CN1823581A - 针叶树胚胎发生组织的连续培养 - Google Patents
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Abstract
本发明提供针叶树胚胎发生组织的增殖方法。本发明方法分别包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织的时间段足以使胚胎发生组织增殖的步骤。
Description
参考相关申请
本申请要求于2004年2月25日提交的美国临时申请No.60/547,475的优先权。
发明领域
本发明涉及体外生产植物胚胎，以及任选从植物胚胎中生产植物的方法。
发明背景
以针叶树(例如，松树和枞树)制造木材制品的需求不断增长。建议针对此问题的一个解决方案是识别单个树木，其具有理想特征，诸如生长快速，并且通过体细胞克隆生产众多遗传上相同的质优树木的无性系。体细胞克隆是从没有合子的植物细胞中体外生产植物胚胎的方法。这些克隆可被培育成具有理想特征的一片针叶树或整个林子。
用于体细胞克隆针叶树的一个方法是，在促进处理的组织形成针叶树体细胞胚，然后是全植株的条件下，体外处理分离的活的针叶树组织。分离的针叶树组织可在一种或多种auxin和/或细胞分裂素存在下培养，以促进形成和增殖胚胎发生组织，接着在促进形成子叶针叶树胚胎的条件被培养。然后，胚胎发芽生成针叶树。针叶树胚胎发生组织的例子为通过体外组织培养可从切自针叶树种籽的胚胎中形成的胚胎囊柄团(embryonal suspensor masses)(ESMs)。以示例方式，图1示出液体培养物中的松树胚胎囊柄团。图2示出形成白ESM的子叶松树体细胞胚(子叶在胚胎的圆顶是可见的)。
然而，一直困扰的问题是刺激有效形成能够以高效发芽生成针叶树植株的子叶针叶树体细胞胚。优选地，在针叶树同样物种的种籽中，体外形成的子叶针叶树体细胞胚在形态学，解剖学和生化学上相似或相同于体内形成的合子针叶树胚胎。具体而言，需要比现有技术方法生产的量更大的合子样子叶针叶树体细胞胚的体外生产方法。优选地，由新方法生产的子叶针叶树体细胞胚的发芽率和质量应高于现有技术方法。
发明概述
如上所述，本发明提供了体外增殖针叶树胚胎组织的方法。本发明方法分别包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够长的时间段使胚胎发生组织增殖的步骤。
本发明方法在例如，体外增殖针叶树胚胎发生组织中是有用的。增殖的胚胎发生组织可进一步培养以生产可发芽和长成针叶树树木的针叶树子叶体细胞胚。因此，本发明方法利于生产具有所需属性(例如，生长率增加)的针叶树树木，从而有助于满足木材和木材制品的需求。
附图简述
本发明的前述方面和伴随的许多优点参照下列详述并结合附图将变得更容易理解，其中：
图1示出液体培养物中的松树胚胎囊柄团；以及
图2示出形成自ESM的子叶松树体细胞胚(子叶在胚胎圆顶是可见的)。
优选实施方案详述
如本发明所用的术语“子叶胚胎”表示具有一个或多个子叶的胚胎。
如本发明所用的术语“体细胞胚”是指自不是合子的植物细胞体外发育的植物胚胎。
如本发明所用的术语“胚胎发生组织”是指任何衍生自针叶树的组织，在用本发明方法处理后能够生产一个或多个子叶针叶树体细胞胚。因此，术语“胚胎发生组织”包括例如，针叶树胚胎囊柄团。
如本发明所用的术语“增殖培养基”是指液体培养基，其可促进针叶树胚胎发生组织在增殖培养基中培养时的增殖。
如本发明所用的术语“连续培养”及其意思上的等同物适用于针叶树胚胎发生组织的培养，表示在液体增殖培养基中通过周期性(至少一次)向培养物中添加额外的增殖培养基而无需移出原始增殖培养基来培养针叶树胚胎发生组织。因此，例如，针叶树胚胎发生组织可培养在体积为50mL的增殖培养基中一周，然后向原始体积的增殖培养基中另加入体积为50mL的增殖培养基，从而胚胎发生组织进一步培养在100mL的增殖培养基中。在连续培养针叶树胚胎发生组织的实践中，为了评价培养参数(例如，生长率和组织质量)，需取出少量培养组织。
除非另有所指，所有浓度值以重量/体积百分比表示。
本发明提供用于体外增殖针叶树胚胎发生组织的方法。本发明方法分别包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够长的时间段以使胚胎发生组织增殖的步骤。本发明方法可用于增殖从任何针叶树物种获得的针叶树胚胎发生组织，所述针叶树物种诸如松科树的成员，包括Pinus属的成员(例如，火炬松(Pinus taeda))，或诸如Pseudotsuga属的成员(例如，花旗松(Pseudotsuga menziesii))。
本发明的连续培养方法是对现有技术所教导的“分批”培养方法的改进。在分批培养方法中，针叶树胚胎发生组织在液体增殖培养基中培养一段时间，从增殖培养基分离出胚胎发生组织(例如，让胚胎发生组织从培养基中沉降出来)，接着胚胎发生组织的等份试样取出并转入分开体积的新鲜增殖培养基中用于进一步培养。每当需要生成多重容器时，就重复此方法，所述容器各自包括分开批次的胚胎发生组织培养物。采用连续培养比分批培养具有若干优点：例如，在分批培养中胚胎发生组织必须周期性地传代培养至新的生长容器中，而连续培养通常只需相对较少的劳力；以及胚胎发生组织在连续培养中一般比在分批培养方法的批次之间发生的培养变异性较少。
在实施本发明中有用的胚胎发生组织的例子为胚胎囊柄团(ESMs)。ESMs可从针叶树种籽中取出的前子叶胚胎制备。种籽通常被表面灭菌后，再取出前子叶胚胎，然后在起始培养基之上或之中培养，所述培养基允许形成ESMs，其包括在通过发芽和分裂而增殖的过程中的早期胚胎。如果需要，培养基可包括刺激早期胚胎增殖的激素。培养基中所含激素的例子有auxins(例如，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如，6-苄氨基嘌呤(BAP))。Auxins可用的浓度例如从1mg/L到200mg/L。细胞分裂素可用的浓度例如从0.1mg/L到50mg/L。对培养火炬松前子叶胚胎以诱导形成ESMs有用的培养基的例子为本发明实施例2中所述的LM1培养基。对培养花旗松前子叶胚胎以诱导形成ESMs有用的培养基的例子为本发明实施例3中所述的DM1培养基。
增殖培养基的配制促进针叶树胚胎发生组织，诸如胚胎囊柄团的生长和增殖。增殖培养基可被搅拌以促进胚胎发生组织的生长和增殖。增殖培养基的同渗重摩一般为180-400mM/kg。增殖培养基含有的营养物维持胚胎发生组织，并且包括促进胚胎发生组织的细胞分裂和生长的激素，诸如一种或多种auxins和/或细胞分裂素。
在增殖培养基中，一般需要，虽不是必要的，包括麦芽糖作为唯一或主要的可代谢糖源。有用麦芽糖浓度的例子范围为约2.5％至约6.0％。合适的火炬松液体增殖培养基的例子为入本发明实施例2所述的LM2培养基(无胶凝剂)。合适的花旗松增殖培养基的例子为入本发明实施例3所述的DM2培养基。针叶树胚胎发生组织通常培养在增殖培养基中(例如，多达6个月的时间段)，周期性(例如，每周一次)加入更多的增殖培养基，培养的合适温度诸如从10-30℃，或诸如从15-25℃，或诸如从20-23℃。
在本发明方法的有些实施方案中，针叶树胚胎组织的体积与周期性加入到胚胎发生组织的连续培养物中的新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶2到约1∶5；在本发明方法的有些实施方案中，针叶树胚胎组织的体积与周期性加入到胚胎发生组织的连续培养物中的新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶3到约1∶5；以及在本发明方法的有些实施方案中，针叶树胚胎组织的体积与周期性加入到胚胎发生组织的连续培养物中的新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶4到约1∶5。上下文中所用的术语“约”包括比率的确切范围(例如，范围“约1∶4到约1∶5”包括范围1∶4到1∶5)。
针叶树胚胎发生组织的体积的测量可将培养容器在室温(通常为20-25℃)下置于水平面(例如，实验台)上30分钟。组织沉降到培养容器的底部，测量沉降组织的体积(例如，通过向上抽取沉降的组织到校准吸管中，或通过观察沉降组织相对于培养容器上的体积校准标记的水平而进行测量)。以此方式测量的组织体积称为沉降的细胞体积(缩写成SCV)。
以代表性例子方式，将沉降细胞体积10mL的针叶树胚胎囊柄团在起始体积为40mL的增殖培养基中培养一周。ESMs增殖，并且在第二周开始时有20mL的沉降细胞体积。在第二周开始时，向起始体积的增殖培养基中另加入40-100mL体积的增殖培养基，并使ESMs进一步培养在其中。
虽然不希望受任何理论的束缚，本发明人假设，在培养过程中由针叶树胚胎发生组织生产的促生长的化学物质与周期性添加新鲜增殖培养基的组合促进了针叶树胚胎发生组织的增殖。本发明人假设，在分批培养中，当胚胎发生组织周期性传代培养到分开批次的新鲜增殖培养基中时，促生长化学物质基本上被去除或稀释。
在有些实施方案中，本发明提供用于生产花旗松子叶体细胞胚或火炬松子叶体细胞胚的方法，其中这些方法各自包括下列步骤：(a)在起始培养基之上或之中培养花旗松合子胚胎或火炬松合子胚胎足够的时间段以生产胚胎囊柄团；(b)在液体增殖培养基中连续培养胚胎囊柄团足够的时间段以使胚胎囊柄团增殖；以及(c)在发育培养基之中或之上培养增殖的胚胎囊柄团足够的时间段以从胚胎囊柄团中生产花旗松或火炬松子叶体细胞胚。
起始培养基通常包括无机盐和有机营养物质。起始培养基的同渗重摩一般为约160mM/kg或甚至更低，但也可高至170mM/kg。起始培养基通常包括生长激素。起始培养基中所包含的激素的例子有auxins(例如，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如，6-苄氨基嘌呤(BAP))。Auxins可用的浓度例如从1mg/L到200mg/L。细胞分裂素可用的浓度例如从0.1mg/L到50mg/L。
起始培养基可能含有吸附剂成份，尤其是当使用很高水平的生长激素时。吸附剂可以是在实施本发明方法中所用的浓度下对胚胎发生细胞没有毒性，并且能够吸收促生长激素的任何成分以及在前子叶胚胎发育过程中由植物细胞生产的存在于培养基中的毒性化合物。有用的吸附剂成分的非限制性例子包括活性碳，可溶性聚乙烯吡咯烷酮，不溶性聚乙烯吡咯烷酮，活性氧化铝，和硅胶。吸附剂成分的存在量例如从约0.1g/L到约5g/L。火炬松起始培养基的例子为本发明实施例2中所述的LM1培养基。花旗松起始培养基的例子为本发明实施例3中所述的DM1培养基。
针叶体细胞通常培养在起始培养基之中或之上6-12周的时间段，诸如8-10周，或诸如约8周，培养的温度从10-30℃，或诸如从15-25℃，或诸如从20-23℃。
将胚胎发生组织从起始培养基转移到增殖培养基中。在实施本发明中有用的代表性增殖培养基的组成和属性如上所述。
接着，将胚胎发生组织从增殖培养基转移至发育培养基，所述发育培养基配制以促进针叶树胚胎发生组织发育成子叶针叶树体细胞胚。发育培养基可以是固体培养基(通过将胶凝剂溶解于液体发育培养基中而固化)或液体培养基。当使用液体发育培养基时，胚胎发生组织可以完全浸没在培养基中，在胚胎发生组织培养于其中的时间过程中，这可加以搅拌。吸附垫托物(例如，制自纤维素的垫，或其他某个吸附水溶液的材料，诸如发育培养基)浸泡在液体发育培养基中，而针叶树体细胞胚置于浸透的垫上并且与发育培养基接触。
当使用固体培养基时，胚胎发生组织可置于发育培养基的表面，并且能部分渗透固体培养基的表面。因此，固体发育培养基包括有部分固化并且使胚胎发生组织基本上渗透入培养基体内的培养基，还包括完全固化的培养基，其不允许胚胎发生组织渗透固化培养基体内。液体培养基在加入适量的胶凝剂，诸如琼脂后被完全或部分固化。
发育培养基含有维持胚胎发生组织的营养物。麦芽糖可包含在培养基中作为胚胎发生组织的主要或唯一的可代谢糖源。有用的麦芽糖浓度的范围为2.5％-6.0％。合适的发育培养基通常不含有促生长激素，诸如auxins和细胞分裂素，但可包括激素脱落酸。当脱落酸用于发育培养基中时，所用的浓度范围通常为1mg/L到200mg/L，诸如1mg/L到100mg/L。发育培养基的同渗重摩可调节至一数值，落入理想的范围内，诸如250-450mM/kg，或诸如250-350mM/kg。发育培养基的pH也可调节至一数值，位于理想的范围内，诸如4.5-6.5，或诸如5.0-6.0。胚胎发生组织通常温育在发育培养基之中或之上，温育温度范围为20-24℃，诸如21-24℃。合适的火炬松发育培养基的例子为本发明实施例2中所述的LM5培养基。合适的花旗松发育培养基的例子为本发明实施例3中所述的DM4培养基。
将胚胎发生针叶树组织在发育培养基之中或之上培养足够的时间段以从胚胎发生针叶树组织生产子叶针叶树体细胞胚。例如，通常将花旗松胚胎囊柄团在发育培养基之中或之上培养约7周到约8周以生产花旗松子叶体细胞胚。再次以示例方式，通常将火炬松胚胎囊柄团在发育培养基之中或之上培养约10周到约12周以生产火炬松子叶体细胞胚。
利用本发明方法生产的子叶针叶树体细胞胚可任选发芽形成针叶树幼苗，如果需要，可长成针叶树树木。发芽的幼苗可转移至土壤中进一步生长。例如，发芽的幼苗可种植在温室的土壤中，并且在移栽到室外之前允许生长。通常，子叶针叶树体细胞胚用灯照明以刺激发芽。一般而言，本发明方法的所有步骤除了发芽外皆在黑暗中进行。
利用本发明方法生产的子叶针叶树体细胞胚也可导入加工种籽中，所述加工种籽可被储存用于随后的种植和发芽，或可被种植无需存放。有用的加工种籽的代表性例子包括公开在美国专利No.5,687,504中的加工种籽，该专利在此以其全文引作参考。
本发明方法可用于例如生产单个针叶树树木的克隆，其具有一种或多种理想的特征，诸如快速生长率。因此，在一个方面，本发明提供用于生产一群遗传上相同的子叶针叶树体细胞胚的方法，其中任何在此所述的方法用于从遗传上相似的起始材料(例如，从单个火炬松或花旗松合子胚胎)中生产一群遗传上相同的子叶针叶树体细胞胚。
实施例1
该实施例表明在火炬松体细胞胚生产的增殖阶段成功使用连续培养。
材料和方法：火炬松基因型A，B和C用于处理1-5(如下所述)。火炬松基因型A用于处理6(如下所述)。ESMs在含有增殖培养基的摇瓶中连续培养6周。增殖培养基的组成如下表1所示。
表1
| 火炬松增殖培养基(LM培养基) | |
| 盐 | mg/L |
| NH4NO3 | 150 |
| KNO3 | 909.9 |
| Ca(NO3)2.2H2O | 236.15 |
| MgSO4.7H2O | 246.5 |
| Mg(NO3)2.6H2O | 256.5 |
| MgCl2.6H2O | 50 |
| KH2PO4 | 136 |
| CaCl2.6H2O | 50 |
| KI | 4.15 |
| H3BO3 | 15.5 |
| MnSO4.H2O | 10.5 |
| ZnSO4.7H2O | 14.4 |
| NaMoO4.2H2O | 0.125 |
| CuSO4.5H2O | 0.125 |
| CoCl2.6H2O | 0.125 |
| FeSO4.7H2O | 27.87 |
| Na2EDTA | 37.26 |
| 维生素/氨基酸 | mg/L |
| 尼克酸 | 0.5 |
| 维生素B6盐酸盐 | 0.5 |
| 维生素B1盐酸盐 | 1 |
| 甘氨酸 | 2 |
| 糖/琼脂 | mg/L |
| 肌醇 | 200 |
| 酪蛋白水解物 | 500 |
| L-谷氨酰胺 | 1000 |
| 麦芽糖 | 30000 |
| 激素 | mg/L |
| 2，4-D | 1.1 |
| BAP | 0.1 |
| 激动素 | 0.1 |
使用下列增殖培养条件。
处理1(分批培养对照)：将10mL ESM接种到含有40mL增殖培养基的250mL摇瓶中。每周一次，把10mL沉降细胞体积(SCV)的ESM转移到40mL新鲜LM培养基中。SCV与新鲜培养基的比维持在1∶4。SCV与培养基总体积(加上ESM)的比维持在1∶5。
处理2：将10mL ESM接种到含有40mL增殖培养基的250mL摇瓶中。每周一次，向摇瓶加入新鲜LM培养基。假设SCV的量在前一周已加倍。加入足够的新鲜LM培养基至摇瓶中以使SCV与新鲜培养基的比估计为1∶2。SCV与培养基总体积的比维持在1∶5。处理2的设计是使ESM饥饿，以证实当新鲜LM培养基提供太少时ESM变成棕色。
处理3：将10mL ESM接种到含有40mL增殖培养基的250mL摇瓶中。一周后，向摇瓶加入新鲜LM培养基。假设SCV的量在前一周已加倍。还假设在第一周结束时摇瓶中旧的LM培养基比第一周开始时要少，这是因为ESM的生长已使用一些旧培养基。所以，需要加入足够的新鲜LM培养基以确保SCV与培养基总体积的比维持在1∶5，而SCV与新鲜培养基的比设计成1∶2.5。与处理2类似，处理3的设计是使ESM“饥饿”，以证实当新鲜LM培养基提供太少时ESM变成棕色。
处理4：将10mL ESM接种到含有40mL增殖培养基的250mL摇瓶中。一周后，向摇瓶加入新鲜LM培养基。假设SCV的量在前一周已加倍，以及估计的SCV体积乘以4，从而获得加入的新鲜LM培养基的体积。旧的LM培养基计算时不在考虑之列。因此，SCV与新鲜LM培养基的比设计成1∶4。SCV与培养基总体积的比不受控制。假设ESM每周加倍，而细胞需要足量的新鲜培养基(等于4×SCV)，处理4的设计由估计供给足够的新鲜LM培养基，以促进ESM的进一步生长。
处理5：将10mL ESM接种到含有40mL增殖培养基的250mL摇瓶中。一周后，向摇瓶加入新鲜LM培养基。当SCV转移到新的空摇瓶中时测量其体积。旧培养基的体积也加以测量，并且转移至与SCV相同的新摇瓶中。SCV的体积乘以4以确定加入的新鲜LM培养基的体积。SCV与新鲜LM培养基的比维持在1∶4，而SCV与培养基总体积的比不受控制。同处理4类似，处理5的设计供给足够的新鲜LM培养基以促进ESM的进一步生长。在处理5中，实际测量SCV的体积，而非如处理4中一样估计体积。
处理6：在连续培养容器中，将20mL基因型A ESM用于起始培养物。连续培养容器为Optima 6L培养系统，购自MetaBios Inc.，135Innovation & Development Center，University of Victoria，R-HutMcKenzie Avenue，Victoria，BC Canada，V8W 3W2。每周直观估计SCV的体积，并用无菌软管和连接器将新鲜LM培养基泵送至容器中。ESM样品每周用无菌注射器和管道采集自容器。SCV与新鲜LM培养基的比设计成1∶4，而SCV与培养基总体积的比不受控制。处理6为利用连续培养容器对处理4的放大。
表2对6种处理分别示出估计和测量体积(以毫升(mL)计)的LM培养基，SCV与新鲜LM培养基体积的比(缩写成SCV∶新鲜)，以及SCV与总培养基体积的比(缩写成SCV∶总)。
表2
| 估计的体积 | 测量的体积 | 估计的体积 | ||||||
| 处理#1 | 处理#2 | 处理#3 | 处理#4 | 处理#5 | 处理#5 | 处理#5 | 处理#6 | |
| 基因型A | 基因型B | 基因型C | 基因型A | |||||
| 第0周 | ||||||||
| SCV | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 20 |
| 旧培养基 | ||||||||
| 新鲜培养基 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 40 | 80 |
| 总体积 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 100 |
| SCV∶总 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
| SCV∶新 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.5 |
| 第1周 | ||||||||
| SCV | 10 | 20 | 20 | 20 | 20 | 21 | 12.5 | 40 |
| 旧培养基 | 0 | 40 | 30 | 30 | 26 | 23 | 33.5 | 80 |
| 新鲜培养基 | 40 | 40 | 50 | 80 | 80 | 84 | 50 | 160 |
| 总体积 | 50 | 100 | 100 | 130 | 126 | 128 | 96 | 280 |
| SCV∶总 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.15 | 0.16 | 0.16 | 0.13 | 0.14 |
| SCV∶新 | 0.25 | 0.50 | 0.40 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 第2周 | ||||||||
| SCV | 10 | 40 | 40 | 40 | 39 | 38 | 16 | 80 |
| 旧培养基 | 80 | 60 | 90 | 88 | 88 | 73 | 240 | |
| 新鲜培养基 | 40 | 80 | 100 | 160 | 156 | 152 | 64 | 320 |
| 总体积 | 50 | 200 | 200 | 290 | 283 | 278 | 153 | 640 |
| SCV∶总 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.14 | 0.14 | 0.14 | 0.10 | 0.13 |
| SCV∶新 | 0.25 | 0.50 | 0.40 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 二次抽样开始 | 二次抽样开始 | |||||||
| 第3周 | 估计体积 | 测量体积 | ||||||
| SCV | 10 | 80 | 80 | 80 | 30 | 30 | 30 | 160 |
| 旧培养基 | 0 | 160 | 120 | 210 | 58 | 60 | 120 | 480 |
| 新鲜培养基 | 40 | 160 | 200 | 320 | 120 | 120 | 120 | 640 |
| 总体积 | 50 | 400 | 400 | 610 | 208 | 210 | 270 | 1280 |
| SCV∶总 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.13 | 0.14 | 0.14 | 0.11 | 0.13 |
| SCV∶新 | 0.25 | 0.5 | 0.40 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 第4周 | ||||||||
| SCV | 10 | 160 | 160 | 160 | 30 | 30 | 30 | 320 |
| 旧培养基 | 0 | 320 | 240 | 450 | 49 | 33 | 没有数据 | 960 |
| 新鲜培养基 | 40 | 320 | 400 | 640 | 120 | 120 | 120 | 1280 |
| 总体积 | 50 | 800 | 800 | 1250 | 199 | 183 | 150 | 2560 |
| SCV∶总 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.13 | 0.15 | 0.16 | 0.13 | |
| SCV∶新 | 0.25 | 0.50 | 0.40 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
| 第5周 | ||||||||
| SCV | 10 | 320 | 320 | 320 | 30 | 30 | 25 | 640 |
| 旧培养基 | 0 | 640 | 480 | 900 | 119 | 50 | 82 | 960 |
| 新鲜培养基 | 40 | 640 | 800 | 1280 | 120 | 120 | 100 | 2560 |
| 总体积 | 50 | 1600 | 1600 | 2500 | 269 | 200 | 207 | 4160 |
| SCV∶总 | 0.20 | 0.20 | 0.20 | 0.13 | 0.11 | 0.15 | 0.12 | 0.15 |
| SCV∶新 | 0.25 | 0.50 | 0.40 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 |
另外的基因型B培养在连续培养容器中进行。在第0周，将40mL基因型B ESM接种到含有200mL新鲜LM培养基的连续培养容器中。每周如处理6中所述加入新鲜LM培养基。假设SCV每周加倍，估计的SCV乘以4以确定加入的新鲜LM培养基的体积。旧LM培养基计算时不在考虑之列。SCV与新鲜LM培养基的比设计成1∶4。SCV与LM培养基总体积的比不受控制。该试验持续5周。另外，维持分批培养对照摇瓶，与上述处理1相同。
培养方法学：所有培养物起始在小(250mL)摇瓶中，但是至第一周结束时，体积已基本上增长。将培养物转换到500mL摇瓶中。至第二周结束时，处理2-6维持在1L摇瓶中，每个摇瓶有200-350mL培养物。处理1永远保持在250mL摇瓶中。
在第3，4和5周，SCV和培养基的体积快速增长。为了避免对各个处理/基因型组合维持若干大摇瓶，取出ESM和旧培养基的二次抽样，转移到新摇瓶，然后添加到含有适量新鲜LM培养基的新摇瓶中。ESM和旧培养基完全混合在一起，再对处理2-4的混合物二次抽样。对于处理5，摇瓶沉降，接着利用30mL大孔玻璃吸管单独测量SCV和旧培养基。计算SCV与旧培养基的现有比例。然后以相同比例将SCV与旧培养基转移至新摇瓶中。保持每个基因型/处理组合的摇瓶数少至一个大摇瓶，或总数15个摇瓶。
数据采集：在每周培养物转移时，取样2-3mL SCV，以评价胚胎的质量。第一周，收回3mL组合ESM加上旧培养基混合物。该量的混合物不够提供充足的ESM以评价胚胎质量。剩余周，收回2-3mLSCV并保存用于培养物评价。此操作也许已经轻微改变了SCV与旧培养基的比，但是如同摇瓶内含物随时间在体积上增加一样，该偏差的显著性降低。
结果：处理1，2和3使SCV与总培养基体积的比维持在1∶5。该比在过去用火炬松ESMs的分批培养物已工作良好。处理4，5和6加入新鲜培养基的量为SCV的4倍，而不考虑总体积。如表2所示，其中新鲜LM培养基加入的量为估计SCV体积的4倍的所有处理超过已经在分批培养中使用的SCV与增殖培养基比1∶5。然而，ESM在连续培养中以这些条件仍比在分批培养中以SCV与总培养基体积比1∶5维持时更快速生长。
关于ESM质量，值得注意的是，处理2中的ESM在最终周阶段受压和变小，而处理4和5接受更大比的新鲜增殖培养基，通常显示更好的胚胎质量。连续培养中的ESM的早期胚胎质量优于摇瓶中分批培养；一般而言，连续培养中的胚胎比分批培养中的胚胎更同步，较小和更有组织的头和定向囊柄。
关于ESMs在各种不同的培养条件下的生长，表3显示了对各种基因型A，B和C而言从处理1和5获得的ESM的体积。这些计算的进行是追加每周废弃的ESM的体积，以及使用观察的生长率以外推得出总体积。在培养第二周后开始，处理5(连续培养摇瓶)的全部3种基因型比处理1(分批培养)生长更快。
表3：处理1和5的外推的沉降细胞体积(mL)
| 周 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| A.1 | 10 | 16 | 35 | 67 | 127 | 292 | 380 |
| A.5 | 10 | 20 | 39 | 93 | 158 | 248 | 614 |
| B.1 | 10 | 15 | 29 | 48 | 97 | 165 | 329 |
| B.5 | 10 | 21 | 38 | 90 | 270 | 540 | 1134 |
| C.1 | 10 | 13 | 18 | 27 | 35 | 42 | 42 |
| C.5 | 10 | 13 | 16 | 35 | 56 | 108 | 130 |
基因型A和B在处理4和5中显示了更好的早期胚胎质量。基因型A最初在处理2和3中是受压的，直到培养物调整至培养条件。在后来的周，两个基因型均不再显示受压，但是胚胎在处理2和3中同步比在处理4和5中更少。这些通常快速生长的基因型在处理2和3中可能已受到营养物的限制。
在所有基因型中，处理4和5中的早期胚胎似乎最同步。在处理4中，假定SCV每周加倍，并且加入足够的新鲜培养基以维持1份SCV与4份新鲜培养基的比。处理4中，SCV与新鲜LM培养基的比1∶4基于对SCV体积的估计，在处理5中，SCV与新鲜LM培养基的比1∶4基于对SCV体积的实际测量，这两个处理均生产高质量的ESMs。结果，估计每周SCV加倍，并且加入足够的新鲜增殖培养基以维持SCV与新鲜增殖培养基的比1∶4，这是在连续培养中用于生长液体火炬松ESM培养物的相对直接的方法。
接种到连续培养容器和摇瓶中的所有基因型A ESM来自同样的培养物。在培养第一周后，ESM在连续培养容器和摇瓶中似乎相似。至第2和3周，摇瓶中的ESM比连续培养容器中的ESM显得更健康。然而在第4，5和6周，连续培养容器中的ESM看起来至少与摇瓶中的ESM一样健康。该试验结果显示，在调整2-3周后，火炬松ESMs在连续培养容器中以SCV与新鲜培养基的相同比增殖如在摇瓶中增殖得一样好或更好。
实施例2
该实施例描述本发明用于生产火炬松子叶体细胞胚的代表性方法。
基础组织培养基的组成示于表4中。对基础培养基组成为各个培养基所需的修改列于表5中。各个组织培养基的制备是把所有成分混合在一起，除了脱落酸和麦芽糖(如果需要)之外，并且在高压灭菌(121℃，15psi，15分钟)之前使培养基调节至所需的体积。脱落酸过滤灭菌，以无菌形式加到无菌培养基中。在加到维持培养基之前，L-谷氨酰胺也过滤灭菌。在要求麦芽糖的培养基中，培养基制成高达90％的所需体积。10×麦芽糖储液高压灭菌或过滤灭菌，并且加到高压灭菌培养基中。加入Gelrite制得固体LM-1培养基。将10mL LM-1培养基倾入60×15mm培养皿中，或将20mL LM-1培养基倾入100×25mm培养皿中。
表4：火炬松基础培养基(LM)
| 基盐 | mg/L | 基盐 | mg/L |
| NH4NO3 | 150 | H3BO3 | 15.5 |
| KNO3 | 909.9 | MnSO4.H2O | 10.5 |
| Ca(NO3)2.4H2O | 236.2 | ZnSO4.7H2O | 14.4 |
| MgSO4.7H2O | 246.5 | NaMoO4.2H2O | 0.125 |
| Mg(NO3)2.6H2O | 256.5 | CuSO4.5H2O | 0.125 |
| MgCl2.6H2O | 50 | CoCl2.6H2O | 0.125 |
| KH2PO4 | 136 | FeSO4.7H2O | 27.85 |
| CaCl2.2H2O | 50 | Na2EDTA | 37.25 |
| KI | 4.15 | ||
| 有机添加剂 | mg/L | 有机添加剂 | mg/L |
| 烟酸 | 0.5 | Casamino acids | 500 |
| 维生素B6.HCl | 0.5 | L-谷氨酰胺 | 变量 |
| 维生素B1.HCl | 1 | 肌醇 | 变量 |
| 甘氨酸 | 2 | 碳水化合物 | 变量 |
| pH | 5.7 |
*对一些基因型而言，L-谷氨酰胺在增殖培养基中过滤灭菌。
表5：火炬松培养基的配制
| LM-1 | LM-2 | LM-3 | LM-4 | LM-5 | LM-6* | |
| 阶段I | 阶段II | 阶段III | 阶段III | 阶段IV | ||
| (所有单位以mg/L表示) | 初始 | 增殖 | 冲洗 | 固体发育 | 液体发育 | 层化 |
| L-脯氨酸 | - | - | 100 | 100 | 100 | 100 |
| L-天冬酰胺 | - | - | 100 | 100 | 100 | 100 |
| L-精氨酸 | - | - | 50 | 50 | 50 | 50 |
| L-丙氨酸 | - | - | 20 | 20 | 20 | 20 |
| L-丝氨酸 | - | - | 20 | 20 | 20 | 20 |
| L-谷氨酰胺 | 250 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| 肌醇 | 200 | 200 | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 |
| 麦芽糖 | 30,000 | 30,000 | 25,000 | 25,000 | 25,000 | 25,000 |
| 葡萄糖 | - | - | - | 10,000 | 10,000 | - |
| PEG 8000 | - | - | - | 100,000 | 120,000 | - |
| 活性碳 | 1250 | - | - | 1000 | 1000 | 1000 |
| Gelrite | 1600 | 1600** | - | 2500 | - | - |
| 2，4-D | 55 | 1.1 | - | - | - | - |
| BAP | 7.5 | 0.1 | - | - | - | - |
| 激动素 | 7.5 | 0.1 | - | - | - | - |
| ABA | - | +/-1.0*** | 10 | 25 | 25 | - |
*LM-6层化培养基只有FeSO4.7H2O(13.93mg/L)和Na2EDTA(18.83mg/L)基量的一半。
**Gelrite不加入液体增殖培养基
***ABA以每个基因型为基础加入。所有培养基的pH调整至5.7。
胚胎发生培养物的起始：当不成熟胚胎在发育过程中达到前圆顶或圆顶阶段时，采集雌球果。采集通常开始于7月的第一周(受精后约4-6周)，持续直到第一次出现子叶原基(7月中)。起始的最适胚胎阶段为圆顶开始发育的时候。
从球果去除种籽，并且浸泡在10％含有几滴Tween-20去污剂的Liquinox溶液中，搅拌10分钟。然后，用蒸馏水冲洗种籽30分钟。种籽在15％(v/v)H2O2溶液中搅拌10分钟。接着以连续等份的无菌水通过在层流罩中搅拌把种籽洗5次。
将表面灭菌的种籽转移到培养皿中，在解剖显微镜下观察种籽，并用解剖刀和镊子去除种皮和珠心膜。离体的雌配子体置于LM-1诱导培养基上。离体的配子体的放置应使其纵向轴平行于培养基表面，以致珠孔与培养基接触，但又不浸没在培养基中。培养皿用双层parafilm密封，并将培养物23℃下温育在黑暗中。
2-3周后，体细胞胚从雌配子体的珠孔端突出。粘性半透明白色团发育(0.5-10mm)在这些不成熟胚胎的头的周围。这就称为胚胎囊柄团(ESM)。胚胎囊柄团由各种不同早期发育阶段的胚胎组成。各个胚胎含有胚胎头和囊柄系统。
胚胎囊柄团的增殖：在把离体的雌配子体置于LM-1诱导培养基上之后5-6周，将ESM从原始外植体中分离，并且转移到固体增殖培养基(LM-2)。ESM培养物通过天然针叶树型卵割多胚繁殖。ESM培养物每2周传代培养到新鲜培养基上，并于23℃下温育在黑暗中。当ESM培养物达到1cm长时，将其分成两块，维持所有的块直到有若干块可用于开始悬浮培养。
建立液体增殖培养物：将1-2g(鲜重)ESM(4或5块，每块1cm)转移到含有20ml LM-2液体培养基的250ml锥形瓶中。锥形瓶在黑暗中23℃下置于摇床(90-110rpm)上。1周后，测量沉降的细胞体积(SCV)，如果SCV小于3ml，锥形瓶放回到摇床上而对培养基不进行任何添加或改变。如果SCV有至少5ml，则向瓶中加入25ml新鲜培养基，再放回到摇床上。
第二周后，将培养物在倾斜瓶架上沉降15分钟。如果周前瓶中未加入培养基，则取出10ml废培养基，并用10ml新鲜培养基替换。如果前周已向瓶中加入了培养基，并且培养物看起来生长旺盛，则培养物如下处理。当培养物的建立足以每周生产10ml或更多的沉降细胞，把ESM转移到连续培养容器中，并加入一定体积的培养基，以致ESM与新鲜增殖培养基的比为1∶4。每周加入新鲜LM-2液体培养基，无需传代培养而增加连续培养物。容器沉降15分钟，估计ESM的体积，以细胞与新鲜培养基的比1∶4(v/v)加入新鲜培养基。将旧培养基留在培养容器中，体积计算时不在考虑之列。该阶段的培养物可连续增殖，低温保藏，或者可被单一化(singulated)和发育用于发芽。
胚胎发育：在培养皿或Cambro盒中，利用浸泡在双层Concert 10％CC垫的液体发育培养基LM-5，完成胚胎发育。培养物在维持培养基中培养后沉降，并且抽吸以去除上清液。在转移到Cytostir烧杯过程中，用吸管测量沉降的细胞体积。冲洗培养基(LM-3)的体积等于沉降的细胞体积，加入到沉降细胞中。LM-3培养基中的细胞在Cytostir烧杯中旋转，并另沉降10分钟。取出一半的上清液，并使剩余ESM转移到Cytostir烧杯中。细胞在搅动培养皿中搅动。
ESM吸取到位于浸泡在液体培养基中的垫上的过滤纸。每个标准2”×2”垫使用0.75ml ESM混合物。培养皿用双层parafilm密封，并在黑暗中23℃下温育。约12周后，ESM培养物生产子叶胚胎。
层化：层化是把胚胎置于冷的潮湿环境中若干周的过程，据信模拟冬天。
制备的培养皿包括单层垫材料(2”×2”10％CC，或更大的切口以适合Cambro盒)。每个2”×2”垫加入约18-19ml液体LM-6培养基(对盒而言，加入更多)。将带有火炬松胚胎的过滤纸从发育培养皿上转移到层化培养基的垫上。此外，合子样子叶胚胎可选自发育培养基，并且置于层化培养基上的新过滤纸。培养皿用parafilm密封，并且置于黑暗中2-6℃下4周。
调节体细胞胚：除了层化之外，其中胚胎接触高相对湿度(RH)环境的发育后调节处理改善发芽。高RH环境的提供是加入无菌水至半Cambro盒中。在层化后，配体单一化，并且置于大培养皿中的干过滤纸上。空培养皿置于含有无菌水的半Cambro盒中。胚胎接触高RH环境，直到胚胎的含水量达到60-65％。密封盒子以致垫圈紧紧密封，并用粘合夹子夹住，再置于黑暗中23℃下3周。调节后，成熟体细胞胚从盒子中取出，并可插入到加工种籽中，用于随后的发芽和幼苗建立，或者可直接发芽。
实施例3
该实施例描述本发明生产花旗松(Pseudotsuga menziesii)子叶体细胞胚的代表性方法。
基础培养基的组成列于表6中。基础培养基对各个培养基所需的修改列于表7中。层化培养基的组成示于表8中。表6，7和8中的浓度单位为每升毫克(mg/L)。培养基的制备是将所有成分混合在一起，除了脱落酸(ABA)，赤霉酸(GA)和麦芽糖(如果需要)之外，并且在121℃，15psi下高压灭菌15分钟之前，使培养基调节至所需体积。ABA和GA 4/7过滤灭菌，并在无菌条件下加入到灭菌培养基中。如果培养基需要麦芽糖，则使培养基首先调节至90％的所需体积，并将无菌10×麦芽糖储液的等份试样加入到高压灭菌的培养基中。Gelrite用于制备固体DM-1培养皿，而组织培养(TC)琼脂用于制备固体DM-2培养皿。以每培养皿10ml的DM-1或DM-2培养基加入到60×15mm培养皿上，或以每培养皿20ml的DM-1或DM-2培养基加入到100×25mm培养皿上。
表6：花旗松基本培养基(DM)
| 基盐 | mg/L | 有机添加剂 | mg/L |
| KNO3 | 变量 | 肌醇 | 变量 |
| CaCl2.2H2O | 200 | 维生素B1.HCl | 1 |
| Ca(NO3)2.4H2O | 变量 | 烟酸 | 0.5 |
| KH2PO4 | 340 | 维生素B6.HCl | 0.5 |
| MgSO4.7H2O | 400 | 甘氨酸 | 2 |
| MnSO4.H2O | 15.8 | L-谷氨酰胺 | 变量 |
| ZnSO4.7H2O | 8 | Casamino acids | 500 |
| CuSO4.5H2O | 0.024 | 蔗糖或麦芽糖 | 变量 |
| FeSO4.7H2O | 27.85 | ||
| Na2EDTA | 37.25 | PH | 5.7 |
| H3BO3 | 5 | ||
| NaMoO4.2H2O | 0.2 | ||
| CoCl2.6H2O | 0.02 | ||
| KI | 1 |
表7：花旗松培养基的配制
| DM-1 | DM-2 | DM-3 | DM-4 | |
| 阶段I起始 | 阶段II增殖 | 阶段III单一化 | 阶段IV发育 | |
| KNO3 | 1250(1) | 1250 | 1050 | 2500 |
| Ca(NO3)2.4H2O | - | - | 200 | - |
| 肌醇 | 1000 | 5000 | 100 | 100 |
| L-谷氨酰胺 | 450 | 1000 | 1000 | 750 |
| 氨基酸混合物(2) | - | - | - | 290 |
| 蔗糖 | 15,000 | |||
| 麦芽糖 | 30,000 | 20,000 | 25,000 | |
| PEG 8000 | - | - | - | 190,000 |
| 2，4-D | 110 | 1.1 | - | - |
| N6-苄基腺嘌呤(BAP) | 45 | 0.22 | - | - |
| 激动素 | 43 | 0.22 | - | - |
| 脱落酸 | - | - | 10/5/5 | 10 |
| 赤霉酸 | - | - | - | 7.5 |
| 活性碳 | 2500 | - | - | 1000 |
| 组织培养琼脂 | - | 5000(3) | - | - |
| Gelrite | 1800 | - | - | - |
(1)所有单位为mg/L(或ppm)
(2)L-脯氨酸-100，L-天冬酰胺-100，L-精氨酸-50，L-丙氨酸-20，L-丝氨酸-20
(3)组织培养琼脂不用于液体培养基
所有培养基的pH调整至5.7
表8：层化培养基(SM)
| 基盐 | mg/L | 有机添加剂 | mg/L |
| NH4NO3 | 206.3 | 肌醇 | 100 |
| KNO3 | 1170 | 维生素B1.HCl | 1 |
| CaCl2.2H2O | 220 | 烟酸 | 0.5 |
| Ca(NO3)2.4H2O | 无 | 维生素B6.HCl | 0.5 |
| KH2PO4 | 85 | 甘氨酸 | 2 |
| MgSO4.7H2O | 185 | Casamino acids | 无 |
| MnSO4.H2O | 8.45 | 蔗糖 | 20,000 |
| ZnSO4.7H2O | 4.3 | ||
| CuSO4.5H2O | 0.013 | 活性碳 | 2500 |
| FeSO4.7H2O | 13.93 | ||
| Na2EDTA | 18.63 | ||
| H3BO3 | 3.1 | PH | 5.7 |
| NaMoO4.2H2O | 0.125 | ||
| CoCl2.6H2O | 0.013 | ||
| KI | 0.42 |
胚胎培养物的起始：当不成熟胚胎达到发育的前圆顶和圆顶阶段时，采集雌球果。采集通常开始于7月的第一周(受精后约4-6周)，直到第一次出现子叶原基(7月中)。最适的起始胚胎阶段为圆顶开始发育但在形成子叶之前的时候。
种籽从球果中取出，并浸没在10％Liquinox的溶液中，所述Liquinox包括若干滴Tween-20去污剂，并搅拌10分钟。然后，用蒸馏水冲洗种籽30分钟。种籽在20％(v/v)H2O2溶液中搅拌10分钟。接着以连续等份的无菌水通过在层流罩中搅拌使种籽洗5次。
将表面灭菌的种籽转移到培养皿中，在解剖显微镜下观察种籽，并切开胚胎，以致保持与雌配子体的连接。离体的雌配子体置于DM-1诱导培养基上从而使胚胎接触培养基。培养皿用双层parafilm密封，并将培养物23℃下温育在黑暗中。
5-9周后，体细胞胚从雌配子体的珠孔端突出。粘性半透明白色团发育(0.5-10mm)在这些不成熟胚胎的头的周围。这就称为胚胎囊柄团(ESM)。胚胎囊柄团由各种不同早期发育阶段的胚胎组成。各个胚胎含有胚胎头和囊柄系统。
胚胎囊柄团的增殖：将ESM从原始外植体中分离，并且转移到固体增殖培养基(DM-2)。ESM培养物通过天然针叶树型卵割多胚繁殖。ESM培养物每2周传代培养到新鲜培养基上，并于23℃下温育在黑暗中。当ESM培养物达到1cm长时，将其分成两块，并且维持所有的块直到有若干块可用于开始悬浮培养。
建立液体增殖培养物：将1-2g(鲜重)ESM(4或5块，每块1cm)转移到含有20ml DM-2液体培养基的250ml锥形瓶中。锥形瓶在黑暗中23℃下置于摇床(90-110rpm)上。1周后，将25ml新鲜培养基加入到锥形瓶中，再放回到摇床上。
第二周后，将培养物在倾斜瓶架上沉降15分钟。上清液(废培养基)用吸管移出，并用5ml断头吸管测量沉降的细胞体积(SCV)。如果SCV为2-4ml，将SCV返回至瓶中，并加入培养基以使细胞与培养基的比为1∶9(v/v)。如果SCV为5ml或更多，培养物处理如下。当培养物的建立足以每周生产5ml或更多的沉降细胞，把ESM转移到连续培养容器中，并加入一定体积的培养基，以致ESM与新鲜增殖培养基的比为1∶9。每周加入新鲜DM-2培养基，无需传代培养而增加连续培养物。容器沉降15分钟，估计ESM的体积，并以细胞与新鲜培养基的比1∶4(v/v)加入新鲜培养基。将旧培养基留在培养容器中，体积计算时不在考虑之列。该阶段的培养物可连续增殖，低温保藏，或者可被单一化和发育用于发芽。
体细胞胚单一化：脱落酸(ABA)对子叶胚胎发育至关重要，因为其抑制卵割多胚，并且允许胚胎单一化和进一步胚胎发育。将ESM囊柄培养物转移到含有10.0mg/L ABA的DM-3液体培养基中。一周后，培养物再次传代培养到包括5.0mg/L ABA的DM-3培养基中。在另一周后，培养物再次传代培养到包括5.0mg/L ABA的DM-3培养基中。
胚胎发育：在培养皿或Cambro盒中，利用浸泡在双层Concert 10％CC垫的液体发育培养基DM-4，完成胚胎发育。2”×2”垫吸收15-16ml培养基/垫。培养物在单一化培养基中培养后沉降，并且抽吸以去除上清液。在转移到Cytostir烧杯过程中，用吸管测量沉降的细胞体积。保留上清液的体积等于沉降的细胞体积的一半，加入到Cytostir烧杯，然后在搅动培养皿上搅动培养物。接着，0.75ml沉降的ESM混合物(约100mg ESM)吸取到位于DM-4培养基浸泡的垫上的过滤纸。培养皿用双层parafilm密封，并在黑暗中23℃下温育。约7-8周后，ESM培养物生产子叶胚胎。
层化：层化是把胚胎置于冷的潮湿环境中若干周的过程，据信模拟冬天。
制备的培养皿包括单层垫材料(2”×2”10％CC，或更大的切口以适合Cambro盒)。每个2”×2”垫加入约18-19ml液体ESM培养基(对盒而言，加入更多)。将带有花旗松胚胎的过滤纸从发育培养皿上转移到层化培养基的垫上。培养皿用parafilm密封，并且置于黑暗中2-6℃下4周。层化后，成熟体细胞胚从培养皿中取出，并且可插入到加工种籽中，用于随后的发芽和幼苗建立，或可直接发芽。
虽然本发明优选的实施方案已加以说明和描述，但应意识到，在不背离本发明实质和范围的情况下，可对其做出各种各样的变化。
Claims (10)
1.一种增殖针叶树胚胎发生组织的方法，所述方法包括在液体增殖培养基中连续培养针叶树胚胎发生组织足够的时间段以使胚胎发生组织增殖的步骤。
2.权利要求1的方法，其中胚胎发生组织几乎由胚胎囊柄团组成。
3.权利要求1的方法，其中胚胎组织为火炬松胚胎发生组织。
4.权利要求1的方法，其中胚胎组织为花旗松胚胎发生组织。
5.权利要求1的方法，其中将针叶树胚胎发生组织培养在第一体积的增殖培养基中，以及连续培养通过周期性向第一体积的增殖培养基中加入新鲜液体增殖培养而实现。
6.权利要求5的方法，其中新鲜增殖培养基每周一次加入到培养的胚胎发生组织中。
7.权利要求6的方法，其中新鲜增殖培养基每周一次加入到培养的胚胎发生组织，历时2周到10周。
8.权利要求5的方法，其中针叶树胚胎发生组织的体积与新鲜增殖培养基的体积之比为约1∶2到约1∶5。
9.花旗松子叶体细胞胚的生产方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在起始培养基之中或之上培养花旗松合子胚的时间段足以生产胚胎囊柄团；
(b)在液体增殖培养基中连续培养胚胎囊柄团的时间段足以使胚胎囊柄团增殖；以及
(c)在发育培养基之中或之上培养增殖的胚胎囊柄团的时间段足以从胚胎囊柄团中生产花旗松子叶体细胞胚。
10.火炬松子叶体细胞胚的生产方法，所述方法包括下列步骤：
(a)在起始培养基之中或之上培养火炬松合子胚的时间段足以生产胚胎囊柄团；
(b)在液体增殖培养基中连续培养胚胎囊柄团的时间段足以使胚胎囊柄团增殖；以及
(c)在发育培养基之中或之上培养增殖的胚胎囊柄团的时间段足以从胚胎囊柄团中生产火炬松子叶体细胞胚。
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