 3 g 3 0 en e μ H ·μ 3 +j co j- en o AC ft -μ 3 ~ Λ ·>

1 <D H o CD CD rH

en > j- 3 I + + + 0 I-1 p

d i I

H I . I ·Η I *H ·Η I

d i-v »** CO fTy W C λ I

e <3 " ^ac o ^1¾

I . Sot: ^ ro O H O -H r>-H C

•H L 0) -¾ ·Η rH +J r-H+JO H 1/1 Hl mP 6 S h icu-H i aj i i ,γ y Y ^ (Χ-Ο μι -H S C -H S o -HOC O L I n rrt C-HO C-H cm ft -μ (¾ lav's SSi'4 8 2« 8 S Λ

£-*V’ä-8 3 S Λ ^'hc iJ

^2’g.s g· -* g~- *g δ ok^A.S .¾ I ,y 3 ί me co en I CD· en j. ·μ -q Ah rH ·μ O I Cft Idi ΙΈΓ·γΗ I o ω I j=

Π) rH rH ·<Η C3 ·Η ·γΗ P"- ·Η ·Η γΟ ·Η Γ*·"* CC

4-J ι >,hcnx) co h g ω fH d co I—I o cn 'Q

.3 i?a™i SAS S A 6 SASA 5 S 8 g SA S «3 6 «2 ϊ S3-5A 2

£ rHi-HCtö m p <p 010(¾ enpqc L

y A a δ rt td ft ft 3 ft i td ft ac cu st J. X. O CU -P I 3 ft I'OJ- I Ό O ® > S to ί H Φ r-1 >0 I rH £>, H-> ·Η en H Cft-O £ cN^ii- cm 3 μ in c φ 3 ...

____ - Γ~ 1? 6:302:; δ -ο 15 μ · ϋ Π5 · Ο) Ο 05 Q rH οο γΧ μ o f—ι r—t en o o o 05 CO /s n »\ /\ rs β C Q ^ ° M ^ rooo

0 O

g.s -μ & 05 X · e g e d -S ri

3 :nj Cl) i—i o -M < 05 LO 05 O

co toy X £3 0 s-/ 1 -1 d -μ 05 o

X

μ d T5 $ 0) 05 £ rd 05

1—* -H C

*h % *q § S ω <3 3 μ

Ή ·Η i-ι Γ--· I—f ι_θ uo c-- O

O CX r—i ·« «“> *>> r» r>

3 CO 3 O rH O O O rH

-H LO -X | 4- + -f H- +

(3 S

x μ μ e e (d Ρ) O -H 3

O d G P

rH -H <J 3 3 μ H μ' I—1 CO cO un cd Ori t_o r* rs r· 0 :> j- M o o o o o o I + + + + +

sT

1 1 d e \ e 3 . i o μ $ Η L -h t5 hj qj H it 1 l j μ U j/ ι μ I . I μ ·Η μ | -H ö >, I » Ή 13 ro I ·:; 1/¾¾ ω ρ μ Ϊη o μ μ 3 μ i ^ PI 1¾ i r X o μ. cp -—i e ch ,—i e

I h\ ^ S 9 ΛΟ-Η -H O I O - l SÖJ

^ & V ’ ^ '^sr i—I Q) ^‘'v. H TJ <—I -M ·Η ·Η °0 ·Η 4—' Φ S i R ^ Ί 1 r-4 <a f |ώ·Η B a | 05 Oj Pl rX *H Ci) 9c-3 μ ·Η id μ E O Ή E C ΛίΟ-Η X E p, o Ό I μ ij I μ I -X ι μ cm ρ ·η o o m 3 οι i h i μ 11 $ μ >i^· JL μ m * o 05 μ E o, a H λ 1 y μ «sw- 0. 0) S ·*—~· P< X ό 3 .x 15 TJ I CU 13 \ ΗΗ,μμο ο μ μ μΗ o o i hoi >,μμ >,ω μ m '"τ S L pH 3 P l g9 H 9 H μ ° y <m -q ρ μ ι μ ι μ μ o w r5 ε μ op μ ο} η j/ a; cn 113 ιιμ m μ ί 05 μ ο η ι ο) μ ci cm g Ο) 5 g #* rc\ μ c μ co μ η ^ L cV <5 X T5® _1/ 1/ <D cnt,co X ω Sb ¢: ω X μ μ-xoj ,>x o 2 κ- μ μ μ ο-μ οιωμοΟ σι>ρ μ μ μ μ ο Ο μ Ο μ >, 05 I ί>>μ c-jH I μ μ or-ο ι μ Ο 03 μ p I μ Ο) ι μ μ μ 5? μ ‘3 r3 A " L ‘3 L Ηη '3 >, νΐ ,χ ι ο; μ ώ ι μ ώ >, e μ ^ ^ +-J g*ζΥ^ *Γ“* °° Ρ η ·Η οί) Ο *Η CD £-« Ξ -ι** ^ 6 >! Ο ·Η X oaCHQiecii) ο» ο μωρ. ο ·3 *> ο ·3 e μ m ζ: 3 Τ ζ d η ^ df1 Ο (13.Χ 9) 3 οι Η 3 ω οχ) μ

μ ι μ q W μ Q μ ci ι μ η Ο. (οοό h X ι μ χ μ ι L

-Liv ρ 1),¾ id ρ 0)μ ιΗμ ι Ώ α. ^ μ w J/ μ ρ cm > οιμ HTJE η e fttj» Ν.ρμ μ pH· οι g ο σι S am *:e 6 '3 O 2 3 13 <«—> δ

XI

rC

5 6 P en ai o O i—I o en o

Ai ·Η <-0 - - p en Ai Q CO J-

01 P E

en -pc ^ o o a £ -s S 5 s.

ai i 0 ai e · a: e ω o P rö -h d.

C P :rts

X) (¾ H O CSI

ra <C dl un CM

m Q

en bp ω p ^ 1 -1

f—i •H

a; Ό

* H

P

p <1) 0 o

Ai Ai -h en

r—I *H

>> g e >, 3 ·η m s » i 5 £ ·μ P P co i—l en ud 1 (A -P 3 - - « *> CO C i—I CD o o o en co p I + l + 113 - O Ä ai i -h •p cc C O -H <r) 0 e e e e en e -p

r—I *P p -P

Cp C P P rH rH 00 CD

1 0) rH - — - -

CO > J- P rH O O CO

J X I + I + ^ <3

M

I-1 p

(ti III

H -H -H -H I

en C en i, >,

Ai ai Ai d >> O eu O co | p -h P -h P i -h Q 11 ω e XX X -h e ‘d S o £, J2 8 £ 5*3 3S1 3?3 8¾ g lp l -H O υ n! Pen-^CMO) <—i fP rH en p i>> e -d Ai -h — p cm i cm x p Aiot) e n ra tn en

-H -OI pH 0) PPAI-H

Hiv 7 HM P P P P r X O *H X

ai \i-h \ ω cm p Ph p in p e xi p rH i -s h e » il e. p a; g >,

en rH -H rH -H 00 Η X Π H H (U X

• h i rH -h i en i cm --ηχ!, -p tn e h x ·Η O.C -H X -H H>p C 7 Ai hb -H

x P >> O POC Pi I O >) I O 01 nj

;>h O -H *H O 4-1 d) ·Η ·Η H r-t -Hm -H

O ω Ό 3 Q] d) HrHxj (D N G) ^ H

ή £ i h £ e " S i E -pi ai ph o pj, ® ^ So i i p ;;>

Je > cm li ai \p cm .xi 's- i 5 ω - Ser^P H j) > u HNh -h -:c

lD rH co cO i—l O-ι f—I S ("O m-/ rH rH

___ - Γ" 14 6:502 3

Uudet yhdisteet soveltuvat galeenisessa farmasiassa tavallisten kantaja-aineiden yhteydessä kosketusihottuman, mitä erilaisimpien rohtumien,hermostollisten i.hohä Lriö iden, ihon punotustau-din, palovammojen, häpy- ja peräkutinan, punanäppyläisyyden, ihon punoituksien, hilsetystaudin, punajäkälän ja säären punajäkälän ja näiden tapaisten ihosairauksien hoitoon.

Erikois lääkeaineiden valmistus tapahtuu tavalliseen tapaan saattamalla vaikutus-aineet sopivien lisäaineiden kanssa haluttuun apli koi ntimuo toon, kuten esimerkiksi: liuoksiksi, pesunesteiksi, salvoiksi, voiteiksi tai laastareiksi. Mäin formuloitujen lääkeaineiden vaikutus ui nokonsentraa t.i o on riippuvainen aplikoint imuo-uost.i. Pesunesteissä ja salvoissa käytettävä va i kutusainekonsent-raatio on lähinnä välillä 0,001 - 1 .

Tämän lisäksi uudet yhdisteet soveltuvat mahdollisesti tavanomaisten kantaja-aineiden ja apuaineiden yhdistelminä myös hyvin sisäärjhengi tet tävien aineiden valmistamiseen, joita voidaan käyttää hengi tystelden allergisten sairauksien, kuten esim. keuhkoastmojen tai nonukatarrin hoitoon.

Uudet kortikoidit soveltuvat edelleen myös kapselien, tablettien tai rakeiden muodossa, jotka sisältävät lähinnä 10-200 mg vaikutusainetta ja joita aplikoicaan suun kautta, tai suspensioiden muodossa, jotka sisältävät .Lähinnä 1 00-500 mg vaikutusainetta annosyksikkoä kohden ja jotka aplikoIdaan peräsuoleen, myös suolisto-seudun allergisten sairauksien ku t e:, Koi iti sulrerosa ' n ja Kolitis granuloma tasa'n hoitoon.

Seuraav!f>n esimerkkien avul la pyri t ään se lventämään keksintöä.

Esimerkki 1 a) 21,63 g 3/9,2 ].-diasetoksi-17c4rhydroksi-5-pregnen-?0-onia liuotetaan 15b mi:aan vedetöntä metyleenikloridia ja 100 ml:aan vedetöntä formaldehydidimetyyliasetaalia. Liuos jäähdytetään sitten vedellä ja lisätään seokseen, jossa on 31,6 g fosforipentoksi-äia ja 43 g piimää ta ja sekoitetaan tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sitten reaktioseos suodatetaan ja jäännös pestään metyleeni-kloridilla, suodakseen lisätään trietyyli amiinia kunnes pH-arvo on saatu 9:ksI ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa. Jäännös kiteytetään uudelleen mc-taiioli-metyleenikloridi seoksesta ja saadaan 22,68 g 15 6:5023 3, 21-diaset oks i-17c£-metoksimetoksi-5-pregnen-2 0-onia, jonka sulamispiste on 182-184°C.

b) 2 litran Erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,3 % hiivauutetta, 0,3 % maissi-lietettä ja 0,2 % tärkkelyssokeria - pH säädetty arvoon 7,0 -ympätään Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13 930-kuivaviljelmää ja ravistellaan 30°C:ssa kaksi vuorokautta kierrosnopeuden ollessa 175 kierrosta minuutissa.

500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, jossa on 85 ml samaa ravintoainetta ympätään 10 ml Flavobacterium dehydrogenans-vi1jclyliuosta ja ravistellaan 7 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 175 kierrosta minuutissa. Viljelmään lisätään sitten 5 ml steriiliä liuosta, jossa on 0,5 g 3^/> , 2 l-diasetoks i-l7o6-metoks i me toks i-5-pregnen-20-onia di me tyyliformamidissa ja ravistellaan edelleen 65 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 175 kierrosta minuutissa. Fermentoinnin tapahduttua viljelmä uutetaan kaksi kertaa 100 ml :11a etyleenikloridia, uute haihdutetaan kuiviin vakuumissa, jäännös puhdistetaan kromatograafisesti käyttämällä alumiinioksidia ja saadaan 400 mg 21-hydroksi-17o6-metoksimetoksi-4-pregneeni- 3,20-dionia, jonka sulamispiste on 152-153°C.

c) 2 litran Erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 2 % glukoosia ja 2 % maissi-lietettä - pH säädetty arvoon 6,5 - ympätään Curvularia lunata NRRL 2380 kuivaviljelmähuuhdetta ja ravistellaan 60 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 175 kierrosta minuutissa.

500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, jossa on 90 ml steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 1,0 % maissilietettä ja 1,25 % soija-jauhetta - pH säädetty arvoon 6,2 - ympätään 10 ml Curvularia lunata-viljelmää ja ravistellaan 7 tuntia 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 175 kierrosta minuutissa. Sitten viljelmään lisätään 0,6 ml steriiliä liuosta, jossa on 30 mg 2 l-hydroksi-17o(-metoksimetoksi- 4-pregneeni-3,20-dionia dimetyyliformamidissa ja fermentoidaan edelleen 65 tuntia ilmoitetuissa olosuhteissa.

Fermentointiviljelmää käsitellään edelleen kuten esimerkissä Ib on selostettu ja saadaan 27 mg ll//3>,21-dihydroksi-170^-me-toksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 180 -18 2°C.

c 'S 0 2 3 16

Esimerkki 2 a) 50 g: aan 3 β , 2 l-diasetoksi-17 <*/ -hydroksi-5-pregnen-20-onia lisätään 50 mg vedetöntä p-tolueenisulfonihappoa ja 350 ml vedetöntä metyleenikloridia, jäähdytetään 0°C:seen ja kun tähän on lisätty 10 mg metyylivinyylieetteriä, sekoitetaan H tunnin ajan 0°C:ssa. Sitten i'eaktioseokseen lisätään trietyyliamiinia kunnes on saavutettu pH-arvo 9 ja haihdutetaan kuiviin vakuumissa. Saadaan 58 g 3 f' , 2 1-d iasetoksi-17 >0 - (1' -metoksietoksi )-5-pregnen-20-onia diastereonoeriseoksena, jonka sulamispiste on 80-118°C (metanolista uudelleen kiteytetty näyte sulaa .132-13 4°C : ssa) .

b) Liuoksen, jossa on 600 mg 3 fi ,-21-diasetoks i-17 - (1 ’ - metoks ietoksi)-5-prognen-20-oni-diastereonieeriseosta 5 ml: ssa dime t-yyl iformamidia , annetaan reagoida esimerkin Ib mukaisista olosuhteissa Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930-viljelmän kanssa, puhdistcr aan ja saadaan 334 mg 2 3 -hydroksi-17 -.xS — (1 * -me-t ok s ie. toksi) - 4-prugneeni-3 , 2 0-dioni a diast e reome eri seoksena , jonka sulamispiste on 166-178°C.

c) Liuosta, jossa on 100 mg 2 l-hydroks:i-17 ·Χ-- (1'-metoksi-e toks i ) - 4-pregneen 1-3 , 2 O-dioni-diastereor.ioeri seosta 2 ml :ssa di-metyy1iformamidia, fermentoidaan esimerkissä le selostetuissa olosuhteissa Curvulai^ia j una ta NRRL 2380-viljelmälla, puhdistetaan ja saadaan 105 mg 11 /' ,21-dihydroksi-lVOO-(1 ' -metoks ietoksi)-ä-pregneeni-3,2 0-dionia öijymäisenä diastereomeoriseoksena· Tähän seokseen lisätään 3 ml metanoiia ja 0,5 ml 2-norm, suolahapon vesiliuosta ja ravistellaan 5 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen seokseen lisätään 4 ml vettä, neutraloidaan kyllästetyllä natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella, uutetaan kaksi kertaa 8 ml:n etyleenikloridicrillä, orgaaninen faasi haihduit e taan kuiviin vakuumissa, jäännös puhdistetaan kromatograa.fi-sesti alumiinioksidi-pylväässä ja saadaan 69 mg 11/9 ,17<?G ,21-tri-hydroksi-4-pregneen L-3,2 0-dionia, jonka sulamispiste on 217-219°C.

Esimerkki 3 a) 10,0 g:aan 21-asetuksi-17 -hydroksi-4-pregneeni-3 ,2 0-dionia lisätään 13 rng vedetöntä p-tolueenisulfonihappoa ja 130 ml vedetöntä metyleenikloridia, jäähdytetään 0°C: seen ja kun tähän on lisätty 2,3 g metyylivinyylieetteriä, sekoitetaan 7 tunnin ajan 0 C:ssa. Reaktioseosta käsitellään edelleen kuten esimerkissä 2a on selostettu ja saadaan 11 ,6 g 2 l-asetoks i-17 - ( 1'-metoksi- etoksi)-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 135-150°C.

17 6 502 3 b) Liuosta, jossa on 0,1 g 2l-asetoksi-17& -(1'-motoksi-etoksi)-4-pregneeni-3,2O-dioni-diastereomeeriseosta 2 ml:ssa dimetyylilormamidia, fermentoidaan esimerkissä le selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL 2380-viljelmällä ja puhdistetaan ja saadaan 11/5 , 21-dihydroks.i-17<k> -(11 -metoksietoksi )-4-pregneeni-3,2U-dioni, josta hydrolysoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 7 8 mg 11/5 ,17^5· ,21-trihydroksi- 4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 217-219°C.

Esimerkki *4 a) 10,0 g 21-asetoksi-17oc-hydroksi-4-pregneeni-3,20-dionia annetaan reagoida esimerkissä 3a selostetuissa olosuhteissa 2,SO g:n kanssa etyylivinyylieetteriä, puhdistetaan ja saadaan 12,5 g 2 l-asetoksi-17o<3 - ( 1' -etoksietoksi) - M -pregneeni-3 ,2 0-dionia ölj ymäi-senä diasteroomeeriseoksena.

b) Liuos, jossa on 0,1 g 21-asetoksi-17°^-(11-etoksietoksi)- 4-pregneeni-3,20-dioni seosta 2 ml:ssa dimetyyliformamidia, hydr-oksyloidaan esimerkissä 1c selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL 2 380-vil jelmällä, puhdistetaan ja saadaan 17ot'-(l'-etoksietoksi)-ll /£,21-dihydroksi-4-pregneeni-3,20-dionia, josta hydrolysoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 63 mg li/5 , 17o6 ,21-trihydroksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia , jonka sulamispiste on 216-217,5°C.

Esimerkki 5 a) 10,0 g 21-asetoksi-17oC -hydroksi-4-pregneeni-3,20-dionia annetaan reagoida esimerkissä 3a selostetuissa olosuhteissa 4,0 g:n kanssa isobutyylivinyylieetteriä, puhdistetaan ja saadaan 13,5 g 21-asetoksi-17(Xj -(1' -isobutyylioksie toksi ) -4-pregnecni-3 ,20-dionia öljyrnäisenä diastereomeeriseoksena.

b) Liuos, jossa on 0,1 g 21-asetoksi-17pd-(l'-i.sonutyyli-oksietoksi)-4-pregneeni-3,20-dioni-seosta 2 ml:ssa dLmetyyli-formamidia, hydroksyloidaan esimerkissä le selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL 2380-viljelmällä, puhdistetaan ja saadaan 11/5 ,2-dihydroksi-17lX' -(11-isobutyylioksietoksi )-4-pregneeni-3,20-dionia, josta saippuoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 68 mg 11/3 ,170c ,21-trihydroksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 214-216°C (hajoten).

Esimerkki 6 a) 1,95 g:aan 21-asetoksi-17 -hydroksi-4-pregneeni-3,20- 18 6 002 3 dionia lisätään 5 mg vedetöntä p-tolueenisulfonihappoa, 25 ml vedetöntä metyleenikloridia ja 3,5 ml dihydropropaania ja sekoitetaan 13 tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktioseosta käsitellään edelleen esimerkissä 3a selostetulla tavalla ja saadaan 2,0 g 2l-asetoksi-17 οό — ( 2 * -teti^ahydropyranyylioksi) -4-pregneeni - 3,2 0-dionia diastereomeeriseoksena, jonka sulamispiste on 185-200°C.

b) Liuos, jossa oli 0,1 g 2 l-asetoksi-17cxf - ( 2 '-tetrahydro-pyranyylioksi)-4-pregneeni-3,20-dioni-seosta 2 ml:ssa dimetyyli-formamidia, liydroksyloidaan esimerkissä le selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL 2380-viljelmällä, puhdistetaan ja saadaan 11 ΰ , 21-dihydroksi-17 - ( 2 ' -tetrahydropyranyylioks ] )-4- pregneeni-3,20-dionia, josta hydrolysoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 72 mg 11/1,] /λ ,21-trihydroksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 215°C (hajoten).

Es irnerkki 7 a) 50 g 21-asetoksi-17 oC-hydroksi-6 «i-metyyli-4-pregneeni- 3,20-dionia annetaan reagoida esimerkissä 3a selostetuissa olosuhteissa 13,9 g:n kanssa metyylivinyylieetteriä , puhdistetaan ja saadaan 59 g 2 1-ase toksi-17-x< - (1 ’-metoksietoksi )-6 ·-£-metyyli-4-pregneeni-3,20-dionia amorfisena massana.

b) Liuos, jossa on 200 mg 21-asetoksi-17 <£-(1'-metoksietok-s i ) - 6 -me tyy li-4-pregneeni-3 ,2 0-dionia 0,4 mlrssa dimetyyliform-amidia, hydroksy 1 oidaan esimerkissä "le selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NKRL 2380-viljelmällä, puhdistetaan ja saadaan li'*' , 21-dihydroksi-17oC-Q 1 -met: oksi otoksi) - G λ -me tyy li-4 -pregneeni- 3,2 0-dionia, josta hydrolysoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 15 mg 11/¾ ,17-¾ ,21-trihydroksi-6*i -metyyli- 4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 189-192°C.

Esimerkki 8 a) 2,0 g: aan 2 l-asetoksi-17'X/ -hydroksi-16 β -metyyli-4-preg-naani-3,20-dionia lisätään 5 mg p-tolueenisulfonihappoa (vedetöntä) ja 25 ml vedetöntä metyleenikloridia ja jäähdytetään D°C:seen. Seokseen lisätään sitten sekoittaen 0,5 g metyylivinyy 1 ieetteriä , sekoitetaan 5 tunnin ajan 0°C:ssa ja edelleen 12 tuntia huoneen lämpötilassa, reaktioseosta käsitellään edelleen kuten esimerkissä 3a on selostettu ja saadaan 2,1 g 21-aset:oksi-17 00 -(1'-metoksie toks i)-16 fc-metyyli-4-pregneeni-3,20-dionia öljyinä i se nä diastereomeeriseoksena.

19 6:502 3 b) Liuos, jossa on 50 mg 21-asetoksi-17c% - (1'-metoksietoksi)-16 p -metyyli-4-pregneen.i-3,20-dioni-seosta 1 ml:ssa dimetyyliform-amidia, hydroksyloidaan esimerkissä le selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL 2380-viljelmällä, puhdistetaan ja saadaan 11/1' ,21-dihydroksi-17<X -(1'metoksietoksi)-16 -inetyyl i-4-pregnee-ni-3,20-dionia, josta hydrolysoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 32 mg 11^/3,17^1. ,21-trihydroksi-161°' -metyyli- 4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 204-207°C.

Esimerkki 9 a) 50 g 17,%' -hydroksi-H-pregneeni-3 ,20-dionia annetaan reagoida esimerkissä 3a selostetuissa olosuhteissa 15 g:n kanssa metyylivinyylieetteriä, puhdistetaan ja saadaan 51,2 g 17<x5-(l'-metoksietoksi)-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 115-152°C.

b) Liuosta, jossa on 0,1 g 17<% -(1'-metoksietoksi)-4-preg-neeni-3,20-dionia 1 ml:ssa dimetyyliformamidia fermentoidaan esimerkissä le selostetuissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL

2 3 80-vil j elmällä , puhdistetaan ja saadaan 11 ^ -hydroksi-17 -(1' -metoksietoksi)-4-pregneeni-3,20-dioni (sulamispiste 85-103°C) , josta hydrolysoitaessa esimerkissä 2c selostetuissa olosuhteissa saadaan 63 mg 11/9 ,17 -dihydroksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia , jonka sulamispiste on 222~223,5°C. /

Esimerkki 10 / a) 50 g 3 A ,21-asetoksi-17<*' -hydroksi-5-pregnen-?0-onia annetaan reagoida esimerkissä la selostetuissa olosuhteissa 150 mlrssa metyleenikloridia 380 g:n kanssa formaldehydi-bis-glykoli-monometyylieetteriasetaalia, 50 g:n kanssa fosforipentoksidia ja 100 g:n kanssa piimaata, puhdistetaan ja saadaan 45,8 3/S,21-di-asetoksi-17<*, - ( 2 '-metoksietoksi-metoksi)-S-pregnen-20-onia , jonka sulamispiste on 160-161°C.

b) 0,5 g 3,2l-asetoksi-17-(2'-metoksietoksi-metoksi)-5-pregnen-20-onia annetaan reagoida esimerkissä Ib selosteteuissa olosuhteissa Flavobacterium dehydregenans ATCC 13930-viljelmän kanssa, puhdistetaan ja saadaan 390 mg 21-hydroksi-1.7x-(2'-me- toksietoksi-metoksi)-4~pregneeni-3,20-dionia lasimaisena massana.

c) 30 mg 21-hydroksi-17 <%-(2'-metoksietoksi-metoksi)-4-pregneeni-3,20-dionia annetaan reagoida esimerkin le mukaisissa olosuhteissa Curvularia lunata NRRL 2380-viljelmän kanssa, puh- 20 6 002 3 distetaan ja saadaan 24 mg ll/?',21-dihydroksi-17fty-(2,-metoksietoksi-metoksi)-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 143-147°C.

Esimerkki 11 2 litran Erlenmeyer-pulloon, jossa on 500 ml steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 0,1 % hiivauutetta 0,5 % maissilietettä 0,1 % tärkkelyssokeria - pH säädetty arvoon 7,0 - ympätään Arthrobacter simpelx ATCC 6945-kuivaviljelmän huuhdetta ja ravistellaan 48 tunnin ajan 3G°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 190 kierrosta minuutissa.

500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, jossa on 90 ml edellä selostettua ravintoainetta ympätään 10 ml. Arthrobacter simplex-viljulmää ja ravistellaan 6 tuntia 30°C:ssa kieri'osnopeuden ollessa 1G5 kierrosta minuutissa. Viljelmään lisätään sitten 1 ml steriiliä liuosta, jossa on 50 mg 11 ,2 1-dihydroksi-17c<; -metoksimetoksI- 4-pregneeni-3,20-dionia dimetyyliformamidissa ja fermentoidaan edelleen 42 tuntia.

Käymisviljelmä puhdistetaan kuten esimerkissä Ib on selostettu ja saadaan 44,5 mg 11 β ,21-dihydroksi-17<x>-nietoksimetoksi-l,4-pregnadieeni— 3,20-dionia, jonka sulamispiste on 229/230-231°C.

Esimerkki 12 2 litran Erlenmeyer-pulloon, jossa on 500 ml steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 1 % hiivauutetta (Difco) 0,45 % dinatriumvetyfosfaattia 0,34 1 kaliumvetyjosfaattia 0,2 1 Tween BO : tä - pH säädetty arvoon G,7 - ympätään Nocardia globerula ATCC 9356-kuivaviljelmär. huuhdetta ja ravistellaan 72 tunnin ajan 30°C: ssa kierrosnopeuden ollessa 190 kierrosta minuutissa.

2 litran Erlenmeyer-pulloon, jossa on 950 ml steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 2,0 % maissilietettä 0,3 % diammoniumvetyfosfaattia 0,25 % Tween 80:tä - pH säädetty arvoon 6,5 - ympätään 50 ml Nocardia globerula-vi 1 j elmaä ja ravistellaan 24 tunnin ajan 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 190 kierrosta mi- 2i 6 5 02 3 / nuutissa. Viljelmään lisätään sitten 5 ml steriiliä liuosta, jossa on G,25 g 11 (*> ,21-dihydroksi-17 -(1'-metoksietoks i )-6 ok-metyy- li-4-pregneeni-3,20-dionia dimetyyliformamidissa ja käytetään 72 tuntia. Käymisviljelmää käsitellään edelleen esimerkissä Ib selostetulla tavalla ja saadaan 0,21 g 11 β ,2 l-dihydroksi-17 ·** -(l-metoksietoksi)-6°b-metyyli-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 173°C.

Esimerkki 13 a) 50 g 21-asetoksi-17<X-hydroksi-4-pregnaani-3,20-dionia suspendoidaan 600 ml:aan formaldehydietyyliasetaalia ja 600 mitään metyleenikloridia ja jäähdytetään - 30 . ..-40°C: seen. Sekoittaen lisätään seos, jossa on 75 g fosforipentoksidia ja 150 g pii-maata ja sekoittaen edelleen 30 tuntia -30°C:ssa. Liuos suodatetaan ja neutraloidaan trietyyliainiinilla. Kun liuotin on tislattu pois, tislaus toistetaan metanolia käyttäen ja jäännös kiteytetään uudelleen metanolista. Saadaan 35,9 g 21-asetoksi-17 iki-etoksime-toksi-4-pregneeni-3,20-dionia, joka vielä kerran suoritetun uusin-takiteytyksen jälkeen sulaa 137-139°C:ssa.

b) 2 litran Erlenmeyer-pulloon, jossa on 1 litra steriiliä ravintoliuosta, joka sisältää 1 % maissilietettä 1,25 % soijajauhetta - pH säädetty arvoon 6,2 - ympätään Curvularia lunata NRRL 2380-kuivaviljelmän huuhdetta ja ravistellaan 72 tunnin ajan 30°C:ssa kierrosnopeuden ollessa 175 kierrosta minuutissa.

50 litran käymisastiaan, jossa on 29 litraa steriiliä edellä selostetutta ravintoainetta, ympätään 1 litran Curvularia luna-ta-viljelmää ja viljellään 24 tuntia 30oC:ssa käyttämällä ilmastukseen 2 m^ ilmaa tunnissa.

50 litran käymisastiaan, jossa on 36 litraa edellä selostettua steriiliä ravintoliuosta, ympätään 4 litraa Curvularia lunata-esikäytinviljelmää ja viljellään 10 tuntia 30°C:ssa käyttämällä ilmastukseen 2 ilmaa tuntia kohden ja sekoittamalla kierrosnopeuden ollessa 220 kierrosta minuutissa. Viljelmään lisätään sitten 10 g 21-asetoksi-17o<, -etoksimetoksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia 200 ml:ssa etyleeniglykolimonometyylieetteriä. Kymmenennestä tunnista alkaen pH-arvo pidetään välillä 6,5 - 7,0. Neljä tuntia 22 6:502 3 tämän jälkeen lisätään vielä kerran 10 g 21-asetoksi-17<fc -otoksi-metoksi-4-pregneeni-3,20-dionia 200 ml:ssa etyleeniglykolimono-etyylieetteriä ja fermentointia jatketaan edellä mainituissa olosuhteissa vielä 22 tuntia.

Käymisviljelmä uutetaan kolme kertaa 10 litralla etyleeni-kloridia ja sen jälkeen käsittelyä jatketaan kuten esimerkissä Ib on selostettu. Saadaan 13,8 11 ^ ,2i-dihydroksi-17 % -etoksimetok-si-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 153-154°C.

Esimerkki 14 a) 25 g 21-asetoksi-17oC-hydroksi-4-pregneeni-3,20-dionia suspendoidaan 200 ml:aan formaldehydidipropyyliasetaalia ja 320 ml:aan metyleenikloridia ja jäähdytetään -20°C:seen. Sekoittaen lisätään seos, jossa on 4 9,3 g fos foripentoksidia ja 97 g piimaata ja sekoitetaan 22 tuntia -20°C:ssa. Liuos suodatetaan ja neutraloidaan trietyyliamiinilla. Metyleenikloridia tislataan pois va-kuumissa ja formaldehydidipropyyliasetaali-faasi kaadetaan erilleen erottuneesta öljystä. Kun muu liuotin on tislattu pois va-kuumissa, kiteytyy 19 g 21-asetoksi-17oc-propoksimetoksi-4-preg-neeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 145-147°C.

b) .10 g 2 1-asetoksi-17.% -propoksimetoksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia jauhetaan L g:n kanssa Tween 80:tä ja kolminkertaisen vesimäärän kanssa Dyno-Muhle Typ KDL (Fa. Bachofen, Basel)-myllyssä. Tätä jauhetta steriloidaan 1-prosentt.isen H902 :n kanssa ainakin 4 tuntia.

Lajia Curvularia lunata NRRL, 2380 v.i ]. j e llään, kuten esimerkissä 13b on selostettu, ravistuspullossa ja esikäy'ttimessä ja tätä ympätään pääkäyttimeen. Tätä fermenttiä käytetään sama!La tavalla kuin esimerkissä 13b on selostettu ia viljellään 10 tuntia niin ikään esimerkissä 13b selostetuissa olosuhteissa. Viljelmään lisätään sitten 21-asetoksi-17 v<, -p^opoks ime toksi-4-pregneeni- 3,20-dioni-jauhe ja fermentoidaan vielä 44 tuntia, jonka aikana pH-arvo pidetään välillä 6,4-6,7. Viljelmää käsitellään edelleen esimerkissä 13b selostetulla tavalla ja saadaan 6,5 g 11 (b ,2.1 -dihydroksi-17 X, -propoksimetoks i-4-progneeni-3 ,20-dionia , jonka sulamispiste on 134/135-136°C.

Esimerkki 15 a) 50 g 21-asetoksi-17 06-hydroksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia suspendoiaan 500 ml:aan formaldehydidibutyyliasetaalia ja 500 23 0 5023 ml:aan metyleenikloridia ja jäähdytetään -35°C:seen. Sekoittaen lisätään seos, jossa on 74 g fosforipentoksidia ja 150 g piimaata ja sekoitetaan 30 tuntia -35°C:ssa. Liuos suodatetaan ia neutraloidaan trietyyliamiinilla. Metyleenikloridi tislataan pois va-kuumissa ja formaldehydidibutyyliasetaalifaasi kaadetaan erilleen erottuneesta öljystä. Kun muu liuotin on tislattu pois vakuumissa, kiteytyy 38,7 g 21-asetoksi-17<*7-butoksimetoksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia, jonka sulamispiste on 123,5-124,5°C.

b) 8 g 21-asetoksi-17 ^-butoksimetoksi^i-pregneeni-l ,20-dionia jauhetaan 0,7 g: n kanssa Tween 80:tä esimerkissä 14b selostetulla tavalla.

Curvularia lunata NRRL 2380:tä viljellään ravistuspullossa ymppiviljelmänä; esikäyttimessä ja pääkäyttimessä viljellään ja fermentoidaan esimerkissä 13b selostetulla tavalla. 10 tunnin aikana pääkäyttimeen lisätään substraatti ja fermentointia jatketaan vielä 50 tuntia.

Viljelmää käsitellään edelleen esimerkissä 13b selostetulla tavalla ja saadaan 3,7 g 11 p ,21-dihydroksi-17 -butoksimetoksi- 4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 79-81°C.

Esimerkki 16 a) 10,60 g 21-asetoksi-6 <X-fluori-17c>G -hydroksi-4-pregnoeni- 3.20- dionia liuotetaan 265 ml:aan metyleenikloridia ja 47,7 ml:aan formaldehydidiinetyyliasetaalia. Lisätään annoksittain seos, jossa on 7,95 g fosforipentoksidia ja 15,9 g piimaata ja seosta sekoitetaan 90 minuuttia typen suojaamana huoneen lämpötilassa. Liuos suodatetaan ja lisätään 2,1 ml trietyyliamiinia. Liuot timet tislataan pois ja jäännös kiteytetään uudelleen metanolista. Saadaan 7,6 g 21-asetoksi-6 -X-fluoi^i-17 oC-metoksimetoksi-4-pregneeni-3 ,20-dionia, jonka sulamispiste on 161-167°C.

b) Curvularia lunata NRRL 2380:tä viljellään - kuten esimerkissä 13b on selostettu - ravistuspullossa, esi- ja pääkäyttimessä. Kymmenennen tunnin aikana pääkäyttimeen lisätään 5 g 21-asetoksi-6o6-fluori-17oC-metoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dionia 100 ml:ssa etyleeniglykolimonometyylieetteriä. Tästä ajankohdasta alkaen pH-arvo pidetään välillä 6,5-7,0. 14 tuntina lisätään vielä kerran 5 g 2l-asetoksi-6ct-fluori-17ύ -metoksimetoksi-4-pregneeni- 3.20- dionia 100 ml:ssa etyleeniglykolimonometyylieetteriä ja fermentoidaan vielä 26 tuntia.

24 66023

Viljelmää käsitellään edelleen esimerkissä 13b selostetulla tavall a ja saadaan 4,2 g 11 β , 21 -d.ihydroksi-6 ** -f luori-17 % -rnetoksi-metoksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 190-192°C.

Esimerkki 17 a) 43 g 3β, 2 l-diasetoksi-17 -hydroks i-16 β metyy li-S-pregnen-20-onia liuotetaan 800 ml:aan formaldehydidimetyyliasetaalia ja jäähdytetään -15°C:seen. Annoksittain lisätään seos, jossa on 43 g fosforipentoksidia ja 86 g piimaata ja seosta sekoitetaan Ib tuntia noin -15°C:ssa. Liuos suodatetaan, neutraloidaan trietyyli-amiinilla ja liuotin tislataan pois vakuumissa. Jäännös kiteytetään uudelleen metanolista ja saadaan 31,b g 3β ,21-diasetoksi- 17 :o-metoksimetoksi-16 β> -metyyli-b-pregnen-2 0-onia , jonka sulamispiste on 117-118°C.

b) Lajia Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930 viljellään ja fermentoidaan kuten esimerkissä Ib. 7 tuntina lisätään viljelmään 4 ml steriiliä liuosta, jossa on 0,2 g 3/1 ,21-diasetoksi-17 ¢6 -metoksimetoksi-16 Λ -metyyli-5-pregnen-20-onia dimetyyliformamidissa ja ravistellaan edelleen 65 tuntia.

Käymisen tapahduttua viljelmää käsitellään edelleen kuten esimerkissä Ib on selostettu ja saadaan 163 g 21-hydroksi-17 λ -metoksimetoksi-16h -metyyli-4-pregneeni-3,20-dionia, jonKa sulamispiste on 126/128-129°C.

c) Lajia Curvularia lunata NRRL 2380 viljellään ja fermentoidaan esimerkin 1c mukaisesti. 7 tuntina viljelmään lisätään 1 ml steriiliä liuosta, jossa on 50 mg 2] -hydroksi.-17 -metoks imetoksi-16/* -metyyli-4-pregneeni-3,2 0-dionia dimetyyliformamidissa ja fer-mentoidaan edelleen 65 tuntia.

Viljelmää käsitellään edelleen esimerkissä Ib selostetulla tavalla ja saadaan 34,5 g il/* ,21-dihydroks 1-17^ -metoksimetoksi-16/^ -metyyl i-4-pregnee:u-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 204/205-206 C .

Esimerkki 18

Seokseen, jossa on 3 g 11β ,2]-dihydroksi-17^ -metoksimetok-si-4-pregneeni-3,20-dionia 20 ml:ssa pyridiiniä lisätään 5 ml etik-kahappoanhydridiä ja sekoitetaan 6 tuntia huoneen lämpötilassa.

200 ml:ssa jäävettä suoritetun saostuksen jälkeen suodatetaan ja saadaan 3,23 g 2 l-asetoksi-11/?-hydroks i-71 > -metoksimetoks i-4-pregneen.i-3,20-dionia, joka asetonista suoritetun uusintakLteyk-sen jälkeen sulaa 172-177°C:ssa.

25

Esimerkki 19 Έ' '3 O 2 3

Seokseen, jossa on 4 g 11 ,21-dihydroksi-17*i -me t ok s imet-ksi-4-pregneeni-3,20-dionia 25 ml: ssa pyridiiniä, ] is .’it ään 8 ml propionihappoanhydridiä ja sekoitetaan 105 minuuttia huoneen lämpötilassa. 500 mi:ssa jäävettä suoritetun saostamisen jälkeen sekoitetaan kunnes anhydridi on lohjennut, suodatetaan ja saadaan 4,43 g 11/^-hydroksi-17X> -metoksimetoksi-2l-propionyylioksi-4-pregneeni- 3,20-dionia, joka sulaa metanolista suoritetun uusintakiteytyksen jälkeen 119-121°C:ssa.

Esimerkki 20

Seokseen, jossa on 4 g 11/S , 2 l-dihydroksi-17 ^-inetoks imetok-ci-4-pregneeni-3,20-dionia 25 ml:ssa pyridiiniä, lisä!ään 9 ml voi-happoanhydridiä ja sekoitetaan 105 minuuttia huoneen lämpötilassa. 500 mi:ssa jäävettä suoritetun saostamisen jälkeen sekoitetaan edelleen kolme tuntia ja saadaan 4,55 g 21-butyryylioksi-11/^ -hydroksi-17 "o -me toks imetoks i-4-pregneeni-3,20-dionia, joka metanolista suoritetun uusintakiteytyksen jälkeen sulaa 1 4 0-142°C:ssa.

Esimerkki 21

Seokseen, jossa on 4 g 11^? , 21-dihydroksi-17i*. -metoksime-toksi-4-pregneeni-3,20-dionia 25 ml:ssa pyridiiniä, lisätään 11 ml trimetyylietikkahappoanhydridiä ja 100 mg 4-dimetyyliaminopyri-diiniä. Seoksen oltua kuusi tuntia huoneen lämpötilassa lisätään jäävettä, uutetaan metyleenikloridilla ja tämä pestään vesipitoisella etikkahapolla, natriumvetykarbonaattiliuoksella ja vedellä, kuivataan natriumsulf aat Ula ja liuotin tislataan pis vakuumissa. Saadaan 4,8 g 11 Λ -hydroksi-17Λ>-metoksimetoksi-21-trimetyyliaset-okai-4-pregneeni-3,20-dionia, joka metanolista suoritetun uusinta-kitetyksen jälkeen sulaa 182-184°C:ssa.

Esimerkki 22

Seokseen, jossa on 5 g li/?> , 21-dihydroksi-17«O-metoksi-metoksi-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia 30 ml:ssa pyridiiniä, lisätään 8 ml etikkahappoanhydrIdiä ja sekoitetaan 1,5 tuntia huoneen .lämpötilassa. 300 ml: ssa jäävettä suoritetun saostuksen jälkeen suodatetaan ja saadaan 5,08 g 21-asetoksi-.ll/? -hydroksi-17<x» -metok-simetoksi-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, joka metanolista ja pienestä metyleenikloridimäärästä suoritetun uusintakiteytyksen jälkeen sulaa 214°C:ssa.

26 66023

Esimerkki 23

Seokseen, jossa on 1 g 11/5, 21-dihydroksi-17o(-metoksime-toksi-l,4-pregnadieeni-3,20-dionia 6 ml:ssa pyridiiniä, lisätään 2 ml voihappoanhydridiä ja sekoitetaan 1,5 tuntia huoneen lämpötilassa. Jäävedessä suoritetun saostamisen jälkeen sekoitetaan vielä kaksi tuntia, suodatetaan ja saadaan 1,11 g 21-butyryylioksi-ll /3 -hydroksi-17 oi-metoksimetoksi-1,4-pregnadieeni-3,20-dionia, joka meta-nolista ja pienestä metyleenikloridimäärästä suoritetun uusinta-kiteytyksen jälkeen sulaa l82°C:ssa.

Esimerkki 2*4 a) 29jl g 2l-asetoksi-6-kloori-17 0^.*hydroksi-4,6-pregna-dieeni-3,20-dionia liuotetaan 730 ml:aan metyleenikloridia ja 131,0 ml:aan formaldehydidimetyyliasetaalia. Lisätään annoksittain seos, jossa on 22,12 g fosforipentoksidia ja 44 g piimaata ja seosta sekoitetaan 2,5 tuntia typen suojaamana huoneen lämpötilassa. Liuos suodatetaan ja lisätään 5,8 ml trietyyliamiinia. Liuottimet tislataan pois ja jäännös kiteytetään aktiivihiiltä ja 1% trietyyli-amiinia lisäten uudelleen metanolista. Saadaan 15,6 g 21-asetoksi- 6-kloori-17 cN-metoksimetoksi-4,6-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on l83-l86°C.

h) Lajia Curvularia lunata NRRL 2380 viljellään kuten esimerkissä 13b on seiostettu-ravistuspullossa, esi- ja pääkäyttimessä. 10 tunnin aikana pääkyttimeen lisätään 3 g 21-asetoksi-6-kloori-17 <A-metoksimetoks.i-4,6-pregnad.ieeni-3,20-dionia 60 ml:ssa etyleeni-glykolimonometyyl[eetteriä. Tästä ajankohdasta alkaen pH-arvo pidetään välillä 6,4-6,7 ja käymisen annetaan jatkua vielä 20 tuntia. Käymisviljelmää käsitellään edelleen-esimerkiesä 136 selostetulla tavalla- ja saadaan 1,8 g 11/5, 21-dihydroksi-6-kloori-17P^-metoksi-metoksi-4,6-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 234°/ 235 - 236°C.

Esimerkki 25 a) 38,85 g 21-asetoksi-170(-hydroksi-4-pregneeni-3»20-dionia sekoitetaan 235 ml:n kanssa formaldehydidi-isopropyyliasetaalia 500 ml:n kanssa metyleenikloridia ja jäähdytetään -20°C:seen.

27 6:50 2 3

Sekoittaen lisätään seos, jossa on 75 g fosforipentoksidia ja 150 g piimaata ja sekoitetaan 20 tuntia -20°C:ssa. Seos suodatetaan, pestään metyleenikloridilla ja pH säädetään trietyyliamiinilla arvoon 9. Liuottimet tislataan pois vakuumissa ja jäännös liuotetaan metyleenikloridiin. Liuos pestään puoliksi kyllästetyllä natriumkloridiliuoksella, kuivataan natriumsulfaatilla, käsitellään aktiivihiilen kanssa, suodatetaan piimaata käyttäen, ja konsentroidaan vakuumissa. Jäännös kromatografoidaan piigeelillä tolueenietikkaesteri-seoksin. Saadaan 35,8 g 21-asetoksi- 17< -iso-propoksimetoksi-4-pregeeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste pen-taanilla kiteyttämisen jälkeen on 111-117°C.

b) Viljely suoritetaan lajilla Curvularia lunata NRRL 2380-kuten esimerkissä 13b on selostettu-ravistuspullossa, esi- ja pääkäyttimessä. 10 tunnin aikana pääkäyttimeen lisätään 12 g 21-asetoksi- 17 G^-isopropoksimetoksi-4~pregneeni-3,20-dionia 240 ml: ssa etyleeniglykolimonometyylieetteriä. pH-arvo pidetään tästä ajankohdasta alkaen välillä 6,5-7,0 ja käymisen annetaan jatkua vielä 15 tuntia. Käymisviljelmää käsitellään edelleen-esimerkissä 13b selostetulla tavalla- ja saadaan 8,4 g lift, 21-dihydroksi- 17 &.-isopropoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 71°/73 - 78°C.

c) Lajia Arhrobacter simplex ATCC 6946 viljellään-kuten esimerkissä 11 on selostettu-viljely- ja fermentointipulloissa. Kuudennen tunnin aikana käymispullocn lisätään 1 ml steriiliä liuosta, jossa on 50 mg 11^», 21-dihydroksi-17^“isopropoksimetok-si-4-pregneeni-3,20-dionia etyleeniglykolimonometyvlieetterissä ja käymisen annetaan jatkua vielä 42 tuntia.

Käymisviljelmää käsitellään edelleen kuten esimerkissä Ib on selostettu ja saadaan 32 mg lift), 21-dihydroksi-17 Q^-isopropoksi-metoksi-1,4-pregnadieeni~3,20-dionia, jonka sulamispiste on 58°/ 63 - 65°C.

Esimerkki 26 a) Laji Flavobacterium dehydrogenans ATCC 13930 viljellään-kuten esimerkissä Ib on selostettu - ravistuspullossa, esi- ja pääkäyttimessä. 24 tunnin aikana pääkäyttimeen lisätään 19,5 g l6-metyleeni-3· fr, 21-diasetoksi-17 o(-metoksimetoksi-5-pregnen-20-onia 500 ml:ssa dimetyyliformamidia ja fermentoidaan edelleen 28 tuntia.

__ - π 78 6602 3 Käymisviljelmää käsitellään edelleen esimerkissä 13b selostetulla tavalla- ja saadaan 13,5 g l6-metyleeni-21-hydroksi-17 OC-metoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 147°/150-151°C.

b) Lajia Curcularia lunata NRRL 2380 viljellään - kuten esimerkissä 13b on selostettu - ravistuspullossa, esi- ja pää-käyttimessä. 10 tunnin aikana pääkäyttiineen lisätään 20 g 16-metyleeni-21-hydroksi-17O(-metoksimetoksi-i4-pregneeni-3,20-dionia 400 ml:ssa etyleeniglykolimonometyylieetteriä. pH-arvo pidetään tästä ajankohdasta alkaen välillä 6,4 - 6,7 ja käymisen annetaan jatkua vielä 8 tuntia.

Käymisviljelmää käsitellään edelleen kuten esimerkissä 13b on selostettu ja saadaan 11 g l6-metyleeni-ll/3, 21-dihydroksi-17 OU-metoksimetoksi-4-pregneeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 205°/206-208°C.

Esimerkki 27

Laji Arthrobacter simplex ATCC 6946 viljellään - kuten esimerkissä 11 on selostettu- viljely- ja fermentointipulloissa.

6 tunnin aikana fermentointipulloon lisätään 1 ml steriiliä liuosta, jossa on 50 mg 11/3, 21-dihydroksi-17 OC-propoksimetoksi-4-preg-neeni-3,20-dionia etyleeniglykolimonometyylieetterissä ja fermen-tointia jatketaan vielä 42 tuntia. Käymisviljelmää käsitellään edelleen kuten esimerkissä Ib on selostettu ja saadaan 41 mg 11^3, 21-dihydroksi-17 C^-propoksimetoksi-l,4-pregnadieeni-3,20-dionia, jonka sulamispiste on 121°/125-127°C.

Claims

29 6 602 3
1. Menetelmä uusien, tulehduksia ehkäisevästi vaikuttavien 11 /3-hydroksisteroidien valmistamiseksi, joilla on yleiskaava I
0 H0Rl I ie jossa sidos......merkitsee yksinkertaista sidosta tai kaksoissidosta, X on vety, fluori, kloori tai metyyli, on 1-8 hiiliatomia sisältävä, mahdollisesti happiatomin katkaisema alkyyli tai bentsyyli ja R2 on vety tai 1-4 hiiliatomia sisältävä alkyyli tai R^ ja R2 merkitsevät yhdessä trimetyleeniä tai tetrametyleeniä, Rj on vety tai hydroksi ja R^ on vety tai metyyli, tunnettu siitä, että 11-desoksiste-roidia, jolla on yleiskaava II CH0R,- Il r2 ^^ (1I) X jossa X, R^, R2 ja R^ merkitsevät samaa kuin edellä ja R^ on vety5 hydroksi tai alkanoyylioksi, jossa on 1-6 hiiliatomia, 30 65023 fermentoidaan Curvularia-suvun sieniviljelmän avulla, ja haluttaessa saatujen kaavan I mukaisten yhdisteiden, joissa .... merkitsee yksinkertaista sidosta, 1,2-asema dehydrataan, ja haluttaessa saadut kaavan I mukaiset 21-hydroksisteroidit esteröidään.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fermentointi suoritetaan Curvularia lunata-lajin sieni-viljelmän avulla. 31 6 0 0 2 3
1. Förfarande för framställn.ing av nya, anti-inflammatoriskt verkande 11, i -hydroxisteroider med den allmänna formeln I CH„R0 I z 3 R p=° p t J_____OCHOR. χγ^κ'ι I i_ (1) I I » I a /Λ Y λ van bindriingen...... betecknar on enkelbindning el ] er dubbel- bindn ing, X är väte , fluon, klor eller metyl, är en eventuellt av en yyreatoin avbruten alkyl med 1-8 koi - atomer eller bensyl ooh R,. är väte teller alkyl rned 1-H kolatomor eller R^ och 1: llsammanG betecknar trimetylen eller tetmmetylen, är väte eller hydroxi och Ru är väte eller metyl, k ä n n e 1 o e k n a t därav, att man fermenterar en 11-deaox i s feroid med den allmänna formeIn II R, (rö f j 1___..OCHOR I 1 j (II) x van X, R1 , och R:j betecknar detsamma som ovan och R,. är väte, hydroxi eller alkanoylox i med 1-5 kolatomer, med en svampkultur av Curvular ia-Liläk ten , ooh i. f a 1.1. önakvärt, dehydrerar de erhallna föreningarna med formeIn I med ... i betydelsen en enkelbindning, i 1,2-ställn.ing, och 5 fall önckvärt, förestrar de erhallna 21-hyd-roxisterojderma med formed n I.