FI121210B - Menetelmiä havupuiden embryogeenisen solukon lisäämiseksi sekä sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi - Google Patents

Description

Menetelmiä havupuiden embryogeenisen solukon lisäämiseksi sekä sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi

Ristiviite tähän liittyvään patenttihakemukseen

Esillä olevassa patenttihakemuksessa pyydetään etuoikeutta väliai-5 kaisesta US-patenttihakemuksesta nro 60/547 475, joka on jätetty 25.2.2004.

Keksinnön ala

Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä kasvialkioiden tuottamiseksi in vitro ja mahdollisesti kasvien tuottoa näistä kasvialkioista.

Keksinnön tausta 10 Vaatimus havupuiden (esim. mäntyjen ja kuusien) saamisesta puu tuotteiden valmistukseen lisääntyy. Yksi ehdotettu ratkaisu tähän ongelmaan on sellaisten yksittäisten puiden tunnistaminen, joilla on toivotut ominaisuudet, kuten nopea kasvunopeus, ja valiopuiden useiden geneettisesti identtisten kloonien tuottaminen somaattisella kloonauksella. Somaattinen kloonaus on 15 menetelmä kasvialkioiden tuottamiseksi in vitro kasvisoluista, jotka eivät ole tsygootteja. Näitä klooneja voidaan viljellä sellaisten havupuupuustojen tai kokonaisten havupuumetsien saamiseksi, joilla on haluttu ominaisuus (halutut ominaisuudet).

Yhdessä menetelmässä havupuiden somaattiseksi kloonaamiseksi 20 käytetään eristettyjen elävien havupuukudosten in vitro käsittelyä olosuhteissa, jotka edistävät havupuun somaattisten alkioiden ja sitten kokonaisten kasvien muodostumista käsitellystä kudoksesta. Eristettyä havupuukudosta voidaan viljellä yhden tai useamman auksiinin ja/tai sytokiniinin läsnä ollessa sellaisen al-kiokudoksen muodostamiseksi ja lisäämiseksi, jota sitten viljellään sellaisissa 25 olosuhteissa, jotka edistävät sirkkalehtisten havupuualkioiden muodostumista. Sitten nämä alkiot voidaan idättää havupuiden saamiseksi. Esimerkkeinä havupuun alkiokudoksesta ovat alkion alkioripustinmassat (ESM:t), joita voidaan muodostaa kudosviljelyllä in vitro havupuualkioista, jotka on leikattu havupuiden siemenistä. Kuvio 1 esittää esimerkinomaisesti männyn alkion alkioripus-30 tinmassoja nesteviljelmässä. Kuvio 2 esittää männyn sirkkalehtisen somaattisen alkion, joka on muodostunut ESM:sta (sirkkalehdet ovat näkyvissä alkion yläosassa).

2

Jatkuva ongelma on kuitenkin sellaisten havupuiden somaattisten alkioiden tehokkaan muodostumisen stimuloiminen, jotka kykenevät itämään suurella frekvenssillä havupuiden muodostumiseksi. In vitro muodostetut sirk-kalehtiset somaattiset havupuualkiot ovat edullisesti morfologisesti, anatomi-5 sesti ja biokemiallisesti samantapaisia tai identtisiä sellaisten tsygoottisten ha-vupuualkioiden kanssa, jotka ovat muodostuneet in vivo saman lajin havupuu-siemenissä. On erityisesti tarve menetelmistä, joilla tuotetaan tsygootin kaltaisia sirkkalehtisiä havupuiden somaattisia alkioita suurempia määriä in vitro kuin mitä on tuotettu alan aiemmilla menetelmillä. Uusilla menetelmillä tuotettu-10 jen sirkkalehtisten havupuiden somaattisten alkioiden itämisfrekvenssin ja laadun tulisi edullisesti olla korkeampi kuin alan aiemmilla menetelmillä tuotettujen sirkkalehtisten havupuiden somaattisten alkioiden itämisfrekvenssi ja laatu.

Keksinnön yhteenveto

Yhdenmukaisesti edellä olevan kanssa esillä oleva keksintö antaa 15 käyttöön menetelmiä havupuiden alkiokudoksen lisäämiseksi in vitro. Kukin esillä olevan keksinnön menetelmä sisältää vaiheen, jossa viljellään jatkuvasti havupuun alkiokudosta nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa aika, joka riittää alkiokudoksen lisääntymiseksi.

Tämän keksinnön menetelmät ovat käyttökelpoisia esimerkiksi ha-20 vupuun alkiokudoksen lisäämiseksi in vitro. Tätä lisääntynyttä alkiokudosta voidaan viljellä edelleen sirkkalehtisten somaattisten havupuualkioiden tuottamiseksi, joita voidaan idättää ja kasvattaa havupuiden tuottamiseksi. Näin ollen tämän keksinnön menetelmät tehostavat sellaisten havupuiden tuottoa, joilla on toivotut ominaisuudet (esim. lisääntynyt kasvunopeus), ja jotka näin aut-25 tavat tyydyttämään puutavaran ja puutuotteiden tarvetta.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Edellä olevat muodot ja monet tämän keksinnön oheisedut tulevat helpommin tajuttaviksi ja myös ymmärrettäviksi tutustuttaessa seuraavaan yksityiskohtaiseen kuvaukseen yhdessä tähän liitettyjen piirustusten kanssa, 30 joissa: kuvio 1 esittää männyn alkion alkioripustinmassoja nesteviljelmäs- sä; ja kuvio 2 esittää ESM:sta muodostuneen sirkkalehtisen männyn somaattisen alkion (sirkkalehdet ovat näkyvissä alkion yläosassa).

3

Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus Tässä käytettynä termi “sirkkalehtinen alkio” tarkoittaa alkiota, jolla on yksi tai useampi sirkkalehti.

Tässä käytettynä termi “somaattinen alkio” viittaa kasvialkioon, joka 5 on kehittynyt in vitro kasvisolusta, joka ei ole tsygootti.

Tässä käytettynä termi “alkiokudos” (eli embryogeeninen solukko) viittaa mihin tahansa havupuusta peräisin olevaan kudokseen, joka kykenee tuottamaan yhden tai useamman sirkkalehtisen havupuun somaattisen alkion, kun sitä käsitellään tämän keksinnön menetelmien mukaisesti. Näin ollen termi 10 “alkiokudos” sisältää esimerkiksi havupuun alkion alkioripustinmassat.

Tässä käytettynä termi “lisääntymisravintoalusta” viittaa nestemäiseen ravintoalustaan, joka on formuloitu edistämään havupuun sellaisen al-kiokudoksen lisääntymistä, jota viljellään lisääntymisravintoalustassa.

Tässä käytettynä termi “jatkuva viljelmä” ja sen kieliopilliset vasti-15 neet, jota käytetään havupuun alkiokudoksen viljelemiseksi, tarkoittaa havupuun alkiokudoksen viljelyä nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa niin, että viljelmään lisätään ajoittain (ainakin kerran) lisää lisääntymisravintoalustaa poistamatta alkuperäistä lisääntymisravintoalustaa. Näin ollen havupuun al-kiokudosta voidaan viljellä esimerkiksi 50 ml tilavuudessa lisääntymisravinto-20 alustaa yhden viikon ajan, sitten lisätään 50 ml lisätilavuus lisääntymisravintoalustaa alkuperäisen lisääntymisravintoalustan tilavuuteen ja alkiokudosta viljellään vielä tässä 100 ml tilavuudessa lisääntymisravintoalustaa. Käytännössä havupuun alkiokudoksen jatkuvassa viljelyssä pieni määrä viljelykudosta voidaan poistaa viljelyparametrien (esim. kasvunopeuden ja kudoslaadun) arvioi-25 miseksi.

Jollei muutoin ole ilmoitettu, kaikki prosentteina ilmaistut konsentraa-tioarvot ovat painoprosentteja.

Esillä oleva keksintö antaa käyttöön menetelmiä havupuun alkiokudoksen lisäämiseksi in vitro. Esillä olevan keksinnön menetelmät sisältävät ku-30 kin vaiheen, jossa suoritetaan havupuun alkiokudoksen jatkuvaa viljelyä nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa aika, joka riittää alkiokudoksen lisääntymiseksi. Esillä olevan keksinnön menetelmiä voidaan käyttää sellaisen havupuun alkiokudoksen lisäämiseksi, joka on peräisin mistä tahansa havupuu-lajista, kuten P/nacea-heimon jäsenistä sisältäen Pinus-suvun jäseniä [esim. 35 loblollymänty (Pinus taeda)], tai Pseudotsuga-suvun jäsenistä [esim. doug-lasinkuusi (Pseudotsuga menziesii)].

4

Esillä olevan keksinnön menetelmien jatkuvat viljelmät ovat parannus alan aiempiin “eräviljelymenetelmiin”. Käytettäessä eräviljelymenetelmää havupuun alkiokudosta viljellään nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa tietty aika, alkiokudos erotetaan lisääntymisravintoalustasta (esim. antamalla 5 alkiokudoksen laskeutua ravintoalustan pohjalle), sitten poistetaan erät alkiokudosta ja ne lisätään eri tilavuuksiin tuoretta lisääntymisravintoalustaa lisä-viljelyä varten. Tämä menetelmä toistetaan niin monta kertaa kuin halutaan useiden viljelyastioiden saamiseksi, jotka kukin sisältävät eri erät alkiokudosvil-jelmää. Jatkuvan viljelmän käyttö saa aikaan useita etuja eräviljelmään verrat-10 tuna: jatkuva viljelmä esimerkiksi vaatii tyypillisesti vähemmän työtä kuin erävil-jelmä, jossa alkiokudosta täytyy ajoittain jatkoviljellä uusiin viljelytankkeihin; ja jatkuvissa viljelmissä on tyypillisesti vähemmän viljelyvariabiliteettia kuin mitä esiintyy eräviljelymenetelmien alkiokudoserien välillä.

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää havupuun embryogeeni-15 sen solukon lisäämiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää vaiheen, jossa viljellään jatkuvasti havupuun embryogeenistä solukkoa nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa viljelyastiassa vähintään kahden viikon - kuuden kuukauden aika, jolloin jatkuva viljely suoritetaan lisäämällä ajoittain peräkkäisinä lisäyksinä tuoreen nestemäisen lisääntymisravintoalus-20 tan lisätilavuus nestemäiseen lisääntymisravintoalustaan viljelyastiassa, jolloin havupuun embryogeenisen solukon tilavuuden suhde viljelyastiassa viljelyasti-aan lisätyn tuoreen lisääntymisravintoalustan tilavuuteen on noin 1:2 - noin 1:5, ja jolloin viljelyastiaan ajoittain lisätyn nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus lisää kumulatiivisesti nestemäisen lisääntymisravintoalustan 25 kokonaistilavuutta viljelyastiassa.

Esimerkki esillä olevassa keksinnössä käyttökelpoisesta alkioku-doksesta on alkion alkioripustinmassat (ESM:t). ESM:t voidaan valmistaa havupuun siemenestä poistetuista esisirkkalehtisistä alkioista. Nämä siemenet steriloidaan pinnalta tyypillisesti ennen esisirkkalehtisten alkioiden poistamista, 30 joita sitten viljellään aloitusravintoalustalla tai aloitusravintoalustassa, joka sallii sellaisten ESM:n muodostumisen, jotka sisältävät silmikoinnilla ja vakoutumi-sella tapahtuvassa lisääntymisvaiheessa olevia varhaisvaiheen alkioita. Ravintoalusta voi haluttaessa sisältää hormoneja, jotka stimuloivat varhaisvaiheen alkioiden lisääntymistä. Esimerkit hormoneista, joita voidaan sisällyttää ravin-35 toalustaan, ovat auksiinit [esim. 2,4-dikloorifenoksietikkahappo (2,4-D)] ja sy-tokiniinit [esim. 6-bentsyyliaminopuriini (BAP)]. Auksiineja voidaan käyttää esi- 5 merkiksi konsentraationa, joka on 1 mg/l - 200 mg/l. Sytokiniinejä voidaan käyttää esimerkiksi konsentraationa, joka on 0,1 mg/l - 50 mg/l. Esimerkki ravinto-alustasta, joka on käyttökelpoinen loblollymännyn esisirkkalehtisten alkioiden viljelemiseksi ESM:n muodostumisen indusoimiseksi on LMi-ravintoalusta, 5 joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 2. Esimerkki ravintoalustasta, joka on käyttökelpoinen douglasinkuusen esisirkkalehtisten alkioiden viljelemiseksi ESM:n muodotuksen indusoimiseksi on DM-i-ravintoalusta, joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 3.

Lisääntymisravintoalusta on formuloitu havupuun alkiokudoksen, 10 kuten alkion alkioripustinmassojen, kasvun ja lisääntymisen edistämiseksi. Li-sääntymisravintoalustaa voidaan sekoittaa alkiokudoksen kasvun ja lisääntymisen edistämiseksi. Lisääntymisravintoalustan osmolaalisuus on tyypillisesti 180-400 mM/kg. Lisääntymisravintoalusta sisältää ravinteita, jotka ravitsevat alkiokudosta ja voivat sisältää hormoneja, kuten yhtä tai useampaa auksiinia 15 ja/tai sytokiniiniä, jotka edistävät alkiokudoksen soiujakaantumista ja kasvua.

On yleensä toivottavaa, vaikkei välttämätöntä, sisällyttää lisäänty-misravintoalustaan maltoosia ainoaksi tai pääasialliseksi metaboloitavaksi so-kerinlähteeksi. Esimerkkirajat käyttökelpoisista maltoosikonsentraatioista ovat noin 2,5 % - noin 6,0 %. Esimerkki sopivasta nestemäisestä lisääntymisravin-20 toalustasta loblollymäntyä varten on LIVh-alusta (ilman hyytelöimisainetta), joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 2. Esimerkki sopivasta lisääntymisra-vintoalustasta douglasinkuusta varten on DM2-alusta, joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 3. Havupuun alkiokudosta viljellään tyypillisesti lisään-tymisravintoalustassa (esim. aina kuuteen kuukauteen asti) lisäten ajoittain 25 (esim. kerran viikossa) lisääntymisravintoalustaa sopivassa lämpötilassa, kuten 10-30 °C:ssa tai 15 - 25 °C:ssa tai 20 - 23 °C:ssa.

Joissain esillä olevan keksinnön menetelmien suoritusmuodoissa havupuun alkiokudoksen tilavuuden suhde tuoreen lisääntymisravintoalustan, jota lisätään ajoittain alkiokudoksen jatkuvaan viljelmään, tilavuuteen on noin 30 1:3 - noin 1:5, joissain esillä olevan keksinnön menetelmien suoritusmuodoissa havupuun alkiokudoksen tilavuuden suhde tuoreen lisääntymisravintoalustan, jota lisätään ajoittain alkiokudoksen jatkuvaan viljelmään, tilavuuteen on noin 1:4 - noin 1:5. Termi “noin” tässä yhteydessä käytettynä sisältää suhteiden tarkat rajat (esim. alue “noin 1:4 - noin 1:5” sisältää alueen 1:4 -1:5).

6

Havupuun alkiokudoksen tilavuus voidaan mitata sijoittamalla vilje-lyastia vaakasuoralle pinnalle (esim. laboratoriopöydälle) 30 minuutiksi huoneenlämpötilassa (tyypillisesti 20 - 25 °C). Kudos asettuu viljelyastian pohjalle ja asettuneen kudoksen tilavuus mitataan (esim. vetämällä asettunut kudos ka-5 libroituun pipettiin tai katsomalla asettuneen kudoksen taso viljelyastian tila-vuuskalibrointimerkkien avulla). Tällä tavalla mitattuun kudostilavuuteen viitataan termillä asettunut solutilavuus (lyhennys SCV).

Näin ollen edustavan esimerkin valossa havupuun alkion alkioripus-tinmassoja, joiden asettunut solutilavuus on 10 ml, viljellään 40 ml alkutilavuu-10 dessa lisääntymisravintoalustaa yhden viikon ajan. ESM:t lisääntyvät ja niiden asettunut solutilavuus on 20 ml toisen viikon alussa. Toisen viikon alussa lisätään lisääntymisravintoalustan alkutilavuuteen 40 ml -100 ml lisää lisääntymisravintoalustaa ja ESM:ja viljellään siinä vielä lisää.

Samalla, kun esillä olevat keksijät eivät halua sitoutua teoriaan he 15 olettavat, että havupuun alkiokudoksen viljelyn aikana tuottamien kasvua edistävien kemikaalien yhdistelmä yhdessä tuoreen lisääntymisravintoalustan ajoittaisen lisäämisen kanssa edistää havupuun alkiokudoksen lisääntymistä. Keksijät olettavat, että eräviljelmässä kasvua edistävät kemikaalit poistuvat tai laimenevat oleellisesti, kun alkiokudosta jatkoviljellään ajoittain erillisissä erissä 20 tuoretta lisääntymisravintoalustaa.

Esillä oleva keksintö koskee lisäksi menetelmää douglasinkuusen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) viljellään douglasinkuusen tsygoottisia alkioita aloitusravintoalus-25 tässä tai aloitusravintoalustalla aika, joka riittää alkion alkioripustinmassojen tuottamiseksi; (b) viljellään jatkuvasti alkion alkioripustinmassoja nestemäisessä li-sääntymisravintoalustassa vähintään kahden viikon - kuuden kuukauden aika, jolloin jatkuva viljely suoritetaan lisäämällä ajoittain peräkkäisinä lisäyksinä tuo- 30 reen nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus nestemäiseen lisään-tymisravintoalustaan viljelyastiassa, jolloin douglasinkuusen alkioripustinmassojen tilavuuden suhde viljelyastiassa viljelyastiaan lisätyn tuoreen lisääntymisravintoalustan tilavuuteen on noin 1:9, ja jolloin viljelyastiaan ajoittain lisätyn nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus lisää kumulatiivisesti nes-35 temäisen lisääntymisravintoalustan kokonaistilavuutta viljelyastiassa; ja 7 (c) viljellään lisääntyneitä alkion alkioripustinmassoja kehitysravinto-alustassa tai kehitysravintoalustalla aika, joka riittää douglasinkuusen sirkka-lehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi alkion alkioripustinmassoista.

Esillä oleva keksintö koskee myös menetelmää loblollymännyn sirk-5 kalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) viljellään loblollymännyn tsygoottisia alkioita aloitusravintoalus-tassa tai aloitusravintoalustalla aika, joka riittää alkion alkioripustinmassojen tuottamiseksi; 10 (b) viljellään jatkuvasti alkion alkioripustinmassoja nestemäisessä li- sääntymisravintoalustassa vähintään kahden viikon - kuuden kuukauden aika, jolloin jatkuva viljely suoritetaan lisäämällä ajoittain peräkkäisinä lisäyksinä tuoreen nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus nestemäiseen lisään-tymisravintoalustaan viljelyastiassa, jolloin loblollymännyn alkioripustinmasso-15 jen tilavuuden suhde viljelyastiassa viljelyastiaan lisätyn tuoreen lisääntymisravintoalustan tilavuuteen on noin 1:4, ja jolloin viljelyastiaan ajoittain lisätyn nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus lisää kumulatiivisesti nestemäisen lisääntymisravintoalustan kokonaistilavuutta viljelyastiassa; ja (c) viljellään lisääntyneitä alkion alkioripustinmassoja kehitysravinto-20 alustassa tai kehitysravintoalustalla aika, joka riittää loblollymännyn sirkkaleh-tisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi alkion alkioripustinmassoista.

Aloitusravintoalusta sisältää tyypillisesti epäorgaanisia suoloja ja orgaanisia ravinnemateriaaleja. Aloitusravintoalustan osmolaalisuus on tyypillisesti noin 160 mg/kg tai jopa alhaisempi, mutta se voi olla niinkin korkea kuin 25 170 mM/kg. Aloitusravintoalusta sisältää tyypillisesti kasvuhormoneja. Esi merkkejä hormoneista, joita voidaan sisällyttää aloitusravintoalustaan, ovat auksiinit [esim. 2,4-dikloorifenoksietikkahappo (2,4-D)] ja sytokiniinit [esim. 6-bentsyyliaminopuriini (BAP)]. Auksiineja voidaan käyttää esimerkiksi kon-sentraationa, joka on 1 mg/l - 200 mg/l. Sytokiniinejä voidaan käyttää esimer-30 kiksi konsentraationa, joka on 0,1 mg/l - 50 mg/l.

Aloitusravintoalusta voi sisältää adsorbenttikoostumusta erityisesti silloin, kun käytetään erittäin korkeita kasvuhormonitasoja. Adsorbenttikoostu-mus voi olla mikä tahansa koostumus, joka ei ole myrkyllinen alkusoluille esillä olevien menetelmien suorittamisessa käytetyissä konsentraatioissa ja joka ky-35 kenee adsorboimaan ravintoalustassa läsnä olevia kasvua edistäviä hormoneja ja kasvisolujen tuottamia myrkyllisiä yhdisteitä esisirkkalehtisen alkion kehi- 8 tyksen aikana. Ei-rajoittavat esimerkit käyttökelpoisista adsorbenttikoostumuk-sista sisältävät aktivoidun puuhiilen, liukoisen poly(vinyylipyrrolidonin), liukenemattoman poly(vinyylipyrrolidonin), aktivoidun alumiinin ja silikageelin. Ad-sorbenttikoostumusta voi olla läsnä määränä, joka on esimerkiksi noin 5 0,1 g/l - noin 5 g/l. Esimerkki loblollymännyn aloitusravintoalustasta on LMr alusta, joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 2. Esimerkki douglasinkuu-sen aloitusravintoalustasta on DMi-alusta, joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 3.

Havupuun somaattisia soluja viljellään tyypillisesti aloitusravinto-10 alustassa tai aloitusravintoalustalla 6 viikkoa - 12 viikkoa, kuten 8 viikkoa -10 viikkoa tai kuten noin 8 viikkoa lämpötilassa, joka on 10 °C - 30 °C, kuten 15 °C -25 °C tai kuten 20 °C - 23 °C.

Alkiokudos siirretään aloitusravintoalustasta lisääntymisravintoalus-taan. Esillä olevan keksinnön suorittamisessa käyttökelpoisten edustavien li-15 sääntymisravintoalustojen koostumus ja ominaisuudet on kuvattu supra.

Sitten alkiokudos siirretään lisääntymisravintoalustasta kehitysravin-toalustaan, joka on formuloitu niin, että se edistää havupuun somaattisten sirk-kalehtisten alkioiden kehittymistä havupuun alkiokudoksesta. Kehitysravinto-alusta voi olla kiinteää ravintoalustaa (kiinteytetty liuottamalla hyytelöimisainet-20 ta nestemäiseen kehitysravintoalustaan) tai nestemäistä ravintoalustaa. Kun käytetään nestemäistä kehitysravintoalustaa, alkiokudos voidaan upottaa täysin ravintoalustaan, jota voidaan sekoittaa sinä aikana, kun alkiokudosta viljellään siinä. Absorbenttisubstraattia (alusta, joka on valmistettu esim. selluloosasta tai jostain muusta materiaalista, joka absorboi vesipitoisia liuoksia, kuten 25 kehitysravintoliuosta) voidaan liottaa nestemäisessä kehitysravintoalustassa ja havupuun somaattiset alkiot voidaan sijoittaa liotetuille alustoille ja niin, että ne ovat yhteydessä kehitysravintoalustan kanssa.

Kun käytetään kiinteää ravintoalustaa, alkiokudos voidaan sijoittaa kehitysravintoalustan pinnalle ja se voi osittain tunkeutua kiinteän ravintoalus-30 tan pintaan. Näin ollen kiinteät kehitysravintoalustat sisältävät ravintoalustoja, jotka ovat osittain kiinteitä ja sallivat alkiokudoksen oleellisen tunkeutumisen alustaan ja sisältävät myös täysin kiinteitä ravintoalustoja, jotka eivät salli alkiokudoksen tunkeutumista kiinteään alustaan. Nestemäiset ravintoalustat voidaan kiinteyttää täydellisesti tai osittain lisäämällä sopiva määrä hyytelöimis-35 ainetta, kuten agaria.

9

Kehitysravintoalusta sisältää ravinteita, jotka ravitsevat alkiokudos-ta. Maltoosia voidaan lisätä ravintoalustaan alkiokudoksen pääasiallisena tai ainoana metaboloitavan sokerin lähteenä. Käyttökelpoiset maltoosikonsentraa-tiot ovat 2,5 % - 6,0 %. Sopivat kehitysravintoalustat eivät tyypillisesti sisällä 5 kasvua edistäviä hormoneita, kuten auksiineja ja sytokiniinejä, mutta voivat sisältää abskissihappohormonia. Kun abskissihappoa käytetään kehitys ravinto-alustassa, sitä käytetään tyypillisesti konsentraationa, joka on 1 mg/l - 200 mg/l, kuten 1 mg/l-100 mg/l. Kehitysravintoalustan osmolaalisuus voidaan säätää arvoon, joka on halutuissa rajoissa, kuten 250 mM/kg-450 mM/kg, kuten 10 250 mM/kg - 350 mM/kg. Kehitysravintoalustan pH voidaan myös säätää ar voon, joka on halutuissa rajoissa, kuten 4,5-6,5 tai kuten 5,0-6,0. Alkioku-dosta inkuboidaan tyypillisesti kehitysravintoalustassa tai kehitysravintoalustal-la lämpötilassa, joka on 20 °C - 24 °C, kuten 21 °C - 24 °C. Esimerkki sopivasta loblollymännyn kehitysravintoalustasta on LMs-alusta, joka on kuvattu tässä 15 olevassa esimerkissä 2. Esimerkki sopivasta douglasinkuusen kehitysravintoalustasta on DM4-alusta, joka on kuvattu tässä olevassa esimerkissä 3.

Havupuun alkiokudosta viljellään kehitysravintoalustassa tai kehitys-ravintoalustalla aika, joka riittää tuottamaan havupuun somaattisia sirkkalehti-siä alkioita havupuun alkiokudoksesta. Esimerkiksi douglasinkuusen alkion 20 alkioripustinmassoja viljellään tyypillisesti kehitysravintoalustassa tai kehitysra-vintoalustalla noin 7 viikkoa - noin 8 viikkoa douglasinkuusen somaattisten sirkkalehtisten alkioiden tuottamiseksi. Jälleen esimerkkinä, loblollymännyn alkion alkioripustinmassoja viljellään tyypillisesti kehitysravintoalustassa tai kehi-tysravintoalustalla noin 10 viikkoa-noin 12 viikkoa loblollymännyn somaattis-25 ten sirkkalehtisten alkioiden tuottamiseksi.

Keksinnön menetelmiä käyttämällä tuotetut havupuun somaattiset sirkkalehtiset alkiot voidaan mahdollisesti idättää havupuukasvien muodostamiseksi, jotka voidaan kasvattaa havupuiksi, jos halutaan. Nämä idätetyt kasvit voidaan istuttaa maahan lisäkasvatusta varten. Nämä idätetyt kasvit voidaan 30 istuttaa maahan esimerkiksi kasvihuoneessa ja antaa niiden kasvaa ennen istuttamista ulos. Havupuun sirkkalehtisiä somaattisia alkioita pidetään tyypillisesti valossa itämisen stimuloimiseksi. Kaikki keksinnön menetelmien vaiheet idättämistä lukuunottamatta suoritetaan tyypillisesti pimeässä.

Keksinnön menetelmiä käyttäen tuotetut havupuun sirkkalehtiset 35 somaattiset alkiot voidaan myös muuttaa tuotetuiksi siemeniksi, joita voidaan säilyttää myöhempää istutusta ja idätystä varten tai jotka voidaan istuttaa ilman säilytystä. Edustavia esimerkkejä käyttökelpoisista tuotetuista siemenistä 10 ovat tuotetut siemenet, jotka on kuvattu US-patentissa nro 5 687 504, johon tässä viitataan kokonaisuudessaan.

Keksinnön menetelmiä voidaan käyttää esimerkiksi sellaisten yksittäisten havupuukloonien valmistamiseksi, joilla on yksi tai useampi toivottava 5 ominaisuus, kuten nopea kasvu. Näin ollen yhdessä muodossa esillä oleva keksintö saa aikaan menetelmät geneettisesti identtisten havupuun somaattisten sirkkalehtisten alkioiden valmistamiseksi, jossa mitä tahansa tässä kuvatuista menetelmistä käytetään geneettisesti identtisten havupuun somaattisten sirkkalehtisten alkioiden tuottamiseksi geneettisesti homogeenisesta lähtöma-10 teriaalista (esim. yksittäisestä loblollymännyn tai douglasinkuusen tsygoottises-ta alkiosta).

Seuraavat esimerkit ainoastaan kuvaavat tällä hetkellä keksinnön suorittamiseksi ajateltua parasta muotoa eikä niitä ei tule pitää keksintöä rajoittavina.

15 Esimerkki 1 Tämä esimerkki esittää jatkuvan viljelmän onnistuneen käytön loblollymännyn somaattisen alkiontuoton lisääntymisvaiheessa.

Materiaalit ja menetelmät: Käsittelyissä 1-5 (kuvattu alla) käytettiin loblollymännyn genotyyppejä A, B ja C. Loblollymännyn genotyyppiä A käy-20 tettiin käsittelyssä 6 (kuvattu alla). ESM:ja viljeltiin jatkuvasti lisääntymisravin-toalustassa pulloissa kuusi viikkoa. Lisääntymisravintoalustan koostumus on esitetty alla olevassa taulukossa 1.

Taulukko 1

Loblollymännyn lisääntymisravintoalusta (LM-alusta)__

Suolat__mg/l_ NH4NO3 150 KN03 909,9

Ca(N03)2*2H20 236,15

MgS04-7H20 246,5

Mg(N03)2*6H20 256,5

MgCI2*6H20 50 KH2P04 136

CaCI2*6H20 50

Kl 4,15 H3BO3 15,5

MnS04*H20 10,5

ZnSQ4»7H20_ 14,4_ 11

Loblollymännyn lisääntymisravintoalusta (LM-alusta)__

NaMo04*2H20 0,125

CuS04*5H20 0,125

CoCI2*6H20 0,125

FeS04*7H20 27,87

Na2EDTA__37,26_

Vitamiinit/aminohapot__mg/l_

Nikotiinihappo 0,5

Pyridoksiini-HCI 0,5

Tiamiini-HCI 1

Glysiini__2_

Sokeri/agar__mg/l_

Myo-inositoli 200

Kaseiinihydrolysaatti 500 L-glutamiini 1000

Maltoosi__30 000 _

Hormonit__mg/l _ 2,4-D 1,1 BAP 0,1

Kinetiini_ 0,1______ Käytettiin seuraavia lisääntymisviljelyolosuhteita.

Käsittely 1 (eräviljelyverrokki): ympättiin 10 ml ESM:aa 40 ml lisään-tymisravintoalustaa 250 ml pullossa. Kerran viikossa siirrettiin 10 ml ESM:n asettunutta solutilavuutta (SCV) 40 ml:aan tuoretta LM-ravintoalustaa. SCV:n 5 suhde tuoreeseen ravintoalustaan pidettiin arvossa 1:4. SCV-suhde ravinto-alustan kokonaistilavuuteen (plus ESM) pidettiin arvossa 1:5.

Käsittely 2: ympättiin 10 ml ESM:aa 40 ml lisääntymisravintoalustaa 250 ml pullossa. Viikon jälkeen pulloon lisättiin tuoretta LM-ravintoalustaa. Oletettiin, että SCV:n määrä oli kahdentunut aiemmasta viikosta. Pulloon lisättiin 10 riittävästi tuoretta LM-ravintoalustaa niin, että SCV:n suhteen tuoreeseen ravintoalustaan arvioitiin olevan 1:2. SCV:n suhde ravintoalustan kokonaistilavuuteen pidettiin arvossa 1:5. Käsittelyn 2 suunniteltiin “nälkiinnyttävän” ESM:t sen varmistamiseksi, että ESM:t muuttuvat ruskeiksi, kun niille annetaan liian vähän tuoretta LM-ravintoalustaa.

12 Käsittely 3: ympättiin 10 ml ESM:aa 40 ml lisääntymisravintoalustaa 250 ml pullossa. Viikon jälkeen pulloon lisättiin tuoretta LM-ravintoalustaa. Oletettiin, että SCV:n määrä oli kahdentunut aiemmasta viikosta. Oletettiin myös, että pullossa oli vähemmän vanhaa LM-ravintoalustaa ensimmäisen viikon lo-5 pussa kuin ensimmäisen viikon alussa, koska ESM:t olivat käyttäneet jonkin verran vanhaa ravintoalustaa kasvuunsa. Sen vuoksi lisättiin riittävästi tuoretta LM-ravintoalustaa sen varmistamiseksi, että SCV:n suhde tuoreeseen ravinto-alustaan pysyi arvossa 1:5. SCV:n suhteen tuoreeseen ravintoalustaan oli tarkoitus olla 1:2,5. Kuten käsittelyn 2, käsittelyn 3 suunniteltiin “nälkiinnyttävän” 10 ESM:t sen varmistamiseksi, että ESM:t muuttuvat ruskeiksi, kun niille annetaan liian vähän tuoretta LM-ravintoalustaa.

Käsittely 4: ympättiin 10 ml ESM:aa 40 ml lisääntymisravintoalustaa 250 ml pullossa. Viikon jälkeen pulloon lisättiin tuoretta LM-ravintoalustaa. Lisättävän tuoreen LM-ravintoalustan tilavuuden mittaamiseksi oletettiin, että 15 SCV:n määrä oli kahdentunut aiemmasta viikosta ja että arvioitu SCV-tilavuus oli nelinkertaistunut. Vanhaa LM-ravintoalustaa ei otettu huomioon tässä laskelmassa. Näin ollen SCV:n suhteen tuoreeseen LM-ravintoalustaan oli tarkoitus olla 1:4. SCV:n suhdetta ravintoalustan kokonaistilavuuteen ei kontrolloitu. Käsittelyn 4 suunniteltiin tarjoavan riittävästi tuoretta LM-ravintoalustaa arvion 20 mukaan niin, että se edisti ESM:n lisäkasvua olettaen, että ESM jakaantuu kerran viikossa ja että solut saavat sellaisen riittävän määrän tuoretta ravintoalustaa, joka vastaa nelinkertaisesti SCV:tta.

Käsittely 5: ympättiin 10 ml ESM:aa 40 ml lisääntymisravintoalustaa 250 ml pullossa. Viikon jälkeen pulloon lisättiin tuoretta LM-ravintoalustaa. 25 SCV mitattiin, kun ne siirrettiin uuteen tyhjään pulloon. Vanhan ravintoalustan tilavuus mitattiin myös ja se siirrettiin samaan uuteen pulloon kuin SCV:t. SCV kerrottiin neljällä lisättävän tuoreen LM-ravintoalustan tilavuuden määrittämiseksi. SCV:n suhde tuoreeseen LM-ravintoalustaan säilytettiin arvossa 1:4. SCV:n suhdetta ravintoalustan kokonaistilavuuteen ei kontrolloitu. Kuten käsit-30 telyn 4, käsittelyn 5 suunniteltiin tarjoavan riittävästi tuoretta LM-ravintoalustaa niin, että se edisti ESM:n lisäkasvua. Käsittelyssä 5 SCV mitattiin oikeasti mieluummin kuin arvioimalla se, kuten käsittelyssä 4.

Käsittely 6: viljelmän aloittamiseksi jatkuvaviljelytankissa käytettiin 20 ml genotyypin A ESM:ja. Jatkuvaviljelytankki oli 6 litran Optima-viljelysys-35 teemi, jota myy MetaBios Inc., 135 Innovation & Development Center, University of Victoria, R-Hut McKenzie Avenue, Victoria, BC Kanada, V8W 3W2. SCV

13 arvioitiin silmin joka viikko ja tuoretta LM-ravintoalustaa pumpattiin astiaan käyttäen steriiliä letkua ja liitintä. ESM-näytteet kerättiin astiasta joka viikko käyttäen steriiliä ruiskua ja letkua. SCV-suhteen tuoreeseen LM-ravinto-alustaan tarkoitettiin olevan 1:4. SCV-suhdetta ravintoalustan kokonaistilavuu-5 teen ei kontrolloitu. Käsittely 6 oli käsittelyn 4 laajennettu versio, jossa käytettiin jatkuvaviljelyastiaa.

Taulukossa 2 esitetään LM-ravintoalustan arvioidut ja mitatut tilavuudet [millilitroina (ml)], SCV-suhde tuoreen LM-ravintoalustan tilavuuteen (lyhennys SCV:tuore) ja SCV-suhde ravintoalustan kokonaistilavuuteen (ly-10 hennys SCV:kokonais) kullekin kuudelle käsittelylle.

Taulukko 2

Arvioidut tilavuudet Mitatut tilavuudet Arvioidut _________tilavuudet Käs. Käs. Käs. Käs. Käs. #5 Käs. #5 Käs. #5 Käs. #6 #1 #2 #3 #4 Geno- Geno- Geno- Geno-

______tyyppi A tyyppi B tyyppi C tyyppi A

Viikko 0 SCV 10 10 10 10 10 10 10 20

Vanha ravinto- alusta

Tuore ravinto- 40 40 40 40 40 40 40 80 alusta

Kaikkiaan 50 50 50 50 50 50 50 100 SCV:kokonais 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 SCV:tuore 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5

Viikko 1 SCV 10 20 20 20 20 21 12,5 40

Vanha ravinto- 0 40 30 30 26 23 33,5 80 alusta

Tuore ravinto- 40 40 50 80 80 84 50 160 alusta

Kaikkiaan 50 100 100 130 126 128 96 280 SCV:kokonais 0,20 0,20 0,20 0,15 0,16 0,16 0,13 0,14 SCV:tuore 0,25 0,50 0,40 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 14

Arvioidut tilavuudet Mitatut tilavuudet Arvioidut _________tilavuudet Käs. Käs. Käs. Käs. Käs. #5 Käs. #5 Käs. #5 Kas. #6 #1 #2 #3 #4 Geno- Geno- Geno- Geno-

______tyyppi A tyyppi B tyyppi C tyyppi A

Viikko 2 SCV 10 40 40 40 39 38 16 80

Vanha ravinto- 80 60 90 88 88 73 240 alusta

Tuore ravinto- 40 80 100 160 156 152 64 320 alusta

Kaikkiaan 50 200 200 290 283 278 153 640 SCV:kokonais 0,20 0,20 0,20 0,14 0,14 0,14 0,10 0,13 SCV:tuore 0,25 0,50 0,40 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 Näytteidenotto alkaa Näytteidenotto alkaa __Arvioidut tilavuudet__Mitatut tilavuudet__

Viikko 3 SCV 10 80 80 80 30 30 30 160

Vanha ravinto- 0 160 120 210 58 60 120 480 alusta

Tuore ravinto- 40 160 200 320 120 120 120 640 alusta

Kaikkiaan 50 400 400 610 208 210 270 1 280 SCV:kokonais 0,20 0,20 0,20 0,13 0,14 0,14 0,11 0,13 SCV:tuore 0,25 0,50 0,40 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Viikko 4 SCV 10 160 160 160 30 30 30 320

Vanha ravinto- 0 320 240 450 49 33 ei tulosta 960 alusta

Tuore ravinto- 40 320 400 640 120 120 120 1 280 alusta

Kaikkiaan 50 800 800 1 250 199 183 150 2 560 SCV:kokonais 0,20 0,20 0,20 0,13 0,15 0,16 0,13 SCV:tuore 0,25 0,50 0,40 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 15

Arvioidut tilavuudet Mitatut tilavuudet Arvioidut _________tilavuudet Käs. Käs. Käs. Käs. Käs. #5 Käs. #5 Käs. #5 Käs. #6 #1 #2 #3 #4 Geno- Geno- Geno- Geno-

______tyyppi A tyyppi B tyyppi C tyyppi A

Viikko 5 SCV 10 320 320 320 30 30 25 640

Vanha ravinto- 0 640 480 900 119 50 82 960 alusta

Tuore ravinto- 40 640 800 1 280 120 120 100 2 560 alusta

Kaikkiaan 50 1 600 1 600 2 500 269 200 207 4 160 SCV:kokonais 0,20 0,20 0,20 0,13 0,11 0,15 0,12 0,15 SCV:tuore 0,25 0,50 0,40 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Genotyypin B lisäviljely suoritettiin jatkuvaviljelyastiassa. Ympättiin 40 ml genotyypin B ESM:aa 200 ml tuoretta LM-ravintoalustaa jatkuvaviljelyastiassa viikolla 0. Lisättiin kullakin viikolla tuoretta LM-ravintoalustaa, kuten on kuvattu käsittelyn 6 yhteydessä. Oletettiin, että SCV kahdentui kunakin viikko-5 na ja arvioitu SCV kerrottiin neljällä lisättävän tuoreen LM-ravintoalustan tilavuuden määrittämiseksi. Laskuissa ei otettu huomioon vanhaa LM-ravintoalustaa. SCV:n suhteen tuoreen LM-ravintoalustan tilavuuteen oli tarkoitus olla 1:4. SCV:n suhdetta LM-ravintoalustan kokonaistilavuuteen ei kontrolloitu. Tämä koe kesti viisi viikkoa. Pidettiin myös yllä eräviljelyverrokkipulloa, joka oli 10 identtinen yllä kuvatun käsittelyn 1 kanssa.

Viljelymenetelmät: Kaikki viljelmät aloitettiin pienissä (250 ml) pulloissa, mutta ensimmäisen viikon lopussa tilavuudet olivat kasvaneet huomattavasti. Viljelmät siirrettiin 500 ml pulloihin. Toisen viikon lopussa käsittelyt 2 - 6 siirrettiin 1 litran pulloihin niin, että viljelmää oli pullossa 200 ml - 350 ml. 15 Käsittely 1 pidettiin aina 250 ml pullossa.

16

Viikkoina 3, 4 ja 5 SCV ja ravintoalustan tilavuudet lisääntyivät nopeasti. Jotta vältettiin useiden suurten pullojen ylläpito kullekin käsitte-ly/genotyyppiyhdistelmälle, otettiin ESM:n ja vanhan ravintoalustan näytteitä, ne siirrettiin uuteen pulloon ja sitten lisättiin sopivaan määrään tuoretta LM-5 ravintoalustaa uudessa pullossa. ESM ja vanha ravintoalusta sekoitettiin täydellisesti yhteen ennen näytteen ottoa käsittelyjen 2 - 4 seoksista. Käsittelyä 5 varten pullojen annettiin asettua ja SCV ja vanha ravintoalusta mitattiin erikseen käyttäen 30 ml laajareikäistä lasipipettiä. SCV:n suhde vanhaan ravinto-alustaan laskettiin. SCV ja vanha ravintoalusta siirrettiin sitten uuteen pulloon 10 samassa suhteessa. Tämä piti pullojen määrän yhtenä isona pullona per genotyyppi/ käsittely-yhdistelmä tai kaiken kaikkiaan 15 pullona.

Tulosten keräys: Kunkin viikottaisen viljelmäsiirron aikana otettiin 2 ml - 3 ml SCV-näyte alkioiden laadun arvioimiseksi. Ensimmäisellä viikolla otettiin 3 ml yhdistettyä ESM + vanhaa ravintoalustaseosta. Tämä seosmäärä 15 ei riittänyt saamaan aikaan tarpeeksi ESM:aa alkion laadun arvioimiseksi. Jäljellä olevina viikkoina otettiin 2 ml - 3 ml SCV:tta ja säästettiin viljelyarviointiin. Tämä toimenpide saattoi hiukan muuttaa SCV:n suhdetta vanhaan ravintoalustaan, mutta tämän poikkeavuuden merkitsevyys pieneni, kun pullojen sisältöjen tilavuudet suurenivat ajan myötä.

20 Tulokset: Käsittelyt 1, 2 ja 3 pitivät SCV:n suhteen ravintoalustan kokonaistilavuuteen arvossa 1:5. Tämä on se suhde, joka on toiminut hyvin aikaisemmissa loblollymännyn ESM-eräviljelmissä. Käsittelyissä 4, 5 ja 6 lisättiin sellainen määrä tuoretta ravintoalustaa, joka on neljä kertaa SCV:n määrä ottamatta huomioon kokonaistilavuutta. Kuten on esitetty taulukossa 2, kaikissa 25 käsittelyissä, joissa lisättiin tuoretta LM-ravintoalustaa määränä, joka oli neljä kertaa arvioitu SCV, ylitettiin SCVdisääntymisravintoalustasuhde 1:5, jota käytettiin eräviljelmissä. Siitä huolimatta ESM kasvoi silti nopeammin näissä olosuhteissa jatkuvassa viljelmässä kuin silloin, kun sitä pidettiin yllä SCV: ko-konaisravintoalustasuhteena 1:5 eräviljelmässä.

30 Mitä tulee ESM:n laatuun huomattiin, että ESM:t stressaantuivat käsittelyssä 2 ja pienenivät loppuviikkojen aikana, kun taas käsittelyt 4 ja 5, joissa käytettiin paljon suurempaa tuoreen lisääntymisravintoalustan osuutta, sisälsivät yleensä alkioita, joiden laatu oli paljon parempi. ESM:n varhaisvaiheen alkion laatu oli jatkuvassa viljelyssä ylivoimainen verrattuna vastaavaan 35 pulloissa suoritetuissa eräviljelmissä; yleisesti, alkiot jatkuvassa viljelyssä olivat synkronisoituneempia sisältäen pienempiä, organisoituneempia päitä ja al-kioripustimia kuin eräviljelmässä olevat alkiot.

17

Mitä tulee ESM:n kasvuun erilaisissa viljelyolosuhteissa, taulukko 3 esittää sen ESM-tilavuuden, joka saatiin käsittelyistä 1 ja 5 kullekin genotyypille A, B ja C. Nämä laskut suoritettiin lisäämällä takaisin kunakin viikkona poistettu ESM-tilavuus ja käyttämällä havaittua kasvunopeutta kokonaistilavuuden 5 päättelemiseksi. Alkaen toisen viljelyviikon jälkeen käsittely 5 (jatkuvaviljelypul-lot) kasvoi paljon nopeammin kuin käsittely 1 (eräviljelmä) kaikkien kolmen genotyypin osalta.

Taulukko 3. Päätellyt asettuneet solutilavuudet (ml) käsittelyille 1 ja 5

Viikko 0__1__2__3__4__5__6_ A.1 10 16 35 67 127 292 380 A. 5 10 20__39__93__158 248 614 B. 1 10 15 29 48 97 165 329 B. 5 10__21__38__90__270__540__1 134 C. 1 10 13 18 27 35 42 42 C.5 10_|_13_|J6_[35_[_56_ 108 130

Genotyypeillä Aja B oli parempi varhaisvaiheen alkion laatu käsitte-10 lyissä 4 ja 5. Genotyyppi A stressaantui aluksi käsittelyissä 2 ja 3, kunnes viljelmät sopeutuivat viljelyolosuhteisiin. Myöhempinä viikkoina kumpikaan genotyyppi ei enää osoittanut stressaantumista, mutta alkiot olivat vähemmän syk-ronisoituneita käsittelyissä 2 ja 3 kuin ne olivat käsittelyissä 4 ja 5. Näitä yleensä nopeasti kasvavia genotyyppejä rajoittivat ehkä ravinteet käsittelyissä 2 ja 15 3.

Kaikissa genotyypeissä varhaisvaiheen alkiot tuntuivat olevan synk-ronisoituneimpia käsittelyissä 4 ja 5. Käsittelyssä 4 oletettiin, että SCV kahdentui viikoittain ja lisättiin riittävästi tuoretta ravintoalustaa niin, että suhde yksi osa SCV:tta neljään osaa tuoretta ravintoalustaa, säilyi. Sekä käsittely 4, jossa 20 SCV:n suhde 1:4 tuoreeseen LM-ravintoalustaan perustui arvioon SCV:sta, että käsittely 5, jossa SCV:n suhde 1:4 tuoreeseen LM-ravintoalustaan perustui todelliseen mittaukseen SCV:sta, tuottivat korkealaatuisia ESM:ja. Sen mukaisesti arviointi SCV:n kahdentumisesta kunakin viikkona ja riittävä tuoreen li-sääntymisravintoalustan lisääminen niin, että SCV:n suhde tuoreeseen lisään-25 tymisravintoalustaan säilyy arvossa 1:4, on suhteellisen suoraviivainen menetelmä loblollymäntyjen nestemäisten ESM-viljelmien kasvattamiseksi jatkuvassa viljelmässä.

18

Kaikki genotyypin A ESM:t, jotka ympättiin sekä jatkuvaviljelmäas-tiaan että pulloihin, tulivat samasta viljelmästä. Ensimmäisen viljelyviikon jälkeen ESM:t tuntuivat olevan samanlaisia sekä jatkuvaviljelmäastiassa että pulloissa. Viikkoon 2 ja 3 mennessä pulloissa olevat ESM:t tuntuivat olevan ter-5 veempiä kuin ESM:t jatkuvaviljelyastiassa. Viikkojen 4, 5 ja 6 aikana ESM:t jat-kuvaviljelyastiassa tuntuivat kuitenkin olevan ainakin yhtä terveitä kuin ESM:t pulloissa. Tämän kokeen tulokset osoittivat, että kahden tai kolmen viikon sopeutumisajan jälkeen jatkuvaviljelmäastioissa lisääntyneet loblollymännyn ESM:t olivat yhtä hyviä tai parempia kuin ne, jotka lisääntyivät pulloissa salo manlaisilla SCV-suhteilla tuoreeseen ravintoalustaan.

Esimerkki 2 Tässä esimerkissä kuvataan esillä olevan keksinnön edustava menetelmä loblollymännyn sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi.

Kudosviljelyperusravintoalustan koostumus on kuvattu taulukossa 4. 15 Ne modifikaatiot perusravintoalustan koostumukseen, joita tarvitaan kuhunkin ravintoalustaan, on lueteltu taulukossa 5. Kukin kudosviljelyravintoalusta valmistetaan sekoittamalla yhteen kaikki aineosat lukuunottamatta abskissihap-poa ja maltoosia (jos tarvitaan) ja täyttämällä ravintoalusta haluttuun tilavuuteen ennen autoklavoimista (15 minuuttia 121 °C:ssa, 15 psi:n paineessa). 20 Abskissihappo suodatinsteriloidaan ja lisätään aseptisesti steriiliin ravintoalustaan. L-glutamiini suodatinsteriloidaan myös ennen lisäystä ylläpitoravintoalus-taan. Ravintoalustoissa, joissa tarvitaan maltoosia, ravintoalusta täytetään 90 % tarvittavasta tilavuudesta. Maltoosin 10 x kantaliuos autoklavoidaan tai suodatinsteriloidaan ja lisätään autoklavoituun ravintoalustaan. Gelrite-tuotetta lisä-25 tään kiinteän LM-1-ravintoalustan valmistamiseksi. Kymmenen ml LM-1-ravintoalustaa kaadetaan 60 x 15 mm maljoille tai 20 ml LM-1-ravintoalustaa kaadetaan 100 x 25 mm maljoille.

Taulukko 4. Loblollymännyn perusviljelyravintoalusta (LM) 19

Perussuojat__mg/l__Perussuojat__mg/l_ NH4NO3__150__H3BO3_ 15,5_ KNO3__909,9__MnS04*H20__10J5_

Ca(N03)2»4H20__236,2__ZnS04»7H2Q__H4_

MgSQ4»7H20__246,5__NaMoQ4»2H20__0,125_

Mg(N03)2»6H20__256,5__CuSQ4»5H20__0,125_

MgCI2«6H20__50__CoCI2»6H20__0,125_ KH2PQ4__136__FeS04»7H2Q__27,85_

CaCI2»2H20__50__Na2EDTA__37,25_ _KI_ 4,15___

Orgaaniset lisäaineet__mg/l__Orgaaniset lisäaineet__mg/l_

Nikotiinihappo__015__Kasaminohapot__500_

Pyridoksiini*HCI__0J5__L-glutamiini*__vaihtelee

Tiamiini*HCI__1__Myo-inositoli__vaihtelee

Glysiini__2__Hiilihydraatti__vaihtelee _RH_|_5J___ *L-glutamiini suodatinsteriloidaan joidenkin genotyyppien lisääntymisravinto-alustaan.

Taulukko 5. Loblollymännyn ravintoalustojen formulaatiot 20 __LM-1 LM-2 LM-3__LM-4 LM-5 LM-6*

(Kaikki yksi- Vaihe I Vaihe II__Vaihe III _ Vaihe IV

köt ovat mg/l) Aloitus Lisäys Huuhtelu Kiinteä Nestemäinen Stratifiointi _____kehitys kehitys__ L-proliini__:__-__100__100__100__100_ L-asparagiini__-__100__100__100_ 100_ L-arginiini__-__-__50__50__50__50_ L-alaniini__:__:__20__20__20__20_ L-seriini__-__-__20__20__20__20_ L-glutamiini 250 1 000 1 000 1 000 1 000__1 000

Myo-inositoli 200 200 1 000 1 000 1 000__1 000

Maltoosi 30 000 30 000 25 000 25 000 25 000__25 000

Glukoosi__-__-__-__10 000 10 000__-_ PEG8000 __:__:__100 000 120 000__3_

Aktivoitu 1 250 - - 1 000 1 000 1 000 puuhiili________

Gelrite-tuote 1 600 1 600** -__2 500 __:_ 2,4-D__55 1,1__:__:__:_ BAP__7,5 0,1__;__-__:_

Kinetiini__7β__0J__:__:__;__:_ ABA_L_ ± 1,0*** 10_I 25 25_L_ *LM-6-stratifikaatioravintoalustassa on ainoastaan puolet FeS04*7H20:n (13,93 mg/l) ja Na2EDTA:n (18,83 mg/l) perusmäärästä.

**Gelrite-tuotetta ei lisätä nestemäiseen lisääntymisravintoalustaan.

5 ***ABA-yhdistettä lisätään genotyyppiin perustuen. Kaikkien ravintoalustojen pH säädetään 5,7:ään.

Alkioviljelmien aloitus: Kävyt kerätään, kun epäkypsät alkiot saavuttavat kehityksensä predome- tai dome-vaiheen. Kerääminen alkaa tavallisesti heinäkuun ensimmäisellä viikolla (noin 4 - 6 viikkoa hedelmöityksen jäl-10 keen) ja jatkuu, kunnes alkeissirkkalehdet ilmestyvät ensimmäisen kerran (heinäkuun puoliväli). Optimaalinen alkiovaihe aloitusta varten on silloin, kun apikaalinen kupu alkaa kehittyä.

21

Siemenet poistetaan kävyistä ja upotetaan 10 % Liquinox-liuokseen, joka sisältää muutaman tipan Tween 20 -detergenttiä, ja sekoitetaan 10 minuuttia. Sitten siemeniä huuhdellaan tislatulla vedellä 30 minuuttia. Siemeniä sekoitetaan 15% (tilavuus/tilavuus) H2C>2-liuoksessa 10 minuuttia. Sitten sie-5 menet pestään viisi kertaa sekoittamalla peräkkäin steriilin veden erissä la-minaarikaapissa.

Pintasteriloidut siemenet siirretään sitten petrimaljalle ja siemeniä tarkastellaan leikkausmikroskoopilla ja siemenkuori ja siemenaihesydämen kalvo poistetaan skalpellilla ja pinseteillä. Irrotettu naarasgametofyytti sijoite-10 taan LM-1-induktioravintoalustaan. Tämä irrotettu gametofyytti tulisi sijoittaa niin, että sen pituusakseli on samansuuntainen ravintoalustan pinnan kanssa ja niin, että siitereikä on kosketuksessa viljelyravintoalustan kanssa, mutta ei uponnut siihen. Maljat suljetaan kaksinkertaisella parafilmikerroksella ja viljelmiä inkuboidaan pimeässä 23 °C:ssa.

15 Kahden - kolmen viikon kuluttua tapahtuu somaattisten alkioiden ulostyöntyminen naarasgametofyytin siitereiän päästä. Näiden epäkypsien alkioiden päiden ympärille kehittyy limaista läpikuultavaa valkoista massaa (0,5 -10 mm). Tätä kutsutaan alkion alkioripustinmassaksi (ESM). Alkion alkioripus-tinmassa muodostuu kehityksen erilaisissa varhaisvaiheissa olevista alkiosta. 20 Kukin alkio sisältää alkion pään ja alkioripustinsysteemin.

Alkion alkioripustinmassojen lisääminen: Viisi - kuusi viikkoa irrotettujen naarasgametofyyttien asettamisesta LM-1-induktioravintoalustaan ESM:t erotetaan alkuperäisistä eksplanteista ja siirretään kiinteälle lisääntymis-ravintoalustalle (LM-2). ESM-viljelmät lisääntyvät luonnollisella havupuuntyyp-25 pisellä vakoutuvalla monialkioisuussysteemillä. ESM-viljelmiä nuorennetaan joka toinen viikko tuoreeseen ravintoalustaan ja inkuboidaan pimeässä 23 °C:ssa. ESM-viljelmät jaetaan kahteen osaan, kun ne ovat tulleet 1 cm pituisiksi ja kaikkia paloja pidetään yllä, kunnes on useita sellaisia, joita voidaan käyttää suspensioviljelmän aloittamiseksi.

30 Nestemäisten lisääntymisviljelmien pystytys: Yksi - kaksi gram maa (märkäpaino) ESM:aa (neljä tai viisi 1 cm palaa) siirretään 250 ml Erlen-meyer-pulloon, joka sisältää 20 ml nestemäistä LM-2-ravintoalustaa. Pullo sijoitetaan pyörittävälle ravistelijalle (90-110 kierrosta minuutissa) pimeään 23 °C:seen. Viikon kuluttua mitataan asettunut solutilavuus (SCV) ja jos SCV 35 on pienempi kuin 3 ml, pullo palautetaan ravistetaan lisäämättä ravintoalustaa tai tekemättä siihen muutoksia. Jos SCV on ainakin 5 ml, pulloon lisätään 25 ml tuoretta ravintoalustaa palauttaen pullo ravistelijaan.

22

Toisen viikon jälkeen viljelmien annetaan asettua 15 minuuttia vinossa pullopitimessä. Jos pulloon ei oltu lisätty ravintoalustaa viikkoa aiemmin, otetaan 10 ml käytettyä ravintoalustaa ja se korvataan 10 ml tuoretta ravinto-alustaa. Jos edellisellä viikolla pulloon oli lisätty ravintoalustaa ja viljelmä tun-5 tuu kasvavan voimakkaasti, viljelmää käsitellään seuraavasti. Kun viljelmät ovat vakiintuneet riittävästi tuottamaan 10 ml tai enemmän asettuneita soluja viikossa, ESM siirretään jatkuvaviljelyastiaan ja lisätään ravintoalustaa sellainen tilavuus, että ESM:n suhde tuoreeseen lisääntymisravintoalustaan on 1:4. Jatkuvaa viljelmää suurennetaan lisäämällä viikoittain tuoretta nestemäistä 10 LM-2-ravintoalustaa ilman jatkoviljelyä. Astian annetaan asettua 15 minuuttia, ESM:n tilavuus arvioidaan ja lisätään tuoretta ravintoalustaa niin, että solujen suhde tuoreeseen ravintoalustaan (tilavuus/tilavuus) on 1:4. Vanha ravinto-alusta jätetään viljelyastiaan eikä sitä oteta huomioon tilavuuslaskussa. Tässä vaiheessa olevia viljelmiä voidaan lisätä jatkuvasti, säilyttää jäädytettynä tai ne 15 voidaan singuloida ja kehittää idätystä varten.

Alkion kehittäminen: Alkion kehittäminen suoritetaan käyttäen nestemäistä kehitysravintoalustaa LM-5, joka liotetaan Concert 10 % CC -alustojen kaksoiskerrokseen petrimaljalla tai Cambro-laatikossa. Viljelmien annetaan asettua sen jälkeen, kun niitä on viljelty ylläpitoravintoalustassa, ja super-20 natantti imetään pois. Asettunut solutilavuus mitataan pipetillä Cytostir-astiaan siirron aikana. Asettuneille soluille lisätään kyseistä solutilavuutta vastaava tilavuus huuhteluravintoalustaa (LM-3). LM-3-ravintoalustassa olevia soluja pyöritetään Cytostir-astiassa ja niiden annetaan asettua vielä 10 minuuttia. Poistetaan puolet supernatantista ja jäljelle jäänyt ESM siirretään Cytostir-astiaan. 25 Soluja sekoitetaan sekoituslevyllä.

ESM pipetoidaan suodatinpaperille, joka on sijoitettu nestemäisellä ravintoalustalla liotetulle alustalle. Standardia 2” x 2” -alustaa kohti käytetään 0,75 ml ESM-seosta. Maljat suljetaan kahdella parafilmikerroksella ja niitä in-kuboidaan pimeässä 23 °C:ssa. Noin 12 viikon kuluttua ESM-viljelmät tuottavat 30 sirkkalehtisiä alkioita.

Stratifikaatio: Stratifikaatio on menetelmä, jossa alkiot sijoitetaan kylmään kosteaan ympäristöön useiksi viikoiksi, jonka ajatellaan simuloivan talvea.

23

Valmistetaan maljat, jotka sisältävät yhden kerroksen alustamate-riaalia (2” x 2” 10 % CC tai isomman palan, joka sopii Cambro-laatikoihin). Noin 18 -19 ml nestemäistä LM-6-ravintoalustaa lisätään per 2” x 2” -alustaa (enemmän laatikoissa oleviin). Suodatinpaperi, joka sisältää loblollymännyn 5 alkioita, siirretään kehitysmaljoilta stratifikaatioravintoalustamaljoille. Vaihtoehtoisesti, kehitysravintoalustasta voidaan valita tsygootinkaltaisia sirkkalehtisiä alkioita ja sijoittaa ne uusille suodatinpapereille stratifikaatioravintoalustalla. Maljat suljetaan parafilmillä ja sijoitetaan pimeään 2-6 °C:seen neljäksi viikoksi.

Somaattisten alkioiden sopeuttaminen: Stratifikaation lisäksi kelo hityksen jälkeinen sopeuttaminen, jossa alkiot altistetaan korkean suhteellisen kosteuden (RH) sisältävään ympäristöön, parantaa itämistä. Korkean RH:n sisältävä ympäristö saadaan aikaan lisäämällä steriiliä vettä Cambro-puoli-laatikkoon. Stratifikaation jälkeen alkiot singuloidaan ja ne sijoitetaan kuiville suodatinpapereille suureen petrimaljaan. Tämä avoin malja sijoitetaan Cambro-15 puolilaatikkoon, joka sisältää steriiliä vettä. Alkioita altistetaan tälle korkean RH:n sisältävälle ympäristölle, kunnes alkioiden kosteuspitoisuus saavuttaa arvon 60 - 65 %. Laatikot suljetaan niin, että tiivisteet sulkeutuvat tiiviisti ja ne suljetaan nipistimillä ennen sijoittamista pimeään kolmeksi viikoksi 23 °C:ssa. Sopeuttamisen jälkeen kypsät somaattiset alkiot poistetaan laatikoista ja ne 20 voidaan muuttaa tuotetuiksi siemeniksi myöhempää idätystä ja taimen muodostusta varten tai ne voidaan idättää suoraan.

Esimerkki 3 Tämä esimerkki kuvaa esillä olevan keksinnön edustavan menetelmän douglasinkuusen (Pseudotsuga menziesii) sirkkalehtisten somaattisten 25 alkioiden tuottamiseksi.

Perusravintoalustan koostumus on lueteltu taulukossa 6. Ne perus-ravintoalustan modifikaatiot, joita tarvitaan kussakin viljelyravintoalustassa, on lueteltu taulukossa 7. Stratifikaatioalustan koostumus on kuvattu taulukossa 8. Konsentraatioyksiköt taulukoissa 6, 7 ja 8 ovat milligrammoja per litra (mg/l). 30 Nämä ravintoalustat valmistetaan sekoittamalla yhteen kaikki aineosat lukuunottamatta abskissihappoa (ABA), gibberilliinihappoa (GA) ja maltoosia (jos tarvitaan), ja täyttämällä ravintoalusta haluttuun tilavuuteen ennen autoklavoimis-ta 15 minuuttia 121 °C:ssa 15 psi:ssa. ABA ja GA 4/7 suodatinsteriloidaan ja lisätään aseptisesti steriiliin ravintoalustaan. Jos ravintoalustassa tarvitaan 24 maltoosia, ravintoalusta täytetään ensin 90 % tarvittavasta tilavuudesta ja auto-klavoituun ravintoalustaan lisätään steriiliä maltoosin 10 x kantaliuosta. Gelrite-tuotetta lisätään kiinteiden DM-1-maljojen valmistamiseksi ja kudosviljelyagaria (TC) kiinteiden DM-2-maljojen valmistamiseksi. Kymmenen ml DM-1- tai DM-2-5 ravintoalustaa lisätään 60 x 15 mm maljoille tai 20 ml DM-1- tai DM-2-ravinto-alustaa lisätään 100 x 25 mm maljoille.

Taulukko 6. Douglasinkuusen perusviljelyravintoalusta (DM)

Perussuojat__mg/l__Orgaaniset lisäaineet mg/l_ KN03 vaihtelee Myo-inositoli vaihtelee

CaCI2*2H20 200 Tiamiini*HCI 1

Ca(N03)2*4H20 vaihtelee Nikotiinihappo 0,5 KH2P04 340 Pyridoksiini*HCI 0,5

MgS04*7H20 400 Glysiini 2

MnS04*H20 15,8 L-glutamiini vaihtelee

ZnS04*7H20 8 Kasaminohapot 500

CuS04*5H20 0,024 Sakkaroosi tai maltoosi vaihtelee

FeS04*7H20 27,85

Na2EDTA 37,25 pH 5,7 H3BO3 5

NaMo04*2H20 0,2

CoCI2*6H20 0,02

Kl _|j___

Taulukko 7. Douglasinkuusen ravintoalustan formulaatiot 25 DM-1__DM-2__DM-3__DM-4

Vaihe I Vaihe II Vaihe III Vaihe IV

__Aloitus__Lisääminen Singulaatio__Kehitys KN03 1 250(1) 1 250 1 050 2 500

Ca(N03)2‘4H20 - 200

Myo-inositoli 1 000 5 000 100 100 L-glutamiini__450__1 000__1 000__750_

Aminohapposeos (2)__:__-__:__290_

Sakkaroosi__15 000_____

Maltoosi___30 000 20 000__25 000 PEG8000 - - - 190 000 2,4-D 110 1,1 N6-bentsyyli-adeniini (BAP) 45 0,22

Kinetiini 43 0,22

Abskissihappo - - 10/5/5 10

Gibberelliinihappo ... 7,5

Aktivoitu puuhiili 2 500 - - 1 000

Kudosviljelyagar - 5 000(3)

Gelrite-tuote__1 800__:__:__:___ (1) Kaikki yksiköt ovat mg/l (tai ppm).

(2) L-proliini -100, L-asparagiini -100, L-arginiini - 50, L-alaniini - 20, L-seriini - 20.

5 (3) Kudosviljelyagaria ei käytetä nestemäisten ravintoalustojen kanssa.

Kaikkien ravintoalustojen pH säädetään 5,7:ään.

Taulukko 8. Stratifikaatioravintoalusta (SM) 26

Perussuojat__mg/l__Orgaaniset lisäaineet mg/l_ NH4NO3 206,3 Myo-inositoli 100 KNO3 1170 Tiamiini*HCI 1

CaCI2*2H20 220 Nikotiinihappo 0,5

Ca(N03)2*4H20 ei yhtään Pyridoksiini*HCI 0,5 KH2P04 85 Glysiini 2

MgS04'7H20 185 Kasaminohapot ei yhtään

MnS04*H20 8,45 Sakkaroosi 20 000

ZnS04*7H20 4,3

CuS04*5H20 0,013 Aktivoitu puuhiili 2 500

FeS04*7H20 13,93

Na2EDTA 18,63 H3BO3 3,1 pH 5,7

NaMo04*2H20 0,125

CoCI2*6H20 0,013 _KI_ 0,42___

Alkioviljelmien aloitus: Kävyt kerätään, kun epäkypsät alkiot saavuttavat kehityksensä predome- tai dome-vaiheen. Kerääminen alkaa tavallisesti heinäkuun ensimmäisellä viikolla (noin 4-6 viikkoa hedelmöityksen jäl-5 keen) ja jatkuu, kunnes alkeissirkkalehdet ilmestyvät ensimmäisen kerran (heinäkuun puoliväli). Optimaalinen alkiovaihe aloitusta varten on silloin, kun apikaalinen kupu alkaa kehittyä, mutta ennen sirkkalehtien muodostumista.

Siemenet poistetaan kävyistä ja upotetaan 10 % Liquinox-liuokseen, joka sisältää muutaman tipan Tween 20 -detergenttiä, ja sekoitetaan 10 mi-10 nuuttia. Sitten siemeniä huuhdellaan tislatulla vedellä 30 minuuttia. Siemeniä sekoitetaan 20% (tilavuus/tilavuus) H202-liuoksessa 10 minuuttia. Sitten siemenet pestään viisi kertaa sekoittamalla peräkkäisissä steriilin veden erissä laminaarikaapissa.

Pintasteriloidut siemenet siirretään sitten petrimaljalle ja siemeniä 15 tarkastellaan leikkausmikroskoopilla ja alkiot leikataan niin, että ne jäävät kiinni naarasgametofyyttiin. Nämä leikatut naarasgametofyytit sijoitetaan DM-1-indukt-ioravintoalustaan niin, että alkiot koskettavat ravintoalustaa. Maljat suljetaan kaksinkertaisella parafilmikerroksella ja viljelmiä inkuboidaan pimeässä 23 °C:ssa.

27

Viiden - yhdeksän viikon kuluttua tapahtuu somaattisten alkioiden ulostyöntyminen naarasgametofyytin siitereiän päästä. Näiden epäkypsien alkioiden päiden ympärille kehittyy limaista läpikuultavaa valkoista massaa (0,5 -10 mm). Tätä kutsutaan alkion alkioripustinmassaksi (ESM). Alkion al-5 kioripustinmassa muodostuu kehityksen erilaisissa varhaisvaiheissa olevista alkiosta. Kukin alkio sisältää alkion pään ja alkioripustinsysteemin.

Alkion alkioripustinmassojen lisääminen: ESM erotetaan alkuperäisistä eksplanteista ja siirretään kiinteälle lisääntymisravintoalustalle (DM-2). ESM-viljelmät lisääntyvät luonnollisella havupuuntyyppisellä vakoutuvalla mo-10 nialkiosysteemillä. ESM-viljelmiä nuorennetaan joka toinen viikko tuoreeseen ravintoalustaan ja inkuboidaan pimeässä 23 °C:ssa. ESM-viljelmät jaetaan kahteen osaan, kun ne ovat tulleet 1 cm pituisiksi ja kaikkia paloja pidetään yllä, kunnes on useita sellaisia, joita voidaan käyttää suspensioviljelmän aloittamiseksi.

15 Nestemäisten lisääntymisviljelmien pystytys: Yksi-kaksi gram maa (märkäpaino) ESM:aa (neljä tai viisi 1 cm palaa) siirretään 250 ml Erlen-meyer-pulloon, joka sisältää 20 ml nestemäistä DM-2-ravintoalustaa. Pullo sijoitetaan pyörittävälle ravistelijalle (90-110 kierrosta minuutissa) pimeään 23 °C:seen. Viikon kuluttua pulloon lisätään 25 ml tuoretta ravintoalustaa pa-20 lauttaen pullo ravistelijaan.

Toisen viikon jälkeen viljelmien annetaan asettua 15 minuuttia vinossa pullopitimessä. Supernatantti (käytetty ravintoalusta) poistetaan imemällä pipetillä ja asettuneen solutilavuuden (SCV) mittaamiseksi käytetään 5 ml pipettiä, jonka kärki on katkaistu. Jos SCV on 2 - 4 ml, SCV palautetaan pul-25 loon ja lisätään ravintoalustaa niin, että saadaan aikaan sellainen solujen suhde ravintoalustaan (tilavuus/tilavuus), joka on 1:9. Jos SCV on 5 ml tai suurempi, viljelmää käsitellään seuraavasti. Kun viljelmät ovat vakiintuneet riittävästi tuottamaan 5 ml tai enemmän asettuneita soluja viikossa, ESM siirretään jatkuvaviljelyastiaan ja lisätään ravintoalustaa sellainen tilavuus, että ESM:n 30 suhde tuoreeseen lisääntymisravintoalustaan on 1:9. Jatkuvaan viljelmään lisätään viikoittain tuoretta nestemäistä DM-2-ravintoalustaa ilman jatkoviljelyä. Astian annetaan asettua 15 minuuttia, ESM:n tilavuus arvioidaan ja lisätään tuoretta ravintoalustaa niin, että solujen suhde tuoreeseen ravintoalustaan (tilavuus/ tilavuus) on 1:9. Vanha ravintoalusta jätetään viljelyastiaan eikä sitä 35 oteta huomioon tilavuuslaskussa. Tässä vaiheessa olevia viljelmiä voidaan lisätä jatkuvasti, säilyttää jäädytettynä tai ne voidaan singuloida ja kehittää idätystä varten.

28

Somaattisen alkion singulaatio: Abskissihappo (ABA) on tärkeä sirkkalehtisen alkion kehittymiselle, koska se inhiboi vakoutuvaa monialkiosys-teemiä ja sallii alkion singuloitumisen ja alkion lisäkehittymisen. ESM-sus-pensioviijelmät siirretään nestemäiseen DM-3-ravintoalustaan, joka sisältää 5 10,0 mg/l ABA:oa. Yhden viikon kuluttua viljelmät nuorennetaan jälleen DM-3- ravintoalustaan, joka sisältää 5,0 mg/l ABA:oa. Lisäviikon jälkeen viljelmät nuorennetaan jälleen DM-3-ravintoalustaan, joka sisältää 5,0 mg/l ABA:oa.

Alkion kehittäminen: Alkion kehittäminen suoritetaan käyttäen nestemäistä kehitysravintoalustaa DM-4, joka liotetaan Concert 10 % CC -alus-10 tan kaksoiskerrokseen petrimaljalla tai Cambro-laatikossa. 2” x 2” -alustaan kuluu 15-16 ml ravintoalustaa per alustaa. Viljelmien annetaan asettua sen jälkeen, kun niitä on viljelty singulaatioravintoalustassa, ja supernatantti imetään pois. Asettunut solutilavuus mitataan pipetillä Cytostir-astiaan siirron aikana. Cytostir-astiaan lisätään puolta asettunutta solutilavuutta vastaava tila-15 vuus säästettyä supernatanttia ja sitten viljelmää sekoitetaan sekoituslevyllä. Sitten 0,75 ml asettunutta ESM-seosta (noin 100 mg ESM:aa) pipetoidaan suodatinpaperille, joka sijoitetaan DM-4-ravintoalustassa liotetuille alustoille. Maljat suljetaan kahdella parafilmikerroksella ja niitä inkuboidaan pimeässä 23 °C:ssa. Noin 7 - 8 viikon kuluttua ESM-viljelmät tuottavat sirkkalehtisiä alki-20 oita.

Stratifikaatio: Stratifikaatio on menetelmä, jossa alkiot sijoitetaan kylmään kosteaan ympäristöön useiksi viikoiksi, jonka ajatellaan simuloivan talvea.

Valmistetaan maljat, jotka sisältävät yhden kerroksen alustamate-25 riaalia (2” x 2” 10 % CC tai isomman palan, joka sopii Cambro-laatikoihin). Noin 18-19 ml nestemäistä ESM-ravintoalustaa lisätään per 2” x 2” -alustaa (enemmän laatikoissa oleviin). Suodatinpaperi, joka sisältää douglasinkuusen alkioita, siirretään kehitysmaljoilta stratifikaatioravintoalustoille. Maljat suljetaan parafilmillä ja sijoitetaan pimeään 2 - 6 °C:seen neljäksi viikoksi. Stratifikaation 30 jälkeen kypsät somaattiset alkiot poistetaan maljoilta ja ne voidaan muuttaa tuotetuiksi siemeniksi myöhempää idätystä ja taimen muodostusta varten tai ne voidaan idättää suoraan.

Samalla, kun keksinnön edullinen suoritusmuoto on esitetty ja kuvattu tulee ymmärtää, että siihen voidaan tehdä erilaisia muutoksia poistumat-35 ta keksinnön hengestä ja piiristä.

Claims (8)

1. Menetelmä havupuun embryogeenisen solukon lisäämiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheen, jossa viljellään jatkuvasti havupuun 5 embryogeenistä solukkoa nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa viljelyas-tiassa vähintään kahden viikon - kuuden kuukauden aika, jolloin jatkuva viljely suoritetaan lisäämällä ajoittain peräkkäisinä lisäyksinä tuoreen nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus nestemäiseen lisääntymisravintoalustaan viljelyastiassa, jolloin havupuun embryogeenisen solukon tilavuuden suhde vil- 10 jelyastiassa viljelyastiaan lisätyn tuoreen lisääntymisravintoalustan tilavuuteen on noin 1:2-noin 1:5, ja jolloin viljelyastiaan ajoittain lisätyn nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus lisää kumulatiivisesti nestemäisen lisääntymisravintoalustan kokonaistilavuutta viljelyastiassa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 15 että embryogeeninen solukko koostuu oleellisesti alkion alkioripustinmassoista.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että embryogeeninen solukko on loblollymännyn embryogeenistä solukkoa.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että embryogeeninen solukko on douglasinkuusen embryogeenistä solukkoa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuoretta lisääntymisravintoalustaa lisätään kerran viikossa viljeltävään em-bryogeeniseen kudokseen.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että tuoretta lisääntymisravintoalustaa lisätään kerran viikossa viljeltävään 25 embryogeeniseen kudokseen 2 -10 viikon ajan.

7. Menetelmä douglasinkuusen sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) viljellään douglasinkuusen tsygoottisia alkioita aloitusravintoalus-tassa tai aloitusravintoalustalla aika, joka riittää alkion alkioripustinmassojen 30 tuottamiseksi; (b) viljellään jatkuvasti alkion alkioripustinmassoja nestemäisessä lisääntymisravintoalustassa vähintään kahden viikon - kuuden kuukauden aika, jolloin jatkuva viljely suoritetaan lisäämällä ajoittain peräkkäisinä lisäyksinä tuoreen nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus nestemäiseen lisään- 35 tymisravintoalustaan viljelyastiassa, jolloin douglasinkuusen alkioripustinmassojen tilavuuden suhde viljelyastiassa viljelyastiaan lisätyn tuoreen lisääntymis- ravintoalustan tilavuuteen on noin 1:9, ja jolloin viljelyastiaan ajoittain lisätyn nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus lisää kumulatiivisesti nestemäisen lisääntymisravintoalustan kokonaistilavuutta viljelyastiassa; ja (c) viljellään lisääntyneitä alkion alkioripustinmassoja kehitysravinto-5 alustassa tai kehitysravintoalustalla aika, joka riittää douglasinkuusen sirkka-lehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi alkion alkioripustinmassoista.

8. Menetelmä loblollymännyn sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (a) viljellään loblollymännyn tsygoottisia alkioita aloitusravintoalus-10 tässä tai aloitusravintoalustalla aika, joka riittää alkion alkioripustinmassojen tuottamiseksi; (b) viljellään jatkuvasti alkion alkioripustinmassoja nestemäisessä li-sääntymisravintoalustassa vähintään kahden viikon - kuuden kuukauden aika, jolloin jatkuva viljely suoritetaan lisäämällä ajoittain peräkkäisinä lisäyksinä tuo- 15 reen nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus nestemäiseen lisään-tymisravintoalustaan viljelyastiassa, jolloin loblollymännyn alkioripustinmassojen tilavuuden suhde viljelyastiassa viljelyastiaan lisätyn tuoreen lisääntymisravintoalustan tilavuuteen on noin 1:4, ja jolloin viljelyastiaan ajoittain lisätyn nestemäisen lisääntymisravintoalustan lisätilavuus lisää kumulatiivisesti nestemäi-20 sen lisääntymisravintoalustan kokonaistilavuutta viljelyastiassa; ja (c) viljellään lisääntyneitä alkion alkioripustinmassoja kehitysravinto-alustassa tai kehitysravintoalustalla aika, joka riittää loblollymännyn sirkkalehtisten somaattisten alkioiden tuottamiseksi alkion alkioripustinmassoista.